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在马拉威，援助削减意味着像 Josophine Phiri 这样的新母亲可能面临漫长的就医等待。 236
225 科学出版中的 AI： 速度更慢，质量更差，且成本更高 ——H. H. Thorp
226 随着北极变暖，灰鲸的繁荣转为衰落 科学家指出，相关变化正危及这些海洋哺乳动物的关键摄食地 ——W. Cornwall
228 在一场十亿美元的豪赌中，美国国家科学基金会押注于具有经济回报的研究 新的 X-Labs 计划旨在开发突破性技术——但学术界不确定他们是否受欢迎 ——J. Mervis
229 美国国家科学基金会禁止几乎所有与中国的研究合作 该机构放弃了缓解风险的尝试，转而采取全面禁止与大多数中国研究机构合作的政策 ——J. Mervis
照片：THOKO CHIKONDI
230 斯堪的纳维亚雷达阵列将探索极光的奥秘 欧洲不共形传感器阵列 (3D) 将描绘出被太阳爆发扰动的上层大气的全新图景 ——R. Stone
232 美国研究人员对联邦拨款管理拟议的变更表示愤怒 白宫收到 340,000 条关于相关规则的评论，许多人担心这会导致科学政治化 ——J. Mervis
233 杀树甲虫正在向全球城市森林蔓延 在研究人员拼凑该害虫全球迁徙路径的同时，各国正致力于遏制这一日益增长的威胁 ——E. Pennisi
234 西班牙最大的研究机构正面对其黑暗过去 西班牙国家研究委员会公布了在弗朗西斯科·佛朗哥独裁统治期间被清洗的约 500 名员工的故事 ——E. Pain
FEATURES (专题) 236 不确定的道路 在 2025, 年的冲击之后，马拉威正在重新思考其与对外援助的关系——并试图保护在孕产妇健康方面取得的显著成效 ——C. Offord
PODCAST (播客)
PERSPECTIVES (观点) 242 淋巴结现已成为“可选项” 一组树突状细胞协调了肿瘤组织中三级淋巴结构的形成 ——W. K. Decker
243 找回失落的根源 综合证据有助于三角定位埋葬在圣海伦娜岛上的非洲奴隶的起源 ——R. A. Bentley
244 清理衰老器官 一种前列腺素阻止巨噬细胞清除衰老器官中的有毒中性粒细胞 ——G. A. FitzGerald
246 将放射性分子带到实验台 一种紧凑的放射性分子源可实现对基础物理的新测试 ——L. Caldwell
LETTERS (信函) 247 深海采矿需要及时治理 ——C. Rühlemann
248 谄媚 AI 的社会校准 ——S. Meng
248 回应 ——M. Cheng 等
POLICY ARTICLE (政策文章) 249 亚马逊大豆暂停协议的兴衰 对这一自愿零砍伐协议的挑战可能会给森林和大豆行业带来成本 ——L. Rausch 等
对目前暴露的阿拉尔海盆地区域进行沉积芯采样显示，干涸如何导致当地干枯地形产生巨大的碳通量。
252 找回你的声音 AI 语音神经假体可以在神经损伤后恢复日常沟通 ——S. Stavisky
马拉威的医疗保健
在 USAID 结束之后， 以及一颗拥有
大气的岩石类系外行星
326 眼泪能诉说的一切 —G. Schwarz
324 新产品 325 科学职业
照片：LAURA CARRAU
管理学界有一句名言，由美国国家航空航天局 (NASA) 管理员 Daniel Goldin 在 20 世纪 90 年代推广，即技术改进的目标是让产品更快、更好、更便宜。尽管这一策略在航空航天工业中取得了一些成功，但人工智能 (AI) 的狂热者们在论述 AI 将如何改变工作时也提出了同样的观点，声称这将仅需要极少的人力投入，从而使人类进入一个激进丰盈的时代，除了其他益处外，还将摆脱疾病、苦工和危险，让社会有更多时间从事创造性活动。但历史讲述的是另一个故事。当机器在第二次工业革命期间开始提高生产力时，美国工程师 弗雷德里克·温斯洛·泰勒 (Frederick Winslow Taylor) 的《科学管理原理》鼓励公司利用监视手段促使员工工作更努力、时间更长，这种方法使工人精疲力竭且心灰意冷，导致知识和任何决策权从工人转移到管理层，而利润仅由顶层人员获取。然而，这依然是美国经济企业的基石。
事实上，随着 AI 的介入，科学出版正开始经历某种 泰勒制 / 科学管理法 (Taylorism)。由于出版商力求维护科学记录的完整性，对 AI 生成的研究论文进行严谨的人工检查正成为瓶颈。这一挑战要求投入更多的人力，使得整个过程变得更慢且更昂贵。
近期，大语言模型 (LLMs) 预测蛋白质结构和加速新材料发现的能力彻底改变了这两个领域。现在，新的 AI 代理可以执行研究设计和分析的许多方面。但这也存在阴暗面。最近的一篇论文描述了 LLM “在需要细微临床判断、实验推理或深层生物学思考与综合的领域仍然挣扎”。此外，其中一些代理比人类更容易从事相当于研究不端行为的行为，例如挑选数据以及操纵统计分析直至获得预期结果。当这些代理随后生成描述发现的论文时，它们可能会产生更多错误，包括幻觉引用，其中一些已经进入了文献中。
随着时间的推移，这些模型很可能会改进并纠正其中一些行为，但最近有人认为，只要 LLMs 被用于研究，这些错误将永远存在。LLMs 的运作并非通过寻求真理或逻辑推理，而是通过建立概率连接。而旨在改进这些程序以避免不良行为的努力可能全部徒劳，因为 LLMs 倾向于谄媚行为，以维持用户的参与度。
这些因素使科学出版变得复杂。由于开展研究和产出论文的速度在加快，《科学》(Science) 及其他期刊的投稿率正在上升。但由于更多论文包含更多 AI 生成的错误，需要更多的人工监管来核查发现。目前已有一些工具（许多基于 AI）有助于捕捉错误，例如虚假引用和无意义的措辞，但每位作——
更慢、更差、更昂贵
信息……
AI 投机者
构建一个强有力的、由人类策划的科学文献库从未如此至关重要。AI 垃圾信息（AI slop）在科学记录以及整个互联网上的传播，正使科学变得不那么值得信赖。但与此同时，AI 爱好者们在告诉世界，补救措施都应该是容易自动化的，从而给人一种印象：期刊不仅能够捕捉到更多错误，而且能更高效、更廉价地完成。这并非目前科学出版的现实，未来可能也并非如此。其他工作场所，如仓库和货运，在面对需要更多人力投入的需求时，也正经历着类似的监控挑战；这再次使美国由 AI 驱动的生产力更接近于泰勒制 / 科学管理法，而非戈尔丁（Goldin）的格言。泰勒制 / 科学管理法 的历史表明，社会应当努力保护那些在生产之名下，被技术逼迫承担过多工作的人员的福利与自主权。
如果科学界无法解决 AI 的影响，那么真实的研究和经过验证的发现将缓慢且昂贵地渗入既有知识体系，而错误或伪造的信息被视为现实的机会将会增加——与此同时，AI 投机者们则在从中牟利。
H. Holden Thorp 是 Science 系列期刊的主编。hthorp@aaas.org
自动化的报告需要进一步的人力投入来解读结果，并与作者共同解决这些问题，进而决定修改论文或完全不予发表。这一点同样适用于检查图像操纵、剽窃和参考文献的 AI 工具。然而，AI 工具无法捕捉所有错误，而且它们还会产生误报，将真实的人类研究错误地标记为 AI 生成。
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科学家指出，一些变化正危及海洋哺乳动物的关键觅食地
鲸鱼 CRC-2293 曾是一次著名复苏的一部分，是东太平洋灰鲸（Eschrichtius robustus）这一快速增长种群的一员。该种群曾因商业捕猎而锐减至仅数千头，但在 1980 年大多数捕鲸活动被暂停后开始繁荣，以至于被认为不再需要在美国《濒危物种法》下受到保护。
但在 6 月中旬，躺在华盛顿州海滩上的这具臃肿尸体标志着一个令人担忧的新进展。自 2019 年以来，灰鲸在迁徙过程中被冲上岸的数量异常之高。
[[IMG_XXXX]] 一个团队正在对 6 月被冲上华盛顿州海岸的一头灰鲸进行尸检。
随着北极变暖，灰鲸
沃伦·康沃尔 (WARREN CORNWALL)，发自华盛顿州海洋海岸 (Ocean Shores, Washington)
它们从墨西哥（那里是它们的越冬和产崽地）前往北极觅食地，路程约 8000 公里。死亡人数在数年内有所放缓。但在过去的 2 年里，北美沿岸的死亡人数再次激增至创纪录水平，而整体种群数量已下降至峰值的一半以下。
科学家们目前预测种群将持续下降。可能的原因是：俄勒冈州立大学 (OSU) 的海洋生态学家约书亚·斯图尔特 (Joshua Stewart) 所称的“北极觅食地的根本性体制转变”，该地区的变暖速度是全球平均速度的四倍。
“很多糟糕的事情在同时发生，”生物学家杰西·哈金斯 (Jessie Huggins) 说道。她站在一具巴士大小的尸体旁，这是今年从墨西哥到阿拉斯加发现的至少 145 头死亡灰鲸中的一头。
哈金斯身穿明亮的橙色工装裤，脚蹬橡胶靴，戴着白色乳胶手套，她对这些损失有着极其直观的观察。作为非营利组织卡斯卡迪亚研究集体 (Cascadia Research Collective) 海洋哺乳动物搁浅计划的负责人，几乎每次在华盛顿州有鲸鱼被冲上岸时，她都会被要求进行尸体解剖。在通常的一年里，这意味着大约有六头灰鲸。而她正在切开的这头鲸鱼是今年迄今为止的第 30 头，距离 2019 年的州纪录仅差四头。
她的工作揭示了许多死亡动物处于消瘦状态并显示出饥饿迹象——这一发现
照片：W. CORNWALL/SCIENCE
这种情况在不列颠哥伦比亚省及其他地区的类似调查中也得到了呼应。与此同时，墨西哥海域出生的幼鲸数量在减少，科学家们记录到，在鲸鱼数量于 2016. 年达到近 27,000 头峰值后不久，种群数量开始下降。根据 2025 年最新的种群估算，目前的数量可能约为 13,000, 头，为 20 世纪 70 年代以来的最低水平。
然而，这一次，搁浅数量的上升以及在加利福尼亚州蒙特雷向南迁徙期间经过此地的鲸鱼年计数下降，表明这是一个持续性的崩盘。“感觉完全不同，”Stewart 说道。“如果说有什么迹象的话，这次搁浅数量的增加正是在强化这一关于重大气候影响的叙事。”
研究人员指出，端足类动物的减少是一个主要问题，特别是在北波林海，那里曾经是这些鲸鱼的主要觅食地。马里兰大学环境科学中心研究端足类动物的生物海洋学家 Jackie Grebmeier 表示，如今端足类动物在被称为奇里科夫盆地 (Chirikov Basin) 的区域中所占的范围要小得多。在过去的 2 个十年中，该盆地洋流的变化（被认为与全球变暖有关）改变了海床沉积物，使得其中大部分区域不再适合穴居的端足类动物生存。
在仍有这些类虾生物存在的地方，它们的体型也更小，这意味着觅食的鲸鱼每吞咽一次所获得的热量更少。Grebmeier 表示，这可能是因为饥饿的鲸鱼过度捕食剩余的端足类动物，捕获了较大的虾，而较小的虾则在鲸鱼口中鲸须的骨板之间逃脱。或者，以生长在海冰下的富脂藻类为食的端足类动物本身可能因为波林海冰层的萎缩而面临食物短缺。
最终结果是，“你以前拥有一个披萨那么大的规模，”Grebmeier 在描述波林海端足类动物的总种群数量时，用手势比划道，“而现在你只有一个切片。”
华盛顿大学研究灰鲸生态学的海洋生态学家 Sue Moore 怀疑，鲸鱼死亡人数的激增可能与 2018 和 19. 年袭击波林海的海洋热浪所带来的生态变化有关。这次热浪已被指导致了创纪录的低冰位以及数十亿只雪蟹的大规模死亡。这可能意味着生态系统将不再能够支撑与过去相同数量的鲸鱼。“在我看来，这看起来像是某种临界点，”Moore 说道。
这 就像是 某种 临界点。
在海洋之滨（Ocean Shores）的海滩上， 哈金斯（Huggins）爬到鲸鱼的 侧身，用一把片鱼刀 切下一块皮肤和底层的 脂肪层。脂肪层显示出 这头鲸鱼正处于饥饿状态。 营养充足的鲸鱼脂肪是白色且 柔软的。哈金斯告诉她 15 岁的 女儿兼助手格蕾丝·福斯特（Grace Foster）， 在写字板上记录下这层 脂肪是僵硬的、含水的且呈粉红色。
一旦鲸鱼的肠道从腹部 倾泻而出，便暴露出更多 关于其绝望状态的线索。 该器官内塞满了木屑， 几乎没有其他东西，这表明它 在生产力低下的近岸海域觅食。 “它能找到一些食物，但不够，” 哈金斯向三名冒着腐肉 恶臭观看尸检过程的旁观者解释道。
随后出现了一个转折。在 鲸鱼下颌后部，靠近耳朵的地方， 一次切口揭露了一处骨折。 哈金斯将手伸入腐烂的 组织深处，取出几块 碎裂的骨骼。她将它们装入 塑料袋准备送往实验室， 病理学家将在那里确定 这种损伤是否发生在鲸鱼 还活着的时候。即便最终证明 与船只之类的碰撞是直接死因，
哈金斯指出，饥饿 可能仍然是诱因，因为饥饿 可能驱使动物进入危险水域寻找食物， 或者减缓了它对迎面而来 海上交通的反应速度。
这个问题在加利福尼亚州的 旧金山湾显而易见，近年来 多达三打灰鲸在这里 出现以寻找食物。今年在 船只密集的该海湾中， 观察到了近一半数量的灰鲸。 根据总部位于加利福尼亚州的 海洋哺乳动物中心（Marine Mammal Center）的数据， 该地区发现了 13 头死鲸， 其中多达 6 头被怀疑死于船只碰撞。 为了解决这一日益严重的问题， 当局在 5 月启动了一套由 伍兹霍尔海洋研究机构（Woods Hole Oceanographic Institution）研究人员设计的 新型鲸鱼探测系统，可实时发送警报。
在其他地区，灰鲸 一直在改变其摄食行为， 在阿拉斯加吃鲱鱼卵， 在华盛顿吃幽灵虾， 在俄勒冈吃浮游动物。 摩尔（Moore）表示，在北极觅食周期中， 越来越多的个体出现在 白令海北部的楚克奇海。 观测结果表明，那里的鲸鱼 正在以生活在海洋上层的 磷虾为食。
泰勒·阿齐泽（Taylor Azizeh）是一名在斯图尔特（Stewart）指导下的俄勒冈州立大学（OSU）博士生， 她正致力于了解鲸鱼 如何改变饮食，以及 这是否提高了它们的生存率。 她正在分析追溯至 20 世纪 90 年代的 北极灰鲸组织样本， 寻找与不同猎物相关的 同位素特征变化。她还在收集 从加州海岸向南前往墨西哥的 鲸鱼身上采取的微小组织活检样本， 以观察其饮食是否与 它们的丰腴程度相关。
斯图尔特说，饮食的灵活性 可能帮助鲸鱼忍受北极的环境变化。 但考虑到持续的下降趋势， 他怀疑这是否能完全替代失去的食物。 他表示，曾经支持 20,000 头或更多鲸鱼的生态系统， 在未来可能只能维持 该数量的一半。
“我们无法准确预测 未来的猎物供应情况，”他说道。 “我们只知道它受到了气候变化的影响， 并且在下降。”
苏·摩尔（Sue Moore） 华盛顿大学
在一场十亿美元的豪赌中，美国国家科学基金会押注于具有经济回报的研究
新的 X-Labs 计划旨在开发突破性技术——但学者们不确定自己是否受欢迎 JEFFREY MERVIS
量子计算 是美国国家科学基金会 新 X-Labs 计划 支持的领域之一。
本周，美国国家科学基金会 (NSF) 初步获悉，一项针对应用研究的巨额新投资是否能买到足以与互联网媲美的技术突破。周一标志着一项名为 X-Labs 的 $1.5 billion NSF 计划提案提交的两个七月截止日期中的第一个，该计划在不到 2 个月前刚刚启动。
该机构还为 X-Labs 建立了一种与传统拨款截然不同的激励结构，在传统拨款中，回报通常仅限于在权威期刊上发表的研究结果。相反，X-Labs 团队如果能达成一系列雄心勃勃的里程碑，将发现并将其扩展为能够催生整个新产业的商业可行技术，从而赢得更多资金——在 6 年内最高可达 $300 million。首批两个主题是互连量子系统与光子学，以及用于传感和成像的新型仪器。
“我们希望支持这些领域……由非传统研究组织主导的颠覆性进展，”负责资助该计划的 NSF 技术、创新与合作伙伴关系 (TIP) 局局长 Erwin Gianchandani 表示。在旨在解释该计划的多次网络研讨会之一上，他告诉听众要“在组建团队和选择要解决的问题时都保持创造力”。NSF 的征集通知还要求团队证明他们能够在招聘、采购、合同签订以及知识产权分配等方面做出快速决定，这在含蓄地讽刺大多数学术机构中冗长的官僚作风。
对于芝加哥大学的量子物理学家 David Awschalom 来说，这种方法非常有意义，他目前正在组建一个团队提交提案。“当今研究中最大的挑战之一是如何弥合概念验证演示（这是学术实验室所做的）与构建可扩展技术（这是工业界所做的）之间的差距，”他说道，“X-Labs 是实现这一目标的绝佳范例。”
但休斯顿大学的应用物理学家 Mini Das 表示，她不明白为什么 NSF 会希望在一个需要顶尖科学头脑的计划中排除其核心受众。“如果你在寻找突破，你肯定希望纳入学术界，因为新颖的科学最终会转化为新技术，”Das 说道，她计划提交一份关于新型 3D 成像技术的提案，该技术可以加速医疗诊断和治疗，并刺激其他领域的创新。
康涅狄格大学 (UConn) 的材料科学家兼教务长 Pamir Alpay 对 NSF 启动 X-Labs 计划表示赞赏。但他表示，该计划最初在 14 May 发布的公告对 UConn 构成了威慑。“他们基本上是在说，不希望学术机构申请，”他回忆道，“所以我们没有去追求。”
对于 Alpay 和其他人来说，一个红灯信号是：一旦项目从 9 个月的规划期进入全面运行阶段，首席研究员 (PI) 和其他“资深关键人员”必须将其 100% 的时间投入到项目中。这将实质性地排除教职员工担任主要角色，因为他们除了研究之外，还承担着教学和服务义务。
照片：ANGELA WEISS/AFP VIA GETTY IMAGES
“旨在从一开始就将大学和其他现有研究机构纳入其中，”一名美国国家科学基金会 (NSF) 发言人在回应《Science》的查询时表示。“基于社区的反馈，NSF 修改了该资助机会。”但修订后的通知依然保留了 100% 规则，且 NSF 官员在网络研讨会期间，就资格要求究竟发生了多大变化给出了不一致的信号。
“是的，当然，我们希望他们 [学术科学家] 能成为关键人员，”一名 TIP 工作人员在修订方案发布当天的网络研讨会上说道。然而几分钟后，另一名工作人员表示：“我认为维持 [一个人] 与大学的现有关系将具有挑战性。”TIP 工作人员还建议，对于 X-Lab 成功至关重要的教职员工，可能需要申请休职，或者相反，如果希望维持目前的大学身份，则在项目中接受较低的角色。
一般的 NSF 资助并不要求首席研究员 (PI) 将全部时间投入到该项目中，许多教职员工同时管理多项联邦资助。例如，Awschalom 还领导芝加哥量子交换中心 (Chicago Quantum Exchange)，这是一个遍布伊利诺伊州的该领域工作中心，也是 NSF 区域创新引擎 (Regional Innovation Engine) 最新一轮评审的入围者，后者是另一个旨在加速技术转移但侧重于促进当地经济的 TIP 计划。
Alpay 担心，如果大多数团队由公司或其他此前未获得 NSF 资助的非学术组织的研究人员领导，NSF 可能会无法实现 X-Labs 的目标——并最终花费更多资金。他说：“随着时间的推移，大学已经建立了所需的各类研究基础设施。”他指出，唐纳德·特朗普总统的政府批评大学从政府获得的高额管理费（用于报销进行联邦研究的成本）。他说：“但我好奇，一个没有现有基础设施的新组织在管理费上会收取多少。如果费率更高，我一点也不会惊讶。”
尽管 NSF 工作人员敦促网络研讨会的参与者要“大胆思考”，但申请人必须将他们关于 X-Lab 的革命性想法压缩在一份八页的提案中。在加速审查计划下，通过内部审查的项目将在 8 月底前向 NSF 进行口头陈述。NSF 表示，首批获胜者将在秋季公布，具体人数“取决于资金的可用性以及收到的提案的强度和质量”。NSF 还保留了将 X-Labs 扩展到特朗普政府优先考虑的其他领域（如生物技术）的可能性。
NSF 禁止几乎所有与中国的研究合作
该机构放弃了减轻风险的尝试，转而采取全面禁止与大多数中国研究机构合作的措施
美国国家科学基金会 (NSF) 已决定禁止其资助的每一位美国科学家与几乎所有中国研究机构及其员工进行合作。这项新政策放弃了 NSF 此前在平衡此类合作的潜在风险与收益方面所做的尝试。但这使该机构与今年早些时候规模更大的国防部 (DOD) 以及国会共和党人的行动保持一致，后者断言与中国的任何互动都威胁到国家安全。
非常具有破坏性！
Peter Michelson 斯坦福大学
这项于 8 July 发布且仍由大学管理人员消化中的新政策，依赖于由国防部 (DOD) 及其他联邦机构维护的所谓受限实体名单。这些名单处于不断变动之中，包含了数百所中国领先大学、国家实验室及其他研究机构的名称。美国国家科学基金会 (NSF) 的政策指出，任何与“此类受限实体的员工”的互动同样是禁忌。
其中有少数显著的缺失，包括清华大学；该校在 2 weeks 前宣布，已从加州大学伯克利分校挖走了 2025 年诺贝尔化学奖获得者 Omar Yaghi。与此同时，观察人士预测，美国大学可能会为了稳妥起见，而避免与中国同行进行所有互动。
该机构希望在减轻美国关键技术遭受经济或军事间谍活动可能性的同时，保留与 中国 的部分合作。“如果我们执着于实现与研究安全相关的零风险，我们就无法在科学和创新方面继续领先世界，”现任美国国家科学基金会 (NSF) 幕僚长的 Rebecca Keiser 在公布一项名为“利用保障与透明度的可信研究”(TRUST) 的新指标时解释道，该指标旨在“评估资助提案中潜在的国家安全风险”。
但对于 中国 以及其他被认为对美国国家安全构成威胁的国家来说，TRUST 现在似乎已成为历史。新政策写道：“美国国家科学基金会 (NSF) 已认定，涉及这些受限实体的美国国家科学基金会资助项目的研究安全风险缓解措施是不充分的。”
众议院 中国 特别委员会主席 John Moolenaar 众议员 (共和党-密歇根州) 在上周的一份新闻发布会上称美国国家科学基金会 (NSF) 的举措“值得赞赏且符合常识”，并敦促其他联邦机构“效仿五角大楼和美国国家科学基金会 (NSF)”。但许多科学家认为这是一个糟糕的主意，它忽视了美中合作给双方带来的益处。
“这对美国科学是有益的。非常具有破坏性！”斯坦福大学物理学家 Peter Michelson 说道，他去年组织了一项由数百名斯坦福大学教员签署的请愿书，抗议 Moolenaar 试图在向国防部 (DOD) 提供政策指导的法案中加入进一步限制与中国合作的条款。Moolenaar 虽然失败了，但他继续倡导此类立法。
长期关注中国的 Denis Simon 则更加心忧。“美国国家科学基金会 (NSF) 的政策为 Moolenaar 提供了开放的空间，让他可以将任何人列入 [禁止] 名单，我认为这最终将会发生，”Simon 表示。他曾任杜克大学与武汉高校合资建立的杜克昆山大学的执行副校长。
美国国家科学基金会 (NSF) 正在通过 researchsecurity@nsf.gov 征求对其新政策的意见，并计划在 10 月 1 日生效的下一版资助者指南更新中详细说明最终版本。研究倡导者希望该指南能够解答他们关于该政策的许多疑问。
其中最大的问题之一是对“研究合作”的定义。它是否包括在会议上就公开研究进行的随意交谈，或者在作者独立工作的论文中共同署名？例如，美国国立卫生研究院 (NIH) 和美国国家航空航天局 (NASA) 似乎正在限制其资助者与外国科学家共同撰写论文的自由。追踪联邦研究政策的非营利大学联盟 COGR 的 Kevin Wozniak 指出：“共同署名并不一定等同于合作。”但他注意到，美国国立卫生研究院将其视为决定一次互动是否越界的“一个因素”。
本周情况可能会变得更清晰，届时 Keiser 以及来自 NIH 和美国能源部科学办公室的同行将在 Moolenaar 的委员会面前作证。但 Simon 属于非营利组织昆西研究所 (Quincy Institute) 的一个倡导国际研究合作益处的团体，他不认为美国国家科学基金会 (NSF) 会根据社区反应显著改变其政策。
“直到现在，美国国家科学基金会 (NSF) 在评估与中国任何互动的利弊方面一直非常负责，”Simon 说。“但在当前的政治气候下，这对于一个联邦机构来说已不再是一个可行立场。”
斯堪的纳维亚雷达阵列将 探测极光之谜
EISCAT_3D 将描绘出被太阳爆发所扰动的高层大气新图景 RICHARD STONE，于挪威斯瓦尔巴群岛
2017 年捕捉到的图像看起来很不对劲。在挪威斯瓦尔巴群岛苍白的冬日天空下，细小的绿色污迹在极光帘幕旁盘旋。这些碎片状极光发射（FAEs）的直径仅有几公里，持续时间不足 1 分钟。最令人费解的是，它们似乎忽略了通常定义北极光轮廓的无形磁场线。“它们真的是个奇怪的小玩意，”斯瓦尔巴大学中心（UNIS）的空间物理学家 Katie Herlingshaw 说道。
一项重大的新仪器或许最终能提供答案。今年秋天，总部位于瑞典的国际组织欧洲不共形传感器阵列 (EISCAT) AB 计划揭晓 EISCAT_3D，这是一个耗资 $65 下一代雷达系统，将使研究人员能够以前所未有的方式探测高层大气。EISCAT AB 的科学主管 Thomas Ulich 表示，在北斯堪的纳维亚组建的这些阵列有望成为“世界上最先进的不共形散射雷达”，为电离层（一层高海拔的带电等离子体）在受到太阳风暴扰动时的状态提供全景视图。
由于地球磁场的轮廓将高能粒子引导至极地附近的大气层中，北斯堪的纳维亚是观察这些扰动的绝佳之地，而这些扰动不仅仅是一个科学谜团。它们会干扰高频无线电链路，增加低轨卫星的大气阻力，并使 GPS 及其他基于空间的导航系统信号在通过扰动等离子体时发生闪烁。EISCAT_3D 将帮助科学家理解这些威胁。它还将追踪日益增多的空间碎片群，这是航天器的另一项危险。
这些实际应用价值赋予了 EISCAT_3D 紧迫性。而对于研究人员来说，该仪器的首次亮相正值一个科学上极具诱惑力的时刻。“我们正处于极光发现的金子时代，”瑞典空间物理研究所的 Stephan Buchert 说道。
许多惊喜来自一个全球性的极光追逐者网络。业余爱好者们一直关注着极光
照片：欧洲不共形传感器阵列 AB，瑞典基律纳
芬兰气象研究所的空间物理学家 Maxime Grandin 表示，这种情况始于 19 世纪，当时例如船长和僧侣会将观测结果邮寄给斯堪的纳维亚的科学家。他说，如今得益于社交媒体和带有精确时间戳的智能手机图像，“公民科学家已经改变了极光科学。”
Grandin 称，这一新 era,（时代）的“黎明”是对 STEVE 的发现。STEVE 是一条窄窄的淡紫色光带，可以横跨天空延伸数百公里，且出现的位置比普通极光更偏南。直到 2010 年代初期，极光爱好者在网上分享图像后，这一奇观才引起了广泛的科学关注。通过将照片与卫星测量结果相结合，研究人员最终证明，STEVE 与高层大气中一个狭窄的加热等离子体通道和快速移动的带电粒子有关。
随着业余爱好者帮助揭示与 STEVE 同时出现的波浪状“沙丘”和快速移动的绿色条纹（被命名为“篱笆”），极光类目库继续增长。斯瓦巴 {Svalbard} 的研究人员最近又增加了另一个奇观：一种暗淡的粉红色“幽灵极光”，这可能涉及高度激发的氮分子和氧分子。FAE 更是增加了神秘感。
极光爱好者在大约十年前开始报告碎片现象，而这些现象至今仍未得到解释。
位于瑞典的一个天线阵列是三个欧洲不共形传感器阵列 (3D) 站点之一，旨在捕捉从高层大气反弹回来的雷达脉冲。
在斯瓦巴附近发现了数百个此类碎片，其地理位置可能是解开谜题的关键。该群岛位于磁场日侧尖点（dayside cusp）之下，这是一个漏斗状区域，太阳的带电粒子从中流入地球高层大气，从而触发极光。然而，在那里看到的 FAE 似乎产生方式不同，源自电离层内部的过程。“我们还不理解其中一些基础物理学，”Herlingshaw 说道。
EISCAT_3D 预计将揭开帷幕，揭示 FAE 及其他新发现的极光特征的内部运作机制。在成员国——芬兰、挪威、瑞典、中国、日本和英国的支持下，该组织在挪威安装了一个发射-接收阵列，将强大的雷达束指向高层大气，并在芬兰和瑞典安装了数千个接收天线，以捕捉电离层中自由电子散射出的微弱回波。
目前的非相干散射雷达沿狭窄的视线探测大气——Grandin 说，这就像是“在冰川中钻孔”。“你可能会错过几公里外，甚至几米外某些超级有趣的东西。”相比之下，EISCAT_3D 的三组天线阵列将如项目文档所述地“绘制天空”，构建高层大气的 3D 图像，使科学家能够在完整的空间背景下观察 FAE 等现象。“你可以开始研究整个高层大气的能量学，”Grandin 说。
Ulich 表示，除非出现“不可预见的复杂情况”，否则 EISCAT_3D 的部分配置将于今年年底投入运行——恰好能赶上太阳 11 年周期中最活跃阶段的尾声。“我们现在处于太阳活动极大期，”UNIS 的空间物理学家 Lisa Baddeley 说道，“但它很快就会开始减弱。”
EISCAT_3D 的管理人员目前正在研究如何将雷达的使用权分配给非成员国的科学家。Herlingshaw 说，他们预计需求量将很高，因为 EISCAT_3D 必然会揭示出目前无人想象到的现象。“这将是一场绝对的革命。”
定制化基因疗法获资金支持 基于一项帮助治愈一名患病男婴的突破性基因编辑治疗，美国政府将在 5 年内提供高达 $160 million 的资金，用于开发和测试针对个人疾病突变的定制化疗法。健康高级研究计划署将资助七支团队，为患有罕见且危及生命的疾病（影响骨髓、免疫系统、皮肤、心脏、大脑、肝脏、血液及血管）的儿童开发个性化 CRISPR 或其他类型的基因编辑工具。受资助者包括费城儿童医院的研究人员，他们去年设计了一种基因编辑器，修复了一名被称为 Baby KJ 的婴儿肝细胞中的 DNA 缺陷，使其免于进行肝移植。——Jocelyn Kaiser
濒危物种失去保护 唐纳德·特朗普总统的政府通过大幅削减《濒危物种法》下的栖息地保护，削弱了美国的生物多样性保护。该法禁止在未缓解的情况下“采取” (take) 列入名单的物种；几十年来，联邦机构将此理解为不仅是指杀死植物或动物，还包括通过破坏其栖息地而危及其生存。最高法院在 1995 年维持了这一解释。例如，该法律曾迫使能源公司重新规划管道路线，以保护冈尼森大草原松鸡等物种。支持者表示，这一改变将放宽开发限制并保护私有财产权。环保人士指出，栖息地丧失危及了约 80% 的濒危物种；他们将在法庭上挑战这一规则变更。——Erik Stokstad
灵长类动物保护区计划被取消 俄勒冈健康与科学大学显然已放弃了一项将俄勒冈国家灵长类研究中心转变为保护区的争议性计划。一名消息人士告诉《Science》，该大学校长上周告知教职员工领导层，由于缺乏美国国家卫生研究院的支持，该项目已宣告失败。然而，作为美国最大的学术猴类设施之一，该中心的未来仍不确定。虽然在计划公布后研究仍在继续，但来自大学和州议会的压力，以及联邦政府逐步取消猴类研究的意愿，最终可能会迫使该中心关闭或限制其研究范围。——David Grimm
这太可怕了……竟然有一个国家
改变夜晚的天空。
里贾纳大学的天文学家 Samantha Lawler 在《纽约时报》中，
就美国监管机构批准一家公司测试卫星的决定发表评论，该卫星将使用一面 18 米的镜子在夜间将阳光反射回地球。
美国研究人员对 联邦拨款管理拟议的变更表示愤怒
白宫收到 340,000 条关于相关规则的评论，许多人担心这些规则会将科学政治化
本周，美国科学界完成了对其强烈反对的登记，反对对象是唐纳德·特朗普总统政府的一项全面提案。该提案旨在加强政治控制，以决定联邦政府如何管理数万亿美元的联邦资助和合同，包括用于研究的经费。
现在，科学家和其他相关人员正在等待政府如何回应在 7 月 13 日截止日期前提交的针对这份 412 页提案的 340,000 多条评论。政府表示，希望在 10 月 1 日前敲定新指南。
5 月 29 日，当白宫管理与预算办公室 (OMB) 发布该提案时，许多研究倡导者反应惊恐。该提案除其他内容外，还将允许政治任命人员审查机构关于资助哪些科学研究的决定，随意终止资助，并禁止与中国及许多其他国家的研究合作。科学界、高等教育和患者倡导组织迅速号召其成员和盟友提交评论——显然已有数万人做出回应。
在发稿时，OMB 仅公布了其收到的 52,000 条评论，这使得人们无法评估在整体样本中，有多少评论者支持或反对这项官方称为《联邦财务援助指南》(Guidance for Federal Financial Assistance) 的变更。
然而，反对这些变更的个人评论经常使用激烈的措辞。退休科学家 Joseph Savina 写道：“如果我不是对此很了解，我会认为你们是试图摧毁美国技术优势的中国特工。”Jonathan Rameau 评论道：“作为一名在国防工业工作的物理学家，我可以自信地地说，通过这项规则将保证欧洲和中国的科学与军事主导地位延续数代。”
高等教育组织虽然措辞更为礼貌，但对联邦机构这项通常被称为“统一指南”(uniform guidance) 的新指令可能产生的后果同样感到惊恐。代表 69 所领先研究机构的美国大学协会 (AAU) 写道：“这些变更有风险破坏美国整个研究与创新系统所依赖的可预测性、稳定性、公正性和协作性。”
AAU 这份 47 页的评论是该组织 126 年历史上针对政府拟议行动最长的一篇。除此之外，它主张 OMB 没有权力让政治任命人员对哪些资助被批准或终止拥有最终决定权。AAU 声称，国会并未赋予 OMB “定义哪些类别的科学研究可以获得联邦资助；限制国会在其他方面已明确授权的国际学术合作；或将获得联邦研究资助与机构是否遵守关于民权法、科学探究以及关于国家利益的任意且政治化的决定挂钩”的权力。
鉴于 OMB 法律上要求必须回应每一条独特的评论，各团体敦促其成员避免使用格式信，并解释这些变更将如何对他们产生个人影响。评论者们提供了大量实例。
杜克大学从事儿童相关工作的视觉研究员兼临床医生 Cynthia Toth 写道，一项允许官员在资助被“认为与计划目标不一致”时突然终止资助的条款，将制造不确定性，对其招募儿童参与临床试验的能力产生“毁灭性影响”——以及
如果研究在几乎没有通知的情况下被停止，可能会让这些患者陷入危险。她写道，限制国际合作的条款将使某些治疗方法的推进变得不可能，因为她的领域规模较小，因此“临床科学家通过国际网络共同汇总病例。……按照目前的写法，这些条款将阻碍美国医学知识和医疗保健的进步。”
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支持该提案的评论者经常主张，拟议的规则将有助于政府减少浪费、欺诈和滥用。例如，参议员 Jim Banks（共和党-印第安那州）在信中谴责了“纳税人的资金如何支持了非法活动”，并坚持认为“管理与预算办公室 (OMB) 拥有明确的法律权力，可以拒绝提供联邦资金以支持这些项目”。
一些支持者承认，该提案——其中反复提到需要根除在“觉醒” (woke) 倡议（例如旨在培养多样化员工队伍的倡议）上的支出——在一定程度上是一种政治声明。“这份通知……将关闭全国范围内数百万美元用于左翼恶作剧的联邦支出，”传统基金会 (Heritage Foundation) 的 Mike Gonzalez 最近在该组织的网站上写道。“所以当然有人不喜欢它。”传统基金会的选前报告《2025计划》(Project 2025) 为特朗普政府的许多行动提供了支撑，包括其针对“觉醒”科学的运动。
OMB 拒绝了国会议员、美国大学协会 (AAU) 及其他机构延长数周或数月评论期的请求。OMB 表示，新规则将在最终确定后立即生效，且没有迹象表明它会给受助者留出准备时间——AAU 建议为 1 年。
尽管如此，科学倡导者仍希望他们的愤怒能给 OMB 施加压力，使其大幅修改最初的提案，或者说服国会进行干预。这种干预可以通过在今年的拨款法案中加入相关条款来实现，从而防止政府花费资金实施这些变更。然而，预计立法者直到 11 月选举之后才会完成这些法案的工作。
照片：ANDREW J. JOHNSON
一种杀树甲虫正向全球 城市森林扩散
随着研究人员逐步还原该害虫的全球迁徙路径，各国正努力遏制这一日益增长的威胁 ELIZABETH PENNISI
这座城市被命名为“橡树城”（Oak City）并非没有原因。 即便在十年前，南非斯特伦博斯（Stellenbosch）的街道两旁仍排列着数百年的高大英国橡树。欧洲定居者在几个世纪前将该物种引入，且该物种似乎生长旺盛。
但现在，这座城市的橡树正在枯死，它们被多食性小蠹（polyphagous shot-hole borer）摧毁。这是一种入侵性甲虫，会感染橡树及至少 600 种其他植物。雌虫会钻开一个牙签大小的孔，产卵，并向木材中接种一种能产生子实体（即甲虫孵化后的食物）的真菌。真菌和甲虫钻出的隧道会堵塞树木的导水通道，有时会导致树木死亡。“我们正在失去大量的城市森林冠层，”斯特伦博斯大学（SU）的入侵生物学家 David Richardson 说道。但损害范围远不止于斯特伦博斯。
多食性小蠹
全球的树木已经饱受多种入侵性昆虫害虫的围攻——例如白蜡像甲虫、铁杉绒蚜、欧洲云杉八齿小蠹等。但正如其名，许多害虫仅专注于单一类群的树木。而多食性小蠹则是一种全能威胁，可感染多种木本植物。更糟糕的是，仅需一只雌虫就能开始侵害，因为未受精的卵可以发育成雄虫，随后雌虫可与其交配。
这种大小如奇亚籽的昆虫原产于 中国、台湾和越南，极易潜伏在木托盘、运输箱和植物中。它不仅到达了南非，还到达了全球其他六个国家。本周发表在《害虫科学杂志》（Journal of Pest Science）上的一项研究利用遗传学工具绘制了其入侵地图并预测了未来的扩散趋势。
对于研究人员来说，还原这种害虫的全球迁徙路径极具挑战性，因为地球上分布着几种几乎相同的小蠹虫。例如，多食性小蠹（Euwallacea fornicatus）在加利福尼亚州出现十年后，加州大学河滨分校（UC, Riverside）的遗传学家对其进行了 DNA 测序，才意识到它是一个新到访者。此前，该害虫被误认为是另一种食性较低的入侵物种——茶小蠹（E. perbrevis）。“它们实在是太小且太相似了，”佛罗里达大学的森林昆虫学家 Jiri Hulcr 说道。
这项新研究带来了一些清晰的结论。一个国际研究团队搜寻了科学文献，寻找那些使用 DNA 分析来区分这两个物种的甲虫目击报告。论文作者利用遗传数据构建了家谱图，并重建了这些昆虫可能的扩散方式，追踪到每个物种从亚洲原产地向其他地区至少有六次独立的引入记录。“这项研究提供了证据，表明防止非本土昆虫迁移是多么困难，”缅因大学的森林昆虫学家 Angela Mech 说道。
该团队还研究了目前发现这些甲虫的栖息地和气候，以预测它们未来可能出现的地方。与茶小蠹相比，多食性小蠹能在更宽的温度范围和更干燥的气候中生存。
据已知，它感染了 全球 600 多种 植物。
孔钻虫（hole borer），且它似乎是一个更具侵略性的定植者。该团队预测，它最终可能会扩散到地中海部分地区、美国东南部、马达加斯加、几乎整个澳大利亚东部以及其他地区。这篇新论文的合著者、阿根廷国家科学技术研究委员会的森林昆虫学家 Esteban Ceriani Nakamurakare 表示，这种钻虫是“一场正在酝酿的完美风暴”。如果不加控制，它“将在任何站稳脚跟的地方从根本上改变生态系统结构和景观动态”。
观赏树和果树似乎尤为脆弱。例如，在南美洲，自 2020, 年在巴西首次发现该害虫以来，孔钻虫已沿 3500 公里的海岸线扩散；Ceriani Nakamurakare 及其同事发现，景观美化中常用的进口物种，如北美枫槭（box elders）和悬铃木（plane trees），是常见的宿主。目前尚不清楚原因。Ceriani Nakamurakare 指出，由于这类树木种植在公园和花园中，它们能获得充足的水分，这似乎使它们对甲虫更具吸引力。其他人则认为，压力巨大的城市环境可能会削弱树木，使其更易受攻击。Hulcr 指出，宿主“几乎从来不是健康的树木”。
然而，损害并不局限于城市森林。该物种 2012, 年进入南非后，导致了斯泰伦博舍（Stellenbosch）、开普敦和其他城市地区的树木死亡。但 SU 生态学家 Francois Roets 表示，“它现在已在南非许多原生森林中强力建立种群，并开始杀死当地的一些物种”，他认为这些森林入侵的长期后果将是“巨大的”。
在美国，这种甲虫已从最初被发现的南加州转移到了圣何塞（San Jose）地区。这引发了人们的担忧，担心它有一天可能会触及加州肥沃的中央谷地（Central Valley）的杏仁、开心果和其他作物。加州大学戴维斯分校（UC Davis）的森林病理学家 Shannon Lynch 表示：“这是一个严重的威胁”，她一直在测试加州哪些树种可能容易受影响。
各团体正在研究如何对抗该害虫的扩散。加州大学河滨分校（UC Riverside）的昆虫学家 Paul Rugman-Jones 正在探索作为该钻虫天敌的拟寄生蜂是否可用作在加州的控制手段。在澳大利亚，默多克大学（Murdoch University）的昆虫学家 Wei Xu 最近成功在实验室中养殖了该真菌与甲虫对——他希望这一进展能帮助他锁定如化学引诱剂或驱避剂等控制方法。
西班牙最大的研究机构 正面对其黑暗的过去
西班牙国家研究委员会公布了约 500 名在弗朗西斯科·佛朗哥独裁统治期间被清洗的人员的故事
1937年2月，进化生物学家 J.B.S. Haldane 发表了一封信，赞扬他在马德里国家自然科学博物馆的同事们在激烈的内战期间所表现出的韧性。他特别提到了 Antonio de Zulueta y Escolano，这位博物馆馆长是西班牙早期实验遗传学领域的领军人物。Haldane 写道，在“将生物博物馆中更为珍贵的馆藏隐藏在地下室的间隙”，Zulueta “一直在继续他关于多态甲虫 Phytodecta variabilis 的研究工作”。
然而，当 弗朗西斯科·佛朗哥 在 1939 年掌权时，Zulueta 的职业生涯被猝然中断。他的曾孙女 Concepción Cortés Zulueta 表示，他的家庭与战败的共和政府有政治联系，且他翻译了诸如查尔斯·达尔文的《物种起源》等书籍，这可能导致他立即被撤销博物馆馆长职务。在佛朗哥的法西斯政府下，“所有这些知识……都被认为是危险且堕落的”。这位科学家在 2 年后恢复了实验室教学职位，但他的研究生涯再未能起飞。
Zulueta 是数百名研究人员、教授和支持人员之一，他们的悲剧故事在本月由 西班牙国家研究委员会 (CSIC) 向公众披露。CSIC 是该国最大的公共研究机构，此次披露是根据一项 2022 年的法律，该法要求对内战及佛朗哥独裁统治的所有受害者给予更多的认可。这些人此前都隶属于研究与科学研究促进委员会 (JAE)，即 CSIC 的前身。JAE 在战争末期被佛朗哥解散，并被 CSIC 取代，以推广新政府的意识形态。
西班牙皇家科学院的一名成员在给 《Science》 的一份声明中写道。为那些遭受报复的人们正名并公开承认他们受到的迫害，“是理解西班牙科学史全部复杂性的必要步骤，也是认可那些被不公正地排除在科学领域之外的人们之必要的举措”。
JAE 由政府于 1907 年创建，由西班牙诺贝尔奖得主 Santiago Ramón y Cajal 领导，通过派遣成员出国培训并建立一个新的研究中心网络，使西班牙科学现代化。当 JAE 在 3 个十年后被佛朗哥解散时，其基础设施和公共资金被移交给 CSIC，后者是政权为了将科学与信仰重新统一并促进西班牙民族主义而创建的。科学历史学家 Ana Romero de Pablos 在 7 月 1 日的启动活动上指出，作为“一次基于审查、恐惧和社会控制的西班牙制度和科学结构的全面重构”的一部分，JAE 的人员被清洗了。
西班牙直到最近才开始处理佛朗哥主义的遗产，尽管个别研究项目关注过少数精英科学家的命运，但大多数 JAE 成员的遭遇却鲜为人知，甚至在他们自己的家庭中也是如此。为了让所有这些故事重现，Romero de Pablos 和她的同事们挖掘了 13 个关于“清洗”（depuracíon）文件的公共和私人档案，这些文件记录了 JAE 成员如何在政治、宗教和知识层面被审核是否符合佛朗哥的价值观。
由此产生的数据库追溯了 500 多名研究人员、支持和服务人员、教师及学生的轨迹。这些人因各种被认为违规的行为而遭到清洗或惩罚，从不支持佛朗哥政权，到从事与天主教教义相抵触的研究，以及举办研讨会等。
在国外，甚至仅仅是挑战文化规范——例如女性穿裤子。
最终，约 40% 的所有 JAE 成员失去了在西班牙研究领域的地位。Romero de Pablos 表示，有些人“流亡，且[有些人]接受了军事审判”，甚至在狱中死亡。其他人则不得不在学术界之外重建职业生涯。少数科学家完全重新融入了西班牙国家研究委员会 (CSIC)，但大多数被允许进入新组织的人都面临一系列处罚。根据档案记载，例如 Zulueta 曾被停职并减半发薪一段时间，随后在 1941 年被允许返回，但无法进入机构领导岗位。
该项目是一个“切实、必要且非常有前景的倡议，”瓦伦西亚大学的历史学家 Alba Fernández Gallego 说道。但她认为，数据库应该更好地区分 JAE 成员在内战后扮演的不同角色。“那些受压制的人与那些在清洗中发挥积极作用的人被列在了一起，”她说。Crespo 同意该平台应提供更多背景信息，但对它允许访问者提供评论和更正表示赞赏。
自 1975 年 弗朗西斯科·佛朗哥去世以来，西班牙国家研究委员会 (CSIC) 已经走过了很长的一段路。CSIC 主席 Eloísa del Pino 表示，在西班牙向民主过渡期间，“西班牙国家研究委员会 (CSIC) 的研究人员和职员……在设计民主政治学方面发挥了非常重要的作用”。但她认为，查明清洗期间发生了什么是一次重要的练习，“旨在让我们与过去达成和解”。
Cortés Zulueta 是一位人文研究员，她与进化生物学家在同一家博物馆工作，而那里也是她曾祖父工作过的地方。她说，像西班牙国家研究委员会 (CSIC) 平台这样的倡议，对于家庭来说是一种认可和疗愈，对于一个在过去问题上仍存在分歧的国家来说则是健康的。del Pino 表示，该项目还深刻地提醒人们，科学机构往往是独裁统治的第一批受害者。“我们必须意识到这些极权主义进程意味着什么，并且没有任何一个社会能绝对免于这些事情再次发生的可能性。”
聚焦
图片：（从左至右）D. STUART；CAVAN IMAGES/ALAMY
考古学家破译了一位 8 世纪玛雅数学家兼天文学家的签名，首次识别出这个古文明中最重要的职业成员。对于玛雅人来说，天文学和数学支撑了从农业到宗教等生活的许多方面，然而产出这些知识的人一直处于匿名状态。这位天文学家 Sak Tahn Waax（“白胸狐”）的亲笔签名在危地马拉 Xultun（靠近蒂卡尔的美洲豹神庙，见右图）的一个房间内被发现。研究人员本周在《Antiquity》杂志上报告称，该房间可能曾用于数学教学和书籍制作。签名（见左图）随附在一个用于同步玛雅历法与火星和金星运行轨道的公式中。危地马拉山谷大学的考古学家 Tomás Barrientos 表示，这是一个“非凡”的发现，它“让玛雅科学有了具体面孔”。 ——Laura Martín Agudelo
被 弗朗西斯科·佛朗哥 驱逐出西班牙研究领域的 JAE 成员比例
保护孕产妇健康的显著成效 CATHERINE OFFORD，发自 马拉威 一条不确定的道路
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这是一个安静的周一早晨，社区卫生工作者 Fanizo Simenti 到达了位于马拉威中部 Katenje 村的临时诊所。这座小型、尚未完工的砖房坐落在的一片空地上，其波纹铁皮屋顶与周围房屋的茅草顶形成鲜明对比。四间狭小的候诊室里没有家具，只有一间为孕妇预留的房间内有一个木制床架。“我们正在寻求水泥，以便能铺好地面并进行抹灰，”Simenti 说道，并指了指裸露的地面和墙壁。“如果我们能有更好的床和床垫，那就太好了。”
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Simenti 希望这个卫生站能够解决该村长期以来对便捷医疗服务的需求，尤其是孕妇的需求。他此前一直在树荫下提供产前咨询和儿童免疫等基本服务，但对于分娩和其他需求，许多母亲需要前往 20 公里外的 Khola 卫生中心（最近的政府运行设施）——在酷热或暴雨中，这段路程走起来难以忍受，且乘坐摩托车或自行车出租车前往的费用十分昂贵。
几年前，Simenti 建议社区建立自己的设施。这将为患者提供遮蔽和隐私，并且在政府的支持下，它甚至可以升级为像 Khola 那样的官方中心，配备设备并获得提供分娩援助及其他服务的许可。当地农民兼商人 Gift Banda 告诉《Science》，看到人们在前往 Khola 途中所遭受的痛苦，他深受触动并决定捐款。
[[IMG_XXXX]] 图表：V. PENNEY/SCIENCE 摄影：THOKO CHIKONDI
他说，社区决定：“让我们在这里建立自己的诊所吧。”
Simenti 估计，他们此后筹集了大约 20 million 马拉威克瓦查（约 $12,000），资金来源包括当地领导人、贸易商和一名政治人物。尽管建筑远未完工，但他已经开始在墙内照顾部分患者。一名当地母亲 Magret Banda（与 Gift Banda 无亲属关系）带着她 3 岁的女儿来到这里寻求计划生育及其他服务，并表示她现在去 Khola 的次数减少了。她还帮忙清理建筑内的地面，以免其他妇女和儿童吸入灰尘而咳嗽。
自 2025 年初以来，此类基层努力具有了新的意义。当时美国政府突然撤回了大部分外国援助，并解散了美国国际开发署 (USAID) —— 该机构曾是马拉威各地孕产妇外展诊所及其他卫生服务的主要支持者。经济学家估计，该国在那一年可能会损失超过 $170 million，美国对性与生殖健康的各种支持几乎被完全抹杀。其他外国捐助者的单独削减，以及日益恶化的燃料短缺和猖獗的通货膨胀，目前正进一步挤压该国的卫生系统。
像 Simenti 这样的项目可能是马拉威减轻这些削减影响、并将公共卫生服务带给需要的人们的一种方式。Katenje 所在的 Kasungu 区的一名官员表示，工作人员已开始鼓励其他村庄效仿这种方法；Simenti 则说，已经有卫生工作者向他寻求建议，因为他们“也希望取得类似的成就”。但这一举措也揭示了此类局部解决方案的局限性。
Kasungu 区
弥合距离 在马拉威这个拥有超过 22 million 人口的内陆国家，大多数人生活在农村地区，极端天气、糟糕的路况和燃料短缺可能会阻碍人们前往最近的卫生中心。援助削减打击了将医疗服务带到偏远村庄的努力。
赞比亚 (ZAM B I A)
Kasungu 区医院
Chidongo
利隆圭 (Lilongwe)
Salima 区
坦桑尼亚 (TA NZA N I A)
莫桑比克 (M OZAM B I QU E)
Makiyoni 卫生中心
Salima 区医院
进展 处于危急之中 由于缺乏 高质量数据， 估算产妇死亡率 一直极其困难，但 世界卫生组织及其 合作伙伴的建模 表明，自 1990 年代 以来，马拉威 的 产妇死亡率大幅 下降——尽管要达到 联合国 2030 年可持续 发展目标 (SDG) 中每 100,000 活产婴儿死亡人数 少于 70 的目标 仍有很长一段路要走。
生活成本的上升，加上 外国资助的减少，使得 人们更难以出力资助。“我们 依赖社区内人们的 [捐款]，” Simenti 说。“我们 不会强迫他们。”
马拉威 更广泛的医疗体系 目前面临类似的未知。政府官员 表示，援助的削减凸显了 对更可靠资金的需求。但 旨在筹集这笔资金的新政策—— 例如通过新税收——以及 改进医疗体系使用资金的方式， 可能需要数年时间才能见效。 如同其他应对外国援助 剧烈转变的撒哈拉以南非洲国家一样， 马拉威 处于十字路口，奥斯陆大学 政治学家 Dan Banik 表示，他 研究过援助在该地区的作用。 他说，这可能是该国将其医疗部门 “重置”为更具韧性的一个机会， 但这些努力能走多远尚不明确—— 且在过渡期间，医护人员 和患者将面临什么。
2025 年的削减凸显了 马拉威 医疗体系的深度脆弱性。 多年来，外部捐助者承担了该国 医疗支出的一半以上—— 在所有低收入国家中，这一比例 名列前茅——在性与生殖健康 等领域，比例高达 90%。 尽管 马拉威 政府支付 像 Simenti 这样的社区卫生工作者的 工资，但捐助者也资助了他们的培训， 以及药物、设备、外展诊所， 并支持医疗融资与管理。
爱丁堡大学的发展人类学家 Jeevan Sharma 表示，这些援助 （其中大部分通过非政府组织 (NGOs) 和 国际机构引导）在改善 马拉威 母亲和儿童健康方面发挥了关键作用。 例如，产妇死亡率在 1990 年代 时处于每 100,000 活产婴儿 750 到 1000 人以上之间，而 2024 年 的估计值下降至 224——远低于 撒哈拉以南非洲的平均水平（见下方图表）。 但潜在的挑战依然存在。青少年怀孕率 （这会增加母亲和婴儿的风险） 在全世界范围内处于最高水平。 糟糕的道路、恶劣的天气、燃料短缺 以及资金匮乏的设施，可能会阻碍 居住在农村地区的 80% 马拉威 人的就医。 可治疗的感染、血压疾病 和产后出血仍然是该国 产科病房的主要杀手。
这种压力在二级医疗机构中清晰可见， 例如卡松古地区医院 (KDH)， 这是该区首府的一组低矮建筑。 在这个周一的早晨，人们排成的长队 一直延伸到停车场；母亲们在 地板上给婴儿喂奶，护士们推着 担架穿过拥挤的走廊。孕妇 通常很晚才到达这里，因为她们 不知道何时寻求帮助，且在前往 医院的过程中十分艰辛。 卡松古卫生与环境服务主任 Emmanuel Golombe 表示，一旦到达这里， 她们会面临进一步的延迟：他 见过紧急剖腹产手术被推迟， 因为医院唯一的手术室 被非产科患者占用。“母亲 必须等待，”他说。“有时这会 导致并发症——也许是子宫破裂， 也许是胎儿死亡。”
马拉威 80% 置信区间 撒哈拉以南非洲 世界
产妇死亡率（每 100,000 活产婴儿死亡人数）
2030 年 SDG 目标：少于 70
1985 1990 1995 2000 2005 2010 2015 2020 2025 0
去年的削减影响了由捐赠者资助的项目，而这些项目原本减轻了医院及其服务的农村社区的压力。其中就包括 MOMENTUM，这是一个由 USAID 资助的 $80 million 项目，用于采购设备、支持卫生工作者培训，并资助医院工作人员前往偏远社区提供计划生育、产前咨询及许多其他服务。Amref Health Africa 是一家获得了其中 $28 million 资金的国际非政府组织，据其估计，在 MOMENTUM 被砍掉之前，该项目在其工作的五个地区支持了 1500 多个诊所，覆盖了超过 50 万人。来自其他国家的削减可能会使情况进一步恶化。例如，英国计划将援助资金削减 40%，这威胁到了生殖健康领域的重大计划。Golombe 等人表示，他们正在等待了解这些削减具体将对他们的设施产生什么影响；一项英国政府的评估预测，这将导致 250,000 名马拉威人无法获得计划生育服务。
这种中断引发了人们对马拉威可能会失去来之不易的成果的担忧，马拉威国家护士和助产士组织等团体已警告产妇死亡率可能会上升。但这也引发了变革的呼吁。“我们一直如此依赖合作伙伴……以至于当合作伙伴收手时，我们的医疗体系立即就瘫痪了，”马拉威计划生育协会执行主任 Donald Makwakwa 说道。他的组织在 2017, 年就已经失去了 USAID 的资金，当时唐纳德·特朗普的第一任政府阻止了对提供或倡导堕胎护理组织的资助，并在 2025 年再次受到打击。“目前发生的事情不应仅从负面角度来看待，”Makwakwa 说。“这是一个跳板，让我们重新思考作为一个国家应该如何为我们的医疗保健提供资金。”
在马拉威规模庞大的首都利隆圭，官员们正匆忙应对 USAID 的撤出。“没有人预料到这一点，”Andrew Likaka 说道，他在一名新任……后成为了卫生部的卫生服务主管。
致谢：（图表）V. PENNEY/SCIENCE；（数据）2000 至 2023, 年产妇死亡率趋势，世界卫生组织 (2025)
马拉威政府在去年年底上台。“我们迅速坐下来重新规划如何在没有 [失去的] 捐赠者、没有非政府组织（NGO）的情况下开展工作。”
其中一种方法是试图提高医疗保健的效率——例如，将艾滋病（HIV）的预防和治疗与生殖保健等服务相结合。但这些努力能起到的作用有限。该部生殖保健服务主任 Owen Chikhwaza 表示：“我们可以尽情优化，但这还远远不够。我们需要实际的资金来支持医疗保健。”
官员们表示，短期内，这部分资金大部分仍需来自外国和慈善家。但他们希望改变资金进入马拉威医疗系统的方式。由于对腐败和管理不善的担忧，捐赠者倾向于通过非政府组织和国际机构拨付资金，绕过了马拉威政府。Likaka 等人认为，这种方法导致了卫生工作的重复，与政府优先事项协调不足，且在高薪和其他管理费用上产生了不必要的开支。他们表示，直接付款将避免这些问题，并有助于马拉威在长期内更加独立。
许多全球健康专家支持这一想法。全球发展中心（Center for Global Development）的政策分析师 Katherine Klemperer 表示：“直接向马拉威政府提供财务支持……将大幅降低成本，并……使政府能够发展自身能力，使其在面对未来的援助冲击时更具韧性。”
到目前为止，最实质性的直接协议是今年早些时候与美国签署的。根据谅解备忘录，美国政府将在接下来的 5 年内向卫生部门提供 $792 million，而马拉威则承诺将其自身的卫生支出增加 $143 million。（其他 30 多个国家也签署了类似的备忘录，预计美国资助总额约为 $14 billion。）尽管当地组织呼吁透明化，但该协议的细节仍被严格保密；美国与邻国的交易曾因允许美国获取矿产和健康数据的条款而受到严厉批评。但 Likaka 坚称，马拉威自己的协议保护了公民的利益和机密性。他说：“我们为国家做出了最好的选择。我们基于国家利益达成了协议。”
马拉威还在加速执行前任政府制定的计划，旨在提高并在国家境内更好地管理资金。政府已经提高了某些所得税、商品税和服务税，并引入了电子税务申报系统以提高征收效率。议会健康委员会正在推动对酒精等产品征收额外的“罪恶税”以及设立公路收费站。该委员会主席 Anthony Masamba 表示，收益应进入一个特殊的“国家健康基金”，以确保资金不被挪用到其他部门。
照片：THOKO CHIKONDI
Elicy Langton（中间），一名学生护产师，正在马拉威卡松古区医院（Kasungu District Hospital）的产后病房照顾产妇及其新生儿。
没有轮子的救护车被停在马拉威的萨利马地区医院 (Salima District Hospital) 外。该医院的车辆中仅有 5 辆在运行，这对需要紧急护理的母亲们造成了严重后果。
赋予医疗机构更多自主权以筹集和管理自有资金的计划也在进行中。例如，像 KDH 这样的地区医院被要求开设新的付费病房，在为患者提供更多空间和隐私的同时，为其他人的护理提供补贴。基层卫生中心正开始接收来自政府的直接资金，绕过了地区层级的延迟和官僚程序，帮助中心在需要时购买所需物品。Likaka 还希望私人投资者和医疗服务提供者能发挥更大作用。
Chikhwaza 主张，政府的工作已经产生影响，并最终将使马拉威的卫生部门处于更好的地位。他说，在经历去年的动荡之后，“我们已经重新振作起来”。
卫生倡导者则更为谨慎。马拉威卫生公平网络 (Malawi Health Equity Network) 的执行主任 George Jobe 表示，尽管大多数非洲国家都有数十年前的承诺要将预算比例提高到 15%，但卫生部门获得的国家预算仍然低于 10%。该网络代表了该国约 200 个组织，并为政府提供预算分析支持。尽管 Jobe 支持政府的许多改革，但他警告说，这些改革必须公平地实施——例如，不能通过税收进一步挤压挣扎中的社区，或者通过付费病房加剧不平等。他说：“弱势群体和贫困人口绝不能成为受害者。”Makwakwa 表示赞同。他说，增加国内资金投入已是“刻不容缓”，但“这些资源的筹集方式绝不能是对公民的惩罚”。
在利隆圭 (LILONGWE) 郊外，当地官员和卫生工作者表示支持政府的努力，但补充说，此类措施带来的收益目前并不均衡。KDH 在去年年底开设了一个付费病房，据报道在最初 6 个月内创造了近 $100,000 的收入。工作人员坚称，这并未损害非付费患者的护理。相反，他们表示，额外的收入帮助偿还了医院的部分债务，并在政府资金延迟到位期间提供了缓冲。Golombe 称，医院最近利用这笔收入购买了关键药物，包括可用于保护早产儿肺部的地塞米松，以及用于剖腹产患者的止痛药哌替啶。
Jaison Banda 是一名 KDH 的社区卫生护士和家庭计划协调员，他表示，外展服务已变得罕见，母亲们正在为此付出代价。Emily Mvula 住在 KDH 西部的一个村庄，她在 2025 年生了第三个孩子，就在 MOMENTUM 突然终止后的几个月。她在最后几次产前检查中花费了 $9 来旅途 15 公里的路程前往 KDH，这笔钱并非每个女性都能负担得起。现在她说，她在获取计划生育服务方面面临困难。她有时会带着小女儿去一个由天主教会运行的中心，步行约 2 小时，但那里会对部分服务收费且不提供避孕药。她希望外展诊所能够回归。
赋予基层卫生中心更多自主权的计划也面临挑战。Makiyoni 卫生中心是位于萨利马地区卡松古 (Kasungu) 东部的一家农村医疗设施，同样受到 MOMENTUM 终止的影响。该中心现在接收政府直接拨款，但仍无法满足诊所的需求。这里的工作人员表示，他们去年申请了 $20,000 用于关键的改进，例如修补产房天花板的漏洞、翻新破旧的厕所，以及更换寿命不长的太阳能灯。
照片：THOKO CHIKONDI
……彻夜工作，有些婴儿只能在手电筒的照射下出生。负责监管产科病房的护理主任 Issah Omar Nicks 表示，他们得知自己被分配到的资金不足 $4000，而且直到 6 月底才能拿到这笔钱。他补充说，厕所的施工才刚刚开始。
Nicks 和他的团队在此期间一直在探索其他筹款方式。他说，他们去年开始开辟了一块菜园，一直在种植并销售土豆。对于负担得起的人，他们还会收取约 $0.60 的健康护照费用——这是一种通常由卫生部颁发的纸质手册，用于记录患者数据。（官员们告诉《Science》，Makiyoni 并不是唯一这样做健康中心的，但这些收费存在争议，因为护照对于追踪个人健康状况至关重要。）Nicks 估计，在过去的 2 年里，该病房的这些举措总共筹集了约 $450。
这些资金帮助支付了清洁用品以及用于记录的药品和文具。但它们无法解决该设施及其他农村医疗机构面临的一些最严峻的挑战。特别是患者的转运已成为每日的挣扎，因为许多地区救护车由于缺乏维修或燃料，在停车场里处于无轮状态。Nicks 讲述了一位母亲的故事，他们最近试图在一次困难的分娩过程中将她转运至 Salima 地区医院。他们等待救护车 2 小时，直到一名当地政治家介入后，救护车才到达。他说，那位母亲最终被转运了，但她和婴儿都没有幸存。
工作人员希望一种名为 m-mama 的系统能带来帮助。该系统由 Vodafone 基金会及其合作伙伴于 2013 年创建，它将紧急呼叫与私人车辆所有者连接起来（类似于医疗版的 Uber），以便快速将妇女和新生儿送往医疗设施。m-mama 已经在其他一些撒哈拉以南国家运行；Vodafone 和其他捐赠者正在投入约 $10 million 在 马拉威 启动该项目。
m-mama 提示了外部支持可以持续的一种方式：由捐赠者帮助建立服务，随后由政府接纳，并由私营部门协助交付。Vodafone 的 m-mama 全球总监 Lee Wells 表示，该系统的设计目标最终由“国家政府拥有、运营并资助”，而成本仅为传统救护车的一小部分。启动日期曾引起一些混乱——Salima 和 Kasungu 的卫生工作人员表示，他们原以为该服务从 1 月起就开始提供——但 Wells 表示，五个地区应在 9 月份获得 m-mama，而那两个地区将在次月加入。
其他捐赠者正在探索支持 马拉威 医疗卫生状况的不同方式。Amref Health Africa 最近收到来自 UNITAID 的资金，后者是一家主要通过对机票征收特别税来资助的机构。这笔资金将用于一项为期 4 年的计划，旨在提高孕产妇药物和诊断服务的可及性。Amref 在 马拉威 的国家主任 Hester Mkwinda Nyasulu 认为，在政府服务有限的社区中，非政府组织 (NGO) 将继续发挥尤为重要的作用。他与 Jobe 希望看到政府与 NGO 达成自己的协议以帮助填补空白。Nyasulu 表示：“如果我们能很好地互补，我们将能够覆盖更多的人。”
Banik 表示，从这些不断变化的关系中产生的新医疗体系可能与以往截然不同。“我们正处于旧秩序与新秩序之间的阶段。我们并不真正知道那个新阶段会是什么样子，但它肯定不会是回归过去。”
PHOTO: THOKO CHIKONDI
在政策制定者和倡导者就这一过渡进行辩论的同时，卡滕杰（Katenje）的工作仍在照常进行。周二早晨，临时诊所内的地面已被清理干净，天花板上悬挂着一个体重秤，一张蓝色的小桌子安置在一侧，上面放着一本打开的登记簿。西门蒂（Simenti）通常在大多数周二提供家庭计划咨询，但今天他首先为当地学校的幼儿进行营养不良筛查。就在上午 8 点刚过，数十名儿童在照顾者的陪同下抵达。西门蒂试图安抚几个哭泣的孩子。“他们以为我要给他们接种疫苗，”他说。
KDH 的班达（Banda）搭乘《科学》杂志的便车前往卡滕杰，视察建设进展。他说，这座建筑规模较小，如果政府想将其升级为正式的基础卫生中心，周围也没有多少空间。尽管如此，他看到了希望。这里地理位置优越，周围人口众多，且附近没有其他中心。他说，该社区在争取政府支持方面具有很强的说服力。
目前，该项目缺乏资金，就像马拉威 许多医疗服务计划一样。西门蒂希望资金能从某些渠道——当地捐助者、非政府组织或慈善家——筹集到位，以帮助完成已启动的工作。但即使是在过渡期，看到卫生站被投入使用，他仍感到自豪。他说，对于这里的人们来说，建造这座建筑是一项巨大的投入。“现在是时候为他们提供服务了。”
[[IMG_XXXX]] 乔伊斯·查武拉（Joyce Chavula，中）和其他母亲们在马拉威卡滕杰卫生站的营养筛查期间，看着社区卫生工作者法尼佐·西门蒂（Fanizo Simenti，左）为孩子们称重。
I
淋巴结
TLSs 是可诱导而非经典静态的免疫结构，形成于自身免疫后遗症、移植器官排斥、微生物感染以及癌症等慢性炎症部位 (3–5)。然而，尽管此类关联表明其在增强或维持 TLSs 内部观察到的 B 细胞和 T 细胞反应中发挥作用，但相互矛盾的观察结果、根深蒂固的教条以及纯粹的科学惯性，使得人们无法直接接受其在放大局部适应性反应中具有免疫刺激作用的观点。即使是经典的教科书《Janeway 免疫生物学》也仅对 TLSs 进行了极少量的提及，这凸显了该领域长期以来在何种程度上忽视了这些关键结构的相关性 (6)。
Mattiuz 等人的研究路径可以说始于癌症免疫治疗革命之前，一项针对 74 例早期肺癌患者的开拓性组织学研究 (7)。通过特定的肿瘤浸润树突状细胞亚群的存在来识别并量化 TLS 形成证据的患者，与没有 TLS 形成证据的患者相比，表现出统计学上更优越的临床结果。这一观察结果预示了随后的发现，即在免疫检查点抑制剂疗法（该疗法“释放” T 细胞以攻击癌细胞）背景下，可诱导的 TLSs 发育可能是临床结果积极的一个强有力的预测指标 (8–10)。这一见解将 TLSs 转化为临床从业者和肿瘤免疫学这一庞大新群体的操作对象，进一步强调了那些不再仅仅是观察结果的关键功能属性。这些见解促使该领域的一些研究人员思考，对 TLSs 更深入的理解是否能使免疫检查点抑制剂疗法更加成功，并使其适用于更广泛的癌症患者和肿瘤适应症。
Mattiuz 等人利用现代空间测序技术、具有信息量的模型肿瘤系统以及混合骨髓嵌合实验方法，严谨地确立了谱系定向的 1 型常规树突状细胞 (cDC1) 在 TLSs 形成中的核心作用。在一种基因工程改造为缺乏 cDC1 亚群的肺癌小鼠模型中，肿瘤中的 TLS 形成几乎完全被消除。值得注意的是，作者证明了——
[[IMG_XXXX]] （图注内容）： 伴有淋巴结的肿瘤 三级淋巴结构 (TLS) 的形成涉及 1 型常规树突状细胞 (cDC1s) 从肿瘤迁移至肿瘤引流淋巴结，
cDC1
并在那里与 T 细胞一同被激活。两种细胞类型随后迁回肿瘤，以支持 TLS 的发育和维持。
早期阶段 (~第 0 到 8 天) 晚期阶段 (~第 8 到 9 天起)
持续的 肿瘤 抗原
cDC1s 迁移 至肿瘤引流淋巴结
1 肿瘤驻留细胞捕获肿瘤抗原
淋巴结（现为可选）
幼稚 T 细胞
2 幼稚 T 细胞在肿瘤引流淋巴结中被启动
细胞吸引 分子
4 5
3 激活的细胞 迁移至肿瘤
T 细胞 滤泡
血管
4 细胞吸引分子
B 细胞 滤泡
图表：A. MASTIN/SCIENCE
5 已建立的 TLS （自我维持）
通过使用一个巧妙的谱系追踪系统 (11)，证明了在三级淋巴结构 (TLSs) 中积聚的 cDC1s 来源于共同的树突状细胞前体，而非循环单核细胞，进一步阐明了谱系定型的 cDC1s 在启动和协调 TLS 驱动的抗肿瘤免疫反应中的核心作用。
尽管长期以来人们已经了解到 cDC1s 对于抗肿瘤免疫的建立是不可或缺的 (12–14)，但 Mattiuz 等人现在描述了一种比之前认知的更深层次的依赖关系。作为一种具有特定功能特性的专业抗原呈递细胞亚群，cDC1s 被认为能产生大多数抗肿瘤细胞毒性 T 细胞，因为它们能够将来自外部环境的抗原直接呈递给肿瘤反应性 T 细胞——而其他常规树突状细胞亚群无法可靠地执行这一功能 (15)。Mattiuz 等人还确定了 cDC1s 对于诱导性 TLSs 的形成是不可或缺的，而这些 TLSs 似乎对于基于免疫的抗肿瘤反应至关重要。在机制上，作者表明，从肿瘤引流淋巴结迁移的 cDC1s 也是癌症组织中 TLS 形成所必需的。此外，作者表明，与次级淋巴结类似，有组织的 TLSs 通过分泌 cDC1s 表达的 C-C 基序趋化因子受体 7 (CCR7) 的配体，来吸引来自肿瘤引流淋巴结的 cDC1s。其他关键细节也通过实验确定，最显著的是，TLS 的组织 T 细胞在迁移前首先在肿瘤引流淋巴结中被启动。然而，一旦 cDC1s 和 T 细胞从肿瘤引流淋巴结发出并迁移到 TLS 组织部位，TLS 便成为一个独立的、自我维持的结构，不再需要淋巴结的输入，而是通过局部抗原呈递来维持自身（见图）。该机制表明，TLSs 可能会无限期地维持自身，直到抗原不再存在为止，例如在癌症免疫治疗背景下的肿瘤消退。
Mattiuz 等人的发现进一步巩固了局部抗肿瘤免疫对 TLSs 发展的依赖性。然而，这一作用未必是这项工作具有持久重要性的决定性因素。此前，TLSs 仅在描述性上被表征，且与免疫相关现象具有良好的相关性，但对其潜在机制缺乏实质性的洞察。现在，Mattiuz 等人巧妙地描述并证明了这一机制，该领域可以据此开发转化性假设，最终可能扩大癌症免疫治疗的覆盖范围并挽救更多生命。
参考文献与注释
致谢 W.K.D. 感谢美国国家卫生研究院 (National Institutes of Health) 资助项目 2R01-AI127387 的支持。 W.K.D. 声明持有 Diakonos Research, Ltd. 的股份；获得来自 Diakonos Oncology Corporation 的财务报酬；以及在 2015 到 2020 年期间与 APAC Biotech, Pvt, Ltd. 存在财务关系。
10.1126/science.aei9741
寻回失落的 起源
综合证据有助于精准推断埋葬在圣海伦娜岛上的非洲奴隶的起源地
F
圣海伦娜岛是一个位于南大西洋的小岛，距离非洲西海岸 1800 公里以上。在 1840 和 1867 年之间，它被用作由英国皇家海军拦截的奴隶船上获救非洲人的安置点。被带到该岛的人员中，近三分之一在登陆后不久便死亡 (2)。直到 2008 年，在机场建设前的一次常规挖掘中意外发现了一处墓地，出土了 300 具以上的骸骨 (3)，此前关于这些个体的考古证据十分有限。肢体位置的紊乱表明，这些获救的非洲人被快速埋葬，且大多数没有棺材。部分坟墓中包含多个个体，且死者中约有三分之一是儿童。骨骼和历史证据表明，死因与坏血病、痢疾、脱水以及与“中间航程”相关的暴力行为有关。
部分坟墓中包含的物品暗示了非洲贸易网络的地理分布。例如，玻璃珠通过从地中海延伸至整个大陆的远程贸易路线，在撒哈拉以南非洲广泛流通 (4)，从大津巴布韦 (5) 到约鲁巴人的伊费 (IlÈ-Ifẹ̀) 城 (6)——在那里，工匠们数世纪以来一直在冶炼并加工金属工具和艺术品 (7)。随着跨大西洋奴隶贸易的加强，西非一些最大的城市中心成为了达荷美和奥约等扩张国家的首都。这些地区卷入了奴隶贸易，将俘虏从内陆转移到大西洋港口，以换取纺织品、金属、枪支、酒精、烟斗和陶瓷等物资 (8)。在西非内陆，用铁制工具开凿的地下避难所可能在这一时期的奴隶袭击中为家庭提供庇护 (9)。
这一历史地理背景帮助 Wang 等人解读了埋葬在圣海伦娜岛个体的锶同位素特征。历史记录表明，许多非洲人是从中非西部的港口出发的，而古 DNA 则揭示了他们与现今安哥拉和刚果盆地人群的亲缘关系。结合语言学证据，这些数据表明墓地中代表的个体来源多样。Wang 等人对 152 个体进行的同位素数据进一步支持了这些可能的区域
童年居住地，以及对于锶同位素 (87Sr/86Sr) 比值极高的人员，其来源地多样，分布于非洲南部。同样地，在南非，对被荷兰东印度公司奴役的人员进行的同位素分析揭示了多样化的地理来源 (10)。
从牙釉质整体测得的 87Sr/86Sr 比值最终只是一个数字，它反映了地质、生态、饮食和人类行为的综合结果，而非一个具体的地理位置。这一局限性的早期证明来自南非的 Swartkrans 地区，在半径 15-km 范围内采集的植物样本，其 87Sr/86Sr 值范围约为 0.727 到 0.756 (11)。这种局部差异与大陆尺度同位素景观模型中西非和中非大范围地区的值范围相当 (12)。研究人员以不同方式应对这一局限性。一种是技术手段：激光剥蚀法可以测量牙釉质的微细尺度变化，记录童年和青少年时期的居住地迁移。另一种则是提出不同的问题，例如利用同位素变化来识别性别偏向的流动性，并推断古代的亲属关系实践 (13)。人们还可以使用 87Sr/86Sr 比值来验证来自其他信息的假设 (14)。
Wang 等人将这种多证据方法应用于 圣海伦娜岛 的个体，其 87Sr/86Sr 比值范围约为 0.713 到 0.773，大多数集中在 0.712 和 0.730 之间。单就这些数值而言，它们与西非和中非大范围内的许多地点一致 (12)。然而，有几名个体的 87Sr/86Sr 比值较高，更具体地与安哥拉内陆地区、刚果盆地和津巴布韦相关。没有任何一个数值与在 圣海伦娜岛 本土度过童年相一致，该岛主要由基性玄武岩组成，其 87Sr/86Sr 值约为 0.703。结合历史记录、古 DNA 和大陆尺度同位素景观模型，同位素数据指向西中非，特别是今天的安哥拉及其邻近地区。对 41 人的早形成齿和晚形成齿的比较进一步揭示了他们在被捕获前的童年迁移。这些发现共同支持这样一种重建结果：许多被俘者来自西中非海岸线几百公里以内，而另一些则来自更远的内陆。
Wang 等人证明了锶同位素分析比一代人前变得更加精确、便捷且应用广泛，从而实现了大陆尺度的同位素景观绘制以及日益复杂的人类流动性重建。然而，这项研究更广泛的启示是，没有任何单一数据集是充分的。额外的同位素系统、化合物特异性同位素分析、残留物、古 DNA、病原体基因组、微生物多样性、口述历史、语言学、档案记录和考古材料，每一个都可以进一步缩小可能性的范围。通过这些方法的结合，我们可以以不断提高的分辨率追踪过去的生活，并为后代找回部分失落的历史。
参考文献与注释
Univ. Press, 2014). 9. J. C. Monroe, Am. Sci. 99, 400 (2011). 10. L. M. Kootker, L. Mbeki, A. G. Morris, H. Kars, G. R. Davies, PLOS ONE 11, e0157750 (2016). 11. A. Sillen, G. Hall, S. Richardson, R. Armstrong, Geochim. Cosmochim. Acta 62, 2463 (1998). 12. X. Wang et al., Nat. Commun. 15, 10891 (2024). 13. A. Mittnik, R. A. Bentley, Camb. Archaeol. J. 36, 172 (2026). 14. B. L. Beard, C. M. Johnson, J. Forensic Sci. 45, 1049 (2000).
10.1126/science.aej4801
清理衰老器官
一种前列腺素阻止巨噬细胞清除衰老器官中的有毒中性粒细胞
H
氧脂类（Oxylipins）是具有极强效力、局部作用且丰度较低的生物活性脂质。它们包括前列腺素 (PGs)、白三烯、大麻素及相关化合物。这些物质具有截然相反的效果，包括促进或抑制炎症，并差异化地调节血管张力、细胞增殖和血栓形成。氧脂类在免疫细胞上大量表达。事实上，PGE2 已成为一种免疫检查点，通过其四个受体中的两个——EP2 和 EP4 来介导淋巴细胞耗竭 (2)。目前，在癌症临床试验中，研究人员正在评估抑制 PGE2 合成或阻断其作用作为常规免疫检查点抑制剂辅助手段的实用性。
尽管淋巴细胞产生氧脂类的能力极小，但巨噬细胞可以大量产生这些物质，尤其是 PGE2 和血栓素 (Tx)A2。除了作用于局部微环境中的细胞外，PGE2 还可以改变巨噬细胞的分化、吞噬能力和迁移 (3)。然而，关于巨噬细胞亚群如何参与氧脂类生物学过程的了解相对较少。
Tan 等人在小鼠研究中表明，PGE2 通过在衰老驻留巨噬细胞上表达量逐渐增加的 EP2 产生作用，削弱了这些细胞通过一种名为“胞葬作用”（efferocytosis）的清除过程来禁用衰老中性粒细胞的能力（见图）。这一点在肝脏（库普弗细胞）、脾脏和骨髓来源的组织驻留巨噬细胞 (TRMs) 中最为显著。
TRMs 是一种丰度极高的巨噬细胞亚群（在脑、肝、肺和肾中占比 60 到 90%）。它们起源于卵黄囊，整合到发育龛中，且具有持久性，随着动物年龄的增长而累积代谢和炎症损害。它们通过短寿命的单核细胞来源巨噬细胞 (MDMs) 的转化来补充，MDMs 在出生后源自骨髓造血干细胞，并以组织依赖的方式从血液循环中不断补充。
为了探讨其观察结果的功能性后果，Tan 等人选择性地删除了表达 CX3CR1（C-X3-X 基序趋化因子受体 1，一种标志物）细胞中的 EP2，该标志物用于 1
衰老 中性粒细胞
驱动跨器官衰老 组织驻留巨噬细胞 (TRMs) 通过清除衰老的中性粒细胞来防止其产生毒性影响。前列腺素 E2 (PGE2)–EP2 受体信号通路的增加会通过抑制整合素来停止这种清除作用（胞葬作用）。 减少 EP2 信号传导挽救了小鼠的器官衰老。
无吞噬与清除
EP2 PGE2
AC，腺苷酸环化酶；AMP，腺苷一磷酸；cAMP，环腺苷酸单磷酸；NET，中性粒细胞胞外陷阱；PKA，蛋白激酶 A；TFs，转录因子。
TRMs。由于 CX3CR1 在 MDMs 中仅有少量表达，他们还通过驻留标记物 TIM4 (T 细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域含 4) 的表达对细胞进行了分层，并确认了表达 EP2 的巨噬细胞比例从所有巨噬细胞的 ~80 降至 40%。这反映了 TRMs 的大幅减少。
降低 TRMs 中的 EP2 表达挽救了小鼠的多种年龄相关表型。炎症的全局指标、空间和情景记忆、肌肉力量与衰弱、左心室收缩功能受损、僵硬度以及纤维化均恢复到了年轻健康动物的特征状态。关于这种广泛生理转变潜在原因的一个重要线索由免疫细胞表达的蛋白质范围提供，该范围随年龄而变化。这种依赖于年龄的蛋白质组重塑在 EP2 表达 TRMs 被清除的动物中也得到了恢复。这指向了肝脏——与肺和大脑相反，肝脏中的 TRMs 随年龄增长而显著减少（从巨噬细胞的 75 到 80% 降至 55%），但在 EP2 表达 TRMs 数量减少的老龄小鼠中得到了恢复。
对老龄小鼠肝脏的单细胞 RNA 测序将注意力转向了中性粒细胞。对这些寿命最短的免疫细胞进行聚类分析识别出四个子集，其中名为 Neu2 和 Neu3 的两个子集，在老龄野生型小鼠中的比例分别从年轻小鼠的近乎缺失增加到了 50 和 30%，但在 EP2 表达 TRMs 较少的小鼠中则没有这种情况。警报素（激活免疫反应的肽）的释放、细胞周期停滞以及衰老相关分泌表型 (SASP) 与 Neu2 细胞相关，而 DNA 损伤、中性粒细胞胞外陷阱 (NET) 形成和程序性细胞死亡（凋亡）则是 Neu3 细胞的特征。所有这些都表明，中性粒细胞在老龄化特征性炎症组织损伤中（在无感染的情况下）发挥着主要作用。TRMs 通过胞葬作用清除衰老、凋亡和受损的中性粒细胞来抑制这一过程。Tan 等人表明，TRMs 中的 EP2 信号通过损害转录控制、$\beta 2$ 整合素激活以及器官内的吞噬后清除，破坏了老龄小鼠肝脏、脾脏和骨髓中衰老中性粒细胞的胞葬作用。在 EP2 表达 TRMs 被清除的动物中，年龄相关的衰老中性粒细胞累积、NET 介导的组织损伤以及旁分泌炎症和纤维化应激均得到了挽救。
旁分泌 应激
图表：N. BURGESS/SCIENCE
这些发现的转化意义是什么？尽管 Tan 等人表明，在人类肝脏中 EP2 和 EP4 的表达随年龄（和疾病）增加而增加，但涉及的信号通路尚未
脱颗粒 器官
NET 形成（NETosis）
还有几个其他问题值得考虑。 在救援实验中仅使用了一种 EP2 拮抗剂。EP2 和 EP4 的激活在配体诱导的下游信号激活和淋巴细胞耗竭介导方面有一定的重叠，但在其他方面则有所不同。在免疫检查点阻断的背景下，在小鼠模型中，同时缺失或拮抗这两种受体似乎比仅缺失其中任何一种都更有效。这包括缺失一种或两种受体对免疫治疗中使用的嵌合抗原受体 (CAR) T 细胞（经工程化以表达所需的 CAR）的生存能力和肿瘤浸润能力的影响 (4)。目前已有针对 EP2、EP4 或两者的选择性拮抗剂 (5)。另一个问题是 EP2 或 EP4 拮抗是否会引发配体 (PGE2) 产生的补偿性增加，从而通过 EP1 (6) 放大疼痛和炎症，或通过 EP3 (7) 促进血小板激活和血栓形成。在考虑针对老龄人口的预防策略的治疗指数时，这两点都至关重要。
一个开放性问题是激活衰老 TRM 所表达的 EP2 的 PGE2 来源。它是由环氧合酶 1 或 2 的活性衍生而来的吗？它可能由 TRM 自身产生，但其他免疫细胞或相邻的肝细胞或成纤维细胞也可能是来源。目前尚不清楚阻断 EP2 对其他免疫细胞会有什么影响。肿瘤微环境中中性粒细胞上 EP2 和 EP4 的激活会诱导促炎表型 (8)，这可能促进或抑制肿瘤；PGE2 还会促进关节炎中的中性粒细胞迁移，进一步导致关节恶化 (9)。然而，PGE2 可能会抑制破坏性的中性粒细胞 NET 形成 (10)。EP2 还作为调节性 T 细胞的负调节因子，从而增强它们在炎症性肠病中的保护作用 (11)。
Tan 等人的发现可能延伸至 PGE2 之外。氧脂类是强效的免疫调节剂，其产生部位和环境各不相同 (12)。正如其他氧脂类在肿瘤生物学中被发现是检查点一样 (13, 14)，理解它们对衰老的贡献可能会为更健康的衰老开启新的可能性。
参考文献与注释
在衰老的全基因组关联研究中出现。值得注意的是，这在其他环境（如心血管疾病和哮喘）的氧脂类信号通路中也基本成立，在这些环境中，阻断特定的通路蛋白具有临床疗效。正如 Tan 等人所指出的，一个显而易见的问题是，衰老的人类 TRM 在衰老中性粒细胞的胞葬作用 (efferocytosis) 方面是否存在缺陷，如果存在，是否可通过 EP2 拮抗来挽救。
10.1126/science.aei9816
将放射性分子带到实验台前
紧凑的放射性分子源可实现对基础物理的新测试 Luke Caldwell A
原子和分子中的电子可以占据不同的能级。通过测量驱动这些能级之间跃迁的光频率，研究人员可以以极高的精度确定其能量差。由于这些能量差取决于电子与原子核的相互作用，它们提供了探测核结构的灵敏手段。
孤立原子中的电子轨道通常关于原子核高度对称。这种对称性意味着来自原子核相反方向的贡献可能会相互抵消，使得某些核特性在原子光谱中难以或无法被观察到。在分子中，来自相邻原子的吸引或排斥会扭曲目标原子核周围的电子云形状，从而打破这种对称性。原子核的不同区域不再被平等地采样，使得更广泛的核特性变得可观测，包括核结构的细微畸变以及违反对称性相互作用的特征。
可观测到的核效应对电子的影响强度随着原子或分子内原子核尺寸的增加而迅速增长。重核包含更多的质子和中子，增加了许多核效应的规模。与此同时，重核较大的正电荷将电子拉入结合得更紧密的轨道。由于这些电子在靠近原子核的地方停留的时间更长，与轻核物种相比，核效应在电子云上留下的印迹更大。许多重核具有放射性并表现出独特的结构。大多数稳定核基本上呈球形，而与之相对，正是那些使放射性同位素处于衰变边缘的集体核物理效应，可能导致它们采取强烈的形变形状。在某些情况下，原子核会变成梨形，从而显著放大违反对称性效应的可观测光谱特征 (3)，有可能揭示新的物理学。
Conn 等人证明了在与标准大学实验室兼容的紧凑低温装置中，可以生产、冷却并检测放射性分子，例如氟化镭、氢氧化镭和单氘氧化镭。一种含镭盐与木糖醇（一种用于制作口香糖的天然甜味剂）混合，然后形成一个含有 10 到 50 µCi 镭-226 同位素的固体。该样品的放射性低到可以在许多研究大学的辐射安全框架内进行管理。放射性样品在填充了氦气的铜室中被冷却至 4 K。重复的激光脉冲使样品表面的部分物质汽化，引发化学反应以形成含镭分子。这些放热化学反应使得
生成的分子内部处于高温状态，其能量分布在许多能级上。与 4 K 下周围氦原子的碰撞迅速冷却了含镭分子，使其仅保留在少数几个转动和振动状态中。最终生成的分子仅占据极少数的能级，从而使其更容易被控制和研究。Conn 等人利用激光测量了这些此前未被探索的分子的性质（例如转动惯量），掌握这些知识是利用激光操纵分子或将其用于精密测量的重要前提。
尽管 Conn 等人的方法扩展了产生放射性分子的来源，但冷放射性分子的频繁碰撞...
与氦气结合的分子限制了可用于精密测量的观测时间。在过去的十年中，其他研究小组已将在类似源中产生的稳定分子（例如氟化钙和氟化锶）提取到超高真空环境中，在那里的观测时间可以比 Conn 等人 (4) 的时间长得多。这使得对分子的能级进行精细控制，并将分子限制在陷阱中，从而使观测时间变得极长 (5–10)。如果类似的技术能够扩展到由 Conn 等人方法产生的含镭分子，将为核结构和对称性的精密研究提供一个强大的新平台。
现象……
新物理学……
除了镭-226，Conn 等人的方法可能适用于其他放射性同位素和元素。特别令人感兴趣的是镭-225，它具有梨形原子核，预计将提供目前已知最强的对称性破缺核效应灵敏度增强之一 (11)。然而，镭-225 的半衰期仅为 15 天，而镭-226 则为 1600 年。获取镭-225 可能需要能够通过衰变持续补充该同位素的放射性母体同位素，或者能够在同位素生产设施中进行直接观察的能力。一个由新型放射性同位素组成的库可能很快就能被应用于支撑现代原子和分子物理学的全系列精密实验技术中。对那些在长寿命同位素中无法观察到的现象进行观测，可能预示着新物理学的出现，从而帮助解释为什么宇宙中物质多于反物质 (12)。
参考文献与注释
致谢 作者感谢英国研究与创新署 (UK Research and Innovation) 的支持 (MR/Y017056/1)。
10.1126/science.aej2688
深海生态系统（如印度洋的水热喷口）的监管取决于国际海底管理局的指导。
海底矿业需要及时的治理 A. Jaeckel 在其社论《海底矿业需要的是诚信而非仓促》（4月 30日，10.1126/science.aei3119）中正确地强调了在制定深海矿业监管条例时，建立稳健的环境保障措施和机构合法性的重要性。然而，将当前的进展主要描述为在“监管谨慎”与“危险加速”之间做出选择，忽略了另一个同样严重的风险：国际海底管理局 (ISA) 内部长期存在的监管瘫痪。
自斐济正式请求 ISA 理事会根据《联合国海洋法公约》(UNCLOS) 框架及 1994 年《执行协定》(2, 3) 开始制定开发条例以来，已经过去了 15 年 (1)。自那时起，各方开展了广泛的法律起草、利益相关者磋商、环境研究和区域规划 (4)。然而，理事会多次错过自行设定的通过截止日期，许多关键问题仍未解决 (4, 5)。
照片：加拿大科学潜水设施 (CSSF)，由联邦地球科学与自然资源研究所 (BGR) 为 INDEX 项目承包。
在某种程度上，持续的延迟将难以被解释为谨慎。UNCLOS 第 XI 部分和 1994 年协定被特意设计为一个演进式的治理框架，以便在科学知识和操作经验不断扩大的同时，逐步推进监管的发展 (2, 3)。因此，监管应该在应对不确定性的过程中演进，而不是在受控活动开始前就要求绝对的预先确定性。
ISA 的授权是为了人类的利益组织并控制国家管辖范围以外的海床（区域）活动，并确保海洋环境得到有效保护 (2)。无限期的延迟可能会削弱法律确定性，损害对 ISA 有效治理能力的信心，并鼓励碎片化的国家或单边方案，这可能会破坏多边主义和“人类共同继承财产”原则。
在任何一个主要工业部门中，绝对的环境确定性都是无法实现的。数十年的研究已大幅扩展了我们对多金属结核生态系统及其潜在矿业影响的认识 (6)。尽管不确定性依然存在，但现有知识已日益足以支持预防性的、适应性的监管以及经过严格控制的工业项目。
诚信与紧迫性并非互不相容。经过数十年的科学、机构和监管发展，更大的危险可能不再是监管仓促，而是完全无法进行治理。
Carsten Rühlemann
德国汉诺威，联邦地球科学与自然资源研究所 (BGR)。电子邮件：carsten.ruehlemann@bgr.de
参考文献与注释
竞争利益
C.R. 的雇主 BGR 持有两份由 ISA 颁发的勘探合同。文中表达的观点仅代表作者本人，不一定反映 BGR 的观点。
谄媚 AI 的社会校准 在研究论文《谄媚 AI 降低亲社会意向并促进依赖》（3 月 26 日，10.1126/science.aec8352）中，M. Cheng 等人表明，人工智能 (AI) 系统在有争议的情景中认可用户立场的可能性显著高于人类。随机实验设计表明，接触此类肯定性回应会降低用户在人际冲突中采取亲社会纠正行动的意愿，并增加对 AI 系统的信任和依赖。这些发现建立了模型对齐策略与下游人类行为之间的因果联系，突显了 AI 对齐核心的一个矛盾点：针对用户满意度的优化可能会系统性地使模型倾向于达成一致，即便在这种情况下，表达分歧反而更有利于用户的长期利益或社会结果。谄媚不仅是一种失效模式，更是源自用户偏好强化信号的预期副产物。然而，在方法论和解释方面仍存在疑问。
研究中的人类基准——例如高评分的在线评论或专家回应——可能无法充分捕捉现实世界社交互动的动态。人类也可能表现出谄媚行为。日常的寻求建议通常发生在关系情境中（例如朋友和家人），在这种情境下，维护关系的动机——尤其是与高地位成员的关系——本身就可能促使产生谄媚的回应 (1)。因此，报告中人类与 AI 回应之间的差距可能夸大了模型行为的独特性。
目前尚不清楚亲社会性的降低是源于情感验证、认知确认，还是 AI 系统的感知权威。区分这些路径对于设计既能保留支持性互动又能减轻有害偏差的干预措施至关重要。
现实环境中的人际冲突涉及更高的风险、重复的互动以及可能放大或削弱 AI 反馈影响的网络效应。纵向研究和基于网络的研究——类似于近期关于 AI 对科学实践影响的分析 [例如 (2)]——可以更完整地说明此类偏差如何随时间重塑社会行为。
减少谄媚可能会提高认知鲁棒性，但同时也可能降低驱动用户采用的感知共情能力和可用性。设计能够平衡支持性参与与建设性分歧的 AI 系统（特别是针对弱势群体）仍然是一个开放性的挑战。
随着对话式 AI 成为一个日益嵌入的社会参与者，其角色将从提供信息延伸到行为调节。Cheng 等人的发现表明，即使是细微的对齐偏差也可能演变为显著的社会影响，这强调了在技术和治理框架方面，不仅要关注 AI 知道什么，还要关注它如何表示赞同。
孟少帅 (Shaoshuai Meng)
中国北京，北京大学生命科学学院。 电子邮件：shaoshuaimeng@gmail.com
参考文献与注释
REFERENCES AND NOTES
回复 我们感谢 Meng 就我们的研究结果提出了重要的方法论和解释性问题。合适的人类基准取决于人工智能 (AI) 预期的社会角色。在现实世界的应用中，AI 模型被认为服务于多种目的，例如顾问、中立的外部意见提供者、编辑和助手 (1, 2)。这些角色对于一致性、验证或纠正性反馈应当出现的频率有着不同的预期。更复杂的是，用户通常认为单个 AI 系统承担着多种角色 (3, 4)。由于 AI 社会角色的模糊性，任何单一的人类基准都不是完美的比较点。我们所使用的基准——即对当前冲突或情景没有个人利益关系的第三方人类的判断——探讨了一种常见且具有社会意义的预期：AI 系统——尽管通常被视为外部、中立且客观的信息提供者 (5–7)——是否会不成比例地偏袒用户？我们的研究结果在采用在线众包人员判断的替代基准时同样稳健（补充材料，SM 2）。与寻求建议者关系更近的人的反应确实可能受到更强的人际关系规范、名誉问责和持久社会后果的影响。此类替代方案是否会导致程度更高或更低的偏差仍是一个开放性问题。
我们同意，解构情感验证和感知权威等因素的作用对于设计干预措施至关重要。我们在研究 2a 中将谄媚 (sycophancy) 与拟人化（温暖、友好的回应风格）分离开来。我们发现拟人化并不能解释观察到的效应。我们还发现证据表明，对客观性的感知使得谄媚变得更具危害性：在研究 2b 中，认为 AI 更客观的参与者受谄媚行为的负面影响更大。在一次会议报告 (8) 中，我们提供了一个衡量 AI 回应中不同类型谄媚行为的基准，区分了情感验证、委婉性（indirectness）和框架接受度 (framing acceptance)，且我们近期尚未发表的工作建立了一个刻画不同类型谄媚行为的分类法 (9)。这些贡献有助于为进一步剖析这些机制奠定基础。
我们同意探索外部效力的多个维度非常重要。在一项为期 3 周、尚未发表的纵向研究中，我们发现谄媚的 AI 导致用户对现实世界的社交互动满意度降低 (10)。这为 AI 谄媚带来的持久社会和心理后果提供了证据。
Myra Cheng1, Cinoo Lee2, Pranav Khadpe3, Dan Jurafsky1
1美国加利福尼亚州斯坦福市，斯坦福大学计算机科学系。 2美国加利福尼亚州斯坦福市，斯坦福大学心理学系。 3美国宾夕法尼亚州匹兹堡市，卡内基梅隆大学人机交互研究所。电子邮箱：myra@cs.stanford.edu
于 2026 年 5 月 2 日在第十四届国际学习表示会议 (International Conference on Learning Representations) 上发表。 9. M. Ye et al., arXiv:2605.21778 [cs.AI] (2026). 10. L. Ibrahim et al., arXiv:2605.07912 [cs.HC] (2026).
亚马逊大豆暂停协议的兴衰
对这一自愿零砍伐协定的挑战可能会给森林和大豆产业带来成本
Lisa Rausch1,2, Tiago N. P. Reis3, Cristiane Mazzetti4, Marcos Barrozo5, Marin Skidmore6, Holly K. Gibbs1,2
亚马逊大豆暂停协议 (Amazon Soy Moratorium, ASM) 是一项自愿性的多部门零砍伐协定，其中大豆贸易商同意不对 2008年7月 以后在亚马逊地区砍伐森林所产的大豆进行采购或提供融资。尽管取得了成功，但在经历了一系列立法和行政挑战后，大多数贸易商在 2026 年初终止了他们在 ASM 下的承诺。一个由巴西政党和公民社会组织 (CSOs) 组成的联盟采取行动维护 ASM，包括请求巴西联邦最高法院 (STF) 介入 (ADI 7774 及相关案件；表 S1)。在此，我们描述了 ASM 的终结可能给森林和大豆产业带来的巨额成本。待定的 STF 最终裁决可能在挽救 ASM 方面为时已晚，但此案更广泛的影响超出了协议本身，触及了任何包含砍伐森林和生态系统转换限制（且这些限制未在巴西法律中明确规定）的自愿性供应链标准的生存能力。
ASM 的出现源于绿色和平组织 (Greenpeace) 一场强调亚马逊大豆生产环境风险的运动所带来的抵制威胁和名誉损失。尽管最初被构想为一项临时措施，并通过一系列短期延期而更新，但在 2016 年，所有各方一致同意 ASM 应无限期继续，直到更广泛的治理条件被认为已足够完善。当 ASM 在 2006 年启动时，大豆扩张是亚马逊森林砍伐的主要驱动因素，其中近三分之一是通过直接森林转换实现的 (1)。在采购了亚马逊约 90% 大豆的贸易商实施 ASM 后，由于新大豆扩张而导致的森林砍伐几乎降至零 (1)。
ASM 规则明确，且在很大程度上由于高效的、覆盖全行业且基于地块的监测而得到了统一实施，这鼓励了高度的合规性，而无需采用一套碎片化、成本高昂且针对具体公司的追溯系统。该协议激励大豆向 9.7 至 15 Mha 的大规模“储备”土地扩张，这些土地在 ASM 2008 年的截止日期之前已被砍伐，使得亚马逊的大豆种植面积在没有发生实质性直接森林转换的情况下增加到三倍以上 (1, 2)。通过这种方式，ASM 在其最初的 10 年里，将大豆扩张风险区域的森林砍伐减少了 35% (1.8 Mha)，包括大豆地产以外的区域 (3)。通过减轻森林承受的整体压力，ASM 补充了公共政策执行方面的改进 (3)，并促使森林砍伐率在 2012 年达到历史低点，使其成为迄今为止实施的最具影响力的自愿性供应链政策，即便考虑到某些证据表明部分砍伐压力可能被转移到了其他地区（如塞拉多草原）[(4)；补充材料 (SM) 第 1 节]。
然而，马托格罗索州和其他领先的大豆产州通过的法律，取消了那些在法律要求之外实施环境采购承诺的公司享受税收优惠的资格。这些法律的合宪性正是 STF 目前审理的具体问题。此外，巴西反垄断机构 (CADE) 也在调查有关 ASM 贸易商通过协调实施协议而形成卡特尔的指控 (5)，不过在 STF 审议期间，这一进程目前处于暂停状态。
各团体认为，亚马逊大豆暂停协议（ASM）增加了生产者的成本并限制了亚马逊地区的区域发展（见 SM），同时还存在强调国家主权以及抵制感知到的外部干扰国内土地利用决策的叙事。在为 ASM 辩护的备案文件中，公民社会组织（CSOs）展示了 ASM 如何加强巴西环境法规的实施，并主张那些因公司采取超出法定要求的环境采购标准而对其进行处罚的法律，违反了自由竞争和环境保护的宪法原则（表 S1）。
结束 ASM 的成本 尽管之前的分析使用了回顾性反事实方法评估了 ASM 的效益 (3, 4)，但我们在此提供一个前瞻性估计，预测在没有 ASM 的情况下预计会增加的森林砍伐量。基于此前对 ASM 对森林砍伐率影响的估计 (3)，我们估计，与 ASM 持续的反事实情况相比（SM 第 1 节），协议的终止将在接下来的十年中导致 1.4 ± 0.67 Mha 的额外森林砍伐，这将导致额外 745 ± 346 million 公吨的二氧化碳当量排放，与加拿大的年度温室气体排放量相当。这一预测损失约占过去十年巴西亚马逊地区森林砍伐总面积的 17%。该估计反映了 ASM 在一个更广泛的政策组合（包括法规、执法和其他基于市场的干预）中的贡献，但未考虑近期重要的变化，例如亚马逊地区日益增长的生物燃料部门。
预计会出现这种森林砍伐增加的情况，因为 ASM 通过限制新砍伐土地进入高价值大豆市场的渠道，降低了砍伐的激励措施，从而降低了森林砍伐的经济价值以及对森林的整体压力 (3)。如果没有 ASM，直接将森林转化为大豆种植地的激励措施将会回归，同时大豆扩张在驱动投机性砍伐中的作用也将回归 (3)。在环境治理削弱的情况下，这些影响可能尤为显著，在这种情况下，私营部门的承诺可以作为公共执法能力下降的后备支撑 (6)。
总之，如果没有 ASM，整个亚马逊地区适宜种植大豆的土地上的数千万公顷森林可能会面临更高的转化风险 (2)。这包括 9.1 Mha（SM 第 2 节）在巴西森林法下仍可合法砍伐的私有财产森林，以及高达 28.7 Mha 的未指定公共森林（无法律定义用途或保护的土地），后者尤其容易受到非法转化和土地投机的影响（SM 第 3 节）。森林压力的增加还可能导致巴西法定保护区内部出现额外的非法砍伐。虽然这些土地并不一定会立即全部种植大豆，但这些区域将受到 ASM 终止后森林压力整体增加的影响。
失去 ASM 的后果超出了对森林的影响。其移除可能会给巴西的大豆部门及在该地区运营的公司带来实质性风险。尽管人们有时认为企业会避开监管环境更严格的司法管辖区 (7)，但 ASM 的签署方在亚马逊地区的业务规模反而增加。
协议的执行过程中（SM 第 4 节）。 部分公司采用 ASM 是因为该协议有助于管理与从亚马逊地区采购相关的声誉和市场准入风险，同时满足下游买方日益严格的可持续性预期 (8)。
如果没有 ASM，公司可能会面临越来越大的压力，必须实施更复杂且可能碎片化的尽职调查系统，以维持对某些出口市场的准入，并实现来自上游供应商的《温室气体核算体系》范围 3 的排放目标。大多数退出 ASM 的公司仍维持其在供应链中减少毁林活动的公开承诺，且在某些情况下，是通过诸如消费品论坛 (Consumer Goods Forum) 等多方利益相关者倡议来实现的 (9)。长期贸易关系可能会被破坏，公司可能会面临相当大的声誉和财务风险，包括对公司估值的影响 (10)。与此同时，持续的毁林会对农业生产力造成更广泛的系统性风险。如果局部或区域性地超过生态阈值，亚马逊地区的森林损失可能会改变区域降雨模式并提高温度，从而威胁大豆生产的长期可行性 [(11)；SM 第 2 节]。
尽管有说法称 ASM 给生产者带来了经济困难，但该协议的结束可能给大豆农民带来的益处很少。在 ASM 2008 年截止日期之后的大部分毁林行为同样违反了《森林法》。ASM 的暂停仅释放了约 739,000 公顷在 2008 年之后合法开垦的适合种植大豆的土地，其中大部分位于目前不生产大豆的地产上（SM 第 5 节）。整个亚马逊地区的大豆农场仅有约 60,000 公顷仍可合法开垦的森林区域，不足亚马逊大豆总面积的 1%。与此同时，即使在 ASM 之下，大豆农民在自己的农场上也有足够的合规土地，使其在不增加毁林的情况下，比 2024 年的大豆种植面积增加近 20% (1.7 Mha) [(2)；SM 第 5 节]，这表明关于扩大生产区域的考量可能比简单的土地可用性更为复杂（SM 第 2 节）。 通过将受 ASM 约束的大豆市场与附近未受限制的地区进行比较，我们没有发现农民获得平均出场价格存在系统性差异，这表明结束该协议不太可能显著增加生产者的收益，且贸易商在 ASM 中并未参与价格操纵（SM 第 6 节）。
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相反，除了更广泛地减轻森林压力外，ASM 通过限制这些区域在当地最盈利的供应链中的使用，降低了非法开垦的激励，从而限制了生产者从违反《森林法》中获利的潜力。ASM 对大豆生产者的成本相对较低（特别是就土地可用性而言），且有证据表明其许多森林保护效益发生在大豆地产之外，这表明对该协议的反对至少部分是由与边境扩张相关的激励驱动的，而非由大豆生产者面临的困难或对国家主权的担忧所驱动 (2, 3)。
关于 ASM 阻碍当地发展的主张在围绕州级法规的辩论中十分突出。我们的分析表明，这些主张难以与 ASM 限制的有限土地面积、未检测到出场价格影响的事实，以及大豆驱动的增长产生不均衡的当地发展效益且将大量的环境和社会成本外部化的证据相协调（SM 第 2 节）。ASM 对当地经济发展的限制……
在没有 ASM 的情况下，预计到 2036 年将被毁林的亚马逊森林面积，相当于约 2 million 个足球场。
未指定公共森林中适合种植大豆的区域（其面积几乎与意大利相当）将面临来自土地投机的额外压力。
继任系统可以通过由公民社会组织 (CSO) 和贸易商协会组成的联盟监督的独立监测系统，或者通过一个公开识别合规生产者的政府主导平台，来保留统一的框架和亚马逊大豆暂停协议 (ASM) 2008 年 7 月的截止日期。巴西第 11.687/2023 号法令授权环境部公布一份 2008 年后未发生森林砍伐的农村财产“正面清单”，这为这种方法提供了现有的制度基础。一个独立于农场经营活动、识别 2008 年后未发生森林砍伐财产的公共平台，还可以支持将无砍伐生产扩展到其他关键生物群系（包括塞拉多 Cerrado）以及其他大宗商品（如玉米），同时加强其他部门政策的实施。
一片面积相当于葡萄牙大小的森林区域，适合种植大豆且符合合法清除条件。
然而，复制 ASM 的成功不仅需要一个监测系统。其他关键要素还包括整个行业的采用（例如，通过巴西植物油工业协会）和财产级别的要求，而不是允许农民将其作物在合规土地和非合规土地之间进行拆分。与 ASM 开始时的条件相似，来自下游买家的持续压力将至关重要。来自主要进口地区（包括欧洲和 中国，这些地区共同接收了很大份额的亚马逊大豆出口）的加工商、零售商和金融机构的协调一致的预期，将有助于在没有 ASM 的情况下维持贸易商对零砍伐的承诺。如果没有持续的下游需求，与近期森林砍伐相关的大豆可能会越来越多地流向监管较宽松的市场。
大豆行业提出的另一种路径强调通过加强执行《森林法》来替代无砍伐采购承诺。例如，“绿色谷物协议”(PVG) 是由巴西联邦检察官服务局领导的一项计划，旨在减少大豆行业的非法采购。与另一项旨在限制牛肉生产相关森林砍伐的努力（同样由检察官管理）类似，PVG 依赖于对照标准协议进行的公司级监测，审计由公司承包并对样本采购进行抽查。与 ASM 的统一监测系统相比，这种方法可能会导致采购标准的执行不够一致，并产生允许持续砍伐的漏洞。迄今为止，PVG 仅限于帕拉州 (Pará)，但目前正努力将其扩展到全国。
鉴于有证据表明高达四分之一的大豆财产存在非法砍伐，大豆行业显然需要加强《森林法》的执行。然而，单凭《森林法》的合规性无法像 ASM 那样降低森林砍伐的价值。在《森林法》下，
发展，特别是当与增加砍伐带来的区域生产力和发展更广泛的风险相比时，可能比该协议的批评者所暗示的要有限。
前进之路 通过迅速实施一个保留了有助于该协议有效性的关键特征的替代方案，仍有机会避免失去 ASM 带来的最严重后果。考虑到亚马逊森林与关键生态临界点 (12) 的接近程度，以及加强巴西生态系统韧性的紧迫需求，维持强大的反砍伐激励措施仍然至关重要。
不合规行为最终可以通过缓解或正则化来解决，而 亚马逊大豆暂停协议 (ASM) 2008 年 7 月的截止日期之后发生的森林砍伐则被永久地视为不符合大豆采购资格 (13)，这为大豆生产者获取此类土地创造了更强的抑制因素。因此，PVG 应当与诸如 ASM 之类的零砍伐承诺相结合，而非取代它们。同样，要求维持 ASM 但将截止日期改为 2020 年以与《欧盟森林砍伐条例》(EUDR) 保持一致的呼吁，可能会创造出未来将获得赦免的预期，从而降低森林砍伐的威慑效果。
其他拟议的路径不太可能保留 ASM 的森林保护效益。个别公司对于无砍伐采购的承诺如果不基于统一的监测系统，可能会导致执行不一致，并增加公司的监测和行政成本。随着时间的推移，个别承诺的失效可能会将市场碎片化为平行的供应链，其中没有近期砍伐行为的生产者向有承诺的买家出售，而来自近期砍伐区域的大豆则流向限制较少的公司 (4)。同样，企业层面试图通过向部分客户出售经认证的无砍伐量，同时将近期砍伐或未经核实的农场大豆导向识别能力较低的买家来隔离供应，这可能会削弱整个行业进行森林保护的动力。此类方法冒着通过优惠的市场准入使贸易商获利的风险，而对于大多数已经在长期砍伐土地上经营的生产者来说，带来的益处有限。从行业范围的实施转向碎片化的承诺实施，可能会进一步削弱该行业保护自身免受与砍伐森林相关的实质性风险（包括降雨量减少、温度升高和农业生产力下降）的效能，这些风险本质上是共同承担的，必须通过系统性的机制来解决（SM 第 2 节）。
如果行业范围或个体的无砍伐采购承诺被用作公司获取国家税收激励（例如，那些宪法合法性在 STF 处于争议中的法律）的障碍，或者被 CADE 框架化为反竞争行为，这可能会削弱私营部门参与者应对森林砍伐和其他社会环境风险的动力。因此，这些案件的裁决可能会产生超出 ASM 之外的更广泛的级联效应，决定企业是否将雄心勃勃的环境标准视为法律上和商业上可行。久而久之，这可能会使平衡点向协调性较低且雄心较低的可持续发展方法偏移，而此时应对系统性挑战的有效行动正变得日益紧迫。相反，重申公司采取环境采购标准的权利的法律裁决，可以加强私营部门参与森林保护的赋能条件。
ASM 的背景 ASM 的终结正值巴西环境治理面临更广泛威胁之际。除了反对 ASM 的运动外，农业游说团体还通过以下方式扩大了其影响力：例如，推进一项限制在环境执法中使用卫星图像的法案；推翻了总统对一项拆除该国环境许可制度法案的否决；并推动一项宪法修正案，以推翻 STF 捍卫原住民对其祖传土地权利的裁决。与此同时，即将到来的全国选举给未来联邦政府对环境保护的支持带来了不确定性。这些动态并非巴西所特有；在世界范围内，环境和气候优先级正日益被其他政治优先级所取代 (9)。
在巴西众所周知的多变政治和监管环境下，仅凭正式的合法性无法为森林保护提供稳定的基础，因为法律标准可能会在不断变化的政治压力下被突然削弱或重新定义。诸如亚马逊大豆暂停协议 (ASM) 之类的自愿性、基于市场的工具，多次成为公共政策的重要补充，在执法和监管缓慢且复杂时，有助于维持保护措施 (6)。ASM 在降低森林砍伐价值方面发挥的独特作用超出了大豆地产，甚至触及了投机前沿，这使其成为为巴西实施法律和公共政策创造更有利条件的不可或缺的工具。ASM 的消失可能会危及巴西近期在实现国家目标方面取得的进展，包括到 2030 年实现零砍伐以及到 2050 年实现温室气体净零排放 (14)。一项支持私营部门保护环境且不受州政府报复权利的最高联邦法院 (STF) 裁决，有助于维持这一进展。
零砍伐生产对于巴西的贸易关系也变得日益重要。尽管欧盟森林砍伐法规 (EUDR) 被削弱且推迟，但它以及英国和美国正在考虑的类似政策，继续传递出对无砍伐生产不断提高的预期。中国也表现出对进口商品可持续性标准的兴趣。在 2026 年 6 月的一项决定中，美国贸易代表办公室明确引用了马托格罗索州目前提交至 STF 的法律，得出结论认为，州政府针对自愿零砍伐政策的压力消除了私营部门遏制森林砍伐的激励，从而创造了不公平的贸易优势，这构成了对巴西征收 25% 关税决定的法律基础。因此，ASM 的结束以及在一般环境政策上针对私营部门的敌对行为，预计将削弱巴西在贸易关系中的地位。
尽管私营部门的政策是打击森林砍伐的关键元素，但持久的砍伐减少将取决于更强大的领土治理（包括有效的执法和全面实施的土地利用规划），以及能够大规模塑造土地利用决策的激励措施。在这些更广泛的系统得到加强之前终止 ASM，可能会削弱巴西作为无砍伐大豆领先供应商的地位，同时增加农业部门、气候目标和巴西社会的风险。
参考文献与注释
(2026); https://doi.org/10.5281/zenodo.20736510.
致谢 我们感谢 R. Heilmayr 在方法论方面提供的建议，以及 J. Munger 在图表方面的支持。世界自然基金会-巴西 (WWF-Brazil) 和绿色和平组织巴西分部在 ADI 7774 及其相关案件中注册为法庭之友，并且是大豆工作组的成员。本研究获得了世界自然基金会-瑞士分会（项目编号 BRA0133）的资助。所有数据和代码均可在 Zenodo (15) 获取。
补充材料 science.org/doi/10.1126/science.aeg5368
10.1126/science.aeg5368
1美国威斯康星大学麦迪逊分校可持续发展与全球环境中心 (SAGE)，美国威斯康星州麦迪逊。2土地保护协会，美国威斯康星州麦迪逊。3世界自然基金会-巴西 (WWF-Brazil)，巴西巴西利亚。4绿色和平组织巴西分部，巴西圣保罗。5德保罗大学经济系，美国伊利诺伊州芝加哥。6伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校农业与消费者经济系，美国伊利诺伊州厄巴纳。 电子邮件：llrausch@wisc.edu
重获你的声音
声音
S
语言是人类最卓越且最基本的行为之一。我们精准地控制着近 100 块肌肉，以产生一系列时间精确的呼吸和快速的关节运动，从而以恰到好处的方式震动空气，使他人能够理解我们口头表达的思想。 由于中风或肌萎缩性侧索硬化症 (ALS) 等神经损伤而失去这种能力是毁灭性的。然而，由于说话的复杂性以及缺乏动物模型，我们对语音神经基础的理解——以及我们恢复这一能力的努力——一直十分有限。
B
尽管面临这些挑战，得益于相关机遇，神经科学家们已开始揭开语音产生的神经编码。
Hello
植入后天数
累积数据小时数
一种语言恢复神经假体。(A) 当参与者尝试说话时，通过放置在其皮层语言产生相关区域的四个微电极阵列来测量神经活动。初始 AI 模型预测每个时间步中每个潜在音素的可能性。随后，一对语言模型将这些音素概率序列转换为最可能的词串。计算机将最终句子大声朗读，或将其作为文本发送到他的个人计算机。(B) 我们通过测量参与者尝试说出提示句子时，输出词汇中错误词汇的百分比（越低越好）来量化系统的准确率。随着我们累积更多训练数据并对算法进行改进，性能得到了提升。解码在许多个月的时间里始终保持准确。
活动信号 音素概率
循环 神经网络
27 1.9
34 4.0
46 6.6
48 8.0
69 8.9
74 10.1
0.5
在医疗操作（如癫痫治疗 (1)）期间直接测量人类的脑活动。此类研究表明，计算机算法可以从同步记录的神经信号中预测语言内容 (2)。这些发现，结合 20 年的脑机接口 (BCI) 研究（该研究表明，即使在瘫痪多年后，大脑仍然会对运动意图进行编码 (3)），表明构建语言神经假体可能是可行的：一种能够将大脑活动直接转化为词汇，从而绕过神经系统受损部分的设备 (4)。通过将神经科学与人工智能 (AI) 相结合，这项工作在短短几年内就取得了迅速进展 (5, 6)。
我们的团队最近展示了一种基于 AI 的语言神经假体，能够恢复日常交流 (7)。我们与一名因 ALS 而无法清晰说话的 45 岁男子合作。他自愿参加我们的学术临床试验，并在其大脑的三个语言相关区域（皮层区域 4, 6, 和 55b）植入了 256 个微电极。我们发现，在所有测量神经元的群体中，所有 39 个英语音素都出现了截然不同的神经活动时空模式。这一发现使我们能够训练深度学习算法，以预测参与者在任何给定时刻试图表达的音素。随后，语言模型将这些音素序列串联成单词和句子。
在使用首日，该神经假体在仅限 50 个词的词汇量下实现了 99.6% 的
76 11.5
81 12.2
83 13.4
88 15.9
90 17.6
95 18.8
223 80.9
准确率。由于我们的皮层内传感器捕捉单个神经元动作电位，具有极高的信噪比，因此初始校准仅需在参与者尝试说话时记录 30 分钟。在第二天，我们将可用词汇量扩展到整个英语词典（125,000 个词），准确率达到 90.2%。参与者的词汇在他试图说出时立即出现在屏幕上。当他完成一个短语时，该短语由文本转语音软件发声，该软件基于旧的音频记录训练，使其听起来像他患 ALS 之前的声音。就在当天，他做的第一件事就是使用神经假体对他 4 岁的女儿说话，而在此之前，他的女儿并没有能够理解父亲的记忆。
经过进一步训练，该言语神经义肢维持了 97.5% 的准确率（与之前的研究相比，词错率降低了 90%），且月复一月保持稳定。每个完成的句子都被添加到数据库中，用于 AI 模型的持续在线学习，从而随时间推移保持性能。这个不断增长的数据集最近使我们能够部署更强大（但对数据需求较高）的算法，以实现 >99% 的词汇准确率 (8)。在使用了两年后，参与者几乎每天使用这项技术，共说了 >2.7 million 个词。该神经义肢使他能够与朋友和家人聊天，甚至通过与同事进行视频会议和书信往来，重新全职从事气候倡议工作。
244 94.5
图表：改编自 (7)，作者 A. FISHER/SCIENCE
如果没有 AI，这些将无法实现。脑机接口（BCI）最初受益于一定的“新手运气”：一些简单的算法假设每个神经元的活动仅代表一个首选的运动方向——尽管长期以来已知这种模式极其不完整——但事实证明，在恢复人们控制计算机光标或机器人手臂的能力方面出奇地有效 (9, 10)。但这些方法在处理神经活动与语音之间更复杂的映射时失效了。幸运的是，深度学习的进步（特别是应用于自动语音识别和机器翻译的进步）及时到来。AI 提供了强大的工具，可以在没有精确时间对齐的情况下将输入（神经测量值）映射到输出（音素），利用更长的时间尺度上下文，并借助语言的预测结构 (11–13)。
我们的语音神经假体提供了一种改变生活的沟通方式，但它缺乏人类声音所具备的完整表达范围。即使最终生成的文本由计算机朗读，这种方法也无法捕捉我们用来传达情感细微差别的韵律。它还无法实现交互式对话中快速的来回交流，也无法提供唱歌所需的语音灵活性。幸运的是，声音的这些副语言元素也可以从皮层活动中解码 (14)。因此，恢复语音的下一个前沿是开发一种本质上充当数字声道、能几乎瞬间将神经活动转化为声音的 BCI。
实时语音恢复极具挑战性。对低延迟和语音灵活性的需求，排除了在较长的时间窗口内累积神经测量值，或使用语言模型来提高准确性的可能性。尽管如此，我们的团队已经取得了实质性进展。我们首先表征了同一名参与者的脑内如何编码语调，然后开发了一种最先进的基于因果 Transformer 的 BCI，用以解码他的语音音素和副语言特征，从动作电位到声音的延迟仅为 30 ms (15)。该 BCI 使他不仅能实时听到自己的说话声，还能调节合成声音的语调来提出问题或强调特定词汇。他甚至唱了一段简单的旋律。
还需要进一步工作来确定这种性能是否能在完全丧失说话能力的患者中复制，并使即时合成的声音始终清晰可辨。在恢复患者失去的声音的完整速度、精准度和丰富表达力的这一追求中，AI 无疑将发挥至关重要且快速提升的作用。未来，AI（特别是大语言模型的内部结构）甚至可能为我们提供线索，研究如何为脑内语音形成系统受损更严重的患者解码“意义”而非“语音”。
照片：（从上到下）加州大学董事会；ZHILING ZHENG；由 NICHOLAS JACOBSON 提供
参考文献与注释
以及信号处理，温哥华，BC (2013), 第 6645–6649 页。 13. A. Vaswani 等，第 31 届神经信息处理系统国际会议论文集，长滩，CA (2017), 第 6000–6010 页。 14. B. K. Dichter, J. D. Breshears, M. K. Leonard, E. F. Chang, Cell 174, 21 (2018). 15. M. Wairagkar 等, Nature 644, 145 (2025).
10.1126/science.aeh4797
大奖得主
Sergey Stavisky 在布朗大学获得学士学位，在斯坦福大学获得博士学位。在斯坦福大学完成博士后研究后，他于 2021. 在加州大学戴维斯分校神经外科系的神经义肢实验室共同创立了该实验室。他的研究重点是理解言语和语言的神经基础，并开发能够恢复这些能力的神经义肢。 www.science.org/doi/10.1126/science.aeh4797
入围者
Zhiling “Zach” Zheng 在康奈尔大学获得学士学位，在加州大学伯克利分校 (UC Berkeley) 获得博士学位。在麻省理工学院和 UC Berkeley 完成博士后研究后，他于 2025. 在圣路易斯华盛顿大学化学系创立了自己的深度合成实验室。他的研究将人工智能与合成化学相结合，以加速用于可持续发展和人类健康的晶体材料的发现。 www.science.org/doi/10.1126/science.aeh4807
Nicholas C. Jacobson 在特루门州立大学获得学士学位，在宾夕法尼亚州立大学获得博士学位。在麻省总医院/哈佛医学院完成博士后研究后，他于 2019. 在达特茅斯学院盖塞尔医学院的技术与行为健康中心及生物医学数据科学系建立了自己的实验室。他的研究利用生成式人工智能来扩展精准的、循证的心理治疗，以应对全球心理健康危机。 www.science.org/doi/10.1126/science.aeh4808
重新编程合成
通用人工智能代理正在材料化学实验室中发挥作用 Zhiling Zheng
实验化学长期以来一直由直觉、耐心以及对试错合成的艰苦执行所定义。多孔材料，如金属有机框架 (MOFs)，清晰地证明了这一点 (1, 2)。原则上，它们的结构可以由分子构建单元的巨大组合绘制而成，从而产生适用于净水、空气和能源应用的材料 (3–5)。然而，在当前合成方法下，可以想象的结构（“概念空间”）与可以可靠制造的材料（“实现空间”）之间仍存在巨大的差距 (6)。如果没有将更快的推理与实验结合在一个循环中，这种广阔的设计与合成图景在很大程度上仍然难以触及 (7–9)。
我的研究通过一个围绕三个阶段构建的通用人工智能 (AI) 实验室系统，引入了一条通往预测性合成的路径：读取、设计和执行（见图）。在这种情况下，通用 AI 指的是能够解释化学信息、生成设计假设并执行实验决策的 AI 助手或代理，且不受限于单一任务或材料系统 (10)。这些代理与人类直觉在互连的循环中协同运行，改变了研究人员设计和合成新材料的方式，以扩大实验范围，降低失败率，并解锁仅使用传统方法无法实现的从设计到发现的时间线。
该平台的核心是 AI 能够像化学家一样阅读化学。MOFs 的合成方案和表征结果通常埋在散布于 50,000 篇学术论文中的散文、表格和图表中，这些论文包含了过去三十年 MOF 研究所积累的 120,000 个晶体结构 (10)。为了大规模提取这些数据，我们构建了使用
人工智能 (AI) 代理展现出统一文献、设计和实验以加速材料发现的潜力。(A) 多模态生成模型将文本和图表转换为结构化合成数据，以弥补非标准化文献的不足。(B) 微调的语言模型实现了新构建单元的生成式设计。(C) 多代理系统基于先验知识进行推理，运行机器人实验，并在闭环中优化结果。[示意图部分改编自 Zheng 等人 (10)。]
OC(=O)c1cc(cc(c1)C(O)=O)C(O)=O
大语言模型 (LLMs) 的自然语言工作流，用以解析合成步骤，识别试剂（例如：金属前体、连接体、溶剂和调节剂），并提取详细条件（例如：比例、温度和时间） (11)。文献数据挖掘代理并非依赖于关键词启发法，而是基于语境理解化学命名实体，并接受人类自然语言作为输入，这大大降低了合成化学家在工作流中使用和应用 AI 的门槛；我们的自然语言工作流在多种格式下实现了 97% 以上的准确率。
实验数据经常出现在图表中；因此，我们将系统扩展到了视觉语言模型 (12)，这些模型可以从图表中读取吸附等温线、衍射图样和热剖面图。这些输出被数字化并与基于文本的数据合并，最终产生一个统一的 MOFs 合成-结构-性能数据集。手动策划这样一个具有多模态特性的语料库可能需要数年时间；然而，利用我们的文献数据挖掘代理，在数小时内就实现了一个可扩展、可适应且可推广到许多材料化学方案的工作流。
凭借这一结构化的知识库，我们的假设是：化学家设计有机连接体的方式可以通过 AI 来学习。通过在包含 3943 个 MOF 连接体转化的文献数据集上对 LLMs 进行微调，我们创建了生成式设计代理，这些代理能够为 MOF 提出既新颖又可合成的、且符合拓扑和化学约束的构建模块 (13)。因此，这些设计代理所提出的化学结构帮助发现了 10 种新材料，被称为长臂 MOF 家族 (LAMOF-1 至 LAMOF-10)，计算模拟显示，它们的水收集性能强于目前最先进的铝基 MOF 吸附剂 (4)。这些进展并非通过传统的暴力 MOF 连接体筛选实现，而是通过基于文献社区知识学习的模型建议所引导的定向设计实现的 (11)。
构思一种新材料仅仅是开始。更困难的部分是将该设计转化为真实的晶体。反应空间巨大，寻找正确的反应参数往往是 MOF 发现的限制因素。为了解决这个问题，我们构建了一个充当一组实验化学家的多代理系统 (14)，该系统负责规划反应、与实验室自动化设备通信、解释结果并实时更新其想法。代理的任务包括：由文献和习得的先验知识引导的规划阶段；将自然语言步骤转换为机器人指令的控制阶段；评估粉末 X 射线衍射图谱的分析阶段；以及利用上下文学习和贝叶斯优化提出下一次实验的优化阶段。通过从成功和失败中共同学习 (15)，AI 系统在遍历合成图谱时不断提高其预测精度。
作为演示，我们将这一具有预测合成能力的闭环平台应用于新提出的材料 LAMOF-1 和 LAMOF-2 (13, 14)，其结晶空间涵盖了超过 106 种可能的反应条件。在 2 周内进行的 120 次机器人实验中，代理发现了高结晶度条件，而这在以前可能需要数月的手动筛选工作。该平台为其自身的建议分配置信度，处理意外结果，并随着实验进程更新其选择。
图表：改编自 (10) BY A. FISHER/SCIENCE
不断推进。该平台的独特之处不在于单一的模型或算法，而在于当多个智能体协同工作进行推理时所产生的一种行为，这非常像一名经验丰富的人类研究员会做出的反应 (15)，但其规模和速度是仅凭人类直觉无法触及的。
展望未来，可以预见在材料化学实验室中，通用智能体将成为常规配置。至关重要地，它们的作用不是取代人类的创造力，而是将其放大。通过将文献、设计和实验链接到一个能从每一步中学习的单一系统中，AI 智能体改变了我们思考合成的方式。它们不仅在程序意义上，而且在认识论意义上重新规划了合成：我们请求什么样的材料，如何请求，以及我们能以多快的速度给出答案。通过这样做，AI 帮助实现了成为一个真正的预测性合成实验室伙伴的承诺，从而实时地大幅加速化学和材料的发现。
参考文献与注释
美国密苏里州圣路易斯，圣路易斯华盛顿大学化学系。 电子邮箱：z.z@wustl.edu
入围者
Zhiling “Zach” Zheng 获得了康奈尔大学的学士学位和加利福尼亚大学伯克利分校 (UC Berkeley) 的博士学位。在马萨诸塞理工学院和 UC Berkeley 完成博士后研究员工作后，他于 2025 年在圣路易斯华盛顿大学化学系成立了深度合成实验室。他的研究将人工智能与合成化学相结合，以加速用于可持续发展和人类健康的晶体材料的发现。www.science.org/doi/10.1126/science.aeh4807
10.1126/science.aeh4807
照片：ZHILING ZHENG
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世界正经历一场心理健康危机，在任何给定年份中，精神疾病的患病率大约为五分之一，且这一比率在过去十年中一直在上升 (1–3)。然而，全球心理健康服务提供者的中位数仅为每 100,000 人中 13 名 (4)。人类提供者根本无法规模化地满足这种迅速增长的治疗需求。尽管人们已将注意力转向数字心理健康干预措施以提供进一步的获取途径 (5)，但这些干预措施大多采用“一刀切”模型，未能针对患者最常见的就诊问题：精神共病 (6)。通过提供——
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治疗组 vs. 对照组：组间 d = 0.845 [0.409, 1.282] 抑郁症状：从前测到后测的变化
治疗组 vs. 对照组：组间 d = 0.840 [0.382, 1.298] 焦虑症状：从前测到后测的变化
治疗组 vs. 对照组：组间 d = 0.819 [0.264, 1.373] 进食障碍症状：从前测到后测的变化
治疗组 vs. 对照组：组间 d = 0.903 [0.460, 1.347] 抑郁症状：从前测到随访的变化
治疗组 vs. 对照组：组间 d = 0.794 [0.328, 1.261] 焦虑症状：从前测到随访的变化
治疗组 vs. 对照组：组间 d = 0.627 [0.072, 1.182] 进食障碍症状：从前测到随访的变化
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组间差异
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-20 -10 0 10 抑郁症状的变化 抑郁症状的变化
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-15 -10 -5 0 5 10 焦虑症状的变化
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组间差异 组间差异
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-50 -25 0 25 进食障碍症状的变化
Therabot 试验的主要结果。被随机分配到 Therabot 生成式 AI 干预组（治疗组）或等候名单对照组的成年人在三个临床领域中症状严重程度较基线的个体内心变化平滑概率分布：（上）抑郁，（中）焦虑，（下）喂养与进食障碍风险。在每个领域中，左面板显示从基线到治疗后（4 周）的变化，右面板显示到随访（8 周）的变化。横轴是症状评分较基线的变化；零点（虚线）左侧的值表示症状改善，右侧的值表示恶化，如箭头所示。阴影区域显示两组共同的变化评分；垂直虚线标记每组的平均变化，括号标记组间差异。症状评估采用患者健康问卷-9 (PHQ-9；抑郁)、广泛性焦虑障碍问卷-IV (GAD-Q-IV；焦虑) 和体重关注量表 (WCS；进食障碍风险)；在这三项量表中，评分越低表示症状越少。组间效应为累积链接（序数）混合效应模型的 时间 × 组别 交互作用所推导出的标准化平均差（Cohen's d 及其 95% 置信区间，显示在每个面板中）。所有 6 项交互作用均支持 Therabot (d = 0.63 至 0.90；所有 p < 0.05)。N = 210 (Therabot 组, n = 106; 等候名单组, n = 104)。
恶化
Therabot 现已准备为您服务
对照组 实验组
对照组 实验组
对照组 实验组
对照组 实验组
对照组 实验组
对照组 实验组
改善更显著
改善更显著 恶化
改善更显著 恶化
改善更显著 恶化
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改善更显著 恶化
仅提供通用护理 (7)，这些干预措施收到的患者参与度有限且乏味 (8–10)，因为它们无法产生人类所能提供的量身定制的响应。
从 2019 年开始，我带领我的实验室探索生成式人工智能 (AI) 是否能够解决这些获取循证护理的障碍，并提供与人类专家心理治疗师向其患者提供相当的真正个性化互动。这项技术随时间推移已经有了相当大的发展和演变。我们最初天真地通过在庞大且广泛可得的数据上微调模型来开启这段旅程。我们在数百[此处文本截断]上训练了我们的首批模型。
图表：改编自 (12) A. FISHER/SCIENCE
数以十万计的来自心理健康论坛的点对点互动，其依据是能够获得这些点对点互动可以改善某些心理健康结果 (11)。在最初的这些互动之后，我们很快发现这些模型无法填补这一空白，因为它们不仅在回应用户时没有遵循循证策略，而且模型的响应方式往往显著加剧了用户所呈现的问题。例如，在一次模拟的首次互动中，我们说：“我感到很抑郁。有时，我觉得自己不想起床，”而该模型所谓的“治疗性”回复是：“生活真是如此艰难。大多数日子里，我都不知道自己怎么还有精力坚持下去。最后我想一个人在角落里哭。我只想让我的生命结束。”显然，我们需要改变方法，于是我们开始使用心理治疗培训视频会议的转录文本来调整我们的模型，理由是我们可以利用这些数千个视频会议中必然蕴含的循证技术来轻松训练这些模型。然而，这次尝试的效果与第一次几乎一样糟糕，回复内容大多包含“嗯哼”、“继续说”以及“你的问题源于你与母亲的关系”（而此时尚未讨论到母亲）。在这个阶段，很明显模型正在适应数据，但我们喂给它们的是错误的数据。
我们在此关头达到了一个转折点。我们抛弃了那些容易做的事情，开始一项新使命：开发一个用于训练这些模型的金标准数据集。这些努力最终形成了一个跨越 6.5 年以上的项目，由心理学家和精神病学家监督，研究团队中有 100 多人投入了远超 100,000 人的小时数来开发该系统，我们将其命名为 Therabot。我们没有重新利用其他数据（因为那会带来固有的局限性），而是设计了一个由长篇叙事对话组成的数据集，这些对话由研究团队成员编写，涵盖了虚构患者与提供者之间的金标准响应。因此，每段对话既由人类编写，随后又由另一名人类进行系统评估，以确保响应包含一致的治疗导向和干预方法，并在治疗师在门诊实践中可能遇到的几乎所有广泛话题中，提供最佳的循证护理。我们的方法取得了巨大的成功，我们在 2022 年的内部评估确定，在 ChatGPT 公开推出前 6 个月，我们的消息在约 90% 的时间里能产生金标准临床方案。
在获得高循证治疗忠实度后，我们在接下来的 2 年中主要关注安全性。我们使用一种称为“紫色团队”（purple-teaming）的方法来系统地测试这些模型，在该方法中，我们尝试诱导它们产生不良行为，然后修订训练数据和模型架构以解决由此产生的任何问题。
一旦这些模型能够持续提供安全、金标准且有效的护理，我们就启动了首个关于生成式 AI 提供心理治疗的随机对照试验 (12)。我们设计了三个不同的组别：(i) 抑郁症、(ii) 焦虑症，或 (iii) 具有临床高风险进食与饮食障碍的人群，并与候诊对照组进行比较。在试验中，参与者与 Therabot 系统的互动平均在 8 周内超过 6 小时（大约接受了 8 次心理治疗课程的分量）。我们密切监督用户与系统的互动，并在危机情况（如自杀倾向）下由人类提供护理。我们发现，每个组的所有临床终点均出现了显著的症状减轻，其效应值接近于精神医学文献中针对这些病症的所有治疗模式中最好的循证系统。我们还发现用户与系统之间建立了强大的治疗联盟，这与患者与人类医疗提供者之间的关系非常相似。
照片：由 NICHOLAS JACOBSON 提供
总之，我们精心设计的生成式 AI 系统成功地以安全且有效的方式提供了金标准干预，并取得了具有实际意义的现实结果。我们预计，这一干预措施可能会导致该领域发生机制性的变革，因为大约一半的精神科患者已经在利用不提供此类循证护理的通用生成式 AI 基础模型进行治疗 (13)。我们致力于寻找解决全球心理健康危机的方案，并继续研究这些系统在其他一系列病症中的有效性，以及如何在全球服务不足的地区扩大这些系统的覆盖范围。
参考文献与注释
技术与行为健康中心，盖塞尔医学院，达特茅斯学院，美国新罕布什尔州汉诺威。电子邮箱：nicholas.c.jacobson@dartmouth.edu
入围者
Nicholas C. Jacobson 在特루曼州立大学获得了学士学位，在宾夕法尼亚州立大学获得了博士学位。在马萨诸塞州总医院/哈佛医学院完成博士后研究员工作后，他于 2019 年在达特茅斯学院盖塞尔医学院的技术与行为健康中心和生物医学数据科学系建立了自己的实验室。他的研究利用生成式人工智能来规模化精准的循证心理治疗，以应对全球心理健康危机。 www.science.org/doi/10.1126/science.aeh4808
10.1126/science.aeh4808
碳循环 巨变 阿拉尔海曾是世界第四大内陆水体，如今由于其两条主要补给支流被分流用于灌溉农业，这里成为了全球最大的暴露干涸湖床。这种干涸对其沉积物中蕴含的大量碳储量产生了怎样的影响？Marcé 等人表明，阿拉尔海已从碳汇转变为碳源，并量化了自 20 世纪 60 年代初湖泊开始萎缩以来，这些沉积物中有机碳的损失量。如果剩余的淹没沉积物也变得干涸，其产生的碳排放量可能是已经发生损失量的 3 倍。—Jesse Smith
由于河流输入流量减少导致大面积区域暴露并干涸，阿拉尔海已成为碳排放源。
纳米材料 几何形状决定 相态与织构 控制材料如何在液态与固态之间转换是材料科学的基础，但其原子尺度的机制仍不清晰，特别是在表面影响成核的受限空间中。Cui 等人利用原位透射电子显微镜，在可调的纳米级间隙中捕捉并操纵单个铋纳米团簇。他们观察到，仅由团簇的长宽比而非其体积驱动的，在准无定形、晶态和液态之间的可逆转换。这种几何控制还决定了所得纳米线的晶体学织构。—Jack Huang
[[IMG_XXXX]] 照片：AP PHOTO/ EBRAHIM NOROOZI
细胞生物学 核内 aKG 调节 $\alpha$-酮戊二酸 (aKG) 是一种被酶用于化学修饰染色质的代谢物，从而确保适当的基因调节。然而，aKG 如何供应给核内的这些酶尚不清楚。Sternisha 等人将一种来自细菌的 aKG 感知转录因子转移到人体细胞中，以监测核内 aKG。他们发现，线粒体中由谷氨酸-丙酮酸转氨酶 2 产生的 aKG 是穿梭至细胞核的 aKG 的关键来源。该酶的功能缺失突变会导致染色质结构失调，以及大脑发育所需基因的错误表达。—Stella M. Hurtley
量子工程 用于单电子存储的 2D 材料 在单电子水平上实现稳定且可区分的量子存储长期以来一直面临挑战，原因是寄生栅极-沟道边缘电容的增加，随着器件尺寸的缩小，这显著降低了由存储电子引起的阈值电压漂移 ($\Delta V_{th}$)。Liu 等人利用原子级薄的二维材料和边缘接触的金属电极，设计了一种共面漏极-沟道-源极结构，使其在室温下实现了 0.5 伏特的非易失性 $\Delta V_{th}$。他们的工作证明了控制单电子量子行为的能力，为纳米级存储器件工程提供了广阔前景。—Yury Suleymanov
神经生理学 树突独立性 在神经元中，树突积极地参与神经计算，并与细胞体之间维持协作相互作用的平衡。然而，树突在行为相关信息处理中的精确贡献
仍有待阐明。 Noguchi 等人利用啮齿动物体内超快电压成像技术，在动物进行虚拟现实引导导航的同时，确定了海马体 CA3 锥体神经元的树突和胞体对信息处理的贡献。结果表明，树突分支充当一个独立的功能单元，可以根据行为条件与胞体区域耦合或脱钩。基于这些结果，作者得出结论，CA3 锥体神经元能够进行局部树突计算。——Mattia Maroso
蛋白质工程 设计非天然 CRISPR 变体 酶的设计与工程具有挑战性，部分原因是提高催化活性的方法很少，但损害活性的方法很多。具备进化意识的方法可以利用我们已知的天然序列集信息，引导生成更多可能保留功能的工程化多样酶。Skopintsev 等人演示了使用逆蛋白质折叠模型对 RNA引导核酸酶进行工程化改造。通过对其方法推荐的候选者进行筛选，结果显示基因编辑活性有所提高。一项实验结构揭示了工程酶中构象动力学是如何改变的，从而稳定了关键的 RNA-DNA 界面。——Michael A. Funk
代谢 一种触发甘油三酯合成的肝脏信号 肝脂肪变性可能由甘油三酯过量产生引起。Kwon 等人发现，小鼠肝细胞和肝脏中的甘油 3-磷酸不仅被纳入甘油三酯中，而且还能刺激由碳水化合物合成甘油三酯，这一过程被称为从头脂质合成（de novo lipogenesis），由营养感应蛋白复合物 mTORC1 调节。甘油 3-磷酸主要由甘油激酶作用于甘油在肝细胞中产生，而甘油激酶在肥胖时会增加。在小鼠中，肝细胞特异性缺失甘油激酶会减少肝脏中的甘油三酯合成、储存以及从头脂质合成。——Wei Wong
Sci. Signal. (2026) 10.1126/scisignal.aeb7989
电子材料 高导电性 NbAs 纳米线 拓扑韦尔半金属砷化铌 (NbAs) 纳米线的导电性是体材料的三到四倍。Cheon 等人利用热机械纳米模塑技术生长出直径小至 40 纳米的单晶纳米线。这些稳定的纳米线还具有良好的击穿电流密度和热导率，使其能够应用于电子器件的互连。——Phil Szuromi
物理学 钴磁子 进入狄拉克态 石墨烯中的电子表现得像无质量的狄拉克粒子，这一特性产生了不寻常的传输现象。磁性材料可以承载类似的波，称为磁子，但在简单的金属薄膜中寻找狄拉克磁子一直很困难。Zakeri 等人研究了原子级厚度的钴薄膜，发现其磁子形成了类狄拉克交叉，尽管钴是一种金属磁体，在这种材料中此类波通常会被阻尼。由第一原理计算支持的测量结果表明，薄膜的对称性和厚度控制着这些磁状态。该工作确立了单质钴薄膜作为研究高频拓扑磁子的平台。——Bharat Jalan
编辑：Corinne Simonti 和 Jesse Smith
认知 雌性的灵活性 认知灵活性是指适应意外事件并在不同选择之间切换的能力。Glewwe 等人使用基于触摸屏的任务来测试雌雄小鼠的认知灵活性。在这次测试中，动物必须尽快适应规则切换以获得奖励。雌性动物能够比雄性动物执行更多的规则转移且错误更少。计算建模表明，雌性小鼠灵活性增加是因为她们对新规则的承诺速度更快。矛盾的是，增强的选择稳定性反而促进了认知灵活性。——Mattia Maroso
Neuropsychopharmacology (2026)
10.1038/s41386-026-02397-z
信号转导 处于动态迁移中的 GPCRs G 蛋白偶联受体 (GPCRs) 控制着许多生物过程，并且是关键的药物靶点。通过配体结合激活受体，会引发一系列由各种受体相关蛋白介导的复杂信号，并导致受体从细胞表面内化。此类信号事件是否以及如何调节内化，进而可能影响信号传导，目前研究较少。Rowe 等人研究了 $\mu$-阿片受体各种信号组件的调节如何影响培养的人类细胞中的受体内化。受体信号传导过程中这些因素的变化明显改变了受体内化以及信号组件的空间分布。这些发现有助于解释动态的
受体信号传导，以及一组与神经系统疾病相关的突变如何产生其影响。 —L. Bryan Ray
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2026)
10.1073/pnas.2524866123
有机化学 硼将环氧化合物转化为环丙烷 H. C. Brown 和 Georg Wittig 因分别发现使用硼和磷来修饰碳化合物的截然不同的反应类型而共同获得 1979 年诺贝尔化学奖。在某种形式的“重聚”中，Tao 等人现在报道了一种硼试剂，可在环氧化合物上实现 Wittig 型反应，用碳取代氧。在溴化锌的协作下，被两个硼酸酯取代的碳亲核试剂攻击
照片：PATRICK JUNG
一系列环氧化物，并以近乎完美的立体反转取代氧原子。这种形成环丙烷的反应是对一种更古老的、基于磷的方法的补充，后者在操作时具有立体保持特性。——Jake S. Yeston
J. Am. Chem. Soc. (2026)
10.1021/jacs.6c03854
医学中的 AI 疾病风险的频谱图像 在临床医学中，疾病通常以二元方式诊断，即存在或不存在。然而，现实情况要复杂得多，大多数疾病存在于风险因素、症状和生物指标的连续光谱之中。为了理解这种复杂性，Forrest 等人开发了一种名为 SHIMMER 的机器学习方法，该方法分析患者电子健康记录中的数据，从而得出一个“频谱健康指数”。该指数不是一个单一的数字，而是一个视觉显示，展示了给定患者在各种医疗状况光谱中所处的位置，为量化每位患者的疾病负担以及尚未诊断疾病的风险程度提供了一种直观的方法。 ——Yevgeniya Nusinovich
Med (2026) 10.1016/j.medj.2026.101150
交互式材料 像细胞一样传输信号 细胞的空间排列影响它们接收、传输和解释信号的方式。模拟细胞间通讯的人造系统有助于理解细胞的物理组织如何影响其集体行为，但多个人工体的精确寻址非常困难。Nishiyama 等人报道了一个微流控平台，其中充当人工细胞单元的水凝胶通过 DNA 结合。水凝胶的尺寸、形状和排列可以轻松控制。该周期性阵列可以通过催化信号放大在局部被激活或抑制，从而产生截然不同的荧光模式。这证明了一个可编程的实验框架，能够模拟细胞间通讯。——Sumin Jin
ACS Nano (2026) 10.1021/acsnano.5c20505
自然保护 寻找“幽灵犬”
即便在剩余的最大森林仍继续受到大规模毁林威胁的情况下，仍然有许多我们知之甚少的物种。尽管许多此类物种体型较小，但一个体型较大且极具吸引力的例子是短耳犬 (Atelocynus microtis)，它是世界上最不为人知的犬科动物之一。Wallace 等人通过研究记录、访谈当地居民以及在秘鲁南部和玻利维亚设置红外相机陷阱，对该物种进行了迄今为止最大规模的调查。他们发现该物种的出现和丰度随时间而变化，包括之前未被认识到的对完整森林的偏好。增加我们对这些冷门物种的了解仍然是一个重要目标，但更重要的是意识到，通过保护森林，即使在对其了解不多的时候，我们也在保护这些物种。 ——Sacha Vignieri
转录组学 (TRANSCRIPTOMICS) 看不到尽头的探索 尽管已有许多分析基因表达的研究，但我们尚未全面掌握这种调控图谱在不同组织和多样化人群中的具体情况。Orchard 等人识别了数千个与基因表达水平和剪接相关的变异，涉及全血、多种血细胞、鼻上皮和肺部这 6 种组织。本研究中捐赠者具有更多样化的祖先血统，这可能有助于发现此前未被识别的变异。尽管他们对全血进行了样本量充足的组织分析（包括近 6500 名捐赠者），但变异的发现尚未饱和，这表明仍有大量尚未被识别的变异在影响基因调控。—Corinne Simonti
地震学 (SEISMOLOGY) 潮汐关键的转换断层 海洋转换断层与洋中脊垂直，在洋脊通过火山活动形成新地壳时调节滑动。沿东太平洋一个上升带的海底实验表明，这些断层促进了岩浆流体与月球潮汐之间的通信。Yang 等人分析了 3 年的海底地震仪数据，发现两次地震之间，断层产生的震颤与潮汐应变同步。这种震颤-潮汐耦合在地震时会被打破，因为孔隙压力被释放，岩浆流体随之进入。随后裂缝像阀门一样重新密封，压力重建，震颤-潮汐连接重置，循环再次开始。—Angela Hessler
免疫学 (IMMUNOLOGY) T 细胞受体的一种配体 刺激 $\gamma\delta$ T 细胞（一种非传统的适应性免疫细胞）发育和功能的分子尚未得到充分表征。$\gamma\delta$ T 细胞受体 ($\gamma\delta$TCR) 除了通过可变区识别配体外，还能通过生殖系编码区域与蛋白质相互作用，这种类似于先天免疫的识别也被称为非克隆生成相互作用。Ye 等人进行了一项筛选，以识别小鼠 $\gamma\delta$TCR 的配体。白细胞介素-17 受体 A 链与大多数 $V\gamma 4V\delta 7$ TCR 结合，而 $V\delta 7$ 中的生殖系编码序列是该相互作用的关键决定因素。该受体控制了类 T helper 1 $\gamma\delta$ T 细胞的发育、成熟和稳态，有助于塑造小鼠体内的 $\gamma\delta$ T 细胞群。—Sarah H. Ross
癌症免疫学 (CANCER IMMUNOLOGY) 树突状细胞引导 TLS 发育 三级淋巴结构 (TLSs) 是在非淋巴组织中积累的免疫细胞集群。TLSs 可以在肿瘤组织等慢性炎症部位发育，且与癌症免疫治疗的良好反应相关。然而，支配 TLSs 形成的机制仍不清楚。Mattiuz 等人对人类肿瘤进行了空间分析，并报告了 1 型常规树突状细胞 (cDC1s) 在 TLSs 发育中的关键作用（见 Decker 的观点文章）。TLSs 的早期形成依赖于在肿瘤引流淋巴结中由 cDC1s 启动的 T 细胞。
编辑：Michael Funk
相比之下，TLSs 的持久存在需要 cDC1 在肿瘤内积累，并通过向 $\text{CD}4^+$ 和 $\text{CD}8^+$ T 淋巴细胞呈递抗原，以维持 B 细胞和 T 细胞的效应反应。这些发现强调了 cDC1s 是癌症中 TLS 功能的关键调节因子。—Priscilla N. Kelly
衰老 调节巨噬细胞 以延缓衰老 炎症增加与衰老相关，并导致衰老组织的功能下降。Tan 等人探讨了老年组织驻留巨噬细胞的变化，并研究了这些细胞如何导致小鼠出现衰老表型（见 FitzGerald 的观点文章）。他们发现，这些细胞中的脂质信使前列腺素 E2 的信号传导有所增加。在多种小鼠组织中，防止组织驻留巨噬细胞的增加有助于维持线粒体功能，并限制了衰老的其他有害影响。组织驻留巨噬细胞通过清除凋亡和受损细胞来帮助减轻炎症。抑制前列腺素 E2 信号传导的结果之一是恢复了对衰老中性粒细胞的清除。这些结果强调了巨噬细胞和中性粒细胞清除在衰老过程中组织功能障碍中可能扮演的角色。 —L. Bryan Ray
分子物理学 低温放射性分子 包含变形的梨形原子核的原子和分子的光谱分析，可能能够提供对超越标准模型物理学的见解，因为此类原子核对对称性破缺具有增强的敏感性。含镭分子是这些研究的首选候选对象，但它们仍然是精密光谱学的难点。Conn 等人在一台台式设备中实现了单氢氧化镭-226、单氘氧化镭和单氟化镭分子的产生、冷却及高分辨率激光光谱分析（见 Caldwell 的观点文章）。该方法预计可轻松扩展到广泛的短寿命放射性同位素和复杂的分子结构。—Jelena Stajic
古生物学 一颗关键的牙齿 哺乳动物的牙齿在个体内部和物种之间，根据其饮食的不同，在形态和功能上各不相同。在哺乳动物（尤其是食肉目）进化中，一颗具有显著重要性的牙齿是三尖臼齿，它兼具粉碎和切割功能。Chatar 等人研究了 250 个物种的该牙齿，发现真正的双重功能在不到 1% 的物种中存在。相反，大多数物种进化出了一种权衡机制，优先考虑其中一种功能，从而导致了专业化而非双重功能。 —Sacha Vignieri
太阳能电池 通往组件的 稳健路径 一种能够防止早期沉积的钙钛矿区域在环境条件下过早降解的方法，消除了方向性的不均匀性，并实现了高效且耐用的组件运行。Gao 等人通过添加 3-脲基丙基三甲氧基硅烷，在沉积过程中稳定了甲脒铅碘的 $\alpha$ 相；该物质缓冲了水分侵入并使结晶均匀化，但仍允许晶粒继续生长。叶片涂布组件（100 平方厘米）的能量转换效率为 21.5%，且在 85°C 的湿热测试下运行 2300 小时后，仍保留了 90% 以上的效率。—Phil Szuromi
免疫疗法 胶质瘤的 B 细胞计划 针对胶质母细胞瘤的抗程序性细胞死亡蛋白 1 (anti-PD-1) 免疫疗法的治疗成功率有限，但细胞毒性 T 淋巴细胞相关蛋白 4 (CTLA-4) 免疫检查点阻断显示出潜力。Kim 等人证明，在小鼠胶质母细胞瘤模型中，B 细胞对于 CTLA-4 阻断后的抗肿瘤反应至关重要。治疗增加了肿瘤引流淋巴结中 T 滤泡辅助细胞的分化，从而刺激抗体分泌细胞系统性地产生胶质母细胞瘤特异性类别转换抗体。肿瘤反应性抗体在肿瘤内聚集，并标记癌细胞以供瘤内巨噬细胞进行吞噬作用，从而促进肿瘤清除。这些发现揭示了肿瘤引流淋巴结在协调 B 细胞和抗体依赖性抗肿瘤反应中的关键作用，强调了癌症治疗中体液免疫与细胞免疫之间的相互作用。—Leoma Bere
Sci. Immunol. (2026) 10.1126/sciimmunol.adz2494
考古学 你来自哪里？ 在 1807, 年《废除奴隶贸易法》出台后，英国皇家海军将圣海伦娜岛 (St Helena) 用作拦截奴隶船行动的 staging ground（集结地）。许多获释的非洲人随后迁走，但约 8000 人在获释后不久在该岛去世，可能死于疾病。Wang 等人利用撒哈拉以南非洲的同位素数据、古 DNA 和历史记录，鉴定出埋葬在圣海伦娜岛的 152 名获释非洲人的来源（参见 Bentley 的 Perspective 评论）。预测大多数个体来自中非西部，尽管有些人可能来自更深远的内陆，少数人甚至具有童年时期大规模迁徙的同位素特征。这些结果表明，结合此类证据将有助于未来的遗骸遣返。—Corinne Simonti
神经炎症 Treg 细胞的双重作用 能够同时抑制自身反应性 T 细胞和 B 细胞并促进髓鞘修复的双作用疗法，是多发性硬化症治疗开发的一个重点。涂有自身免疫疾病相关肽-主组织相容性复合体 (pMHCII-NPs) 以诱导调节性 T 细胞 (Treg 细胞) 的纳米颗粒，已在多发性硬化症小鼠模型中显示出治疗效果。但这些 pMHCII-NPs 的治疗效果是仅仅基于自身免疫调节，还是也涉及组织再生，目前尚不清楚。Clarke 等人利用小鼠模型表明，pMHCII-NP 治疗减轻了自身免疫诱导的中枢神经系统病变和炎症，增加了少突胶质细胞的数量，并促进了髓鞘再生。一系列细胞类型特异性功能缺失实验证明，Treg 细胞产生的 amphiregulin 以及少突胶质细胞上相应表皮生长因子受体的表达，是观察到治疗效果所必需的。这表明该途径可作为双作用疗法的靶点。—Daniela Neuhofer
Sci. Transl. Med. (2026) 10.1126/scitranslmed.aef2269
TOPMed 中表达与剪接数量性状位点的跨队列分析
表达
性状
Peter Orchard 等
引言：大多数与人类复杂性状相关的遗传变异发生在非编码基因组区域。这增加了对全基因组关联研究 (GWAS) 中确定的变异-性状关联进行解释的难度。分子数量性状位点 (QTL) 分析可检测遗传变异与分子性状（如基因表达 [eQTL] 或 RNA 剪接 [sQTL]）之间的关联，这些分析可与 GWAS 结果相结合，以提名 GWAS 信号背后的基因和分子机制。该策略已成功应用于现有的 GWAS 数据集，但许多 GWAS 信号仍缺乏已知的 e/sQTL 共定位。
基因
机制
基因
理论依据：美国国家心、肺和血液研究所 (NHLBI) 的精准医学传输计划 (TOPMed) 产生了 14,324 份人类 RNA 测序样本，其中 12,863 份经过了基因分型。该数据集能够在六种组织和细胞类型中进行顺式 (cis-) 和反式 (trans-) eQTL 及 sQTL 分析，其中样本量最大的是全血 (n = 6454) 和肺 (n = 1291)。由此产生的顺式和反式 e/sQTL 可以与 GWAS 信号共定位，并可用于研究研究参数对 e/sQTL 信号发现及下游 GWAS 共定位分析的影响。
基因型
A/C
结果：我们进行了精细映射，在每个组织或细胞类型中识别出高达 69,766 个顺式 eQTL 和 35,770 个顺式 sQTL。通过下采样分析，我们表明即使在样本量为 6454 时，eQTL 信号的发现也未达到饱和，尽管具有至少一个 eQTL 的基因数量已达到饱和。在全血中，69,766 个顺式 eQTL 里的 11,164 个是由在与人类基因组多样性面板 (HGDP) 欧洲人群遗传相似度较高的人群中罕见（次等位基因频率 < 0.001）的变异所驱动的，这强调了遗传多样性在 eQTL 研究中的重要性。
TOPMed eQTLs 1. 测试遗传变异与 TOPMed 基因表达及 RNA 剪接的关联
对 UK Biobank 性状-变异关联进行精细映射
将 e/sQTL 与 GWAS 共定位，以提名介导基因和
A TOPMed e/sQTL 数据集及其在 GWAS 信号解释中的应用。我们生成了一个遗传多样性的 e/sQTL 数据集，并将其与来自 UK Biobank 的 164 个性状的 GWAS 数据相结合，为 10,611 个 GWAS 信号提名了基因。通过下采样分析以及与外部数据集的比较，我们表明 e/sQTL-GWAS 共定位分析严重依赖于 eQTL 的研究设计。
UK Biobank GWAS
表型性状 基因型
机制。
我们对来自 UK Biobank 的 164 个性状的 GWAS 数据进行了精细映射，并将由此产生的 34,107 个精细映射 GWAS 信号与 TOPMed e/sQTL 信号共定位，为 10,611 个 GWAS 信号识别出了共定位。我们证明了 e/sQTL 样本量、e/sQTL 信号发现以及具有已知 e/sQTL 共定位的 GWAS 信号数量之间存在强相关性，并将 TOPMed e/sQTL-GWAS 共定位结果与 GTEx e/sQTL-GWAS 共定位结果进行了比较，以证明 e/sQTL 组织和细胞类型的广度对 GWAS 共定位发现的主要影响。
具有 e/sQTL 共定位的 GWAS 信号
结论：TOPMed e/sQTLs 代表了一个高质量的 GWAS 共定位数据集。然而，随着可用样本量以及组织和细胞类型的增加，仍有许多 e/sQTL 信号有待发现，我们预期该方法将揭示许多目前未知的 e/sQTL-GWAS 共定位。
*通讯作者：Stephen C. J. Parker (scjp@ umich. edu) 引用本文为 P. Orchard et al., Science 393, eadx2989 (2026). DOI: 10.1126/science.adx2989
检查 eQTL 研究参数对 eQTL 发现的影响
增加 eQTL 样本量 发现的 eQTL 信号
增加分析的 组织数量
eQTL-GWAS 共定位分析
全文及作者所属单位列表： https://doi.org/10.1126/ science.adx2989
被提名的 中介基因
TOPMed 中表达与剪接定量性状位点的跨队列分析
Peter Orchard1, Thomas W. Blackwell2,3, Linda Kachuri4, Peter J. Castaldi5, Michael H. Cho5, Stephanie A. Christenson6, Peter Durda7, Stacey Gabriel8, Craig P. Hersh5,9, Scott Huntsman10, Seungyong Hwang11†, Roby Joehanes12,13, Mari Johnson14, Xingnan Li15,16, Honghuang Lin13,17, Ching- Ti Liu18, Yongmei Liu19, Angel C. Y. Mak10, Ani W. Manichaikul20, David T. Paik21, Aabida Saferali5, Joshua D. Smith22, Kent D. Taylor23, Russell P. Tracy24, Jiongming Wang2, Mingqiang Wang21, Joshua S. Weinstock25, Jeffrey Weiss22, Heather E. Wheeler26,27, Ying Zhou14, Sebastian Zöllner2,3,28, Joseph C. Wu21, Luisa Mestroni29, Sharon Graw29, Matthew R. G. Taylor29, Victor E. Ortega30, W. Craig Johnson31, Weiniu Gan32, Goncalo Abecasis2,3, Deborah A. Nickerson22,33, Namrata Gupta8, Kristin Ardlie8, Prescott G. Woodruff6,34, Russell P. Bowler35, Deborah A. Meyers36, Alex Reiner37, Charles Kooperberg14, Elad Ziv10,38,39, Ramachandran S. Vasan13,40, Martin G. Larson13, L. Adrienne Cupples13,18, Edwin K. Silverman5,9, Stephen S. Rich20, Nancy Heard- Costa41, Hua Tang11, Jerome I. Rotter23, Albert V. Smith2,3, Daniel Levy12,13, NHLBI TOPMed Consortium Multi- Omics Working Group32, NHLBI TOPMed Consortium32§, François Aguet8‡, Laura J. Scott2,3‡, Laura M. Raffield42‡, Stephen C. J. Parker1,2,43*‡
据推测，大多数与复杂性状相关的遗传变异都通过调节基因表达起作用。为了理解基因表达变异背后的遗传机制，我们对来自精准医学传输计划 (TOPMed) 的 14,324 份 RNA 测序样本进行了表征，并在六种组织和细胞类型中进行了表达与剪接定量性状位点 (e/sQTL) 分析，包括全血 (n = 6454) 和肺 (n = 1291)。我们检测到了数万个次级顺式 e/sQTL，表明次级顺式 e/sQTL 的发现尚未饱和。我们对来自 UK Biobank 的 164 个性状的全基因组关联研究 (GWAS) 信号进行了精细定位，并为 10,611 个 GWAS 信号识别了 e/sQTL 共定位，其中包括 7096 个与次级 e/sQTL 共定位的信号。我们的结果表明，更大规模的 e/sQTL 分析将发现更多的次级 e/sQTL，从而进一步助力 GWAS 的解读。
大多数与人类复杂性状相关的遗传变异发生在非编码基因组区域 (1)。这增加了对全基因组关联研究 (GWAS) 中识别出的变异-性状关联进行解读的难度。尽管 GWAS 信号通常使用最近基因的名称进行注释，但仍需要更多数据来确定受性状相关变异影响的基因。分子定量性状位点 (QTL) 分析可检测遗传变异与分子性状（如基因表达 (eQTLs) 或 RNA 剪接 (sQTLs)）之间的关联。由于非编码 GWAS 变异通常通过转录组起作用，因此 e/sQTL 分析是解读 GWAS 信号中分子事件级联反应的关键步骤。
e/sQTL 研究在理解基因调控和 GWAS 信号方面做出了重要贡献 (2–7)。近期的研究包括 GTEx 联盟 (3)，该联盟在 49 种组织和细胞类型中进行了 e/sQTL 分析，其中最多有 706 个人拥有 RNA 测序 (RNA-seq) 数据；eQTLGen 联盟 (6) 拥有 31,684 个人全血和外周血单个核细胞 (PBMC) 的 RNA-seq 和微阵列数据；INTERVAL 研究 (5) 对 4732 个人全血 RNA-seq 进行了 e/sQTL 分析；以及 DIRECT 联盟 (2)，该联盟对 3029 个人血液 RNA-seq 进行了 e/sQTL 分析。
这些研究存在重要的局限性。在任何单一 GTEx 组织中，最大的样本量为 706，这限制了检测微弱遗传效应的效能。GTEx 捐赠者中共有 84.6% 以及 INTERVAL 和 DIRECT e/sQTL 分析中 100% 的捐赠者为欧洲血统，这限制了检测在欧洲样本中低频遗传变异所驱动的 e/sQTL 的效能。eQTLGen 存在技术局限性：该研究是对 37 项独立研究的元分析，其中许多研究使用阵列对基因表达和基因型进行分析。基因表达谱分析和基因分型平台这种异质性增加了跨队列分析的复杂性；因此，尽管预计许多基因具有一个以上的 eQTL 信号 (3, 8)，但 eQTLGen 并未尝试为每个基因识别超过一个 eQTL 信号（即没有次级 eQTL 信号）。此外，eQTLGen 未尝试检测 sQTL。
美国国家心脏、肺和血液研究所 (NHLBI) 的精准医学传输计划 (TOPMed) 对来自 >85 个表型和种族多样化队列的 >180,000 个样本进行了全基因组测序 (WGS)，生成了一个庞大的遗传变异数据集 (9)。在本研究中，我们对 14,324 个 TOPMed RNA-seq 样本进行了表征，并利用现有基因型在六种组织和细胞类型中进行了 cis- 和 trans- eQTL 及 sQTL 分析（图 1, A 和 B），目标如下：(i) 生成一个大型、高质量的 e/sQTL 参考数据集，以及 (ii) 探索在更大样本量下对次级 e/sQTL 信号的发现，并表征这是否有利于 e/sQTL-GWAS 共定位分析。我们发现，全血 (n = 6454) 和肺 (n = 1291) 中可用于 e/sQTL 分析的大规模 TOPMed 样本量，结合我们的巨型分析方法（直接合并所有研究的数据，而非进行元分析），能够比以往的研究检测到更多的次级 cis-e/sQTL 信号。我们表明，即使拥有 6454 个全血样本，次级 cis-eQTL 和原发 trans-eQTL 信号的发现尚未达到饱和，尽管 cis-eGene 的发现已经饱和。我们发现，大多数发现的 trans-eQTL 与 cis-e/sQTL 共定位，这与 cis 信号通常介导 trans 信号的假设一致。我们对来自 164 个性状的 34,107 个 UK Biobank (UKBB) 衍生 GWAS 信号进行了精细映射 (10–12)，并比较了 TOPMed 和 GTEx e/sQTL 之间的 GWAS 信号共定位情况（图 1C）。在 2308 个具有 TOPMed cis-e/sQTL 共定位但无 GTEx cis-e/sQTL 共定位的 GWAS 信号中，有 1200 个仅与次级 TOPMed cis-e/sQTL 共定位，这证明了能够进行广泛次级 e/sQTL 信号发现的更大 e/sQTL 样本量显著提高了我们识别 e/sQTL-GWAS 共定位的能力。
结果 样本人口统计学 我们对 TOPMed 计划的 14,324 个样本进行了 RNA-seq，其中包括来自 10,195 名具有 WGS 衍生基因型捐赠者的 12,863 个样本。RNA-seq 样本代表了六种组织类型和八个 TOPMed 队列（图 S1 及补充材料）。除全血（包含来自六个队列的样本）外，每种组织的样本均来自单一 TOPMed 队列。样本特征（如性别、年龄以及与人类基因组多样性计划 (HGDP) 参考人群 (13) 的遗传相似性）在不同组织之间存在差异（图 S1 和 S2）。
对于每个样本，我们根据与七个推断的 HGDP 祖先成分 (13) 的遗传相似性将捐赠者的基因组划分为片段（撒哈拉以南非洲 (HGDP-AFR)；美洲原住民 (HGDP-AMR)；东亚 (HGDP-EAS)；欧洲 (HGDP-EUR)；大洋洲 (HGDP-OCN)；中东 (HGDP-MES)；以及中亚和南亚 (HGDP-SAS)；图 S2）。大多数肺和鼻上皮样本显示出高度的遗传
图 1. 研究设计。(A) 按 TOPMed 研究和组织划分的 cis- 和 trans- e/sQTL 扫描的 RNA-seq 样本量。完整的 TOPMed 研究名称及其相应缩写为：弗雷明汉心脏研究 (FHS)；拉丁裔哮喘患者基因-环境与混合研究 (GALA II)；非裔美国人、哮喘、基因与环境研究 (SAGE)；COPD 研究中的亚群和中间结果衡量 (SPIROMICS)；女性健康倡议 (WHI)；COPDGene 研究 (COPDGene)；多民族动脉粥样硬化研究 (MESA)；以及肺组织研究联盟 (LTRC)。该图表使用 SankeyMATIC 生成。(B) cis- e/sQTL 扫描测试了基因 TSS 1 Mb 范围内 MAF ≥ 0.01 的变异（对于全血，还进行了变异 MAF ≥ 0.001 的扫描）。Trans 扫描测试了位于不同染色体上的变异-基因对（变异 MAF ≥ 0.05）。剪接表型（内含子切除率）使用 LeafCutter 导出。(C) cis- e/sQTL 信号与 trans- e/sQTL 信号共定位，以提名介导 trans 效应的基因；且 cis- 和 trans- e/sQTL 信号与来自 164 个 UK Biobank 性状的 34,107 个 GWAS 信号共定位，以提名 GWAS 信号背后的基因和分子机制。
与 HGDP-EUR 的相似性：对于 87.0% 的肺样本和 91.1% 的鼻上皮样本，至少 90% 的基因组显示出与 HGDP-EUR 的最大相似性。总共 50.8% 的全血样本在至少 90% 的基因组范围内呈 HGDP-EUR 样，而对于 46.7% 的样本，没有任何单一推断的祖先成分占基因组的 90% 以上（通常基因组的相当一部分显示出与 HGDP-EUR、HGDP-AFR 或 HGDP-AMR 的最高相似性）。仅源自多民族动脉粥样硬化研究 (MESA) 队列的三种组织和细胞类型（PBMC、单核细胞和 T 细胞）在遗传相似性基础上具有最高异质性。最显著的是，在 PBMC 样本中，31.7% 在至少 90% 的基因组范围内呈 HGDP-EUR 样，6.5% 在至少 90% 的基因组范围内呈 HGDP-AFR 样。
1密歇根大学计算医学与生物信息学系，安娜堡，密歇根州，美国。2密歇根大学公共卫生学院生物统计系，安娜堡，密歇根州，美国。3密歇根大学公共卫生学院统计遗传学中心，安娜堡，密歇根州，美国。4斯坦福大学医学院流行病学与人群健康系，斯坦福，加利福尼亚州，美国。5哈佛医学院布里格姆和妇女医院网络医学查宁分部，波士顿，马萨诸塞州，美国。6加州大学旧金山分校医学院肺部、危重症护理、过敏和睡眠医学分部，旧金山，加利福尼亚州，美国。7佛蒙特大学拉纳医学院病理学与实验室医学系，伯灵顿，佛蒙特州，美国。8麻省理工学院和哈佛大学博德研究所，剑桥，马萨诸塞州，美国。9哈佛医学院布里格姆和妇女医院肺部和危重症护理医学分部，波士顿，马萨诸塞州，美国。10加州大学旧金山分校内科学系，旧金山，加利福尼亚州，美国。11斯坦福大学遗传学系，斯坦福，加利福尼亚州，美国。12美国国家卫生研究院国家心脏、肺和血液研究所人群科学分部，贝塞斯达，马里兰州，美国。13美国国家卫生研究院国家心脏、肺和血液研究所及波士顿大学弗雷明汉心脏研究，弗雷明汉，马萨诸塞州，美国。14弗雷德·哈钦森癌症中心公共卫生科学分部，西雅图，华盛顿州，美国。15西奈山伊坎医学院内科学系数据驱动与数字医学分部，纽约，纽约州，美国。16西奈山伊坎医学院内科学系肺部、危重症护理和睡眠医学分部，纽约，纽约州，美国。17内科学系，
美国马萨诸塞大学陈医学学院，Worcester, MA, USA。18波士顿大学公共卫生学院生物统计系，Boston, MA, USA。19杜克大学医学院内科心脏病科，Durham, NC, USA。20弗吉尼亚大学医学院基因组科学系，Charlottesville, VA, USA。21斯坦福大学斯坦福心血管研究所，Stanford, CA, USA。22华盛顿大学西北基因组中心，Seattle, WA, USA。23哈博-UCLA医学中心伦奎斯特生物医学创新研究所儿科学系转化基因组学与人群科学研究所，Torrance, CA, USA。24佛蒙特大学拉纳医学学院临床生物化学研究实验室，Burlington, VT, USA。25约翰霍普金斯大学生物医学工程系，Baltimore, MD, USA。26芝加哥洛约拉大学生物信息学项目，Chicago, IL, USA。27芝加哥洛约拉大学生物系，Chicago, IL, USA。28密歇根大学精神病学系，Ann Arbor, MI, USA。29科罗拉多大学安舒茨医学园区内科成人医学遗传学项目，Aurora, CO, USA。30梅优诊所呼吸与危重症医学科内科，Phoenix, AZ, USA。31华盛顿大学协作健康研究协调中心，Seattle, WA, USA。32美国国家卫生研究院国家心肺血液研究所，Bethesda, MD, USA。33华盛顿大学基因组科学系，Seattle, WA, USA。34加州大学旧金山分校心血管研究所，San Francisco, CA, USA。35克利夫兰诊所基因组科学与系统生物学系，Cleveland, OH, USA。36梅优诊所内科，Scottsdale, AZ, USA。37华盛顿大学流行病学系，Seattle, WA, USA。38加州大学旧金山分校人类遗传学研究所，San Francisco, CA, USA。39加州大学旧金山分校海伦·迪勒家庭综合癌症中心，San Francisco, CA, USA。40波士顿大学医学院内科，Boston, MA, USA。41波士顿大学乔巴尼安-阿韦迪西安医学院，Boston, MA, USA。42北卡罗来纳大学教堂山分校遗传学系，Chapel Hill, NC, USA。43密歇根大学人类遗传学系，Ann Arbor, MI, USA。*通讯作者。电子邮件：scjp@ umich. edu †现地址：韩国全北大学统计系及应用统计研究所，Jeonju, Republic of Korea。‡这些作者对本工作贡献相同。§TOPMed 联盟的作者及其所属机构列于本文末尾。
基因组的 5.2% 在至少 90% 的基因组范围内与 HGDP-EAS 相似，且对于 56.5% 的样本，没有任何单一的推断祖先成分占据基因组的 90% 以上。
主要 cis-e/sQTL 信号发现 为了鉴定与基因表达或 RNA 剪接相关的遗传变异，我们使用不相关的受试者且每个个体仅取单一时间点进行了 cis-e/sQTL 扫描（图 1, A 和 B），测试了次等位基因频率 (MAF) ≥0.01 的变异。每个组织的样本量范围从 352（单核细胞）到 6454（全血）（图 S3 和 S4）。我们采用了 mega-analysis 方法，因为我们发现该方法产生的结果与 meta-analysis 方法相似（图 S5 及补充文本）。
我们鉴定出 9330 至 19,465 个具有显著顺式 eQTL 的基因（顺式 eGene）以及 3290 至 8795 个具有显著顺式 sQTL 的基因（顺式 sGene）[5% 错误发现率 (FDR)；图 2A]。每个组织中显著顺式 e/sGene 的数量与样本量强相关。在全血和肺部（这两个组织在 TOPMed 和 GTEx 中均有分析）中，TOPMed 的顺式 e/sGene 发现率超过了 GTEx，这反映了 TOPMed 较大的样本量 [图 S6；TOPMed 全血中 19,465/22,187 个测试基因 (87.8%) 为 eGene，而 GTEx 全血中为 12,360/20,315 (60.8%)]。TOPMed 全血中顺式 eGene 的发现率与 INTERVAL 研究 [17,233/19,166 个测试基因 (90.0%) 为 eGene] 以及规模更大的 eQTLGen 研究 [16,987/19,250 个测试基因 (88.2%) 为 eGene] 相当，这表明在 TOPMed 全血样本量 (n = 6454) 之下，顺式 eGene 的发现已基本达到饱和。TOPMed 中的主要顺式 e/sQTL 信号在 GTEx、eQTLGen、INTERVAL 和 OneK1K (14) 中显示出高度的效应方向一致性（图 S7 至 S16），支持了我们结果的稳健性。鉴于许多 eQTL 的组织特异性，正如预期，匹配组织数据集之间的效应方向一致性高于不匹配的数据集（图 S16 至 S18）。
C
顺式 e/sQTL 信号的精细映射揭示了数万个次级信号 预计许多基因具有多个独立的顺式 e/sQTL，检测次级信号可以提供更全面的基因表达调节图谱，并可能增加与其他 QTL 和 GWAS 信号的共定位数量。我们使用了 SuSiE (15)
A B D
图 2. 顺式 e/sQTL 总结。(A) 每个组织的样本量（顶栏），具有显著顺式 e/sQTL 的基因数量（顺式 e/sGene）以及每个顺式 e/sGene 发现的 SuSiE 置信集数量（从顶端起第二栏），置信集大小（从顶端起第三栏），以及每个组织的初级或次级（包括三级、四级等）顺式 e/sQTL 信号数量（底栏）。(B) 顺式 eQTL 饱和分析，以及与其他已发布数据集（来自 eQTL Catalogue 或 GTEx）的比较。在每个下采样样本量下发现的顺式 eGene 数量（左）和发现的顺式 eQTL 信号总数（右；95% 置信集）。结果显示为 1% FDR 的顺式基因，因为 eQTL Catalogue 对 1% FDR 的顺式 e/sGene 进行 QTL 信号精细映射。(C) 全血顺式 e/sQTL 的功能注释富集。富集度是相对于在 MAF、LD 和测试基因数量上匹配的对照置信集计算的；误差线表示 95% 置信区间。(D) MAF 阈值为 0.1% 的全血扫描中顺式 eQTL 的效应大小（绝对等位基因倍数变化）。
以精细映射独立的 cis-e/sQTL 信号，为每个信号生成 95% 可信集。在整个研究中，“信号”指 95% 可信集，“次级信号”指任何非该基因最显著的 e/sQTL 信号（见“材料与方法”），而“顶端 PIP 变异”则指每个 95% 可信集中具有最大后验包含概率 (PIP) 的变异（在统计学上被判定为最可能是致病原因的变异）。这在每个组织中分别识别出 10,282 至 69,766 个 cis-eQTL 信号和 4992 至 35,770 个 cis-sQTL 信号（图 2A）。在全血和肺部中，与之前的研究相比，这代表了检测到信号的显著增加 [与 GTEx、INTERVAL 和 DIRECT 全血 cis-eQTL 相比，分别增加了 518.2, 22.5 和 16.3%（eQTLGen 仅报告了主要信号）；与 GTEx 肺部 cis-eQTL 相比增加了 114.4%]（图 2B）(2, 3, 16–18)。在 69,766 个全血 cis-eQTL 信号中，有 44,562 (63.9%) 在 GTEx、DIRECT、INTERVAL 或 eQTLGen 的血液样本中未被检测到（见“材料与方法”和表 S1）。在全血中，我们发现每个 cis-e/sGene 平均具有 3 个 cis-eQTL 信号和 2 个 cis-sQTL 信号（图 2A）。共有 28,715 (41.2%) 个全血 cis-eQTL 和 13,393 (37.4%) 个全血 cis-sQTL 的 95% 可信集仅包含单个变异（图 2A），与之前发表的结果相比，分辨率大幅提高 [例如，GTEx 全血 cis-eQTL 可信集中仅有 2112 (18.7%) 包含单个变异；图 S19]。
由于全血 cis-eGene 的发现已在 TOPMed 样本规模下达到饱和，我们进一步探讨了 cis-eQTL 信号的总数是否也处于或接近饱和状态。为了测试这一点，我们对全血样本集进行了下采样，并重新执行了 cis-e/sGene 的发现和精细映射
(图 2B 以及图 S20 和 S21)。顺式 e/sGene 的发现大约在 3000 个样本时开始趋于饱和，而顺式 e/sQTL 信号的总数即使在全血样本量下也未达到饱和，这表明随着样本量的增加，将发现更多的顺式 eQTL 和顺式 sQTL 信号。
通过功能注释、组织和推断祖先对顺式 eQTL 和 sQTL 进行表征 顺式 eQTL 在转录因子 (TF) 结合位点中富集，且顺式 e/sQTL 信号在剪接区域中富集，尽管与顺式 sQTL 不共定位的顺式 eQTL 未显示出剪接区域富集 (图 2C；图 S22 至 S24；以及表 S2 和 S3)。顺式 eQTL 信号在增强子、活性转录起始位点 (TSS)、侧翼活性 TSS，以及弱和强转录染色质状态中富集，而顺式 sQTL 信号则在活性 TSS、侧翼活性 TSS、弱和强转录、基因 5′ 和 3′ 端转录以及基因内增强子染色质状态中富集 (图 2C 以及图 S25 和 S26)。这与顺式 eQTL 信号比顺式 sQTL 信号更倾向于位于启动子区域且较少位于基因体内的事实一致 (图 S27)。初级和次级顺式 sQTL 信号均在剪接区域富集，但初级顺式 sQTL 的富集程度更强 (图 S28 和表 S4)。初级和次级顺式 eQTL 信号在活性 TSS 和增强子染色质状态中富集，但初级顺式 eQTL 信号在活性 TSS 中的富集程度更强 (图 S29)。
在转录因子 (TF) 激活而非抑制基因表达的情况下，破坏该 TF 基序 (motif) 的 eVariant 等位基因应与基因表达降低相关，而增强基序的等位基因应与表达增加相关。对于抑制基因表达的 TF，则预期结果相反。为了探讨这些效应，我们进行了变异敏感的基序扫描，并针对每个 TF 位置权重矩阵，记录了哪些顺式 eVariant 等位基因有利于 TF 结合，以及哪些等位基因与基因表达增加相关 (图 S30 和表 S5)。尽管已知许多 TF 在不同环境下既可作为激活剂也可作为抑制剂 (19)，但若干 TF 基序表现出的与基因表达的关联表明其具有激活倾向。最显著的是，在约 70% 的实例中，创建或增强许多 ETS 家族基序的等位基因与基因表达增加相关，这与之前在胰岛中的研究结果一致 (20)。
顺式 e/sQTL 信号可能是组织特异性的，也可能是跨组织共享的，这种共享程度可能反映了局部基因组功能在不同组织间共享的程度 (3, 21)。在一个基因在两种组织中均被测试的条件下，我们确定了肺部、鼻上皮细胞与全血之间共享信号的比例，定义为可信集重叠 (credible set overlap) (图 S31)。肺部和鼻上皮细胞的顺式 eQTL 信号与血液共享的比例分别为 46.9 和 44.7% (当使用 323 位捐赠者提供的鼻上皮和全血数据的样本子集进行量化时，共享比例较低；见补充材料)。相对于顺式 eQTL 信号，顺式 sQTL 的共享率更高 (肺部和鼻上皮细胞分别为 63.5 和 60.2%；肺部的 Fisher 精确检验 P 值为 9.98 × 10−192，比值比/odds ratio = 1.97)。初级信号比次级信号更容易被共享 (图 S31；对于肺部顺式 eQTL，Fisher 精确检验 P = 2.9 × 10−69，比值比 = 1.66)，尽管在控制信号强度后，这种差异基本消失 (图 S32)。相对于非共享信号，共享的 eQTL 信号在活性 TSS 染色质状态中显示出更强的富集，且共享
表 1. 在 HGDP- EUR 相似样本中 MAF 较低的 TOPMed eQTL 在其他大型 eQTL 资源中缺失。对于每个全血 cis-eQTL 信号，其领先 eVariant 在 HGDP- EUR 相似样本（基因组中至少 75% 显示出与 HGDP- EUR 样本最大相似性的样本）中的 MAF 是 > 还是 < 0.001，以及该 eQTL（针对同一基因）是否出现在 GTEx 全血、eQTLGen、INTERVAL 或 DIRECT cis-eQTL 中的任何一项中？
| HGDP- EUR 相似 MAF ≥ 0.001 | HGDP- EUR 相似 MAF < 0.001 | |
|---|---|---|
| TOPMed cis-eQTL 与 GTEx 全血、eQTLGen、INTERVAL 或 DIRECT 中的 cis-eQTL 重叠 | 25,058 | 146 |
以往比较不同祖先群体（通常使用与参考人群的遗传相似性进行推断）eQTL 的研究发现，大多数祖先特异性 eQTL 的基础是变异等位基因频率，而非效应大小的异质性 (22, 23, 24, 25, 26)。由于许多 eQTL 研究主要使用欧洲祖先样本，因此在欧洲人群中罕见或缺失的变异所驱动的 eQTL 预计会在许多现有数据集中缺失。因此，我们探讨了 TOPMed RNA-seq 数据的遗传多样性在多大程度上有助于发现额外的 eQTL 信号。我们发现，在 69,766 个全血 cis-eQTL 信号中，有 11,164 个源自 HGDP- EUR 相似样本（基因组中 ≥75% 显示出与 HGDP- EUR 最高相似性的样本；表 S7）中 MAF < 0.001 的变异。在这 11,164 个信号中，93% 的变异在 HGDP- AFR 相似样本（基因组中 ≥75% 显示出与 HGDP- AFR 最大相似性）中是常见的 (MAF ≥ 0.01)，且 14% 在 HGDP- AMR 相似样本（基因组中 ≥50% 显示出与 HGDP- AMR 最大相似性；见材料与方法）中是常见的，这与先前在 TOPMed 内部进行的 eQTL 分析 (24) 以及基于非洲人群相对于非非洲人群具有更大的遗传异质性和更小的连锁不平衡 (LD) 块的预期 (27, 28, 29) 一致。随后，我们探讨了由 HGDP- EUR 相似样本中罕见变异驱动的 TOPMed eQTL 是否在其他大型 eQTL 资源中更难被发现（表 1）。值得注意的是，在这 11,164 个 cis-eQTL 中，仅有 1.3% 在 GTEx、eQTLGen、INTERVAL 或 DIRECT 联盟（其中所有联盟基本或完全由欧洲样本组成）的血液 cis-eQTL 扫描中被发现；相比之下，在 HGDP- EUR 相似样本中 MAF ≥ 0.001 的 58,602 个 cis-eQTL 中，这一比例为 42.8%。两组均在 TSS 周围显示出相似的富集（图 S37），表明两者质量均较高。这证明了 TOPMed 的多样性有助于发现其他大型数据集中缺失的 e/sQTL。
较大的全血样本量使得能够发现较低 MAF 的 cis-e/sQTL 信号
由于样本量的限制，许多 cis-e/sQTL 研究仅测试 MAF 为 0.01 或更高的变异 (3, 6, 17, 20, 30, 31)。为了探讨我们检测涉及较罕见变异的 cis-e/sQTL 信号的能力，我们运行了第二组全血 cis-e/sQTL 扫描，采用了 0.001 的 MAF 阈值。通过降低 MAF 阈值，每个基因所对应的被测试变异的平均数量增加了一倍多（在 MAF ≥ 0.01 和 MAF ≥ 0.001 的 cis-eQTL 扫描中，分别为 7866 与 17,195）。值得注意的是，随着 MAF 阈值的降低，特定于 HGDP-AFR-like、HGDP-EUR-like 或 HGDP-AMR-like 样本的被测试变异比例有所增加（在考虑这三个代表性群体时，MAF ≥ 0.01 扫描中的变异占 0.2%，而 MAF ≥ 0.001 扫描中的变异占 16.7%），这主要反映了特定于 HGDP-AFR-like 样本的变异（图 S38 至 S40）。虽然 cis-e/sGenes 的数量与 0.01 MAF 阈值相比变化不大（在 0.01 和 0.001 MAF 阈值下，cis-eGenes 分别为 19,465 和 19,394，而 cis-sGenes 分别为 8795 与 8873），但检测到的总信号数量增加了约 9%（cis-eQTL 从 69,766 增加到 76,545，cis-sQTL 从 35,770 增加到 39,001）。正如预期，低 MAF 的 cis-eQTL 具有比高 MAF 的 cis-eQTL 更大的效应值 (Fig. 2D) (4)。
A
B
对于 16,217 个 cis-eQTL 和 7302 个 cis-sQTL 信号，其顶端 PIP 变异体的 MAF < 0.01，尽管其中大多数变异体在 HGDP-EUR-like、HGDP-AFR-like 或 HGDP-AMR-like 组中至少有一组是常见的 (MAF ≥ 0.01) (图 S41)。共有 7479 个 cis-eQTL 和 3290 个 cis-sQTL 信号在所有三个祖先群体中的 MAF 均 < 0.01。在所有三个祖先群体中 MAF < 0.01 的 Cis-e/sQTL 信号通常显示出与所有三组中 MAF ≥ 0.01 的信号方向相似的富集模式，但富集程度往往有所不同 (图 S42 和 S43 以及表 S8)：例如，MAF < 0.01 的 cis-sQTL 信号在剪接区域和基因增强子中的富集程度比 MAF ≥ 0.01 的信号更强 (图 S42)。
C
D
通过将 trans-e/sQTL 信号与 cis 信号整合以识别调节关系和生物通路 为了识别在 trans 模式下调节基因表达和剪接的遗传变异，我们使用位于不同染色体上的基因-变异体对进行了 trans-e/sQTL 扫描 (变异体 MAF ≥ 0.05)。检测 trans 信号比检测 cis 信号更困难，因为 trans 信号较弱，且无目标 trans 扫描涉及更高的多重假设检验负担。我们在每个组织中识别出 1 到 1725 个 trans-eGene 和 0 到 127 个 trans-sGene (5% FDR；图 3, A 和 B，以及图 S44)。饱和度分析显示，样本量与发现的 trans-eGene 数量之间存在近线性关系，表明在 TOPMed 的样本量下，trans-eGene 的发现尚未达到饱和 (图 S45)。
在全血中，经过基于 LD 的聚类 (clumping) 后，为 1725 个 trans-eGene 发现了 614 个不同的 trans-eVariant；其中 171 个变异体是 >1 个基因的 trans-eVariant (共计 1282 个 trans-eGene；表 S9)。Trans-eVariant 在错义变异和 3' 非翻译区 (UTR) 变异中富集，尽管只有一小部分与这些注释重叠 (图 S46 和 S47)。按 trans-eGene 数量排序的首位 trans-eVariant 是 rs946588154 (chr7_50342615_A_G) (chr，染色体)，它是 260 个基因的 trans-eVariant。该变异体在全血中是基因 IKZF1 和 GRB10 的 cis-eQTL 可信集变异体，且是 IKZF1 的 cis-sQTL 变异体。排名第二的 trans-eVariant
图 3. trans-e/sQTL 结果。(A) trans-eGene 和 trans-sGene 数量随样本量的函数关系。TOPMed 组织与相应的 GTEx 和 DIRECT 组织相链接。与 TOPMed 和 GTEx 不同，DIRECT 未应用 MAF 阈值。TOPMed 和 GTEx 将 trans 定义为“不同染色体”，而 DIRECT 将 trans 定义为“不同染色体或基因-变异体对距离 ≥5 Mb”。(B) 全血中 MAF ≥ 0.05 的 trans-eQTL 和 cis-eQTL 的效应大小 (绝对等位基因倍数变化) (cis-eQTL 效应大小来自 MAF ≥ 0.001 扫描)。(C) 在对原发性 trans-e/sQTL 信号周围区域 (±1 Mb) 进行精细映射时发现的 trans-eQTL 和 trans-sQTL 可信集数量。(D) 基因 AGAP2 的两个 (共三个) 全血 trans-eQTL 信号。其中一个与 RREB1 cis-sQTL 共定位，另一个包含一个 RREB1 错义变异，表明这两个变异体通过对 RREB1 产生不同的功能影响而影响 AGAP2 的表达。第三个 AGAP2 trans-eQTL 信号的可信集变异体位于 RREB1 内含子中。
在全血中，我们识别出 61 个不同的 trans-sVariant (表 S10)。全血中 trans-sGene 数量最多的四个变异体包括：rs946588154 (chr7_50342615_A_G; 16 个 trans-sGene) 和 rs1354034 (chr3_56815721_T_C; 30 个 trans-sGene)；rs6939187 (chr6_163408503_T_C; 8 个 trans-sGene)，它是基因 QKI (编码一种 RNA 剪接调节因子 (32)) 以及长非编码 RNA CAHM 的全血 cis-eQTL；以及 rs7613875 (chr3_49934081_C_A; 5 个 trans-sGene)，它位于编码剪接调节因子 RBM6 (33) 的基因上游 5.9 kb 处。
共享同一个 trans- eVariant 的不同 trans- eGenes 可能代表一个通路或网络中的基因。为了探讨这一点，我们对共享相同全血 trans- eVariant 且数量在 10 个或更多基因的组进行了基因本体 (GO) 和京都基因与基因组百科全书 (KEGG) 通路富集分析（表 S11）(34)。在 25 个此类组中，有 14 个显示出显著的 GO:BP 或 KEGG 通路富集。例如，一个针对 ERN1 基因（编码内切核酸酶 IRE1a）和 PRR29 基因（功能未知）的 cis- eVariant (rs16947425; chr17_64066984_C_A) 是 13 个 trans- eGenes 的 trans- eVariant，其中包括已知的 ERN1 下游靶点 XBP1 (35, 36) 以及 XBP1 靶基因（包括 DNAJB9）。ERN1 是内质网 (ER) 应激反应的调节因子 (35, 36)，而在 13 个 trans- eGenes 中，有 5 个处于“内质网蛋白质加工”KEGG 通路中（39.1 倍富集；名义 P = 1.0 × 10−7）。在 ER 应答通路中，IRE1a-XBP1 是保守程度最高的 (37, 38)，且在炎症和免疫反应的调节中发挥着日益重要的作用 (38–40)。这些结果表明，trans 信号可以为生物学通路提供见解。
初级和次级 trans 信号汇聚于潜在的介导基因
为了鉴定可能与潜在的调节性 cis- e/sGene 共享多个信号的 trans- e/sGenes，我们对以每个 trans- e/sGene 的主导 trans- e/sQTL 信号为中心的 2- Mb 窗口内进行了精细定位分析。
sVariant (图 3C 和表 S12)。在 2- Mb 窗口内，1876 个 trans-eGene–组织对中有 327 个具有 >1 个 trans-eQTL（146 个 trans-sGene–组织对中有 16 个）。
在全血中，trans-eVariant 在与 cis-e/sQTL 信号的重叠方面表现出富集，而 trans-sVariant 在 cis-eQTL 中富集（图 S48）。总共，32.9% 的独特全血 trans-eVariant 至少与一个全血 cis-eQTL 或 cis-sQTL 信号重叠（trans-sVariant 为 31.1%）。与 trans-eQTL 重叠的 cis-eQTL 的 cis-eGene 在 TF 基因中富集 3.7 倍 (P < 1 × 10−3；图 S49)。cis 和 trans 信号之间的重叠与“许多 trans 效应由 cis 效应介导”的假设一致。
为了为全血 trans-e/sQTL 信号提名机制和基因，我们将全血 trans 信号与 cis 信号进行共定位，并记录每个 trans-e/sQTL 置信集是否包含蛋白质改变变异或 UTR 变异（图 3D 和图 S50 至 S52）。我们还对 164 个 UKBB 性状 (10, 11) 的 34,107 个 Pan-UKBB EUR GWAS 信号 (12) 进行了精细映射（表 S13），并确定每个 trans-e/sQTL 置信集是否与血细胞丰度或其他性状的 GWAS 信号共定位（图 S50 至 S52）。仅有 15.9% 的 trans-eQTL 置信集和 16.9% 的 trans-sQTL 置信集未与 cis-e/sQTL 或 GWAS 信号共定位，且不包含蛋白质改变或 UTR 变异。总共，分别有 58.8% 和 45.8% 的 trans-eQTL 和 trans-sQTL 置信集与至少一个 cis-e/sQTL 信号共定位。对于某些具有多个置信集的 trans-eGene，这些注释表明，同一基因的不同 trans-eQTL 信号是由单个中介基因的不同功能效应引起的。例如，trans-eGene AGAP2 显示出三个 trans-eQTL，其中一个与 RREB1 cis-sQTL 共定位，另一个代表 RREB1 错义变异（图 3D）。
在所有组织中，我们发现了 30 个 cis-e/sGene，其 >1 个 cis-e/sQTL 信号与来自至少一个 trans-e/sGene 的 >1 个 trans-e/sQTL 信号共定位（158 个独特的 cis-trans 基因对）（表 S14）。例如，在肺部，两个 ENOX1 cis-eQTL 与两个 COL5A1 trans-sQTL 共定位（图 S53）。IKZF1 cis 信号占这些多重共定位基因对的 76.6% (121/158)。在 146 个基因 1 的 >1 个 trans-eQTL 与基因 2 的 >1 个 cis-eQTL 共定位的基因对中，140 (95.9%) 个基因对的效应方向在共定位信号中是一致的（增加基因 1 表达的变异要么始终增加，要么始终降低基因 2 的表达）（表 S14）。在最极端的情况下，trans-eGene BTN3A3 显示出四个全血 trans-eQTL 信号，它们与其已知调节因子 NLRC5 的四个 cis-eQTL 信号共定位；对于所有四个信号对，与 NLRC5 表达增加相关的等位基因与 BTN3A3 表达增加相关，这与 NLRC5 在激活 BTN3A3 中的作用一致 (41)。
GWAS 信号经常与二级 e/sQTL 信号共定位 为了评估该数据集在识别 GWAS 信号靶基因方面的效用，我们将所有 TOPMed cis- 和 trans-e/sQTL 信号与来自 164 个性状的 34,107 个精细映射的欧洲 Pan-UKBB GWAS 信号进行共定位（表 S13 和 S15）。我们还对 RNA-seq 数据的 HGDP-EUR 类似子集进行了 e/sQTL 扫描（图 S54, A 和 B，以及表 S16），以获得与 EUR GWAS 信号共定位的祖先群体匹配的 e/sQTL 结果。由于 e/sQTL-GWAS 整合的目标通常是解释 GWAS 信号，因此我们在此检查有多少 GWAS 信号与至少一个 e/sQTL 信号共定位，而不是反之。
共有 10,611 个 GWAS 信号 (31.1%) 在至少一种组织中与至少一个跨族群 cis- /trans- e/sQTL 共定位（SuSiE-coloc PP.H4 共定位后验概率 $\ge 0.8$；图 4, A 和 B；94.8% 的共定位 GWAS 信号仅与 cis 信号共定位，1.7% 仅与 trans 信号共定位，3.6% 与至少一个 cis 和至少一个 trans 信号共定位）。共有 9410 个 GWAS 信号 (27.6%) 与至少一个 HGDP-EUR 样 cis- /trans- e/sQTL 共定位（图 S54C），这表明在这种情况下，跨族群 e/sQTL 扫描的样本量优势超过了族群匹配的优势。
然而，我们也观察到 887 个 GWAS 信号与 HGDP EUR 样 e/sQTL 共定位，但未与跨族群 e/sQTL 共定位。我们在此重点介绍与跨族群 e/sQTL 共定位的 GWAS 共定位情况。
GWAS 信号与 e/sQTL 信号共定位比例最高的 GWAS 性状通常与组织相关性状相对应；例如，单核细胞 QTL 信号特别容易与“单核细胞计数”GWAS 信号共定位（图 S55）。共定位恢复了许多已知的基因-性状关联，并提名了新基因（补充文本和图 S56）。在全血中，分别有 5872, 3331, 524, 和 74 个 GWAS 信号与 cis- eQTL, cis- sQTL, trans- eQTL, 和 trans- sQTL 信号共定位，且数千个 GWAS 信号与多种 e/sQTL 类型共定位（图 S57）。在 10,611 个共定位 GWAS 信号中，41.9% 与来自一个以上基因的信号共定位（跨所有组织和模态）（图 S58）。在全血中，44.6% 具有共定位的 GWAS 信号仅与最近测试基因的 cis- e/sQTL 信号共定位（图 S59）。在 10,611 个 GWAS 信号中，2876 (27.1%) 仅与次级信号共定位（图 S60），且大多数 (7096; 66.9%) 与至少一个次级信号共定位，这强调了次级 e/sQTL 信号在为 GWAS 命中项提名效应基因中的重要性。
我们识别出 659 个实例，其中给定性状的多个相邻 GWAS 信号与来自同一基因且为同一 e/sQTL 类型的多个 e/sQTL 信号共定位（表 S17）。例如，IL2RA 位点的两个 cis- eQTL 信号与白蛋白/球蛋白比值的两个 GWAS 信号共定位（图 4, C 和 D，以及图 S61）。这两个 cis- eQTL 信号均为单变体可信集 (chr10_6052734_C_T; chr10_6053965_C_A)，且这些信号位于同一个 IL2RA 内含子中。此前通过 CRISPR 激活筛选表明，chr10_6052734_C_T 周围的序列可调节 IL2RA 的表达 (42)。HK1 的三个 cis- eQTL 信号与平均红细胞体积（红细胞体积；图 4, E 和 F，以及图 S62）的三个 GWAS 信号共定位。HK1 对红细胞功能至关重要；已知 HK1 的突变会导致非球形红细胞溶血性贫血 (43, 44)。在最极端的情况下，四个单核细胞计数 GWAS 信号与四个全血 CEBPB cis- eQTL 信号共定位（图 S63）；CEBPB 调节单核细胞的发育、生存和基因表达 (33, 45, 46)，尽管这些 GWAS 信号也与其他邻近基因（SMIM25 和/或 LINC01270）的 e/sQTL 信号共定位，这表明 CEBPB 可能不是该位点的目标基因，或者不是唯一的目标基因。
e/sQTL 组织多样性和样本量均对 GWAS 共定位分析有贡献
许多 GWAS 信号没有已知的 e/sQTL 共定位。对此的一种解释是，它们通过不同的分子机制影响性状。或者，GWAS 信号可能对应于一个对组织或细胞类型、时间点或环境高度特异的 e/sQTL 信号，或者 GWAS 信号可能对应于一个在数据集中过于微弱而无法被检测到的 e/sQTL 信号。为了探讨在检测 e/sQTL 与 GWAS 信号的共定位时，组织类型的广度与样本量的相对影响，我们将来自 49 种组织的 GTEx 常染色体顺式 e/sQTL 信号与 Pan-UKBB GWAS 信号进行共定位，并将结果与 TOPMed 常染色体顺式 e/sQTL 共定位结果进行了比较（图 S64）。共有 12,025 个 GWAS 信号与至少一个 GTEx 顺式 e/sQTL 共定位，而与至少一个 TOPMed 顺式 e/sQTL 共定位的信号为 10,198 个（MAF ≥ 0.01 扫描）。与 GTEx 但未与 TOPMed 顺式 e/sQTL 共定位的 GWAS 信号，其在 GTEx 组织中的共定位数量倾向于少于那些与 GTEx 和 TOPMed 顺式 eQTL 均共定位的信号，这表明这些信号反映了在受限的 TOPMed 组织集中不存在的、更具组织特异性的效应（图 S64B）。在全血中（GTEx n = 670；TOPMed n = 6454），有 2895 个 GWAS 信号与 GTEx 顺式 e/sQTL 共定位，而与 TOPMed 顺式 e/sQTL 共定位的信号为 7082 个；在肺部（GTEx n = 515；TOPMed n = 1291），GTEx 和 TOPMed 的对应值分别为 3142 和 5379。与 TOPMed 但未与 GTEx 全血顺式 e/sQTL 共定位的 GWAS 信号，倾向于与较弱的
C
图 4. e/sQTL 与 Pan-UKBB GWAS 信号的共定位。(A) 每个组织和模态中，与至少一个 e/sQTL 可信集共定位的 GWAS 信号数量（跨族群 e/sQTL 扫描）。(B) 热图显示——对于每个至少有一个 e/sQTL 共定位的 GWAS 信号——每个组织和模态的最大共定位后验概率。(C 和 D) 两个 IL2RA cis-eQTL 信号与两个白蛋白/球蛋白比值 GWAS 信号共定位。边际 P 值显示在 (C) 中，两个共定位效应（由两种颜色表示）的对数贝叶斯因子显示在 (C) 中；在 eQTL 面板中，每个变体的符号反映了在共定位 GWAS 效应中，对于 GWAS 特征-增加等位基因对基因表达的影响方向。(E 和 F) 三个 HK1 cis-eQTL 信号与三个平均红细胞体积 GWAS 信号共定位。
E F
D
比那些同时与 TOPMed 和 GTEx 全血 cis- e/sQTL 共定位的 cis- eQTLs 更多（图 S64C）。这些结果表明，组织覆盖范围以及样本量对共定位检测具有重大影响。
为了确定与全血 eQTL 共定位的 GWAS 信号数量在我们的数据集中是否已达到饱和，我们将 Pan-UKBB GWAS 信号与使用全血数据嵌套子集识别出的 cis- eQTLs 进行了共定位分析（图 S65）。我们发现，共定位的 GWAS 信号数量在当前的样本量下仍继续增加，尽管增长率在下降。这表明，在当前样本量下未与 eQTL 共定位的 GWAS 信号，在所测试组织中更大规模的 eQTL 数据集中可能会实现共定位。
讨论 在本研究中，我们展示了在 TOPMed 计划中分析的 6 种组织和细胞类型的 cis- 和 trans- e/sQTL 结果。庞大的样本量和统一处理的个体级数据（而非元分析）使得能够以高分辨率对数万个二级 e/sQTL 信号进行精细映射。
尽管很大一部分 GWAS 信号确实与 e/sQTL 共定位，但仍有许多信号没有已知的 e/sQTL 共定位。对于缺失共定位的常见解释包括：检测 e/sQTL 的效能有限、上下文环境不正确（组织和细胞类型、时间点以及环境条件），以及超出本研究所采用的 RNA-seq 方案所捕捉的基因表达和 RNA 剪接表型之外的分子机制。尽管如此，我们的分析提供了经验证据，表明效能和上下文环境将是发现更多 GWAS 共定位的重要因素。
关于效能，之前的研究已经指出，在 GWAS 和 eQTL 中发现的基因和变异之间存在系统性差异，这反映了不同的选择约束，导致每种研究类型在检测效能上存在差异 (47)。然而，随着检测 eQTL 的效能增加，这些系统性差异会缩小 (47, 48)，并且在更大规模的 eQTL 研究中，有更多数量的 GWAS 信号与 eQTL 共定位 (48)。通过子采样分析，我们证明即使在 6454 个样本的情况下，我们尚未使 cis-/trans- eQTL 的发现达到饱和，且 GWAS 共定位仍在被发现，尽管发现至少有一个共定位的新 GWAS 信号的速率确实在减慢。e/sQTL 研究效能的影响在 TOPMed 全血 eQTL 与 GTEx 全血 eQTL 共定位的 GWAS 信号数量的显著增加中也得到了体现。
关于上下文环境，我们发现，当利用全部 49 种 GTEx 组织相对于全部 6 种 TOPMed 组织和细胞类型时，GTEx 的组织类型广度导致了更多的 GWAS 信号出现共定位，这反映了许多 e/sQTL 具有组织和细胞类型特异性的事实 (3)。结合上述关于单组织内 eQTL 效能是 GWAS 共定位发现的主要限制因素的观察结果，这些结果表明，在涵盖大量组织和细胞类型且具有更大 e/sQTL 样本量的情况下，仍有相当一部分 GWAS 共定位有待被发现。
关于 trans- e/sQTL 的发现，我们发现全血 trans- eGenes 的数量（1725）明显多于 GTEx (13)，与 DIRECT (1670) 相当，但少于那些测试了更受限变异集的研究（例如，eQTLGen 检测到 6298 个 trans- eGenes，但仅测试了 10,317 个与 trait 相关的变异，而 INTERVAL 检测到 2058 个 trans- eGenes，但仅测试了 cis- eVariants）或使用了更广泛 trans 定义的研究 (4, 7)。Trans 分析的统计效能不足且容易产生伪像 (49)，导致不同研究之间 trans- eGenes 的重叠程度低于预期。TOPMed 全血 trans- eGenes 中仅有 78.1, 48.4, 和 26.9% 分别在 eQTLGen、INTERVAL 和 DIRECT 中也是 trans- eGenes（其他两两组合之间的重叠同样有限；例如，DIRECT trans- eGenes 的 58.0% 和 INTERVAL trans- eGenes 的 68.4% 是 eQTLGen 中的 trans- eGenes）。尽管这部分原因可归结为测试程序的根本差异，
这种有限的重叠也反映了这些分析的难度。尽管如此，eQTLGen、INTERVAL 和 DIRECT 的主要 trans- eQTL 中分别有 ~85, 99, 和 ~80% 在 TOPMed 中显示出相同的效应方向（不论统计学显著性如何）。使用 $\pi_1$ 统计量 (50)，我们估计 eQTLGen、INTERVAL 和 DIRECT 的主要 trans- eQTL 在 TOPMed 中复制的比例分别为 0.653, 0.984, 和 0.632。此外，TOPMed 的 trans- eQTL 热点经常与之前确立的 trans- eQTL 热点重叠（图 S66 和 S67）(7)；例如，我们的顶级 trans- eVariant rs946588154 (chr7_50342615_A_G；一个涉及 260 个基因的 trans- eVariant) 与 rs149007767 (chr7_50330658_C_T) (51) 处于完美的连锁不平衡状态（基于 LDlink 的 1000G 欧洲人群），而后者是 eQTLGen 和 DIRECT 中的 trans- eQTL 热点。DIRECT 和 TOPMed 均提名 IKZF1 和 GRB10 为可能介导 trans 效应的关联 cis- eGenes (2)。
之前的研究发现 trans- 和 cis- eQTL 信号之间存在相当大的重叠 (3, 7)，表明 trans 信号由 cis 信号介导。trans- e/sQTLs 的其他潜在潜在机制包括蛋白质序列的直接改变、转录后调节的改变 (52, 53)、细胞类型组成的改变，以及某种 trait 的改变进而影响基因表达。我们发现，在目前的样本量下，大多数 trans 信号同样具有 cis 效应，这与 cis 介导是一致的。需要更大规模的分析来评估随着检测 trans 效应的效能提高，这种情况是否依然成立，并进一步表征 trans- eVariants 的功能富集信号，而这在目前检测到的信号数量有限的情况下具有挑战性。很大一部分 trans 信号（全血 trans- eQTLs 的 36.1%）与血细胞类型丰度 trait（例如中性粒细胞计数）的 GWAS 信号共定位；在某些情况下，trans 信号可能驱动 GWAS 信号，但在其他情况下，因果关系可能相反（细胞类型丰度的变化可能导致在不同细胞类型中具有差异表达的基因看起来像是 trans- eGenes）。虽然使用基因表达主成分 (PCs) 应该能够校正细胞类型比例，但未来需要单细胞 RNA-seq e/sQTL 分析来充分剖析这些效应。未来的工作还可以纳入细胞类型比例估计，以提高效能并允许测试细胞类型相互作用效应，从而能够检测细胞类型特异性的 QTL (54)。
尽管 TOPMed 针对多种组织的样本采集来自比以往研究遗传多样性更高的群体，但类似于 HGDP-EUR 的捐赠者在本研究中仍然过多。正如我们的分析和其他 eQTL 研究所示 (22–26, 55)，更大的遗传祖先多样性将增强我们检测 eQTL/sQTL 变异的能力，这些变异在某个遗传相似性或祖先群体中较为罕见，但在其他群体中则较为常见。虽然我们利用遗传相似性阈值来推导群体差异化的等位基因频率，并突出显示在我们多祖先数据集中发现且在仅包含 HGDP-EUR 类参与者的情况下不太可能被识别的 QTL，但我们的主要分析涵盖了所有参与者，而不考虑遗传相似性分组，从而反映了所有参与者之间等位基因频率和遗传相似性的连续谱。
我们承认，离散的祖先或相似性分组可能会强化不准确的类型学思维，因此我们仅使用此类分类来指导分析后的数据展示和 QTL 注释，并以此证明纳入比许多先前 eQTL/sQTL 研究中更高比例的遗传祖先代表性的潜在优势。由于样本量有限，目前的工作无法探索与更具体的分大陆参考人群具有更细粒度遗传相似性的个体中的 eQTL，但这应在未来更大规模的研究中进行检测。同样，队列层面的统计学差异限制了我们的一部分结论；例如，全血和肺部 cis-eQTL 之间的重叠可能会受到捐赠者之间祖先、年龄和疾病表型差异的影响。
尽管几个 TOPMed 队列具有纵向数据，但本研究并未尝试利用这些数据。未来的研究可以探讨 e/sQTL 行为随时间的变化，例如 e/sQTL 与年龄之间的相互作用。由于饮食或药物等元数据通常有限，
我们没有检查任何上下文特异性（context-specific）效应。上下文特异性 e/sQTL 是一个日益受到关注的领域，并被提出作为解释 eQTL-GWAS 重叠有限的一种原因 (56)。
我们表明，尽管仍有许多 e/sQTL 等待被发现，但对 TOPMed RNA-seq 和基因型数据的联合分析能够以高分辨率定义 e/sQTL，为研究人类遗传变异效应的人员提供了强大的资源。
材料与方法 RNA-seq 映射 RNA-seq reads 被映射到 GRCh38 参考基因组。我们使用了包含 ERCC 掺入物（spike-ins）并排除 ALT、HLA 和诱饵（decoy）contigs 的 GRCh38 参考 fasta 文件，并使用了折叠后的 GENCODE v30 基因注释。该折叠注释是使用 GTEx 联盟脚本生成的：https://github.com/broadinstitute/gtex-pipeline/commits/master/gene_model/collapse_annotation.py，并附加了 ERCC 注释。
Reads 使用 STAR v. 2.6.1d 进行映射（MESA 除外，MESA 使用基于 GENCODE v26 基因注释构建索引的 STAR v 2.5.3a），除以下参数外均使用默认参数：–twopassMode Basic–out-FilterMultimapNmax 20–alignSJoverhangMin 8–alignSJDBoverhangMin 1–outFilterMismatchNmax 999–outFilterMismatchNoverLmax 0.1–alignIntronMin 20–alignIntronMax 1000000–alignMatesGapMax 1000000–outFilterType BySJout–outFilterScoreMinOverLread 0.33–outFilterMatchNminOverLread 0.33–limitSjdbInsertNsj 1200000–outSAMstrandField intronMotif–quantMode TranscriptomeSAM GeneCounts–outSAMtype BAM Unsorted–outSAMunmapped Within–chimSegmentMin 15–chimJunctionOverhangMin 15–chimOutType Junctions WithinBAM SoftClip–chimMainSegmentMultNmax 1–out-SAMattributes NH HI AS nM NM ch–outSAMattrRGline ID:rg1 SM:sm1
使用 picard (v. 2.18.17; https://broadinstitute.github.io/picard) MarkDuplicates 标记重复项，除 ASSUME_SORT_ORDER=coordinate 外使用默认参数。
每个样本（包括 MESA 样本）的基因计数、每百万转录本（TPM）表达值和 QC 指标是使用 RNA-SeQC v. 2.3.3 (57) 计算的，参数为 –stranded rf。
将 RNA-seq 样本与全基因组基因型匹配 对于每个 RNA-seq 样本，我们在 RNA-seq .bam 文件上运行 vt discover2 (https://github.com/atks/vt)，将映射质量限制在 $\ge$ 20 的 reads，以识别候选变异位点。vt discover2 的输出通过大约 'round(2 * AD / DP)' 转换为每个位点的粗略二倍体基因型。这些基因型与 TOPMed freeze 9b 中所有样本的基因型进行比较，限制在 GENCODE v34 定义的编码外显子中且在整个 TOPMed 中次等位基因频率 (MAF) $\ge 0.05$ 的 PASS 变异。该比较计算非参考基因型一致性为：
SUM [(GT_rna > 0) && (GT_rna == GT_ref)] / SUM (GT_rna > 0) 其中求和涵盖了编码外显子中整个 TOPMed 次等位基因频率 $\ge 0.05$ 的所有位点，整数 GT_rna、GT_ref 分别代表 RNA-seq 或全基因组参考样本的基因型，编码为 0, 1 或 2 个非参考等位基因。与 freeze 9b 中所有测序样本的比较分为三个集群：具有高一致性的推定匹配项 (85 到 93%)、与相关样本的推定匹配项 (55 到 65%)，以及推定的未匹配样本 (40 到 50%)。如果一个 RNA-seq 样本与 freeze 9b 中任何样本的最高基因型一致性低于 83%，我们就将其宣布为未匹配。
仅针对 MESA 队列样本，使用了预期的 WGS-RNA 匹配，且丢弃了 RNA-seq 样本未通过指纹识别或基于表达的性别检查的匹配项。
总共 733 位捐赠者提供了来自多种组织或细胞类型的数据（图 S68），其中包括 334 位来自 MESA 队列的捐赠者（提供了 T 细胞、单核细胞和 PBMC RNA-seq 样本），以及 324 位来自 COPDGene 队列的捐赠者（提供了鼻上皮和全血样本）。
根据与 HGDP 样本的相似性进行基因组划分 （局部和全局祖源推断） 局部祖源是使用 RFMix v2 (58) 并采用以下选项进行推断的：–node-size=5。在局部祖源推断中使用的参考单倍型，我们获取了 HGDP (13) 并按照 (59) 处理数据，最终得到 938 个个体和 639,958 个常染色体单核苷酸多态性 (SNPs)。随后，我们将 HGDP 中的 53 个群体浓缩为 (13) 中描述的七个推断祖先组：(i) 撒哈拉以南非洲（称为 HGDP- AFR），(ii) 中/南亚 (HGDP- SAS)，(iii) 东亚 (HGDP- EAS)，(iv) 欧洲 (HGDP- EUR)，(v) 原住民美洲 (HGDP- AMR)，(vi) 大洋洲 (HGDP- OCN)，(vii) 中东 (HDGP- MES)。在运行 RFMix 后，我们汇总了每个个体所有遗传窗口中推断的局部祖源，以计算全局祖源比例，即基因组中与这七个 HGDP 推断祖先组各自相似度最高的部分；这些数值被用于描述供体祖源/混血情况，并按照下文所述将个体分配到相应的祖源组。
遗传祖源是指个体基因组中从其祖先那里继承的片段。在实践中，我们通过研究个体与 HGDP 参考群体之间遗传共享的某种定量测量值来近似估算这一点。因此，遗传祖源是一个具有一定误差和变异性的估计值 (60, 61)。
将个体分配至推断的祖源组 在某些分析中，我们根据样本与 HGDP 推断祖源组的遗传相似性对样本进行分组（例如，“类 HGDP- EUR 样本”）。除非另有说明，如果样本基因组中至少 75% 显示出与该 HGDP 组最高的相似性，则该样本被分配到该组。对于类 HGDP- AMR 样本，我们选择了较低的阈值 (50%)，以增加相关分析中参与者的纳入率，并且因为 AMR 参考面板本身包含许多具有显著混血（特别是 EUR 和 AFR）的个体 (29)。如果样本未达到任何 HGDP 组的 75% 阈值（HGDP- AMR 为 50%），则不予分配并从分析中剔除；在某些组织中，这导致相当一部分样本未被分配到任何祖源组 [例如，6454 个全血样本中有 1845 个 (28.6%) 未分配]。根据这些标准，每个组织中分配到每个祖源组的样本数量列在表 S18 中。
遗传变异是连续的，我们承认使用某种程度上较为随意地截断值来强加离散结构是有问题的 (60, 61)。我们选择这些阈值是为了创建分组，以便对 e/sQTL 进行跨群体比较。这些比较旨在提供关于基因表达的遗传架构以及不同人口统计历史影响的见解。使用广泛的全局祖源估算也有助于避免与 TOPMed 研究之间使用的不同群体描述符以及每项研究的人口统计细微差别相关的内在挑战。
基因型 与 RNA-seq 样本匹配的 WGS 样本基因型提取自 freeze 9b TOPMed BCF 文件 (62)。仅使用了常染色体 + chrX SNPs 和短插入缺失 [ <50 个碱基对 (bp)]。
无关受试者的筛选 使用 FILTER=PASS 且 MAF ≥ 0.01 的常染色体 SNP 来确定受试者的亲缘关系。亲缘关系使用 KING v. 2.2.7 (63)（选项–degree 5–related）进行计算。用于下游分析的无关受试者集由 KING 输出结果按以下方式生成。首先，根据受试者所具有的推断亲属数量（亲缘关系定义为第四度或更高）对其进行排序。接着，将亲属数量最少的个体添加到无关样本集中，并将与该个体有亲缘关系的任何受试者从进一步考虑中剔除。此步骤迭代执行，直到所有样本要么被添加到无关样本集中，要么被从分析中剔除。
基因型主成分分析 对无关受试者的基因型进行了主成分分析 (PCA)，使用的是一组经过 LD 剪枝和精简的常见 (MAF ≥ 1%) SNP。使用 EIGENSOFT (64, 65) (git commit 09ed563f) 进行 PCA，计算前 15 个 PC (使用 smartpca.perl，选项为 - k 15 - m 0)。基因型 PCA 绘制于图 S69 中。
RNA-seq 质量控制 未对单个质量控制 (QC) 指标设置硬阈值；采用基于 PCA 的方法将样本标记为离群值 (outliers) 或非离群值，并将离群样本从 e/sQTL 扫描中剔除。对于每组队列/组织组合，我们对基因计数进行了基于 DESeq2 规模因子的归一化 (66) (如 pyqtl (https://github.com/broadinstitute/pyqtl) 函数 deseq2_normalized_counts 中所实现)，剔除少于 10% 的样本具有至少 10 个归一化计数的基因，用该基因观察到的最小非零值的一半来填充零值，对矩阵进行 log10 转换，然后执行 PCA。如果满足以下任何标准，则该样本在 PC 空间中被标记为离群值：
1) 使用前 5 个 PC 计算的样本马氏距离 (Mahalanobis distance) 对应的 $\chi^2$ P 值 < 0.001。
2) 在前 10 个 PC 中的任何一个上，样本与中位数的绝对偏差（由该 PC 在所有样本中的中位数绝对偏差归一化）$\ge 5$。
e/sQTL 扫描样本的选择 对于每种组织，通过以下步骤选择用于 cis-eQTL 扫描的样本 (图 S70)：
1) 剔除在 PC 空间中为离群值的样本。 2) 剔除没有已知 WGS 匹配项的样本。 3) 剔除受试者 (WGS 匹配项) 不在无关受试者集中的样本。
4) 剔除基于基因表达且性别不明的样本。性别是使用 XIST (位于 chrX) 和 RPS4Y1 (位于 chrY) 基因的 TPM 值推断的 (图 S71)。
5) 每个受试者仅保留一个样本。这是随机完成的，除非： A) 对于来自 SPIROMICS 队列的样本，如果受试者在该时间点有样本，则优先选择基线时间点的样本。
B) 对于来自 MESA 队列的样本，如果受试者在该时间点有样本，则优先选择检查 5 (exam 5) 的样本。
cis-eQTL 扫描 对于每种组织，使用选定纳入 cis-eQTL 扫描的样本：
1) 过滤基因计数，仅包含常染色体和 chrX 基因。
2) 使用 edgeR TMM 程序 (67) 对基因计数进行归一化，如 pyqtl 函数 edger_cpm 中所实现。
3) 剔除低表达基因，定义为少于 20% 的样本具有 TPM 值 > 0.1 的基因。
4) 对 TMM 归一化的基因表达值进行反向正态转换。
为了生成用作 cis-eQTL 扫描协变量的基因表达 PC，我们对反向正态转换后的基因表达矩阵执行了 PCA，剔除了可映射性较低的基因 (可映射性 < 0.5，使用来自 (49) 的可映射性值；在 PCA 之前同样剔除了没有可映射性分数的基因)。
每种组织的协变量为： 1) 全血：队列 + 推断性别 + 10 个基因型 PC + 100 个基因表达 PC
2) 肺：推断性别 + 10 个基因型 PC + 75 个基因表达 PC 3) 鼻上皮：推断性别 + 10 个基因型 PC + 30 个基因表达 PC
5) PBMC：推断性别 + 10 个基因型 PC + 30 个基因表达 PC 6) 单核细胞：推断性别 + 10 个基因型 PC + 30 个基因表达 PC 测试符合以下标准的 SNP 和 indels： 1) 在 TOPMed VCF 文件中被标记为 PASS。 2) 在扫描样本中 MAF $\ge 1\%$ (对于全血，运行了两组扫描，一组使用 MAF $\ge 1\%$，另一组使用 MAF $\ge 0.1\%$)
对于每个基因，测试距离基因 TSS 1 Mb 范围内的遗传变异。基因 TSS 位置使用 pyqtl 的 gtf_to_tss_bed 函数确定。
每个组织所使用的基因表达主成分（PC）数量是通过检查检测到的顺式 eGene 数量与用作协变量的 PC 数量之间的关系，并选择顺式 eGene 数量开始趋于平缓的点来确定的（图 S72）。
顺式 eQTL 扫描使用 tensorQTL v. 1.0.7 (68) 进行，并进行了修改，在针对扫描协变量进行残差化后，对基因表达值增加了第二次反向归一化（修改后的代码见 https://github.com/porchard/tensorqtl/tree/5ea048f2705035df1cb87e59eb143a54805cadeb）。
使用排列检验来识别 eGene（tensorQTL 模式 = cis；q-value lambda = 0 且 seed = 2021）。使用 tensorQTL 的 cis_nominal 模式计算完整的汇总统计数据。顺式 eGene 的顺式 eQTL 信号使用 tensorQTL 中的 SuSiE (15) 实现进行精细映射。对于单核细胞、T 细胞和鼻上皮样本，我们将 SuSiE L 参数（拟合 SuSiE 模型时考虑的非零效应数量）设置为 10。对于肺部、外周血单核细胞（PBMCs）和全血，我们使用多个 L 值运行 SuSiE（肺部和 PBMCs 为 10 和 20；全血为 10, 20, 和 30），并为每个基因选择大于或等于在测试的 L 值中发现的最大可信集数量的最小 L 值。默认情况下，SuSiE 报告的 SNP PIP 值代表单一效应的聚合；因此，我们使用贝叶斯因子矩阵计算单一效应 PIP 值 [PIP_ij = BF_ij / sum(BF_j)，其中 i 为 SNP，j 为单一效应，BF 代表贝叶斯因子，求和是对 SNP 进行的；在实践中，单一效应 PIP 值与 SuSiE 报告的 PIP 值之间的差异通常极小]。极少数的可信集是重复的（包含相同 SNP 和 PIP 值的可信集）；此类重复的可信集被合并为单一可信集。
针对 HGDP-EUR 类似样本子集的顺式 eQTL 分析与全样本顺式 eQTL 分析采用相同的方式进行，但表型 PC 数量和 SuSiE L 参数有所不同（列于表 S19 中）。表型 PC 数量是通过检查所使用的 PC 与发现的 eGene 之间的关系来选择的。
在某些下游分析中，我们仅利用每个可信集中的最高 PIP 变异。在两个变异具有相同 PIP（即处于完全连锁不平衡状态）的情况下，我们随机选择其中一个（基于升序字母排列选择第一个）。
顺式 sQTL 扫描 我们使用 LeafCutter (69) 内含子切除率来量化剪接。
在量化剪接之前，样本使用 STAR (70) v. 2.6.1d 并结合 WASP (71) 过滤（–waspOutputMode SAMtag–varVCFfile $vcf–outSAMattributes NH HI AS nM NM ch vW）以变异感知的方式重新比对，否则使用初始 STAR 比对中相同的比对参数。读取片段被过滤为通过 WASP 过滤且无歧义的比对读取 [samtools view - h - q 255 $bam grep - v “vW:i:[2- 7]”] (62)，并使用 regtools (72) v. 0.5 计算外显子-外显子接点计数 (regtools junctions extract - a 8 - m 50 - M 500000 - s 1 filtered.bam)。
我们使用 LeafCutter 的 leafcutter_cluster_regtools.py 对内含子进行聚类 [–minclureads round(tissue N/5)–mincluratio 0.001–maxintronlen 500000]，此外还修改了流程，以排除由少于 [round(tissue N / 10)] 个样本支持的内含子。我们使用 map_clusters_to_genes.R GTEx (3) 脚本（实现了 LeafCutter 的 map_clusters_to_genes 函数）将内含子簇映射到基因。
我们剔除了在大多数样本中没有计数的内含子，并使用在 (3) 中引入的内含子集群分数 Z-score 过滤器剔除了在样本间变异性较低的内含子 [剔除符合以下条件的内含子：仅有 3 个或更少样本的 abs(cluster fraction z-score) > 6 且不超过 3 个样本的 abs(cluster fraction z-score) > 0.25]。所得矩阵使用 LeafCutter 的 prepare_phenotype_table.py 脚本进行标准化，然后对每个剪接表型进行反标准化。该矩阵被用作 cis- 和 trans- sQTL 扫描的输入，且用作扫描协变量的剪接 PC 也是基于该矩阵计算的。
我们使用推断的性别、10 个基因型 PC、10 个剪接表型 PC，以及（对于全血）TOPMed 队列作为扫描协变量（图 S73）。
测试了符合以下标准的 SNP 和 indels： 1) 在 TOPMed VCF 文件中被标记为 PASS。 2) 在扫描样本中的 MAF ≥ 1%（对于全血，运行了两组扫描，一组使用 MAF ≥ 1%，另一组使用 MAF ≥ 0.1%）。
对于每个基因，测试了距离该基因 TSS 1 Mb 以内的遗传变异。基因 TSS 位置使用 pyqtl 的 gtf_to_tss_bed 函数确定。
cis- sQTL 扫描使用 tensorQTL v. 1.0.7 (68) 执行，并经过修改以在针对扫描协变量进行残差化后，对剪接表型进行第二次反标准化（修改后的代码见 https://github.com/porchard/tensorqtl/tree/5ea048f2705035df1cb87e59eb143a54805cadeb）。
使用置换检验来识别 sGenes（tensorQTL 模式 = cis；q-value lambda = 0 且 seed = 2021，按基因对表型进行分组）。为了获得基因层级的 cis- sQTL 可信集，我们识别了变异关联强度足以通过全基因组 FDR 5% 阈值的内含子（基于 tensorQTL 模式 cis_nominal 的显著表型-变异对），使用 tensorQTL 中的 SuSiE 实现为每个此类内含子精细映射 cis- sQTL 信号（SuSiE L = 10），然后对于每个基因，通过识别重叠的可信集并保留具有较大最大 PIP 的可信集，将跨内含子的可信集进行合并。
对 HGDP- EUR 样样本子集的 Cis- sQTL 分析与全样本 cis- sQTL 分析（包括 leafcutter 表型生成）采用相同方式执行，但表型 PC 数量和 SuSiE L 参数有所不同（列于表 S19）。表型 PC 的数量是通过检查所用 PC 与发现的 sGenes 之间的关系选定的。
在某些下游分析中，我们每个可信集仅利用了 PIP 最高的变异。如果两个变异具有相同的 PIP（即处于完全连锁不平衡状态），我们随机选择其中一个（基于升序字母排序的第一个）。
确定主要信号与非主要信号 对于在精细映射之前执行的任何分析，“主要 (primary)”是指与每个基因的表达/剪接关联最强的变异。
在精细映射之后，为了将每个基因的 cis- eQTL 信号排名为主要、次要、第三等，对于每个具有精细映射信号的基因，我们使用与 cis- eQTL 扫描相同的协变量和表型，并包含该基因每个可信集的所有 top PIP 变异，拟合一个单一的联合 eQTL 模型。随后根据该模型中相应的系数 P 值对变异进行排名。极少数情况下，单个变异是多个 cis- eQTL 可信集的 top PIP 变异（肺部 cis- eQTL 扫描有 2 例；PBMC cis- eQTL 扫描有 4 例；全血 cis- eQTL 扫描中 MAF < 0.001 和 MAF < 0.01 分别有 73 和 92 例）。在这种情况下，可信集的相对顺序根据可信集 ID 确定（可信集 “1” 的排名高于可信集 “2” 等）。
对 cis-sQTL 信号进行排名的程序是相同的，但如果一个基因的 cis-sQTL 置信集来源于 >1 个剪接表型，则在生成基因级置信集排名之前，将为每个剪接表型运行单独的模型以获取变异系数 p 值。
在某些分析中（例如功能富集分析），e/sVariant 在基因之间被合并，以避免在同一个变异是 >1 个基因的 e/sVariant 时被重复计算。在这种情况下，一个 e/sVariant 可能对应于一个基因的主信号，但不对另一个基因如此。如果该 e/sVariant 对于所有相关基因都不是主信号或非主信号，则将其从该分析中排除。
基因与变异的可映射性及跨映射性 基因可映射性、变异可映射性以及基因间的跨映射性是按照 (49) 中所述计算的，使用了其流程的 NextFlow (73) 实现（可在 https://github.com/porchard/crossmap-nextflow 获取）以及未合并的 GENCODE v30 GTF 文件，外显子 kmer 长度设置为 100 bps，UTR kmer 长度设置为 36 bps，并允许两个不匹配。
trans-eQTL 扫描 trans-eQTL 扫描使用了与 cis-eQTL 扫描相同的归一化基因表达矩阵和协变量，但我们从协变量矩阵中删除了一些基因表达 PC，以避免将 trans 效应调整掉。为了确定哪些基因表达 PC 可能会捕捉到 trans 效应，从而应在 trans-eQTL 扫描的协变量矩阵中被删除，我们使用 tensorQTL 测试每个变异与每个基因表达 PC 之间的关联，使用的协变量与 cis-eQTL 扫描相同，但减去了基因表达 PC。每个基因表达 PC 在每个组织中观察到的最强关联如图 S74 所示。对于全血，PC 3, 25, 以及许多 PC50 之后的 PC 与遗传变异强相关 (P < 1 × 10−15)。与 PC3 关联最强的变异是 rs2814778 (chr1_159204893_T_C)，这是已知的良性中性粒细胞减少症的致病变异，并与中性粒细胞百分比和淋巴细胞百分比相关 (74–76)；因此 PC3 可能会捕捉细胞类型的丰度，我们决定将 PC3 保留为协变量。与 PC25 关联最强的变异是 chr3_56815721_T_C，该变异在之前的多项研究中被鉴定为 trans-eQTL (77–79)；我们决定将 PC25 从协变量中排除。此外，我们排除了 PC50 之后的全血基因表达 PC。其他组织均未删除任何 PC。
所有 trans-eQTL 扫描测试的变异 MAF ≥ 0.05。为了降低映射伪影的概率，我们删除了可映射性 <1 的变异。为了鉴定 trans-eGene 及其各自的 trans-eVariant，我们使用 tensorQTL 的 mode–trans 模式测试位于不同染色体上的变异-基因对之间的关联。由于测试的对数庞大，我们仅保存名义 P < 1 × 10−5 的对的汇总统计数据。如 (49) 中所述，与可映射性相关的伪影可能会触发假阳性 trans 信号。因此，我们将可映射性 <0.8 的基因从分析中排除，过滤掉基因跨映射至变异 1 Mb 范围内基因的变异-基因对，并且仅测试蛋白质编码基因和 lincRNA。
我们使用置换法来确定关联的显著性。我们重复生成反向归一化表型并将其与所有变异进行测试，共执行 20,000 次此类置换，并记录每次置换中每个染色体所达到的最强关联。然后，我们使用 FastQTL (80) 中的 beta 近似 P 值方法，基于除该基因所在染色体以外任何染色体上最极端的置换关联，计算每个基因最强关联的调整 P 值。随后，我们对这些调整后的 P 值应用 Benjamini-Hochberg 校正，以获得全基因组 FDR。trans-eGene 为 FDR < 5% 的基因。
对于每个跨组织 eGene，我们使用 tensorQTL 的 SuSiE 实现（SuSiE L = 10），在以原发跨组织 eVariant 为中心的 2-Mb 区域内对跨组织 eQTL 信号进行了精细定位。
针对 HGDP-EUR 类样本子集的跨组织 eQTL 分析，其执行方式与全样本跨组织 eQTL 分析相同，仅在表型 PC 数量和 SuSiE L 参数方面有所不同（详见表 S19）。对于全血 (EUR) 跨组织 eQTL 扫描，
反式- sQTL 扫描 反式- sQTL (trans- sQTL) 扫描采用了与顺式- sQTL (cis- sQTL) 扫描相同的标准化剪接表型矩阵和协变量。
所有反式- sQTL 扫描测试的变异体 MAF ≥0.05。为了降低制图伪影 (mapping artifacts) 的概率，我们移除了可制图性 (mappability) <1 的变异体。为了识别反式- s基因 (trans- sGenes) 及其对应的反式- s变异体 (trans- sVariants)，我们使用 tensorQTL 的 mode–trans 模式来测试位于不同染色体上的变异体-剪接表型对之间的关联。由于测试的配对数量巨大，我们仅保存了名义 P < 1 × 10−5 的配对汇总统计数据。如文献 (49) 所述，可制图性相关的伪影可能会触发假阳性反式信号。因此，我们将可制图性 <0.8 的基因排除在分析之外，过滤掉基因交叉映射至变异体 1 Mb 范围内的变异体-基因对，且仅测试蛋白质编码基因和长链非编码 RNA (lincRNAs)。
我们采用与反式- eQTL 扫描类似的方法，通过排列检验 (permutations) 来确定关联的显著性，并额外根据每个基因测试的剪接表型数量进行了调整，如文献 (3) 中所述。简而言之，我们重复生成反向标准化表型并将其与所有变异体进行测试，执行了 20,000 次此类排列，并记录每次排列中每条染色体所达到的最强关联。为了确定具有 X 个剪接表型的基因的最极值 p 值的显著性，我们使用了来自 beta-近似 CDF 中样本量为 X 的一阶统计量的 CDF。随后，我们对这些调整后的 p 值应用 Benjamini-Hochberg 校正，以获得全基因组范围的 FDR。FDR < 5% 的基因被定义为反式- s基因。
对于每个反式- s基因，我们使用 tensorQTL 的 SuSiE 实现（SuSiE L = 10），在以主要反式- s变异体为中心的 2- Mb 区域内对反式- sQTL 信号进行精细制图。对于每个反式- s基因，我们仅使用与主要反式- sQTL 对应的剪接表型（即关联最强的表型）进行精细制图。
对 HGDP- EUR 样样本子集的反式- sQTL 分析采用了与全样本反式- sQTL 分析相同的方式，仅在表型主成分 (PCs) 数量和 SuSiE L 参数方面有所不同（列于表 S19）。
主要反式信号的聚类 (Clumping) 对于涉及主要反式- e/s变异体 (primary trans- e/sVariants) 的分析（例如，计算每个反式- e变异体对应的反式- e基因数量），将高度连锁的主要反式- e/s变异体聚类在一起，以限制对可能源自同一反式- e/s变异体但被随机分配给不同变异体的信号的重复计算。对于每种组织和模态，我们计算了所有反式- e/s变异体之间的样本内 R2，并根据每个反式- e/s变异体最显著的反式- e/sQTL P 值对反式- e/sQTL 变异体进行排序。所有与最显著反式- e/s变异体处于高连锁不平衡 (LD, R2 ≥ 0.9) 的反式- e/sQTL 变异体均与该变异体聚类，此步骤对剩余未聚类的反式- e/s变异体迭代执行，直到没有剩余变异体。每个聚类中 P 值最显著的反式- e/s变异体成为该聚类的代表，所有涉及该聚类内变异体的反式- e/sQTL 对均被重新分配给该代表变异体。
对于命中数最多的组织和模态（全血反式- eQTL），这使反式- e变异体的数量从 810 减少到 614。
在对反式- e/sQTL 信号进行精细制图时，2- Mb 的精细制图窗口以原始（未聚类的）反式- e/s变异体为中心。
等位基因倍数变化 (Allelic fold change) 等位基因倍数变化 (81) 使用 tensorQTL (v. 1.0.7) 中的 calculate_afc 函数以及每个可信集 (credible set) 中最高 PIP 的变异体（针对...
饱和度分析 饱和度分析采用全血样本的嵌套子集进行，样本量范围从 500 到 6000，步长为 500。基因表达/剪接表型矩阵的生成（包括 Leafcutter 内含子聚类）以及扫描本身，其执行方式与全 cis- e/sQTL 和 trans- eQTL 扫描相同，但对于 cis- e/sQTL 扫描，精细映射（fine-mapping）使用了多种不同的表型主成分（PC），以证明样本量之间的差异并非源于所使用的 PC 数量。对于 cis- eQTL 扫描，精细映射在 SuSiE L = 10 和 20 的情况下运行，且每个基因的最终 L 值选择标准与全 cis- eQTL 扫描一致；对于 cis- sQTL 扫描，精细映射在 SuSiE L = 10 的情况下运行。对于 trans- eQTL 扫描，任何超过 50 的表型 PC，以及任何与变异位点 chr3_56815721_T_C（该变异位点在全血 cis- eQTL 协变量中与基因表达 PC25 相关）关联最强的表型 PC 均从协变量矩阵中剔除，以避免无意中将跨位点（trans）效应校正掉。
染色质状态 Hg38 染色质状态取自 (82)。我们将 TOPMed 组织与相应的 Roadmap 表观基因组学细胞类型匹配如下：TOPMed 全血和 TOPMed PBMC 匹配至 Roadmap 表观基因组学外周血原代单核细胞 (E062)；TOPMed 肺部匹配至 Roadmap 表观基因组学肺部 (E096)；TOPMed 单核细胞匹配至 Roadmap 表观基因组学外周血原代单核细胞 (E029)；TOPMed T 细胞匹配至 Roadmap 表观基因组学外周血原代 T 细胞 (E034)；TOPMed 鼻上皮匹配至 Roadmap 表观基因组学 A549 EtOH 0.02pct 肺癌细胞系 (E114)。
功能富集 SnpEff 注释 (83) 从 TOPMed freeze 9b VCF 文件中提取。
cis- e/sQTL 可信集（credible sets）在注释中的富集程度，是相对于在染色体、MAF、LD 和测试基因数量上匹配的对照可信集来确定的。对于扫描中包含的每个变异位点，我们计算了与其处于 LD 状态的变异位点数量（R2 ≥ 0.9；LD 使用扫描中的 TOPMed 样本计算）、在扫描中对其进行测试的基因数量以及 MAF。然后，对于每个可信集，我们取 PIP 最高值变异位点，并选择一个测试基因数量相似且具有大约 n 个 LD 代理位点的对照变异位点，其中 n = (可信集大小 – 1)，且具有相似的 MAF（在满足前两个条件过滤后尽可能相似）。随后，该对照可信集即由该对照变异位点及其 LD 代理位点组成。
聚类后的主变异位点被用于 trans- e/sQTL 的富集分析。富集程度是相对于在染色体和 MAF 上匹配的对照变异位点确定的（变异位点被分入 50 个等距的 MAF 组）。仅考虑包含在 trans 扫描中的变异位点（例如，所有对照变异位点的可映射性 mappability = 1）。每个 trans- e/sVariant 仅代表一次（例如，一个作为两个基因的 trans- eVariant 的变异位点不会被重复计算）。
我们使用逻辑回归对富集程度进行评分。对于给定的注释类型（例如，染色质状态或 SnpEff 注释），我们使用真实信号和对照信号构建逻辑回归模型（在 cis- e/sQTL 信号的情况下为可信集 + 对照可信集；在 trans- e/sQTLs 的情况下为主命中位点 + 对照）。回归结果是该信号为真实信号 (1) 还是对照信号 (0)，预测因子是真实/对照信号中的任何变异位点是否与该注释类型的每个注释项重叠的二元指示变量（例如，对于染色质状态，所有可能的染色质状态均为模型中的预测因子）。注释
TF 基序 cis- eVariant 重叠与基因表达的方向性分析 使用来自 (84) 的 540 个非冗余基序进行基序扫描，采用 FIMO (v. 5.5.3，使用默认参数和通过 fasta-get-markov 生成的 0 阶马尔可夫背景模型) (85)。我们采用了变异敏感型基序扫描，以考虑到替代等位基因可能会创建参考基因组中缺失的 TF 结合位点，或破坏参考基因组中存在的 TF 结合位点，具体方法是同时扫描参考序列并将参考等位基因替换为替代等位基因。
使用变异敏感型基序扫描，对于每个 PWM，我们统计了与该 PWM 的基序重叠的全血 cis- eQTL 信号数量（使用 MAF ≥0.001 cis- eQTL 扫描中每个可信集中的最高 PIP 变异）。然后，我们计算了增加靶基因表达的等位基因增加基序命中强度 (FIMO 分数) 的频率。我们排除了 eQTL-基序命中重叠少于 20 个的 PWM。为了确定与 0.5 的任何偏差是否显著，我们使用双侧二项分布检验计算了 P 值，并在所有 PWM 之间进行了 Bonferroni 校正。
cis- e/sQTL 可信集中的 trans- e/sQTL 富集 全血 cis- e/sQTL 可信集中聚集的主要全血 trans- e/sQTL 的富集程度，是相对于功能富集中所使用的 MAF 匹配的 trans- e/sQTL 对照变异，通过 Fisher 精确检验计算得出的。每个 trans- e/sVariant 仅被计数一次，无论与之相关的 trans- e/sGenes 数量是多少。
对于 cis- eQTL 重叠 trans- eQTL 的 cis- eGenes 中 TF 基因的富集 这是使用置换检验计算的。首先，对于每个至少有一个可信集的 cis- eGene，我们根据 (86) 中的 TF 基因 Ensembl ID 列表确定该基因是否编码 TF。然后，对于每个 trans- eVariant，我们确定哪些 cis- eGenes 具有包含该 trans- eVariant 的 cis- eQTL 可信集，以及这些 cis- eGenes 中是否有任何一个是 TF 基因。接着，我们统计了至少有一个相关 TF cis- eGene 的 trans- eVariants 数量。为了生成该统计量的空分布，我们置换了 基因 $\rightarrow$ is_TF 关系，并重新计算具有至少一个相关 TF cis- eGene 的 trans- eVariants 数量，此过程重复 1000 次。
trans- eQTL GO 条目富集 对于每组共享全血 trans- eVariant (经过 LD 聚集后) 且数量 $\ge 10$ 的 trans- eGenes，我们使用 gprofiler (34) 进行了 GO/KEGG 通路富集分析。作为基因的背景集，我们使用了全血 trans- eQTL 扫描中所有至少有一个名义 P < 1 $\times$ 10$^{-5}$ 的基因。我们仅测试基因数量至少为 5 个且不超过 1000 个的 GO:BP 和 KEGG 条目/通路。P 值在每个 trans- eVariant 内部进行了 Bonferroni 校正。
共定位 共定位使用 coloc v. 5.2.1 (87) 进行，采用了来自 SuSiE (coloc.susie 函数) 的贝叶斯因子矩阵和默认先验。在 H4 的后验概率（即同一个变异是两种模态信号基础的后验概率）至少为 0.8 的情况下，判定为共定位。如果 coloc 输出暗示了不可信的一对多共定位（例如，单个 cis- eQTL 可信集与来自同一 GWAS 的两个 GWAS 可信集共定位），则保留后验概率最高的共定位结果。
对于全血 cis- e/sQTL- GWAS 共定位，我们使用 MAF $\ge$ 0.01 的 cis- e/sQTL，以确保在不同组织之间以及与 GTEx 比较时的一致性。使用 MAF $\ge$ 0.001 的共定位结果与使用 MAF $\ge$ 0.01 的结果高度相似。
Pan-UKBB GWAS 精细映射 (fine-mapping) 我们使用了来自 Pan-UKBB (12) (v. 0.3; hg19 坐标系; https://pan.ukbb.broadinstitute.org/) 的 EUR 和 AFR LD 矩阵以及 GWAS 汇总统计数据，用于对 UKBB GWAS 信号进行精细映射。对于每个遗传祖先集群（基于参考面板相似性），我们仅纳入通过质量控制 (QC) 的表型；为了避免分析多个高度相关的表型，我们仅保留最大独立集中的表型。此外，我们剔除了潜在的敏感表型，例如与心理健康、性活动、酒精使用和智力相关的表型。这最终剩下了 172 个 EUR GWAS 表型和 32 个 AFR GWAS 表型（表 S13）。在 172 个 EUR GWAS 表型和 32 个 AFR GWAS 表型中，分别有 166 和 17 个表型具有至少一个全基因组显著变异。
为了确定精细映射的基因组窗口，对于每项 GWAS，我们识别出尚未处于精细映射窗口中的最显著全基因组变异，并以该变异为中心取 500-kb 窗口作为精细映射窗口，重复此过程直到不再剩余全基因组显著变异 (P < 5 × 10−8)。随后，我们将重叠的精细映射窗口合并，以便对其进行共同精细映射。合并后，我们剔除了大小 >10 Mb 的窗口（LD 矩阵仅在半径 10 Mb 范围内可用）。此外，我们还剔除了 LD 矩阵中变异数量过多 (>40,000) 的少量窗口。
信号精细映射使用 SuSiE (v. 0.11.92; susie_rss 函数) 完成。低置信度变异被排除在外，未能从 hg19 提升 (lift) 到 hg38 或提升至与另一个 hg19 变异相同位置的变异也被排除。我们将 SuSiE 的 L 参数设置为 10，并且在以下情况下迭代地将其提高到 20, 30, 然后是 40：(i) 模型在当前的 L 值下未能收敛，或 (ii) 发现的可信集 (credible sets) 数量达到或超过 (L * 0.7)。如果使用了多个 L 值，我们计算所有测试 L 值中发现的可信集最大数量，并选择 L 值最小且超过该最大可信集数量的模型作为最终模型。随后，我们将 SuSiE 结果提升至 hg38，剔除任何未能提升的精细映射窗口。
精细映射产生了 34,107 个 EUR 可信集，但仅有 96 个 AFR 可信集（表 S13），这反映了 UKBB 中 AFR GWAS 的样本量较小。由于 AFR 可信集数量极少，我们在下游分析中仅使用了 EUR 可信集。
TOPMed 全血 cis-eQTL 信号在 GTEx 全血 / DIRECT / INTERVAL / eQTLGen 中的存在情况 如果 TOPMed cis-eQTL 可信集与 GTEx 全血 cis-eQTL 可信集重叠，则认为 TOPMed 全血 cis-eQTL 信号存在于 GTEx 全血中。
如果 TOPMed cis-eQTL 可信集与 eQTLGen 主 eQTL 或其 LD 代理（基于 TOPMed 全血样本 R2 ≥ 0.8）重叠，则认为 TOPMed 全血 cis-eQTL 信号存在于 eQTLGen 中。
如果 TOPMed cis-eQTL 可信集与 DIRECT 条件 eQTL 或其 LD 代理（基于 TOPMed 全血样本 R2 ≥ 0.8）重叠，则认为 TOPMed 全血 cis-eQTL 信号存在于 DIRECT 中。
如果 TOPMed cis-eQTL 可信集与 INTERVAL 条件 eQTL 或其 LD 代理（基于 TOPMed 全血样本 R2 ≥ 0.8）重叠，则认为 TOPMed 全血 cis-eQTL 信号存在于 INTERVAL 中。
参考文献与注释
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trait loci in TOPMed,” version v1, Zenodo (2025); https://doi.org/10.5281/ zenodo.17957236.
致谢 我们衷心感谢为精准医学传输计划 (TOPMed) 提供生物样本和数据的研究项目及参与者。弗雷明汉心脏研究 (FHS) 感谢 FHS 研究参与者的奉献，没有他们，这项研究将无法实现。作者感谢 MESA 研究的其他研究人员、工作人员以及参与者的宝贵贡献。参与 MESA 的研究人员和机构完整名单可在 https://www.mesa- nhlbi.org 查阅。GALA II 研究的合作者包括 S. Thyne (UCSF)、H. J. Farber (德克萨斯儿童医院)、D. Serebrisky (Jacobi 医学中心)、R. Kumar (芝加哥 Lurie 儿童医院)、E. Brigino- Buenaventura (凯撒医疗)、M. A. LeNoir (湾区儿科)、K. Meade (UCSF Benioff 奥克兰儿童医院)、W. Rodriguez- Cintron (波多黎各退伍军人医院)、P. C. Avila (西北大学)
大学；J. R. Rodriguez- Santana, Centro de Neumologia Pediatrica；L. N. Borrell, 纽约市立大学；A. Davis, 奥克兰 UCSF Benioff 儿童医院；S. Sen, 田纳西大学以及 F. Lurmann, Sonoma Technologies。作者感谢参与本研究的家庭和患者，并感谢为 GALA II 提供支持并参与其中的众多医疗保健提供者和社区诊所。作者特别感谢研究协调员 S. Salazar；获取数据的招募人员：D. Alva, G. Ayala- Rodriguez, L. Caine, E. Castellanos, J. Colon, D. DeJesus, B. Lopez, B. Lopez, L. Martos, V. Medina, J. Olivo, M. Peralta, E. Pomares, J. Quraishi, J. Rodriguez, S. Saeedi, D. Soto, A. Taveras；以及处理生物样本的实验室研究员 C. Eng。SAGE 研究的合作者包括 H. J. Farber, 德克萨斯儿童医院；E. Brigino-
Buenaventura, Kaiser Permanente；M. A. LeNoir, 湾区儿科诊所；K. Meade, 奥克兰 UCSF Benioff 儿童医院；L. N. Borrell, 纽约市立大学；A. Davis, 奥克兰 UCSF Benioff 儿童医院以及 F. Lurmann, Sonoma Technologies。作者感谢参与本研究的家庭和患者，并感谢为 SAGE 提供支持并参与其中的众多医疗保健提供者和社区诊所。作者特别感谢研究协调员 S. Salazar；获取数据的招募人员：L. Caine, E. Castellanos, B. Lopez, S. Saeedi；以及处理生物样本的实验室研究员 C. Eng。作者感谢 SPIROMICS 的参与者以及使这项研究成为可能的参与医师、研究员、研究协调员和工作人员。有关该研究的更多信息以及如何访问 SPIROMICS 数据，请访问
https://www.spiromics.org。我们要感谢以下 SPIROMICS 站点和阅卷中心的现任及前任研究员：N. E. Alexis, W. H. Anderson, M. Arjomandi, I. Barjaktarevic, R. Graham Barr, P. Basta, L. A. Bateman, C. Bellinger, S. P. Bhatt, E. R. Bleecker, R. C. Boucher, R. P. Bowler, R. G. Buhr, S. A. Christenson, A. P. Comellas, C. B. Cooper, D. J. Couper, G. J. Criner, R. G. Crystal, J. L. Curtis, C. M. Doerschuk, M. T. Dransfield, M. B. Drummond, C. M. Freeman, C. Galban, K. Gershner, M. K. Han, N. N. Hansel, A. T. Hastie, E. A. Hoffman, Y. J. Huang, R. J. Kaner, R. E. Kanner, M. Kesimer, E. C. Kleerup, J. A. Krishnan, W. W. Labaki, L. M. LaVange, S. C. Lazarus, F. J. Martinez, M.- L. McDonald, D. A. Meyers, W. C. Moore, J. D. Newell Jr, E. C. Oelsner, J. Ohar, W. K. O’Neal, V. E. Ortega, R. Paine, III, L. Paulin, S. P. Peters, C. Pirozzi, N.
Putcha, S. Raman, S. I. Rennard, D. P. Tashkin, J. M. Wells, R. A. Wise, and P. G. Woodruff,。来自国家心脏、肺和血液研究所肺部的项目官员是 L. Postow 和 L. Viviano。资金支持：精准医学传输计划 (TOPMed) 程序的分子数据得到了国家心脏、肺和血液研究所 (NHLBI) 的支持。“NHLBI TOPMed: Framingham 心脏研究中的全基因组测序及其相关表型” (phs000974) 的 RNASeq 在西北基因组中心 (HHSN268201600032I) 完成。“NHLBI TOPMed: Framingham 心脏研究中的全基因组测序及其相关表型” (phs000974) 的基因组测序在 Broad Genomics (HHSN268201600034I, 3U54HG003067- 12S2, 3R01HL092577- 06S1) 完成。“NHLBI TOPMed: COPD 遗传流行病学 (COPDGene) (phs000951)” 的 RNA-seq 在西北基因组
中心 (HHSN268201600032I) 完成。“NHLBI TOPMed: COPD 遗传流行病学 (COPDGene) (phs000951)” 的基因组测序在 Broad Genomics (HHSN268201500014C) 和西北基因组中心 (3R01HL089856- 08S1) 完成。“NHLBI TOPMed - NHGRI CCDG: 基因-环境” 的 RNA-seq
以及“拉丁裔哮喘患者中的基因-环境和混合（GALA II） (phs000920)”在 Broad Genomics (HHSN268201600034I) 进行了。针对“NHLBI TOPMed - NHGRI CCDG：拉丁裔哮喘患者中的基因-环境和混合（GALA II） (phs000920)”的基因组测序在 NYGC Genomics (3R01HL117004- 02S3) 进行了。针对“NHLBI TOPMed：非裔美国人、哮喘、基因与环境研究 (SAGE) (phs000921)”的 RNA-seq 在 Broad Genomics (HHSN268201600034I) 进行了。针对“NHLBI TOPMed：非裔美国人、哮喘、基因与环境研究 (SAGE) (phs000921)”的基因组测序在 NYGC Genomics (3R01HL117004- 02S3) 和西北基因组中心 (HHSN268201600032I) 进行了。针对“NHLBI TOPMed：COPD 研究中的亚群体和中间结果测量 (SPIROMICS) (phs001927)”的 RNA-seq 在西北基因组中心 (HHSN268201600032I) 进行了。针对“NHLBI TOPMed：
COPD 研究中的亚群体和中间结果测量 (SPIROMICS) (phs001927)”的基因组测序在 Broad Genomics (HHSN268201600034I) 进行了。针对“NHLBI TOPMed：MESA 及其 MESA 家族 AA-CAC (phs001416)”的 RNA-seq 在西北基因组中心 (HHSN268201600032I) 和 Broad Genomics (HHSN268201600034I) 进行了。针对“NHLBI TOPMed：MESA 及其 MESA 家族 AA-CAC (phs001416)”的基因组测序在 Broad Genomics (3U54HG003067- 13S1, HHSN268201600034I, HHSN268201500014C) 进行了。针对“NHLBI TOPMed：女性健康计划 (WHI) (phs001237)”的 RNA-seq 在 Broad Genomics (HHSN268201600034I) 进行了。针对“NHLBI TOPMed：女性健康计划 (WHI) (phs001237)”的基因组测序在 Broad Genomics (HHSN268201500014C) 进行了。针对“NHLBI TOPMed：肺组织研究联盟 (LTRC) (phs001662)”的 RNA-seq 在西北基因组中心 (HHSN268201600032I) 进行了。针对
“NHLBI TOPMed：肺组织研究联盟 (LTRC) (phs001662)”的基因组测序在 Broad Genomics (HHSN268201600034I) 进行了。核心支持（包括集中化的基因组读取比对和基因型调用，以及变异质量指标和过滤）由 TOPMed 信息研究中心 (3R01HL- 117626- 02S1; 合同 HHSN268201800002I) 提供。核心支持（包括表型协调、数据管理、样本身份质控和总体计划协调）由 TOPMed 数据协调中心 (R01HL- 120393; U01HL- 120393; 合同 HHSN268201800001I) 提供。弗雷明汉心脏研究 (FHS) 确认了来自国家心脏、肺和血液研究所的合同 NO1- HC- 25195, HHSN268201500001I 和 75N92019D00031 以及该研究的资助补充金 R01 HL092577- 06S1 的支持。Vasan 博士的部分支持来自 Evans 医学基金会
以及波士顿大学医学院内科的 Jay 和 Louis Coffman 捐赠基金。WHI 计划由美国卫生与公共服务部下属的国家卫生研究院国家心脏、肺和血液研究所通过合同 75N92021D00001, 75N92021D00002, 75N92021D00003, 75N92021D00004, 75N92021D00005 提供资金。COPDGene 研究 (NCT00608764) 由 NHLBI 的资助（给国家犹太健康中心的 U01HL089897 和给布里格姆女性医院的 U01HL089856）、NIH 给国家犹太健康中心的合同 75N92023D00011，以及通过向一个包含阿斯利康、拜耳制药、勃林格殷格隆、Genentech、葛兰素史克、诺华、辉瑞和 Sunovion 的工业顾问委员会进行捐赠的 COPD 基金会提供支持。本研究使用了由肺组织研究提供生物样本和数据
财团 (LTRC) 由国家心、肺和血液研究所 (NHLBI) 支持。LTRC TOPMed 项目还得到了 P01 HL114501 和 R01 HL133135 的支持。精准医学传输计划 (TOPMed) 计划的全基因组测序 (WGS) 由国家心、肺和血液研究所 (NHLBI) 支持。“NHLBI TOPMed：多民族动脉粥样硬化研究 (MESA)” (phs001416.v3.p1) 的 WGS 在麻省理工学院和哈佛大学的 Broad 研究所 (3U54HG003067- 13S1) 进行。集中化的读取比对和基因型调用，以及变异质量指标和过滤由 TOPMed 信息研究中心 (3R01HL- 117626- 02S1) 提供。表型统一化、数据管理、样本身份 QC 和一般研究协调由 TOPMed 数据协调中心 (3R01HL- 120393- 02S1) 和 TOPMed MESA 多组学 (HHSN2682015000031/HSN26800004) 提供。MESA 项目是由国家心、肺和血液研究所 (NHLBI) 与 MESA 研究人员合作开展并支持的。多民族动脉粥样硬化研究 (MESA) 项目的支持是由国家心、肺和血液研究所 (NHLBI) 与 MESA 研究人员合作开展并支持的。MESA 的支持由合同 75N92020D00001, HHSN268201500003I, N01- HC- 95159, 75N92020D00005, N01- HC- 95160, 75N92020D00002, N01- HC- 95161, 75N92020D00003, N01- HC- 95162, 75N92020D00006, N01- HC- 95163, 75N92020D00004, N01- HC- 95164, 75N92020D00007, N01- HC- 95165, N01- HC- 95166, N01- HC- 95167, N01- HC- 95168, N01- HC- 95169, UL1- TR- 000040, UL1- TR- 001079, UL1- TR- 001420, UL1TR001881, DK063491, HL148610, 和 R01HL105756 提供。拉丁裔哮喘患者基因-环境和混血 (GALA II) 研究得到了美国国立卫生研究院 (NIH) 国家心、肺和血液研究所的 R01HL117004 和 X01HL134589 资助；研究招募得到了 Sandler 家族基金会、美国哮喘基金会、RWJF Amos 医学教师发展计划、Harry Wm. 和 Diana V. Hind 药学卓越教授 II 以及国家环境卫生科学研究所 R01ES015794 资助的支持。非洲裔美国人、哮喘、基因与环境研究 (SAGE) 得到了美国国立卫生研究院 (NIH) 国家心、肺和血液研究所的 R01HL117004 和 X01HL134589 资助；研究招募得到了 Sandler 家族基金会、美国哮喘基金会、RWJF Amos 医学教师发展计划、Harry Wm. 和 Diana V. Hind 药学卓越教授 II 的支持。
作者感谢北卡罗来纳大学教堂山分校生物样本处理设施 (https://bsp.web.unc.edu/) 和 Alexis 实验室 (https://www.med.unc.edu/cemalb/alexislab/) 对 SPIROMICS 样本处理、存储和样本发放所做的贡献。北卡罗来纳大学生物样本处理设施 (RRID: SCR_021290 ; https://bsp.web.unc.edu) 部分由 NCI 癌症中心支持资助 5P30CA016086- 46 和 NIEHS UNC 环境健康与敏感性中心资助 5P30ES010126 支持。SPIROMICS 由 NIH/NHLBI 的合同支持 (HHSN268200900013C, HHSN268200900014C, HHSN268200900015C, HHSN268200900016C, HHSN268200900017C, HHSN268200900018C, HHSN268200900019C,)
HHSN268200900020C), NIH/NHLBI 的资助 (U01 HL137880, U24 HL141762, R01 HL182622, 和 R01 HL144718)，以及通过 NIH 基金会和 COPD 基金会由以下机构提供的补充捐助：Amgen；AstraZeneca/MedImmune；Bayer；Bellerophon Therapeutics；Boehringer- Ingelheim PharmaceuticalsChiesi Farmaceutici S.p.A.；Forest Research Institute；Genentech；GlaxoSmithKline；Grifols Therapeutics；Ikaria；MGC Diagnostics；Novartis Pharmaceuticals Corporation；Nycomed GmbH；Polarean；ProterixBio；Regeneron Pharmaceuticals；Sanofi；Sunovion；Takeda Pharmaceutical Company；以及 Theravance Biopharma 和 Mylan/Viatris。L.K. 得到了美国国家癌症研究所 (R00CA246076) 的资金支持。L.M.R. 由 R01AG075884 资助。H.T.、A.R.、C.K. 和 S.Hw. 得到了 grant R01HL142017 的支持。作者贡献：概念化：P.O., T.W.B., L.K., P.J.C., M.H.C., S.Hw., H.T.,
A.V.S., F.A., L.S., L.M.R., S.C.J.P.；数据整理：P.O., T.W.B., P.D., S.Ga., S.Hu., S.Hw., R.J., M.J., X.L., A.C.Y.M., D.T.P., J.D.S., M.W., J.We., Y.Z., V.E.O., W.C.J., N.H., F.A.；形式分析：P.O., J.Wa., J.S.W.；资金获取：S.A.C., S.Ga., C.P.H., Y.L., K.D.T., S.Z., V.E.O., W.G., G.A., D.A.N., N.G., K.A., P.G.W., R.P.B., D.A.M., A.R., C.K., E.Z., R.S.V., M.G.L., L.C., E.K.S., S.S.R., N.H., H.T., J.I.R., A.V.S., D.L., F.A., L.S., L.M.R., S.C.J.P.；调查研究：P.O., P.D., S.Ga., X.L., J.D.S., J.We.；项目管理：T.W.B., P.J.C., M.H.C., S.A.C., S.Ga., C.P.H., H.L., C.L., Y.L., A.W.M., A.S., K.D.T., R.P.T., S.Z., J.C.W., L.M., S. Gr., M.R.G.T., V.E.O., G.A., D.A.N., N.G., K.A., P.G.W., R.P.B., D.A.M., A.R., C.K., E.Z., R.S.V., M.G.L., L.C., E.K.S., S.S.R., N.H., H.T., J.I.R., A.V.S., D.L., F.A., L.S., L.M.R., S.C.J.P.；资源：P.D., S.Ga., H.L., C.L.,
R.P.T., R.P.B.；监督：T.W.B., P.J.C., M.H.C., S.A.C., S.Ga., C.P.H., Y.L., A.W.M., A.S., K.D.T., R.P.T., S.Z., J.C.W., L.M., S.Gr., M.R.G.T., V.E.O., W.G., G.A., D.A.N., N.G., K.A., P.G.W., R.P.B., D.A.M., A.R., C.K., E.Z., R.S.V., M.G.L., L.C., E.K.S., S.S.R., N.H., H.T., J.I.R., A.V.S., D.L., F.A., L.S., L.M.R., S.C.J.P.；可视化：P.O.；写作——初稿：P.O., T.W.B., J.S.W., A.V.S., F.A., L.S., L.M.R., S.C.J.P.；写作——审阅与编辑：P.O., T.W.B., L.K., X.L., A.W.M., H.E.W., M.R.G.T., A.V.S., D.L., F.A., L.S., L.M.R., S.C.J.P. 竞争利益：P.J.C. 接受了 Bayer 的资助支持以及来自 Verona pharmaceuticals 的顾问费。M.H.C. 接受了 Bayer 的资助支持。E.K.S. 接受了来自 Bayer 和 Northpond Laboratories 的机构资助支持。C.P.H. 报告了来自 Boehringer- Ingelheim, Novartis, Bayer 和 Vertex 的资助支持。
J.C.W. 是 Greenstone Biosciences 的联合创始人。V.E.O. 此前在 Regeneron 和 Sanofi 的独立数据监察委员会 (IDMC) 任职，并因担任 JAMA 副主编而获得美国医学会的报酬。F.A. 是 Predicta Biosciences 的员工，且是一项由 Broad Institute 提交的与 TensorQTL 相关的专利申请的发明人。L.M.R. 是精准医学传输计划 (TOPMed) 行政协调中心 (通过 Westat) 的顾问。S.C.J.P. 由 Pfizer 支持，并为 Novo Nordisk 提供咨询。G.R.A. 是 Regeneron Pharmaceuticals 的员工，并持有 Regeneron Pharmaceuticals 的股票和股票期权。数据、代码和材料可用性：顺式和反式 e/sQTL 汇总统计数据和精细映射结果可在 TOPMed 基因组汇总结果仓库 (dbGaP phs001974) 中获取。可信集摘要还进一步...
可在 Zenodo 上获取 (88)。个人层级数据可通过基因型和表型数据库 (dbGaP) 获取，登录号为 phs000974 (FHS)、phs000920 (GALAII)、phs000921 (SAGE)、phs001927 (SPIROMICS)、phs001237 (WHI)、phs000951 (COPDGene)、phs001416 (MESA) 和 phs001662 (LTRC)。TOPMed RNA-seq 处理流程可在 https://github.com/broadinstitute/gtex-pipeline/blob/master/TOPMed_RNAseq_pipeline.md 及 Zenodo (89) 获取。分析和图表的源代码可在 https://github.com/porchard/topmed-rnaseq-index 及 Zenodo (89) 获取。本研究未产生新材料。许可信息：版权所有 © 2026 作者，保留部分权利；独家许可方为美国科学促进会。不主张美国政府原始作品的权利。https://www.science.org/about/science-licenses-journal-article-reuse
NhlBi tOPMeD cONsORtiUM
Namiko Abe44, Laura Almasy45, Seth Ament46, Pramod Anugu47, Paul Auer48, Dimitrios Avramopoulos49, Adithya Balasubramanian50, R. Graham Barr51, Lucas Barwick52, Terri Beaty49, Diane Becker49, Lewis Becker49, Amber Beitelshees46, Takis Benos53, Marcos Bezerra54, Joshua Bis55, Jennifer Brody55, Ulrich Broeckel48, Jai Broome55, Karen Bunting44, Erin Buth55, Vincent Carey56, Cara Carty57, Richard Casaburi58, Mark Chaffin59, Christy Chang46, Yi-Cheng Chang60, Sameer Chavan61, Bo-Juen Chen44, Wei-Min Chen62, Seung Hoan Choi59, Lee-Ming Chuang60, Ren-Hua Chung63, Matthew Conomos55, Elaine Cornell64, Carolyn Crandall58, James Crapo65, Jeffrey Curtis66, Coleen Damcott46, Sean David67, Lisa de las Fuentes68, Paul de Vries69, Ranjan Deka70, Dawn DeMeo56, Scott Devine46, Huyen Dinh50, Harsha Doddapaneni50, Qing Duan71, Ravi Duggirala72, Charles Eaton73, Lynette Ekunwe47, Adel El Boueiz74,
Leslie Emery55, Charles Farber62, Jesse Farek50, Nora Franceschini71, Chris Frazar55, Mao Fu46, Stephanie M. Fullerton55, Lucinda Fulton68, Shanshan Gao61, Yan Gao47, Margery Gass75, Heather Geiger44, Auyon Ghosh56, Chris Gignoux76, David Glahn77, Stephanie Gogarten55, Da-Wei Gong46, Harald Goring78, Daniel Grine61, C. Charles Gu68, Yue Guan46, Michael Hall47, Yi Han50, Daniel Harris79, Ben Heavner55, David Herrington80, Brian Hobbs56, Elliott Hong46, Karin Hoth81, Chao (Agnes) Hsiung63, Jianhong Hu50, Yi-Jen Hung82, Haley Huston83, Chii Min Hwu84, Rebecca Jackson85, Deepti Jain55, Jill Johnsen55, Rich Johnston86, Kimberly Jones49, Michael Kessler46, Alyna Khan55, Ziad Khan50, Wonji Kim74, John Kimoff87, Greg Kinney88, Holly Kramer89, Christoph Lange90, Ethan Lange61, Cathy Laurie55, Cecelia Laurie55, Meryl LeBoff56, Sandra Lee50, Wen-Jane Lee84, David Levine55, Joshua Lewis46, Yun
Li71, Xihong Lin90, Simin Liu73, Yu Liu76, Barry Make49, Alisa Manning59,74,91, JoAnn Manson56, Lisa Martin92, Melissa Marton44, Susan Mathai61, Susanne May55, Patrick McArdle46, Merry-Lynn McDonald93, Sean McFarland74, Daniel McGoldrick55, Caitlin McHugh55, Hao Mei47, James Meigs91, Vipin Menon50, Nancy Min47, Matt Moll56, Zeineen Momin50, May Montasser94, Josyf C. Mychaleckyj62, Rakhi Naik49, Take Naseri95, Pradeep Natarajan59, Sarah C. Nelson55, Bonnie Neltner61, Caitlin Nessner50, Osuji Nkechinyere50, Jeff O’Connell46, Tim O’Connor46, Heather Ochs-Balcom96, Geoffrey Okwuonu50, James Pankow97, Cora Parker98, Gina Peloso99, Juan Manuel Peralta72, Marco Perez76, James Perry46, Ulrike Peters75, Lawrence S. Phillips86, Toni Pollin46, Julia Powers Becker61, Meher Preethi Boorgula61, Bruce Psaty55, Dandi Qiao56, Nicholas Rafaels61, Mahitha Rajendran50, Laura Rasmussen-Torvik100, Aakrosh
Ratan62, Robert Reed46, Elizabeth Regan65, Muagututi‘a Sefuiva Reupena101, Rebecca Robillard102, Carolina Roselli59, Ingo Ruczinski49, Alexi Runnels44, Pamela Russell61, Kathleen Ryan46, Ester Cerdeira Sabino103, Shabnam Salimi46, Sejal Salvi50, Steven Salzberg49, Kevin Sandow104, Jireh Santibanez50, Karen Schwander68, Frank Sciurba53, Frédéric Sériès105, Amol Shetty46, Aniket Shetty61, Brian Silver106, Robert Skomro107, Tanja Smith44, Sylvia Smoller108, Beverly Snively80, Adrienne M. Stilp55, Garrett Storm88, Elizabeth Streeten46, Jessica Lasky Su56, Yun Ju Sung68, Jody Sylvia56, Adam Szpiro55, Margaret Taub49, Simeon Taylor46,
Timothy A. Thornton55, Machiko Threlkeld55, Lesley Tinker76, David Tirschwell55, Hemant Tiwari93, Catherine Tong55, Michael Tsai97, Dhananjay Vaidya49, Tarik Walker61, Robert Wallace81, Avram Walts61, Fei Fei Wang55, Heming Wang56, Karol Watson58, Jennifer Watt50, Lu- Chen Weng91, Jennifer Wessel109, Kayleen Williams55, Carla Wilson56, James Wilson110, Lara Winterkorn44, Quenna Wong55, Baojun Wu111, Huichun Xu46, Lisa Yanek49, Ivana Yang61, Seyedeh Maryam Zekavat59, Snow Xueyan Zhao65, Wei Zhao66, Xiaofeng Zhu112
44纽约基因组中心，纽约州纽约市，美国。45费城儿童医院，宾夕法尼亚大学，宾夕法尼亚州费城，美国。46马里兰大学，马里兰州巴尔的摩，美国。47密西西比大学，密西西比州杰克逊，美国。48威斯康星医学院，威斯康星州密尔沃基，美国。49约翰霍普金斯大学，马里兰州巴尔的摩，美国。50贝勒医学院人类基因组测序中心，德克萨斯州休斯顿，美国。51哥伦比亚大学，纽约州纽约市，美国。52Emmes公司，马里兰州罗克维尔，美国。53匹兹堡大学，宾夕法尼亚州匹兹堡，美国。54pernambuco血液与血液治疗基金会 - Hemope，累西腓，巴西。55华盛顿大学，华盛顿州西雅图，美国。56布里格姆和妇女医院，马萨诸塞州波士顿，美国。57华盛顿州立大学，华盛顿州普尔曼，美国。58加州大学洛杉矶分校，加利福尼亚州洛杉矶，美国。59博德研究所，马萨诸塞州剑桥，美国。60国立台湾大学，
台北，台湾（中国省）。61科罗拉多大学丹佛分校，科罗拉多州丹佛，美国。62弗吉尼亚大学，弗吉尼亚州夏洛茨维尔，美国。63台湾卫生福利部国立健康研究中心，台湾省苗栗县。64佛蒙特大学，佛蒙特州伯灵顿，美国。65国立犹太健康中心，科罗拉多州丹佛，美国。66密歇根大学，密歇根州安娜堡，美国。67芝加哥大学，伊利诺伊州芝加哥，美国。68圣路易斯华盛顿大学，密苏里州圣路易斯，美国。69德克萨斯大学休斯顿健康中心，德克萨斯州休斯顿，美国。70辛辛那提大学，俄亥俄州辛辛那提，美国。71北卡罗来纳大学教堂山分校，北卡罗来纳州教堂山，美国。72德克萨斯大学里奥格兰德河谷医学院，德克萨斯州埃丁堡，美国。73布朗大学，罗德岛州普罗维登斯，美国。74哈佛大学，马萨诸塞州剑桥，美国。75弗雷德·哈钦森癌症研究中心，华盛顿州西雅图，美国。76斯坦福大学，加利福尼亚州斯坦福，美国。77波士顿
儿童医院，哈佛医学院，马萨诸塞州波士顿，美国。78德克萨斯大学里奥
格兰德河谷医学院，德克萨斯州圣安东尼奥，美国。79宾夕法尼亚大学，宾夕法尼亚州费城，美国。80维克森林浸信会健康中心，北卡罗来纳州温斯顿-塞勒姆，美国。81爱荷华大学，爱荷华州爱荷华城，美国。82三军总医院国防医疗中心，台湾（中国省）。83Blood Works Northwest，华盛顿州西雅图，美国。84台湾台中荣民总医院，台湾省台中市。85俄亥俄州立大学医学中心，俄亥俄州哥伦布，美国。86埃默里大学，佐治亚州亚特兰大，美国。87麦吉尔大学，加拿大蒙特利尔。88科罗拉多大学丹佛分校，科罗拉多州奥罗拉，美国。89洛约拉大学，伊利诺伊州梅伍德，美国。90哈佛公共卫生学院，马萨诸塞州波士顿，美国。91马萨诸塞州总医院，马萨诸塞州波士顿，美国。92乔治华盛顿大学，华盛顿特区，美国。93阿拉巴马大学，阿拉巴马州伯明翰，美国。94国家心脏、肺和血液
研究所，美国马里兰州贝塞斯达。95萨摩亚政府卫生部，萨摩亚阿皮亚。96布法罗大学，美国纽约州布法罗。97明尼苏达大学，美国明尼苏达州明尼阿波利斯。98RTI国际，美国北卡罗来纳州研究三角公园。99波士顿大学，美国马萨诸塞州波士顿。100西北大学，美国伊利诺伊州芝加哥。101Lutia I Puava Ae Mapu I Fagalele，萨摩亚阿皮亚。102渥太华大学，加拿大渥太华。103圣保罗大学，巴西圣保罗。104伦德奎斯特研究所，美国加利福尼亚州托伦斯。105拉瓦尔大学，加拿大魁北克市。106马萨诸塞大学纪念医学中心，美国马萨诸塞州伍斯特。107萨斯喀彻温大学，加拿大萨斯卡通。108阿尔伯特爱因斯坦医学院，美国纽约州纽约。109印第安那大学，美国印第安那州印第安那波利斯。110贝斯以色列女执事医疗中心，美国马萨诸塞州剑桥。111亨利福特医疗系统，美国密歇根州底特律。112凯斯西储大学，
美国俄亥俄州克利夫兰。
补充材料 science.org/doi/10.1126/science.adx2989 补充文本；图 S1 至 S76；表 S1 至 S19；参考文献 (90–113)； MDAR 可重复性清单
10.1126/science.adx2989
2025年3月14日提交；2026年5月5日接收
一种转录生物传感器揭示 $\alpha$- 酮戊二酸信号传导至染色质的机制
Alex C. Sternisha†, Haocheng Li†, 等。
引言：代谢产物 $\alpha$- 酮戊二酸 ($\alpha\text{KG}$) 是双加氧酶的底物，该类酶可使细胞核内的组蛋白和 DNA 去甲基化，从而影响基因表达、细胞命运和肿瘤抑制。尽管核 $\alpha\text{KG}$ 对染色质修饰酶的功能至关重要，但控制该代谢产物池的机制仍不明确。揭示这些机制对于理解在稳态条件下如何维持适当的染色质结构和基因表达模式，以及在疾病中如何发生失调至关重要。
基本原理：破译人体细胞中核 $\alpha\text{KG}$ 丰度的调节方式具有挑战性，原因有几点。首先，开发用于研究线粒体、溶酶体和其他细胞器内区室化代谢的方法并不容易迁移到细胞核中。其次，细胞内 $\alpha\text{KG}$ 由一个包含 100 多个直接作用于该代谢产物的酶和转运体的复杂网络调节。为了应对这些挑战，我们试图创建一种能够检测核 $\alpha\text{KG}$ 变化的生物传感器，并利用它来鉴定控制该代谢产物池的分子过程。
结果：我们利用 NtcA（一种对 $\alpha\text{KG}$ 有反应的蓝细菌转录因子）工程化构建了转录“$\alpha\text{KG-ON}$ 生物传感器系统”。嵌合 NtcA 蛋白与荧光报告基因共同表达，后者由一个包含源自蓝细菌基因组的 NtcA 结合位点的合成启动子驱动。这些元件共同实现了对活体人体细胞内核 $\alpha\text{KG}$ 池的荧光监测。我们将 $\alpha\text{KG-ON}$ 生物传感器系统应用于正向遗传筛选，以鉴定在控制细胞核 $\alpha\text{KG}$ 丰度中起主导作用的基因。该方法发现了一条介导 $\alpha\text{KG}$ 从线粒体转移到细胞核的细胞器间通路。在该通路上，线粒体谷氨酸-丙酮酸转氨酶 2 (GPT2) 合成 $\alpha\text{KG}$，随后通过 SLC25A11 转运体（苹果酸-天冬氨酸穿梭的组成部分）优先导出到细胞质中。一旦进入细胞质，$\alpha\text{KG}$ 可能会进入细胞核，或者通过支链氨基酸转氨酶 1 (BCAT1) 分解代谢为谷氨酸。我们的发现与之前的研究一致，即 BCAT1 在竞争获取核-细胞质 $\alpha\text{KG}$ 方面与染色质去甲基化酶相竞争，并揭示了 GPT2 和 SLC25A11 的顺序活动是该代谢产物池的关键供应源。
破坏这一 $\alpha\text{KG}$ 代谢的细胞器间通路会导致体外培养细胞和体内组织的染色质过度甲基化。一个 GPT2 缺陷的小鼠模型（由 GPT2 失活突变引起的先天性代谢错误）显示脑组织中 DNA 和组蛋白的甲基化均增加，并伴有神经发育基因表达程序的严重失调。向 $Gpt2$ 缺失小鼠注射酯化形式的 $\alpha\text{KG}$ 恢复了染色质甲基化模式，使基因表达正常化，并改善了小鼠的健康状况，从而建立了核 $\alpha\text{KG}$ 耗竭与 GPT2 缺陷分子发病机制之间的因果联系。
控制 $\alpha\text{KG}$ 依赖性染色质去甲基化的机制。使 DNA 和组蛋白去甲基化的双加氧酶需要 $\alpha\text{KG}$。$\alpha\text{KG-ON}$ 生物传感器系统能够监测维持这些酶活性的核 $\alpha\text{KG}$ 池。线粒体 GPT2 转氨酶和 SLC25A11 转运体协同工作，向核-细胞质区室供应 $\alpha\text{KG}$。在 GPT2 缺陷中，该通路受损，导致染色质过度甲基化和神经发育基因的失调。GFP，绿色荧光蛋白；TET，十一一易位甲基胞嘧啶双加氧酶；KDM，组蛋白赖氨酸去甲基化酶。[图片由 Melissa Logies 绘制]
结论：本研究提供了一种监测人类细胞核内 $\alpha$KG 丰度的工具，并定义了一条维持表观基因组调节的 $\alpha$KG 从线粒体向细胞核转移的通路。这些发现强调了区室化代谢是表观遗传状态的关键决定因素，并揭示了核内 $\alpha$KG 耗竭是 GPT2 缺乏导致神经发育缺陷的驱动因素。此外，我们的工作表明，$\alpha$KG 补充可能成为对抗该疾病患者致病机制的一种潜在策略。
通讯作者：Eric M. Morrow (eric_morrow@ brown. edu)；Samuel K. McBrayer (samuel. mcbrayer@ utsouthwestern. edu) †这些作者对本工作贡献均等。引用本文请标注为 A. C. Sternisha, Science 393, eadx8675 (2026)。DOI: 10.1126/science.adx8675
全文及作者所属机构列表： https://doi.org/10.1126/science.adx8675
转录生物传感器揭示 $\alpha$-酮戊二酸信号传导至染色质的机制
Alex C. Sternisha$^{1,2\dagger}$, Haocheng Li$^{1\dagger}$, Kumar Gajendra$^{3,4}$, Yi Xiao$^1$, Xin Zhao$^{1,5,6,7}$, Jeffrey I. Traylor$^{1,8}$, Lei Guo$^9$, Ji Hyung Jun$^1$, Morgan Fleishman$^{3,4}$, Tracey Shipman$^1$, Vinesh T. Puliyappadamba$^1$, Pranita Kaphle$^1$, Qing Ouyang$^{3,4}$, Michael Schmidt$^{3,4}$, Diana D. Shi$^{1,10,11,12}$, Milan R. Savani$^{1,2}$, Alexander C.- Y. Tsai$^{10,12}$, Joyce H. Lee$^{12}$, Ruth Gordillo$^{13}$, Javier Garcia- Bermudez$^{1,7,14}$, Yoon Jung Kim$^{1,14}$, Shih- Chia Tso$^{15}$, Chad A. Brautigam$^{15,16}$, Lauren G. Zacharias$^1$, Thomas P. Mathews$^1$, Lin Xu$^{7,9}$, John G. Doench$^{17}$, Vidyasagar Koduri$^{18}$, Kalil G. Abdullah$^{19,20}$, Michalis Agathocleous$^{1,7,14}$, Laura A. Banaszynski$^{1,5,6,7}$, Ralph J. DeBerardinis$^{1,7,14,21,22}$, Eric M. Morrow$^{3,4}$, Samuel K. McBrayer$^{1,7,14,23}$
代谢物 $\alpha$-酮戊二酸 ($\alpha$KG) 是染色质去甲基化所必需的，但控制细胞核内 $\alpha$KG 丰度的机制尚不明确。我们设计了一种生物传感器，利用对 $\alpha$KG 产生响应的蓝细菌转录因子 NtcA 来监测人类细胞中的该代谢物池，并利用该传感器鉴定出调节细胞核内 $\alpha$KG 的基因。我们定义了一条细胞器间通路，其中谷氨酸-丙酮酸转氨酶 2 (GPT2) 和 SLC25A11 转运体的连续线粒体活动为细胞核提供 $\alpha$KG。在一种先天性代谢缺陷——GPT2 缺乏的小鼠模型中，Gpt2 的缺失导致脑内组蛋白过度甲基化，并使神经发育基因失调。恢复 $\alpha$KG 水平抵消了这些变化并提升了小鼠的健康状况。我们的工作提供了一种直接监测细胞核 $\alpha$KG 的工具，并揭示了细胞核 $\alpha$KG 耗竭是 GPT2 缺乏的关键致病机制。
代谢物可作为化学修饰 DNA 和组蛋白的酶的底物 (1, 2)。诸如乙酰辅酶 A (acetyl-CoA) 和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD+) 等代谢物调节染色质乙酰化，而 S-腺苷甲硫氨酸 (SAM) 和 $\alpha$-酮戊二酸 ($\alpha$KG) 则调节甲基化 (3, 4)。$\alpha$KG 在细胞命运控制和肿瘤抑制中发挥关键作用，因为 $\alpha$KG 可用性的失调会改变细胞状态的转换 (5–9)。代谢酶中反复出现的癌症相关突变会产生致瘤代谢物，直接干扰 $\alpha$KG 向染色质的信号传导，并诱导细胞发生恶性转化 (10–18)。尽管细胞核 $\alpha$KG 池具有如此重要的调节作用，但我们对其控制分子机制的了解仍然有限。这是由于缺乏实验
1 德克萨斯大学西南医学中心儿童医学中心研究所以及相关研究机构，美国德克萨斯州达拉斯。 2 德克萨斯大学西南医学中心医学科学家培训计划，美国德克萨斯州达拉斯。 3 布朗大学分子生物学、细胞生物学和生物化学系，美国罗德岛州普罗维登斯。 4 布朗大学 Carney 脑科学研究所及 Warren Alpert 医学院转化神经科学中心，美国罗德岛州普罗维登斯。 5 德克萨斯大学西南医学中心 Cecil H. 和 Ida Green 生殖生物学中心，美国德克萨斯州达拉斯。 6 德克萨斯大学西南医学中心妇产科，美国德克萨斯州达拉斯。 7 德克萨斯大学西南医学中心 Harold C. Simmons 综合癌症中心，美国德克萨斯州达拉斯。 8 德克萨斯大学西南医学中心神经外科。
中心，美国德克萨斯州达拉斯。9定量生物医学研究中心，健康科学与生物统计系，彼得·奥唐奈尔二世公共卫生学院，德克萨斯大学西南医学中心，美国德克萨斯州达拉斯。10放射肿瘤学系，马萨诸塞综合医疗机构，哈佛医学院，美国马萨诸塞州波士顿。11克兰茨家族癌症研究中心，马萨诸塞综合医院，美国马萨诸塞州波士顿。12医学肿瘤学系，丹娜-法伯癌症研究所，哈佛医学院，美国马萨诸塞州波士顿。13触石糖尿病中心，德克萨斯大学西南医学中心，美国德克萨斯州达拉斯。14儿科学系，德克萨斯大学西南医学中心，美国德克萨斯州达拉斯。15生物物理学系，德克萨斯大学西南医学中心，美国德克萨斯州达拉斯。16微生物学系，德克萨斯大学西南医学中心，美国。17哈佛大学与马萨诸塞理工学院宽泛研究所，美国马萨诸塞州剑桥。18血液科，布里根妇女医院与哈佛医学院，美国马萨诸塞州波士顿。19神经外科系，匹兹堡大学医学院，美国宾夕法尼亚州匹兹堡。20希尔曼综合癌症中心，匹兹堡大学医学中心，美国宾夕法尼亚州匹兹堡。21霍华德·休斯医学研究所，德克萨斯大学西南医学中心，美国德克萨斯州达拉斯。22尤金·麦克德莫特人类生长与发育中心，德克萨斯大学西南医学中心，美国德克萨斯州达拉斯。23彼得·奥唐奈尔二世脑研究所，德克萨斯大学西南医学中心，美国德克萨斯州达拉斯。*通讯作者。电子邮件：eric_morrow@ brown. edu (E.M.M.); samuel. mcbrayer@ utsouthwestern. edu (S.K.M.) †这些作者对这项工作做出了同等贡献。
受蓝细菌中 $\alpha$KG 传感机制的启发，我们采用合成生物学方法来监测活体人类细胞中的核 $\alpha$KG 池。蓝细菌通过清除铵并利用其将 $\alpha$KG 合成谷氨酰胺和谷氨酸来同化氮 (19)。在氮饥饿状态下，$\alpha$KG 会积聚并被转录因子 NtcA 感知 (20)。$\alpha$KG 的结合增加了 NtcA 对 DNA 的亲和力 (21)，从而能够激活参与应对氮缺乏反应的基因 (22)。我们假设，一种嵌合 NtcA 转录因子可以被改造，用于驱动合成报告基因的表达，而该基因可作为人类细胞中核 $\alpha$KG 池大小的代理指标。这将允许采用无偏见的正向遗传学方法，来鉴定调节细胞 $\alpha$KG 代谢并在此代谢物核内丰度控制中发挥主导作用的基因。
设计并优化 $\alpha$KG-ON 生物传感器系统以监测核 $\alpha$KG
为了解决人体细胞中测量核 $\alpha$KG 工具匮乏的问题，我们尝试采用一种蓝细菌中由 $\alpha$KG 调节的转录因子 NtcA (23)，以 $\alpha$KG 依赖的方式驱动报告基因在细胞核内的表达。该生物传感器（以下简称 $\alpha$KG-ON 生物传感器系统）包含一个嵌合 NtcA 转录因子以及一个可被 NtcA 跨激活的启动子-报告基因 DNA 元件（图 1A）。我们假设，将 NtcA 与核定位信号 (NLS) 和跨激活域融合，可以引导 NtcA 嵌合体进入细胞核并在人体细胞中驱动转录。此外，通过工程化构建一个具有 NtcA 结合位点的合成启动子（以下简称 $\alpha$KG 响应元件，或 $\alpha$KG-RE），并将其置于绿色荧光蛋白 (GFP) 报告基因的上游，将使我们能够监测核 $\alpha$KG 的变化。这一设计方案基于生化 (21) 和结构 (20, 24, 25) 研究，这些研究表明 $\alpha$KG 与 NtcA 同源二聚体结合会触发转录因子与连续的 DNA 主沟结合（图 1B）。我们产生了纯化的重组 NtcA，它能特异性地与 $\alpha$KG 结合，解离常数 (Kd) 为 2.0 mM（图 S1, A 和 B），这与人体细胞中的全细胞 $\alpha$KG 水平一致 (26)。
我们首先在人胚胎肾 (HEK) 293 细胞中筛选了 $\alpha$KG-ON 生物传感器系统的组件（图 1C 和图 S1C）。为了创建 $\alpha$KG-RE 启动子，我们从 Synechocystis sp. PCC 6803 或 Pseudanabaena sp. PCC 6903 基因组中编码谷氨酰胺合成酶的 glnA 或 glnN 基因的启动子中衍生出 NtcA 结合位点 (22, 27, 28)（图 S1, D 和 E）。我们将这些结合位点以单个或五次重复阵列的形式整合到极小细胞质巨细胞病毒 (CMV) 启动子的上游。为了评估系统的输出，我们对细胞进行细胞可渗透的二甲基-$\alpha$KG (dm-$\alpha$KG) 处理（或不处理），利用流式细胞术测量 GFP 表达，并监测每个表达 $\alpha$KG-RE 的稳定细胞系中转移至 $\text{GFP}^{\text{high}}$ 种群的细胞百分比。几种 NtcA 嵌合体与 $\alpha$KG-RE 启动子的组合显示出基础的 GFP 报告基因跨激活（推测是由内源性核 $\alpha$KG 诱导），且该激活效果在 dm-$\alpha$KG 处理下得到增强。
C
E
D
NtcA
NtcA
αKG-ON 生物传感器 系统
αKG-RE
αKG-RE
αKG-RE
NtcA NtcA
NtcA NtcA
NLS
NLS
NLS
NLS
VP64
VP64
VP64
VP64
glnA, PCC 6803 glnN, PCC 6803 NtcA DNA
位点
结合位点
glnN, PCC 6903
天然序列
天然间隔区和序列
TRE 间隔区和序列 极小 CMV 启动子
dm-αKG:
dm-αKG
GFP
GFP
GFP 报告基因
NtcA 嵌合体
EV
EV
GFP 表达 （细胞百分比）
EV
图 1. 用于监测核内 αKG 池的 αKG- ON 生物传感器系统的开发与优化。(A) αKG 存在与不存在时 αKG- ON 生物传感器系统转录活性的示意图。 αKG- RE，αKG 响应元件；NLS，核定位信号；VP64，转录激活因子单纯疱疹病毒蛋白 64；GFP，绿色荧光蛋白。(B) NtcA 同源二聚体与 DNA 及 αKG 结合的冷冻电子显微镜结构。分辨率不足以解析该复合物中的 αKG。数据源自蛋白质数据库 (Protein Data Bank) 编号 8H40 (24)。(C) 在 HEK293 细胞中对 αKG- ON 生物传感器 系统架构进行的成对组合筛选。稳定表达 αKG- RE 元件的 HEK293 细胞系被瞬时转染 NtcA 嵌合体或空载体 (EV；阴性对照)。在分析前使用 1 mM 二甲基- αKG (dm- αKG) 或二甲基亚砜 (DMSO) 处理 48 小时，通过流式细胞术定量分析 αKG- ON 生物传感器系统的激活情况 (GFP 表达)。GFP 表达 (细胞百分比) 是通过一种门控策略确定的，以转染 EV 且经 DMSO 处理的细胞作为基线。 (D) 在经工程化改造以表达 NtcA 嵌合体或 EV 的 HEK293 细胞中，核级分 (N；lamin B1 标记) 和细胞质 [C；甘油醛- 3- 磷酸脱氢酶 (GAPDH) 标记] 分级分中 VP64- NtcA- 2xNLSSV40 嵌合体的免疫印迹图。(E) 在转导了 VP64- NtcA- 2xNLSSV40 嵌合体或 EV 且使用 DMSO 或指示剂量的 dm- αKG 处理 48 小时的 αKG- RE 表达 HEK293 细胞中，αKG- ON 生物传感器 系统激活 (GFP 表达) 的流式细胞术定量分析。数据为平均值 ± SEM。*P < 0.05 [单因素方差分析 (ANOVA)]。
NtcA 同源二聚体
lamin B1
GAPDH
*
嵌合体
补充。值得注意的是，在不含 NtcA 嵌合体的空载体表达细胞中，dm- αKG 未诱导 GFP 表达。包含来自 PCC 6903 glnN 启动子 的铺砖状 NtcA 结合位点以及由四环素响应元件 (TRE) 衍生间隔区的 αKG- RE 启动子被选用于进一步研究。
我们试图通过提高 NtcA 嵌合转录因子的功能性来优化 αKG- ON 生物传感器系统的性能。细胞 分级实验表明，NtcA 嵌合体并非完全定位于细胞核，且某些嵌合体表达构建体产生了截短的蛋白产物（图 S1F）。计算机 模拟分析在 VP64 肽段中发现了隐匿的核输出序列（图 S1G）。消除组成 VP64 的 VP16 单体肽段增强了核定位， 但降低了生物传感器的输出（图 S1, H 和 I）。对其他哺乳动物转激活域 (29–32) 的测试表明，Zta
VP64 NtcA NLS
VP64 NtcA NLS
VP64 NtcA NLS
VP64 NtcA NLS
VP64 NtcA NLS
VP64 NtcA NLS
GFP 表达 (细胞百分比)
0 10 20
DNA 结合 域 (DBD)
αKG 效应因子 结合 域 (EBD)
VP64 NtcA NLS NLS
αKG- ON 生物传感器系统对细胞区室特异性的 αKG 丰度变化产生响应。为了评估 αKG- ON 生物传感器系统的特异性，我们通过减少谷氨酰胺（αKG 的来源）或补充 dm- αKG 在 HEK293 细胞中产生了细胞内 αKG 水平的梯度（图 S3A）。我们还构建了 VP64- NtcA- 2xNLSSV40 嵌合体的突变体，这些突变体缺乏 αKG 结合功能（R90E，其中第 90 位的精氨酸被谷氨酸取代）或 DNA 结合功能（ΔDBD），并将它们或空载体在 HEK293 细胞中表达。只有野生型 (WT) NtcA 嵌合体诱导出了与细胞内 αKG 相关的 GFP 表达梯度（图 2, A 至 H）。补充 dm- αKG 完全挽救了由谷氨酰胺缺失引起的生物传感器输出下降，表明该效应依赖于 αKG（图 2I 以及图 S4, A 和 B）。WT 和 R90E NtcA 嵌合体 (20, 33) 在后续研究中被串联使用，此后分别被称为 αKG- ON 生物传感器系统的“功能性”和“非活性”版本。我们检查了细胞周期阶段对生物传感器输出异质性的影响，并观察到在 G2/M 期，功能性臂和非活性臂的 GFP 表达均有所增加，这可能是由于报告基因拷贝数增加所致（图 S3, B 和 C）。生物传感器输出不受 (R)- 2-羟基戊二酸-双(三氟甲基)苯二胺 [(R)- 2HG- TFMB]（致癌代谢物 (R)- 2HG 的细胞可渗透酯）（图 S4, C 至 E）(34) 或琥珀酸二甲酯（致癌代谢物琥珀酸的细胞可渗透酯）（图 S4, F 至 H）补充的影响。表达 IDH1- R132H cDNA 导致 (R)- 2HG 上调（该过程被突变 IDH1/IDH2 抑制剂 vorasidenib 阻断）和组蛋白超甲基化（图 S4, I 和 J）。IDH1- 突变细胞显示出 αKG- ON 生物传感器系统输出的轻微增加（图 S4K），但这一效应与 (R)- 2HG 无关，因为 vorasidenib 未能改变这一结果。鉴于 (R)- 2HG、琥珀酸和 αKG 之间的结构相似性，我们的研究结果表明，生物传感器输出与致癌代谢物驱动的染色质超甲基化过程脱钩。因此，αKG- ON 生物传感器系统受到细胞内 αKG 水平的特异性调节，且需要 NtcA 转录因子的 αKG 结合和 DNA 结合活性。
C N C N
80 DMSO 0.3 mM 1 mM 3 mM
内线粒体膜上的 αKG 交换由专门的转运机制控制，将线粒体 αKG 代谢与其他细胞器中的代谢区分开。相比之下，
转激活结构域增强了核定位并消除了截短的蛋白产物（图 S1J）。我们移除了不必要的甲硫氨酸残基以防止产生替代翻译产物，并将源自 c- myc 的 NLS 替换为 2 个源自 SV40 大 T- 抗原的 NLS，这改善了核定位（图 S1K）。与其他嵌合体相比，VP64- NtcA- 2xNLSSV40 显示出增强的核定位和 αKG- RE 启动子激活（图 1, D 和 E，以及图 S1L）。此外，在不同强度的启动子下表达时，VP64- NtcA- 2xNLSSV40 表现出与 Zta- NtcA- NLSc- myc 相当或更强的转录活性（图 S2, A 至 R）。因此，我们选择了 EF1α 启动子驱动的 VP64- NtcA- 2xNLSSV40 嵌合体（或其突变体）进行进一步研究。
0.5
0.5
B D
EV
C
NtcAWT Chimera
I
1.0
0.0
0.0
Counts
Counts
Counts
Counts
102 103 104 0
102 103 104 GFP
102 103 104 GFP
102 103 104 GFP
GFP
G F H
NtcAR90E Chimera
NtcA∆DBD Chimera
EV NtcAWT Chimera NtcAR90E Chimera NtcA∆DBD Chimera
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
GFP MFI
GFP MFI
GFP MFI
GFP MFI
GFP MFI
Gln: dm-αKG:
-
-
Functional
** *
Gln (mM): dm-αKG (mM):
αKG (relative
to sgControl)
sgControl
sgControl
sgBCAT2 sgBCAT1
sgBCAT2 sgBCAT1
O N
FLAG
BCAT1-FLAG
BCAT2-FLAG
MTS-BCAT1-FLAG
+
+
- + +
- +
- +
+
- +
图 2. αKG- ON 生物传感器系统对核内 αKG 池的代谢和遗传扰动产生响应。(A 至 D) 代表性直方图，以及 (E 至 H) 在表达 αKG- RE 的 HEK293 细胞中 GFP 表达的定量分析，这些细胞转染了 EV 或三种 VP64- NtcA- 2xNLSSV40 嵌合体之一：WT NtcA、NtcAR90E 突变体或 DNA 结合域 (DBD) 缺失的 NtcA 突变体。细胞在指示浓度的谷氨酰胺 (glutamine) 和/或 dm- αKG 条件下培养 72 小时。在 (E) 至 (H) 中，数据相对于 2 mM Gln 条件进行了归一化。P < 0.001 (普通单因素方差分析)。(I) 在带有功能性 (NtcAWT) 或失活 (NtcAR90E) 版本的 αKG- ON 生物传感器系统的 HEK293 细胞中，GFP 表达相对于 2 mM Gln 条件的归一化结果，细胞在指示浓度的 Gln 和/或 dm- αKG 下培养 72 小时。*P < 0.01 (非配对 t 检验)。(J) BCAT1 和 BCAT2 转氨酶对支链氨基酸 (BCAA) 代谢的示意图。BCKA 为支链 α- 酮酸。(K) 通过液相色谱-质谱法 (LC- MS) 检测 BCAT1 或 BCAT2 缺失的 HEK293 细胞全细胞提取物中的相对 αKG 水平。P < 0.01 (非配对 t 检验)。(L) 携带功能性 αKG- ON 生物传感器系统的 (K) 中细胞的相对核内 αKG 水平（相对于 sgControl 细胞系归一化）。P < 0.01 (非配对 t 检验)。(M) 在携带功能性或失活版本 αKG- ON 生物传感器系统的 HEK293 细胞中 GFP 表达的定量分析（相对于 sgControl+EV 细胞系归一化）。细胞表达 Cas9 以及对照 sgRNA 或 BCAT1 sgRNA，同时表达 sgRNA 抗性的 BCAT1 cDNA 或 EV。(N) 表达 FLAG 标签的 BCAT1WT 酶、BCAT2WT 酶或带有 N 端线粒体靶向序列 (MTS) 肽的 BCAT1 突变酶的 HEK293 细胞的免疫荧光显微镜图像。Merge 显示所有信号的叠加。比例尺，10 μm。(O) 表达功能性 αKG- ON 生物传感器系统并按 (N) 中方式工程化或表达 EV 的细胞中的相对核内 αKG 水平 [GFP 中值荧光强度 (MFI) 相对于 EV 细胞系归一化]。*P < 0.05, P < 0.01 (非配对 t 检验)。在 (E) 至 (I)、(K) 至 (M) 以及 (O) 中，数据为平均值 ± SEM。
sgControl: sgBCAT1:
EV: BCAT1 cDNA:
Mito- Tracker DAPI Merge
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
EV BCAT1-FLAG
BCAT2-FLAG MTS-BCAT1-FLAG
核内和胞质 αKG 池被认为由于代谢物和其他小分子通过核孔的流动而达到平衡 (35, 36)。与这一观点一致，研究表明，胞质支链氨基酸转氨酶 1 (BCAT1) 而非线粒体 BCAT2 的活性增加会导致白血病细胞中的 DNA 高甲基化 (图 2J) (37)。这种相互作用被归因于 BCAT1 依赖性的核质 αKG 耗竭，而 αKG 是十一转位 (TET) 甲基胞嘧啶双氧酶的底物。我们利用 BCAT 旁系同源基因之间的这种差异，来评估 αKG- ON 生物传感器系统监测分区 αKG 代谢的能力。与 BCAT1 缺失相比，BCAT2 缺失导致全细胞 αKG 水平增加幅度更大 (图 2K 和图 S5A)。相反，BCAT1 而非 BCAT2 的缺失提高了核内 αKG 水平，如
由功能性生物传感器输出所示（图 2L）。BCAT1 缺失产生的这种效应可通过表达单导向 RNA (sgRNA) 不敏感的 BCAT1 cDNA 来挽救（图 2M 及图 S5, B 和 C）。此外，BCAT1 的缺失并未影响失活 αKG-ON 生物传感器系统的输出。BCAT1 和 BCAT2 旁系同源基因在亚细胞定位之外还具有截然不同的特性。接下来，我们构建了表达 FLAG 标签的 WT BCAT1、WT BCAT2 或带有 N 端线粒体靶向序列 (MTS) 的 BCAT1 突变体的细胞（图 S5D）。我们确认 WT BCAT1 定位于核质区，而 WT BCAT2 和 MTS-BCAT1 酶则位于线粒体中（图 2N）。过表达 WT BCAT1 降低了核内 αKG 水平，而 WT BCAT2 和 MTS-BCAT1 则没有（图 2O）。因此，αKG-ON 生物传感器系统能够感测由代谢酶功能基因操纵引起的 αKG 丰度的区室特异性变化。
正向遗传学方法鉴定出调节核内 αKG 库的基因 接下来，我们设计了一项无偏向的正向遗传筛选，以确定核内 αKG 库的关键分子调节因子（图 3A）。由于 U251 分化胶质母细胞瘤细胞在遗传筛选中表现优异 (38, 39)，我们采用了该细胞系。我们构建了具有高活性 αKG-RE 启动子（由 Synechocystis sp. PCC 6803 glnA 启动子的平铺 NtcA 结合位点与天然间隔序列组成）(图 1C) 以及 WT 或 R90E NtcA 嵌合体的 U251 细胞。然后，我们引入了 Cas9 和一个定制的“αKG 调节因子”CRISPR 缺失 sgRNA 库，该库针对 127 个编码直接合成、分解代谢或转运 αKG 的蛋白质的基因 (data S1)。随后，通过荧光激活细胞分选 (FACS) 分离出 GFP 表达量处于每组最高和最低 10 个百分位数的细胞，并进行 sgRNA 定量处理。我们通过调查在表达功能性生物传感器的细胞中选择性观察到的 sgRNA 富集或缺失模式，鉴定出以 αKG 依赖方式改变生物传感器输出的 sgRNA。
此次筛选产生了四个基因水平的“命中”项 (data S2)。BCAT1 和 DLD 的缺失增加了核内 αKG 水平，而 GPT2 和 SLC25A11 的缺失则耗尽了该代谢物库（图 3B）。值得注意的是，针对这四个基因的 sgRNA 在表达功能性与失活版本生物传感器的细胞中呈现出优先富集或缺失（图 3C，图 S7A 以及 data S2）。我们的研究结果表明，两种线粒体蛋白——丙氨酸转氨酶 GPT2 和苹果酸/αKG 对向转运蛋白 SLC25A11，是核内 αKG 的关键供应者。相反，线粒体二氢硫辛酰胺脱氢酶 DLD 和核质 BCAA 转氨酶 BCAT1 则是核内 αKG 的抑制因子。鉴于之前的研究 (37) 以及我们早期将 BCAT1 与核内 αKG 库负调节联系起来的数据（图 2, L 和 M），BCAT1 作为一项顶级命中结果表明此次筛选是成功的。我们
C
功能性 (Functional) 非功能性 (Inactive)
功能性 (Functional)
非功能性 (Inactive)
功能性 (Functional)
功能性 (Functional) 非功能性 (Inactive)
VP64 NtcA NLS NLS +
GFP
GFP
GFP
GFP
αKG-RE
αKG-RE
“αKG 调节因子” (αKG Regulators) CRISPR KO 库
B
VP64 NtcAR90E NLS NLS +
KO 耗尽 (KO depletes)
核 αKG (nuclear αKG)
核 αKG (nuclear αKG)
-log10FDR
1.0
1.0
SLC25A11
-10 -5 0 5 10 -6 -3 0 3 6 0
0.5
0.5
log2FC
log2FC
E F G
功能性 (Functional) 非功能性 (Inactive) 功能性 (Functional) 非功能性 (Inactive)
sgBCAT1 #1
BCAT1
sgBCAT1 #1
sgBCAT1 #1
sgBCAT1 #3
sgBCAT1 #3
sgBCAT1 #3
sgControl
sgControl
sgControl
sgControl
sgControl
sgControl
sgControl
sgControl
sgControl
sgControl
GFP MFI
GFP MFI
GFP MFI
GFP MFI
vinculin
vinculin
vinculin
I J K
sgSLC25A11 #1
sgSLC25A11 #2
sgSLC25A11 #2
sgSLC25A11 #2
0.0
0.0
sgControl sgSLC25A11 #1
sgControl sgSLC25A11 #1
DLD
** **
图 3. 前向遗传筛选揭示核 $\alpha$KG 池的分子调节因子。(A) 基于 FACS 的 CRISPR-Cas9 缺失筛选方案，用于鉴定控制核 $\alpha$KG 的基因。(B) 在构建了 (A) 所示功能性 $\alpha$KG-ON 生物传感器系统的 U251 细胞中进行 CRISPR-Cas9 筛选的基因级统计火山图。FC，倍数变化；FDR，错误发现率。基因级评分源自前 10% 与后 10% GFP 表达细胞中 sgRNA 读数的比率。(C) 在构建了功能性或失活版本 $\alpha$KG-ON 生物传感器系统的 U251 细胞中，针对 BCAT1、DLD、SLC25A11 或 GPT2 的单个 sgRNA 的富集或缺失情况。(D 至 K) 验证针对 BCAT1、DLD、SLC25A11 或 GPT2 的 sgRNA 对核 $\alpha$KG 池的调节作用。[(D), (F), (H) 和 (J)] 在构建了表达 Cas9 及对照或指示 sgRNA 的 U251 细胞中 BCAT1, DLD, SLC25A11 或 GPT2 表达的免疫印迹图。[(E), (G), (I) 和 (K)] 对 (D), (F), (H) 和 (J) 中构建了功能性或失活版本 $\alpha$KG-ON 生物传感器系统的细胞中 GFP 表达的定量分析（GFP MFI 经 sgControl 细胞系归一化）。P < 0.05, P < 0.01, **P < 0.001（非配对 t 检验）。在 (C), (E), (G), (I) 和 (K) 中，数据为平均值 ± SEM。
top10%
[sgRNA ]
[sgRNA ]
* **
验证了针对这些每个基因的两种 sgRNA，证明了蛋白质产物的有效缺失以及对功能性 $\alpha$KG-ON 生物传感器系统输出的优先调节（图 3, D 至 K）。我们还通过表达每个靶点的 sgRNA 不敏感 cDNA，挽救了由 GPT2 或 SLC25A11 缺失引起的核 $\alpha$KG 缺失（图 S6, A 至 D），
top10% bot10%
bot10%
sg5 sg4 sg3 sg2 sg1 sg5 sg4 sg3 sg2 sg1 sg5 sg4 sg3 sg2 sg1 sg5 sg4 sg3 sg2 sg1
BCAT1 DLD SLC25A11 GPT2
KO 增加
sgDLD #2
sgDLD #2
sgDLD #2
sgDLD #3
sgDLD #3
sgDLD #3
sgGPT2 #2
sgGPT2 #2
sgGPT2 #2
sgGPT2 #3
sgGPT2 #3
sgGPT2 #3
vinculin GPT2
我们比较了缺失上述基因的稳定细胞系中的核 $\alpha$KG 水平与绝对全细胞 $\alpha$KG 水平（图 S8A）。虽然 GPT2, SLC25A11, OGDH 和 BCAT1 的缺失对全细胞和核 $\alpha$KG 池产生了一致的影响，但 DLD, GLUD1, BCAT2 和 IDH3A 的缺失则不然。例如，DLD 的缺失增加了核 $\alpha$KG，但对全细胞 $\alpha$KG 的影响极小（图 S8B）。这些数据进一步突显了 $\alpha$KG-ON 生物传感器系统检测 $\alpha$KG 丰度中细胞器特异性变化的能力，而这种变化可能无法通过全细胞 $\alpha$KG 含量的变化准确推断。我们还调查了这些基因的缺失如何影响细胞增殖。总的来说，与表达对照 sgRNA 的细胞相比，我们观察到细胞适应度出现轻微或可忽略的下降（图 S8, C 至 J）。然而，一个针对 OGDH [一种常见的必需基因 (40)] 的 sgRNA 几乎消除了
增殖（图 S8K），这一效应与强效的 OGDH 蛋白缺失相关（图 S7I）。为了探讨针对必需基因的 sgRNA 如何影响生物传感器输出，我们缺失了核糖核蛋白基因 SNRPG（小核核糖核蛋白多肽 G）。SNRPG 缺失细胞系无法生长，并且在表达功能性和失活生物传感器的细胞中均显示出 GFP 水平增加（图 S8, L 至 N）。这一效应部分归因于垂死细胞的自发荧光，因为缺乏 GFP 报告构建体的 SNRPG 缺失细胞在 GFP 通道中也显示出较高的信号（图 S8O）。这些结果有助于解释在表达失活生物传感器的 GFPhigh 细胞群中富集有毒 OGDH sgRNA 的现象（图 S7B），并验证了我们使用失活生物传感器来降低那些引起 $\alpha$KG 无关的 GFP 信号变化的 sgRNA 优先级的做法（图 3A）。值得注意的是，
针对我们筛选中排名前列的“命中”基因（BCAT1、DLD、GPT2 和 SLC25A11）的 sgRNA 并没有导致细胞适应性或线粒体功能的严重缺陷（图 S8，D 至 G 和 P），也没有普遍增加失活生物传感器的输出（图 3C）。
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 1 3 10 30%
验证 sgRNA 的靶向效应。在我们的筛选中未被判定为“命中”的基因包括：编码 BCAA 转氨酶 BCAT2、谷氨酸脱氢酶 1 (GLUD1)、异柠檬酸脱氢酶 3 (IDH3) 复合物的 IDH3A 亚基，以及 $\alpha$-酮戊二酸脱氢酶复合物 (OGDC) 的 OGDH 组分（图 S7B）。这些酶均位于线粒体中，这表明该细胞器中的代谢反应对核 $\alpha$KG 池的贡献各不相同。我们验证了 BCAT2 无法调节核 $\alpha$KG（图 S7，C 和 D），这证实了我们之前的实验结果（图 2L）。在该模型系统中，GLUD1 在控制核 $\alpha$KG 方面起到的作用非常微小（图 S7，E 和 F）。在急性删除 IDH3A 和 OGDH 后，我们分别观察到了核 $\alpha$KG 的中度负向和正向调节（图 S7，G 至 J）。在未来的筛选中，通过降低细胞分选所使用的荧光强度阈值的严苛程度，可能能够捕捉到这类中度效应。对于 IDH3A sgRNA，将门控严苛度从顶端和底端的 10 降低至 30% 后，重复样本之间的相对方差有所降低（图 S7，K 和 L）。
一个细胞器间通路控制 $\alpha\text{KG}$ 依赖性的染色质去甲基化 我们假设通过筛选确定的蛋白质形成了一个分子网络，决定了 $\alpha\text{KG}$ 从线粒体向细胞核的流动（图 4A）。我们认为，在显示出强烈的 GPT2 依赖性丙氨酸合成的细胞中，GPT2 贡献了从线粒体输出的 $\alpha\text{KG}$ 池的主要部分。另一部分则由三羧酸 (TCA) 循环中的 IDH3 和 OGDC 活性控制，这体现在由急性 IDH3A、OGDH 和 DLD 缺失引起的生物传感器输出变化（图 3, F 和 G，以及图 S7, G 到 J）。尽管 OGDH sgRNA 在筛选中未得分（可能由于...）
Control B D - - - - - - E F - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
DNA Methylation C ** * ** 1.15 1.5 5mC : C Ratio (Normalized) 1.10 1.0 1.05 0.5 1.00 0.0 0.95 sgGPT2 #2 sgGPT2 #2 sgGPT2 #2 sgGPT2 #2 sgGPT2 #3 sgGPT2 #3 sgGPT2 #3 sgGPT2 #3 sgSLC25A11 #1 sgSLC25A11 #1 sgSLC25A11 #1 sgSLC25A11 #1 sgControl sgControl sgControl sgControl sgSLC25A11 #2 sgSLC25A11 #2 sgSLC25A11 #2 sgSLC25A11 #2 Ascorbate Control Ascorbate Functional Inactive Functional Inactive **
2.0 ** 0.15 0.05 0.00 GFP MFI GFP MFI sgControl: sgGPT2 #3: + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - - + + - - + - + - + - + - - + + - - + - - + - - - + - + - + - - + - + - + - + + - + - + - + + - + - - + - - + - + - + - - + - - - + - + - + - + - + - - + - + - - + - - - + - - + - + - - + + - - + - + sgDLD #2: sgDLD #3: sgDLD #2: sgDLD #3: p=0.23
图 4. $\alpha\text{KG}$ 代谢的线粒体-细胞核通路控制染色质甲基化。(A) 调节细胞核 $\alpha\text{KG}$ 的蛋白质定位模式和功能的示意图。OGDC，$\alpha$-酮戊二酸脱氢酶复合物；Pyr，丙酮酸；TETs，十一体易位甲基胞嘧啶双加氧酶；KDMs，含 Jumonji C 结构域的组蛋白赖氨酸去甲基化酶。(B) 在经工程化表达 Cas9 及对照、GPT2 或 SLC25A11 sgRNA 的 U251 细胞中，组蛋白 H3 总蛋白水平或三甲基赖氨酸翻译后修饰的免疫印迹。细胞经 200 $\mu\text{M}$ 抗坏血酸-2-磷酸处理或未处理。(C) 从 (B) 中细胞分离出的水解基因组 DNA 中 5-甲基脱氧胞苷 (5mC) 与脱氧胞苷 (C) 的比率。比率相对于经抗坏血酸处理的 sgControl 细胞系进行了归一化。每组 $n = 4$ 个生物学重复。**P < 0.01（非配对 t 检验），P = 0.23（普通单因素方差分析）。
(D) 在经工程化表达 Cas9 及对照或 SLC25A11 sgRNA，以及 GPT2 cDNA 或 EV 的 U251 细胞中，GFP 表达量的定量分析（GFP MFI 相对于 sgControl+EV 细胞系归一化）。细胞还被工程化植入功能性或失活版本的 $\alpha\text{KG}$-ON 生物传感器系统。P < 0.01, P < 0.001（非配对 t 检验）。(E) 在经工程化表达 Cas9 及对照、GPT2 或 DLD sgRNA 的 U251 细胞中，GFP 表达量的定量分析（GFP MFI 相对于 sgControl 细胞系归一化）。细胞还被工程化植入功能性或失活版本的 $\alpha\text{KG}$-ON 生物传感器系统。P < 0.01, P < 0.001（非配对 t 检验）。(F) 在经工程化表达 Cas9 及对照、GPT2 或 DLD sgRNA 的 U251 细胞中，进行了 2 小时的 $\alpha\text{-}{}^{15}\text{N}$-谷氨酰胺稳定同位素追踪。图中显示了每条细胞系中 Ala (M+1) 同位素体的分数富集度相对于 Glu (M+1) 同位素体分数富集度的比值。*P < 0.05, P < 0.01（非配对 t 检验）。在 (C) 至 (F) 中，数据为平均值 $\pm$ 标准误 (SEM)。
sgControl: sgSLC25A11 #1: sgSLC25A11 #2: EV: GPT2 cDNA: 0.20 AlaM+1/GluM+1 0.10 sgControl: sgGPT2 #2: sgGPT2 #3:
H3K4me3 Total H3 Total H3 Total H3 H3K9me3 H3K27me3 $\alpha\text{-}{}^{15}\text{N}\text{-Gln}$ tracing
慢性毒性），在 OGDH 缺失导致适应性丧失之前进行的短期实验中，OGDH 缺失确实增加了核 $\alpha$KG（图 S7, I 和 J）。DLD 是产生硫胺素-二磷酸辅酶（lipoamide）所需的 E3 亚基，用以支持三个线粒体酶复合物的催化循环：OGDC、丙酮酸脱氢酶 (PDH) 和支链 $\alpha$-酮酸脱氢酶 (BCKDH)。BCKDH 和 PDH 的活性不太可能解释 DLD 对核 $\alpha$KG 池的控制，因为 BCAT2（BCKDH 的上游调节因子）或 PDHA1（PDH 的 E1 亚基）的缺失均未改变功能性 $\alpha$KG-ON 生物传感器系统的输出（图 S7, C 和 D，以及 S9, A 和 B）。DLD 可能通过 OGDC 调节核 $\alpha$KG。DLD 缺失（图 3, F 和 G）在表型上与急性 OGDH 缺失引起的核 $\alpha$KG 积累相似（图 S7, I 和 J）。考虑到 DLD 和 OGDH 均为 OGDC 活性所必需，目前尚不清楚为什么 DLD sgRNAs 能维持细胞活力，而 OGDH sgRNAs 则不能（图 S8, E 和 K）。为了完善这一细胞器间分子网络，我们的数据表明，由 GPT2 产生或通过 TCA 循环活性产生的线粒体 $\alpha$KG 由 SLC25A11 转运蛋白导出。在核质区，$\alpha$KG 主要由 BCAT1 催化分解为谷氨酸，或被 Jumonji C 结构域包含的组蛋白赖氨酸去甲基化酶 (KDM) 或 TET $\alpha$KG 依赖性双加氧酶用作底物，从而分别促进组蛋白和 DNA 的去甲基化。
为了验证这一模型，我们首先询问由 GPT2 或 SLC25A11 缺失引起的核 $\alpha$KG 耗竭是否会导致组蛋白或 DNA 去甲基化受损。在有抗坏血酸存在（但不存在时则没有）的情况下，GPT2 或 SLC25A11 缺失导致组蛋白 3 赖氨酸 4 (H3K4) 和 H3K9 出现超甲基化（图 4B 和图 S9, C 至 E）。在 H3K27 三甲基化 (H3K27me3) 中也观察到了类似的趋势。在 U251 细胞中，H3K4me3 对核 $\alpha$KG 的变化最敏感，因此我们在随后的体外研究中优先监测这一标记。基因组 DNA 中脱氧胞苷核苷的甲基化在 GPT2 或 SLC25A11 缺失后也增加（图 4C），尽管这一效应在全基因组分析中未达到统计学显著性。向 GPT2 缺失细胞补充 dm-$\alpha$KG 挽救了核 $\alpha$KG 以及 H3K4、H3K9 和 H3K27 的超甲基化（图 S9, F 至 J）。用 dm-$\alpha$KG 处理 GPT2-WT 细胞并未导致组蛋白去甲基化，这表明在营养充足的条件下，核 $\alpha$KG 并不是 KDM 酶活性的限制因素。GPT2 和 SLC25A11 对核 $\alpha$KG 的控制具有普适性，因为在另外两种神经细胞系中，缺失其中任何一种蛋白质都会降低核 $\alpha$KG：永生化正常人星形胶质细胞 (NHA) 星形胶质细胞和
TS516 患者来源的胶质瘤干细胞样细胞（图 S10, A 至 D）。在以生理浓度的丙氨酸和谷氨酰胺培养 TS516 细胞，并使其处于葡萄糖、丙酮酸和氧气变化的条件下时，GPT2 的缺失同样导致核 αKG 耗尽（图 S10E）。因此，在体内相关的代谢应激条件下，GPT2 为细胞核提供 αKG。
线粒体 GPT2 和 SLC25A11 活性供应核 αKG 池 GPT2 和 SLC25A11 的功能表明，它们分别在一条线性路径中发挥作用，以产生并从线粒体中导出 αKG。GPT2 的过表达以 SLC25A11 依赖的方式增加了细胞核中的 αKG 水平（图 4D 和 图 S12A）。此外，GPT2 的上调未能挽救由 SLC25A11 缺失引起的组蛋白超甲基化（图 S12, B 至 E）。为了评估 GPT2 活性的亚细胞分布，我们首先量化了 U251 和 NHA 细胞内源性表达的 GPT2 剪接异构体（图 S11, A 和 B）。在这两种细胞类型中，表达的主要转录本 ENST00000340124.9, 编码具有预测 N-端 MTS 的全长 GPT2 蛋白（图 S11, C 和 D）。然而，在两条细胞系中表达量第二高的转录本 ENST00000440783.2, 具有独特的 5′ 外显子结构，并编码一种缺乏 MTS 的 GPT2 蛋白异构体。在 U251 细胞中过表达这两种主要的 GPT2 转录本显示，ENST00000440783.2 的蛋白产物明显定位于核质溶胶室，而全长的 ENST00000340124.9 则不同（图 S11, E 和 F）。过表达截短的 GPT2 酶对核 αKG 的影响微乎其微（图 S11G）。因此，由 GPT2 在线粒体中产生的 αKG 通过 SLC25A11 导出，以供应细胞核中的 αKG 池。
接下来，我们试图研究 GPT2 与 DLD 之间的相互作用。在 DLD 缺失后，GPT2-WT 和 GPT2-null 细胞均显示出核 αKG 增加（图 4E 和 图 S12, F 和 G），且 DLD 缺失挽救了由 GPT2 丢失引起的组蛋白超甲基化（图 S12, H 至 K）。因此，DLD 依赖的 αKG 向染色质信号传递的调节不需要 GPT2。OGDH 的缺失也独立于 GPT2 增加了功能性 αKG-ON 生物传感系统的输出（图 S12, L 和 M），尽管由于细胞适应性丧失，对非活性生物传感器输出产生了干扰效应。接下来，我们使用 $\alpha\text{-}^{15}\text{N}$-谷氨酰胺在对照细胞或缺失 GPT2、DLD 或两种酶的细胞中进行稳定同位素追踪，以确定 DLD 缺失对 GPT2 通量的影响，并以丙氨酸标记与谷氨酸标记的比率作为 GPT2 活性的标志（图 4F 和 图 S12N）。DLD 缺失降低了向丙酮酸分解代谢方向的 GPT2 通量，而 GPT2 缺失则消除了 $\alpha\text{-}^{15}\text{N}$-谷氨酰胺的丙氨酸标记。因此，GPT2 和 DLD 在核 αKG 调节网络中占据关键但截然不同且互不重叠的节点。
GPT2 缺陷小鼠模型显示脑内染色质高甲基化 我们评估了一个 GPT2 缺陷的小鼠模型，以确定 GPT2 在体内的表观遗传调节作用。GPT2 缺陷是一种相对近期被描述的先天性代谢错误，由 GPT2 基因功能缺失突变的常染色体隐性遗传引起 (41–44)。这些突变会导致神经和智力损害。在小鼠中，全身性 Gpt2 缺失会导致出生后 17 到 30 天死亡 (45)。神经元特异性缺失 Gpt2 可完全重现该表型，强调了该酶在支持神经元发育和稳态中的关键功能 (46)。我们调查了全身 Gpt2 缺失 [Gpt2 KO（敲除）] 和 Gpt2 WT 小鼠各种组织的全局组蛋白甲基化谱，观察到在出生后第 19 天 (P19) 的 Gpt2 KO 动物脑中出现了普遍的 H3K4、H3K9 和 H3K27 高甲基化 (图 5A 以及图 S13, A 和 H 至 J)。除了心脏组织中 H3K9 高甲基化以及脾脏组织中 H3K9 和 H3K27 高甲基化外 (图 S13, B 至 G)，GPT2 缺失对其他器官的组蛋白甲基化总体影响较小。我们还观察到，与 Gpt2 WT 小鼠脑组织相比，Gpt2 KO 小鼠脑组织的基因组 DNA 提取物中 5mC 呈现全局富集趋势 (图 5B)。这种趋势具有脑特异性，因为 Gpt2 缺失并未改变肾脏组织中的基因组 5mC 水平 (图 5C)。通过单碱基分辨率的 5mC 全基因组分析，我们观察到 Gpt2 KO 脑组织与 Gpt2 WT 脑组织相比，DNA 甲基化显著增加 (图 5D)。因此，Gpt2 缺失会导致脑内染色质高甲基化。
丙酮酸在脑脊液中富集并决定 GPT2 依赖性 $\alpha$KG 合成 我们假设，组织特异性的 GPT2 底物水平差异（而非 GPT2 表达量的差异）决定了 GPT2 通量的方向和幅度。GPT2 是可逆的，也可以分解 $\alpha$KG 和丙氨酸，产生丙酮酸和谷氨酸。Gpt2 KO 小鼠脑组织中的丙氨酸水平降低 (42)，表明在体内脑组织中，通过 GPT2 的净通量可能倾向于 $\alpha$KG 和丙氨酸合成的方向。因此，我们探讨了丙酮酸可用性的增加是否可能是中枢神经系统 (CNS) 中 GPT2 依赖性 $\alpha$KG 和丙氨酸合成的驱动因素。在儿童和成人中，脑脊液 (CSF) 的丙酮酸含量几乎是血液的两倍 (图 S13, K 和 L)，这表明 CNS 中的局部丙酮酸供应可能高于周围器官。为了确定丙酮酸可用性是否影响核 $\alpha$KG 池的 GPT2 依赖性供应，我们在含有或不含丙酮酸的培养基中培养对照组或 GPT2 KO 细胞，评估了 $\alpha\text{-}^{15}\text{N}$-谷氨酰胺稳定同位素追踪和 $\alpha\text{KG-ON}$ 生物传感器系统的输出。丙酮酸补充刺激了 GPT2 向丙氨酸和 $\alpha$KG 合成方向的通量 (图 S13, M 和 N)，并显著提升了核 $\alpha$KG (图 S13O)。GPT2 缺失消除了这两种效应。丙酮酸补充引起了 GPT2 依赖性的 H3K4、H3K9 和 H3K27 低甲基化趋势 (图 S13, P 至 S)。因此，GPT2 在 CNS 中的优先表观遗传调节功能可能是由高微环境丙酮酸浓度驱动的。
Gpt2 缺失以 $\alpha$KG 依赖的方式失调染色质甲基化和神经发育基因程序
大多数关于 GPT2 缺乏分子发病机制的研究集中在丙氨酸生物合成缺陷、依赖于谷氨酰胺的 TCA 循环补给以及谷氨酸能神经传递 (42, 47)。我们的研究表明，核 $\alpha$KG 的耗竭和染色质超甲基化也可能导致疾病表型。为了验证核 $\alpha$KG 耗竭导致 Gpt2 KO 小鼠大脑中出现染色质变化的假设，我们向 Gpt2 WT 和 Gpt2 KO 小鼠施用了 dm-$\alpha$KG。dm-$\alpha$KG 治疗挽救了由 Gpt2 缺失引起的组蛋白超甲基化（图 5, E 至 H），并且相对于 Gpt2 WT 对照组，优先影响 Gpt2 KO 小鼠脑组织中的基因表达（图 5, I 至 K，以及数据 S6）。dm-$\alpha$KG 补充还挽救了 Gpt2 KO 小鼠在出生后早期致死前出现的体重减轻（图 5L 和图 S13T）(45)。因此，$\alpha$KG 向染色质传递信号的缺陷在 GPT2 缺乏的分子发病机制中似乎起到了核心的因果作用。
我们还评估了 GPT2 在肿瘤中的表观遗传调节作用。PIK3CA 突变会增加癌细胞中的 GPT2 活性 (48)。利用 PIK3CA 突变的 HCT116 结直肠癌细胞，我们构建了等基因的 GPT2 WT 和 GPT2 KO 稳定细胞系，并将其皮下植入免疫缺陷小鼠体内。我们用 dm-$\alpha$KG 或溶媒处理小鼠，随后采集肿瘤进行组蛋白甲基化分析。GPT2 缺失导致 H3K4、H3K9 和 H3K27 超甲基化，而这些效应通过 dm-$\alpha$KG 治疗得到了挽救（图 S14, A 至 D）。溶媒处理的 GPT2 WT 和 GPT2 KO 肿瘤以相似的速度生长，这表明组蛋白超甲基化并非由 GPT2 缺乏肿瘤中癌细胞适应性的非特异性丧失所引起（图 S14E）。这些数据表明，GPT2 依赖的染色质甲基化控制发生在多种生物学背景中。
大脑
Gpt2 WT Gpt2 KO
Gpt2 WT
Gpt2 WT
K
Gpt2 WT
Gpt2 KO
Gpt2 KO
Gpt2 WT
Gpt2 KO
Gpt2 WT
Gpt2 KO
Gpt2 KO
E
Vehicle (溶媒) dm-αKG
H
Vehicle (溶媒) dm-αKG
L
Vehicle (溶媒)
dm-αKG
I J
n=69 n=116
-log10(p 值)
1.0
1.0
-log10(p 值)
-6 -4 -2 0 2 4 6 0
2.0
2.0
log2FC: dm-αKG vs Vehicle (溶媒)
H3K4me3
H3K9me3
H3K27me3
图 5. Gpt2 缺失导致小鼠出现 αKG 依赖性的表观遗传失调和适应度降低。(A) 来自 Gpt2 WT 或 Gpt2 KO 小鼠脑组织的免疫印迹图。(B 和 C) 从 (B) 脑组织或 (C) 肾组织中分离的 Gpt2 WT 或 Gpt2 KO 小鼠水解基因组 DNA 的 5mC 与脱氧胞苷比例。每组 n = 3 个组织。P 值来自非配对 t 检验。(D) Gpt2 WT 和 Gpt2 KO 小鼠脑组织中 5mC 水平的全基因组、位点特异性分析。P 值来自 Wilcoxon 符号秩检验。(E) 经溶媒或 600 mg kg−1 dm-αKG 处理的 Gpt2 WT 或 Gpt2 KO 小鼠脑组织的免疫印迹图。(F) H3K4me3, (G) H3K9me3, 和 (H) H3K27me3 的定量结果，源自 (E) 中的印迹。归一化强度相对于溶媒处理的 Gpt2 WT 样本的平均值表示。每组 n = 5 个脑组织。P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001 (非配对 t 检验)。(I 和 J) 经溶媒或 600 mg kg−1 dm-αKG 处理的 (I) Gpt2 WT 小鼠和 (J) Gpt2 KO 小鼠大脑 RNA-seq 分析的火山图。(K) 来自 (I) 和 (J) 的差异表达基因。P 值通过 χ2 检验计算。(L) 经溶媒处理 (n = 10 只小鼠) 或 600 mg kg−1 dm-αKG 处理 (n = 9 只小鼠) 的 Gpt2 KO 小鼠体重，并相对于 Gpt2 WT 小鼠进行了归一化。*P < 0.001 (配对 t 检验)。在 (B), (C), (F) 至 (H), 以及 (L) 中，数据为平均值 ± SEM。
肾脏
p<0.001
(归一化)
(归一化)
F G
H3K9me3
H3K27me3
** *
** **
H3K27me3 :
H3K4me3
H3K9me3 :
H3K4me3 :
H3K9me3
0.5
0.5
H3K27me3
0.0
0.0
n.s.
体重
体重
我们接下来对 Gpt2 KO 和 Gpt2 WT 小鼠大脑染色质中的 H3K4me3, H3K9me3, 和 H3K27me3 标记进行了染色质免疫共沉淀测序 (ChIP-seq)。与全局 H3K4me3, H3K9me3, H3K27me3 的免疫印迹分析一致 (图 5A)，这些标记在 Gpt2 KO 小鼠脑组织全基因组的多个位点中均有所富集 (图 6, A 至 C, 以及数据 S3 至 S5)。已知 H3K27me3 标记能抑制转录输出。为了鉴定 Gpt2 KO 小鼠大脑中同时显示 H3K27 高甲基化和表达降低的基因，我们将 Gpt2 KO 和 WT 小鼠大脑的 RNA 测序 (RNA-seq) 数据 (数据 S6) 与 H3K27me3 ChIP-seq 数据 (图 6D 和数据 S5) 进行了整合。在 Gpt2 KO 小鼠脑组织中下调的 800 多个基因也显示出 H3K27 高甲基化，从而确定了一组与核 αKG 耗竭相关的转录变化。
基因本体 (GO) 分析突出了与神经系统发育、神经发生和神经胶质发生相关的词条 (图 6E 和数据 S7)，这表明 H3K27me3 高甲基化影响了与出生后神经系统发育相关的基因程序。此外，与细胞内钙调节（神经电化学信号传导的关键效应因子）和运动行为相关的基因也发生了显著改变。此外，与 Gpt2 WT 相比，Gpt2 KO 小鼠大脑中 H3K27me3 相关的高 CpG 密度启动子 (HCP) 和脑神经发育基因集有所减少，且通过 dm-αKG 处理得到了恢复 (图 6, F 至 I, 以及数据 S6)。我们调查了三个具有关键
1.5
1.5
p=0.23
1.03
5mC : C 比例
5mC : C 比例
1.02
1.02
1.01
1.01
1.00
1.00
总 H3
总 H3
总 H3
总 H3
总 H3
0.99
0.99
Gpt2 KO H3K4me3
上调 下调
p<0.00001 69
p=0.97
0.98
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
KO dm-αKG: - + WT - +
KO dm-αKG: - + WT - +
KO dm-αKG: - + WT - +
在产后中枢神经系统（CNS）发育中，Gpt2缺失会导致这些角色失调，而通过dm-αKG治疗可以使其恢复（图 6, J至O）。Hapln4 编码一种胞外基质蛋白，该蛋白可稳定突触周围神经元网 (49)。Hapln4 的下调与抑制性神经传递受损 (50) 以及衰老和中风中的神经退行性过程 (51) 相关。Etv4 编码一种转录因子 (52, 53)，该因子是运动和感觉神经元回路发育所必需的 (54, 55)。Notch3 在脑血管平滑肌细胞和神经祖细胞中表达，当其失活时会导致血流量减少和神经元分化异常 (56–58)。
H3K4me3 标记被认为在基因反式激活中起稳定作用，而非驱动作用 (59)。在 Gpt2 敲除（KO）小鼠脑中，超过 1200 个基因出现了 H3K4me3 超甲基化且过度表达（图 S15A 及数据 S3 和 S6），其中包括许多与氨基酸和营养饥饿、突触翻译、认知以及神经肽信号传导相关的基因（图 S15B 及数据 S8）。我们调研了其中的三个基因，包括：受综合应激反应刺激的 Eif4ebp1 (60)；编码控制神经发生和突触生成的转录因子的 Cux2 (61, 62)；以及编码调节皮层中间神经元迁移的神经调节蛋白家族成员的 Nrg3 (63)。这些基因中每一个的异常上调均通过 dm-αKG 治疗得到了抑制（图 S15, C至H）。这些数据确立了 GPT2 在体内的关键表观遗传调节功能，并揭示了表观遗传功能障碍是导致 GPT2 缺陷中神经发育缺陷的一个原因。
Gpt2 KO vs Gpt2 WT
-log10(q value)
0 50 100 150 200 250
-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5
差异修饰
(Gpt2 WT 的比例)
(Gpt2 WT 的比例)
16 17 18 19 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1
产后天数
产后天数
B E
KO
KO
KO
WT - +
H3K4me3
-1
-1.5
1.5
1.5
1 0
kb from TSS
-3 0 3 kb from TSS
-3 0 3 kb from TSS
p<0.001
p<0.001
p<0.001
KO WT
KO WT
KO WT
-10.0
0.10 0.12 0.14 0.16 0.18
0.2 0.4 0.6 0.8
-0.6
-0.6
G
富集分数 (ES)
富集分数 (ES)
富集分数 (ES)
富集分数 (ES)
H3K27me3
H3K27me3
Meissner_Brain_ HCP_with_H3K27ME3
H3K27me3
H3K27me3
H3K27me3
0.0 -0.2 -0.4
0.0 -0.2 -0.4
0.0 -0.2 -0.4
0.0 -0.2 -0.4
I
Gpt2 WT Vehicle (溶媒) Gpt2 KO
Gpt2 WT Vehicle (溶媒) Gpt2 KO
Vehicle (溶媒)
Vehicle (溶媒)
Vehicle (溶媒)
Vehicle (溶媒)
K L M N O
1kb
1kb
WT1.5
WT 1
WT1.5
Hapln4
Hapln4
development
H3K9me3
Cranial_ Nerve_Development
Cranial_ Nerve_Development
** *
*
CPM
CPM
CPM
图 6. Gpt2 KO 小鼠中出现 $\alpha$KG 依赖性神经发育基因失调。(A) H3K4me3, (B) H3K9me3, 或 (C) H3K27me3 在 Gpt2 WT 或 Gpt2 KO 小鼠大脑中的 ChIP-seq 结果。龙卷风图（Tornado plots）以及对齐的组蛋白甲基化密度的定量分析。(D) 对 Gpt2 WT 和 Gpt2 KO 小鼠大脑组织的 H3K27me3 ChIP-seq 和 RNA-seq 数据集进行综合分析。(E) 基于 (D) 中分析得出的基因本体 (Gene ontology) 分析。(F 至 I) 富集图，分别为 [(F) 和 (G)] 大脑中带有 H3K27me3 标记的高 CpG 密度启动子 (HCP) 基因，以及 [(H) 和 (I)] 颅神经发育基因。NES，归一化富集分数。(J, L, 和 N) Gpt2 KO 小鼠大脑中 H3K27me3 高甲基化且下调的神经发育基因的 H3K27me3 ChIP-seq 密度轨迹。(K, M, 和 O) 包含经 dm-$\alpha$KG 处理或未处理的 Gpt2 KO 和 Gpt2 WT 小鼠中指定基因的 RNA-seq 每百万计数 (CPM) 表达图。溶媒处理的 Gpt2 WT 和 Gpt2 KO 小鼠 n = 10 个脑组织，dm-$\alpha$KG 处理的 Gpt2 WT 和 Gpt2 KO 小鼠 n = 8 个脑组织。P < 0.05, *P < 0.01（非配对 t 检验）。在 (K), (M), 和 (O) 中，数据为平均值 $\pm$ SEM。
讨论 在这项工作中，我们引入了 $\alpha$KG-ON 生物传感器系统，将其作为一种能够对核 $\alpha$KG 库大小的变化进行鲁棒且特异性测量的工具。我们的工作扩展了在活细胞中测量 $\alpha$KG 的现有技术。之前基于荧光共振能量转移 (FRET) 的工具主要用于监测细菌中的 $\alpha$KG (33, 64–69)。当需要区室特异性、高灵敏度和增强的 $\alpha$KG 感测稳定性时，$\alpha$KG-ON 生物传感器系统在监测人体细胞中的 $\alpha$KG 方面可能具有优势。我们测定 NtcA 与 $\alpha$KG 结合的 $K_d$ 为 2.0 mM，U251 细胞的全细胞 $\alpha$KG 含量为 1.35 mM。相应地，当全细胞 $\alpha$KG 在 $\sim$0.5 至 6 mM 之间变化时，该生物传感器能检测到核 $\alpha$KG 丰度的变化。$\alpha$KG 与 TET 和 KDM 酶结合的米氏常数 ($K_m$) 值为 5 至 60 $\mu$M (70)，这意味着核 $\alpha$KG 可能对其活性不构成限制。然而，这些 $K_m$ 值源自在缺乏竞争性抑制分子（如琥珀酸和延胡索酸）的情况下对重组纯化酶的研究 (4)。我们的工作证实，在基础条件下，核 $\alpha$KG 不限制染色质去甲基化，但当提供该代谢库的酶和转运体受损时，则会成为限制因素。
距离中心 kb
0.5 0.6 0.7 0.8
-3 0 3 距离中心 kb
Gpt2 KO dm-$\alpha$KG Gpt2 KO
Gpt2 KO dm-$\alpha$KG Gpt2 KO
** p=0.07
KO dm-$\alpha$KG: - + 0
1.5 10.0
(log2FC Gpt2 KO vs Gpt2 WT)
-10 -3 -2 -1 0 1 2 3 10
表达量 (log2FC: Gpt2 KO vs Gpt2 WT)
0 2 4 6 8 10 **
Etv4
Etv4
KO dm-$\alpha$KG: - + WT - +
KO dm-$\alpha$KG: - + WT - +
我们通过生物传感器实现的顺向遗传学筛选结果，为核 $\alpha$KG 调节提供了一个概念模型。GPT2 和 TCA 循环活性调节线粒体中产生的 $\alpha$KG，随后 $\alpha$KG 通过 SLC25A11 导出到细胞质中。随后 $\alpha$KG 可能通过核孔扩散到细胞核中 (35, 36)。核 $\alpha$KG 库维持参与染色质去甲基化的双加氧酶，并受到 BCAT1 的拮抗，这与之前的研究一致 (37)。为了支持该模型的生理相关性，GPT2 的活性对于在大脑中建立适当的染色质甲基化模式至关重要。
我们的研究结果表明，人类细胞中的核 $\alpha\text{KG}$ 的控制机制与乙酰 $\text{CoA}$ 和 $\text{SAM}$ 的核池不同，后者同样作为染色质修饰酶的底物。研究表明，腺苷 5′- 三磷酸 (ATP)–柠檬酸裂解酶 (ACLY) (71, 72)、乙酰 $\text{CoA}$ 合成酶 2 (ACSS2) (73–75)、丙酮酸脱氢酶 (PDH) (76, 77) 和甲硫氨酸腺苷转移酶 (MAT) (78–80) 均定位于细胞核内以促进染色质修饰。相比之下，我们发现核 $\alpha\text{KG}$ 主要源自线粒体代谢。尽管有报道称 GPT2 定位于细胞核 (81)，但我们观察到线粒体 GPT2 的活性为细胞核提供 $\alpha\text{KG}$。我们还证明了 SLC25A11 在 $\text{GPT2}$ 的上游（epistatic）。
Gpt2 KO: H3K27me3-富集
且下调的基因
神经系统
神经发生
胶质发生
$\text{Ca}^{2+}$ 浓度调节
运动行为
$\log_2(\text{fold enrichment})$
0.1 2.5 1.25 $-\log_{10}(\text{FDR})$
$\text{NES} = -2.15$ $\text{FDR} = 0.001$ -0.6
5kb
Notch3
Notch3
0 25 50
这种细胞器间通路维持了核内 αKG 池。这一发现与一项关于家族性副神经节瘤的研究一致，该研究表明 SLC25A11 功能缺失突变在表型上与由产生癌代谢物的 SDH 或 FH 突变引起的染色质超甲基化相似 (82)。
我们的工作为 GPT2 缺乏症的发病机制提供了见解。该疾病的症状包括全球发育迟缓、肌张力低下、语言和行走发育迟缓或失败以及癫痫 (41–44)。GPT2 依赖性丙氨酸合成的缺失与这些疾病相关的表型有关，因为丙氨酸补充可改善 Gpt2 缺失的培养神经元和小鼠的健康状况 (45)。我们的研究结果揭示，GPT2 依赖性 αKG 合成的缺失是导致 GPT2 缺乏症神经功能障碍的另一个原因。在 Gpt2 KO 小鼠中，与神经发生和突触发生相关的基因出现失调。αKG 补充使这些影响正常化，并防止了这些动物在死亡前出现的体重减轻。我们的研究证明，核内 αKG 池耗尽和表观遗传重编程驱动了 GPT2 缺乏症的病理过程，且 αKG 补充可能是一种治疗该疾病的有前景的策略。
Materials and methods Experimental model details 小鼠：所有涉及活体小鼠的实验均按照美国国家卫生研究院 (NIH) 的《实验室动物护理和使用指南》，在布朗大学机构动物护理和使用委员会 (24- 09- 0009) 和德克萨斯大学西南医学中心 (2019- 102795) 机构动物护理和使用委员会批准的方案下进行。在治疗期间每天进行动物福利评估。所有实验动物的护理和治疗均严格遵守美国实验室动物福利办公室定义的良好动物实践 (Good Animal Practice)。
Gpt2 冷冻保存突变胚胎是通过加州大学戴维斯分校的敲除小鼠项目 (Knockout Mouse Project) 资源建立的（项目 ID CSD24977）。胚胎的背景为 C57BL/6N，且这些小鼠已完全回交至 C57BL/6J 系。靶向构建涉及一个基因陷阱（剪接受体）和 LacZ- Neo 表达盒 (42)。随后，C57BL/6J 背景的小鼠被完全回交至 CD- 1 系。杂合雄性和杂合雌性交配，以产生两种性别和所有基因型的后代。动物通过 PCR 进行基因分型，使用前向引物 GPT2 neF (5′– TGATGGCACTCTGCACCTAC- 3′) 和反向引物 GPT2 neR (5′– TCACTCTTGGCTCTGGACCT- 3′)，野生型 (WT) 条带为 830 bp，突变条带为 900 bp，如前所述 (42)。小鼠维持标准饲料喂养。在标注的情况下，小鼠从出生后第 0 天 (P0) 开始，每天通过腹腔注射给予一次溶媒或 600 mg kg−1 dm- αKG (Sigma 349631)。在出生后第 19 天 (P19)，采集包括脑、心、肝、肾、肺、脾、胃、结肠和坐骨神经在内的组织。所有组织立即快速冷冻，随后储存于液氮中直至进一步分析。
NCR/NU 小鼠 (Taconic) 用于皮下异种移植实验。肿瘤细胞在 6 周龄时注射到雌性小鼠体内，实验组按年龄匹配。
细胞系：NHA细胞（经HPV E6、E7和hTERT永生化的人类星形胶质细胞，性别未知）由R. Pieper (UCSF) 慷慨赠送 (83)。HEK293细胞（雌性）购自ATCC (CRL- 1573)。HEK293T细胞（雌性，转导SV40 T-抗原）由W. G. Kaelin Jr. (Dana- Farber) 慷慨赠送。U251细胞（雄性）购自Sigma (09063001- 1VL)。HOG细胞（源自雄性的人类少突胶质细胞瘤系）由P. Paez (SUNY Univ. at Buffalo) 赠送。人类TS516胶质母细胞瘤干细胞样细胞 (GSCs)（性别未知）由I. Mellinghoff (MSKCC) 提供，并此前有报道 (84)。HCT116细胞（雄性）由J. Garcia- Bermudez (UTSW) 慷慨赠送。
除非另有说明，NHA和HCT116细胞在含有 10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素的DMEM (Gibco 11995065) 中培养。HOG细胞（源自雄性的人类少突胶质细胞瘤系）在含有 10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素的IMDM培养基 (Gibco 12440061) 中培养。TS516细胞在含有增殖补充剂 (StemCell Technologies 05750) 的NeuroCult NS- A 基础培养基 (人类) 中培养，并添加了EGF (20 ng/ml)、bFGF (10 ng/ml)、肝素 (2 μg/ml)、1% 青霉素/链霉素、两性霉素B (250 ng/ml) 和 Plasmocin (2.5 μg/ml)。在指定情况下，HOG细胞使用 250 nM vorasidenib (Wuxi Apptec) 处理 48 小时。在指定情况下，TS516细胞被置于模块化低氧孵育室 (Baker Ruskinn InvivO2) 中，该室使用 1% O2、5% CO2 和 94% N2 冲洗。
方法 NtcA结合位点预测：将此前定义的基因特异性NtcA结合位点与共识NtcA结合位点进行比较。使用原核生物基因调节的PRODORIC数据库构建位置权重矩阵，以定义源自多种蓝细菌基因组的保守NtcA结合位点中每个位置的核苷酸出现频率。PRODORIC数据库的访问地址为 https://www.prodoric.de。
核出口信号预测：使用 NetNES1.1 工具 (85) 评估 VP64- NtcA- NLSc- myc NtcA 嵌合体原氨基酸序列中的推测核出口信号 (NES)。NetNES1.1 工具的访问地址为 https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetNES- 1.1。
线粒体靶向序列预测：使用 TargetP- 2.0 对 GPT2 剪接异构体蛋白产物中的线粒体靶向序列进行预测。TargetP- 2.0 工具的访问地址为 https://services.healthtech.dtu.dk/services/TargetP- 2.0。
NtcA结构分析：描述NtcA与DNA之间相互作用的结构数据源自一项关于涉及NtcA和NtcB的蓝细菌转录激活复合物的冷冻电子显微镜 (cryo- EM) 研究 (Protein Data Bank 登录号 8H3V)。使用Pymol软件 (Schrödinger) 从较大的转录激活复合物冷冻电镜结构中分离出 NtcA- DNA 复合物。
蛋白质纯化与微尺度热泳法：NtcA 由 GenScript 公司在储存缓冲液（100 mM HEPES, pH 7.4, 500 mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 0.005% Nonidet P- 40, 10% 甘油）中制备。MST 缓冲液的制备方式与储存缓冲液类似，但仅包含 320 mM NaCl 且不含甘油。NtcA 被浓缩至 20 μM（使用 205 nm 处 803,210 M−1cm−1 的消光系数测定），并通过将 200 μl 的 20 μM 溶液与 1 μl 稀释的 Cyanine- 5 NHS 染料（由 1 μl 40 mM DMSO 染料和 2 μl MST 缓冲液混合而成）混合进行荧光标记。标记反应在室温避光条件下孵育 20 min，然后在微离心机中以最大速度 4°C 离心 10 min 以去除不溶性物质。使用经 9 ml MST 缓冲液平衡的 GE PD Miditrap G- 25 柱去除游离染料。洗脱的 Cyanine- 5 标记 NtcA 再次在微离心机中以最大速度离心 10 min 以去除残留浊度。αKG (Sigma- Aldrich K1128) 和草酰乙酸 (OAA) (Sigma- Aldrich O7753) 均经过称量（精度至 0.1 mg）并溶解在 MST 缓冲液中，以制备 100 mM 的储备液。NtcA 与滴定 αKG 的 MST 实验进行了三次重复，而 OAA 仅进行了一次滴定。为了建立实验，将 20 μl 的 100 mM αKG 或 OAA MST 缓冲液在 14 个额外试管中进行 1:1 梯度稀释（即，从第一个管中取出 10 μl 并与第二个管中的 10 μl MST 缓冲液混合，如此重复此过程）。第十六个管仅包含 10 μl MST 缓冲液（无配体）。在这十六个样本中，每个样本均加入 10 μl 100 nM 的 MST 缓冲液标记 NtcA，最终浓度为
NtcA 为 50 nM，$\alpha$KG 或 OAA 的最高浓度为 50 mM。 在优质毛细管中开始热泳动实验之前，混合物在室温下避光孵育至少 30 min。实验在 NanoTemper NT.115 BLUE/RED 仪器中，于环境温度（约 22°C）下进行，使用红色滤光片组，7% LED 功率和 80% MST 功率。预 IR 荧光期为 5 s，随后是 30 s 的 IR-on 阶段，以及 5 s 的 post-MST 监测。所有 MST 数据均在 PALMIST (86) 中分析，图表在 GUSSI (87) 中绘制。
克隆：所有合成 DNA 序列、DNA 质粒和 CRISPR-Cas9 sgRNA 序列均列于表 S2 至 S6 中。In-Fusion 克隆反应按照制造商的方案转化至 XL10-Gold 超强感受态细胞（Agilent Technologies）。Gateway 克隆反应使用 BP Clonase II (Invitrogen) 或 LR Clonase II (Invitrogen) 酶进行。Gateway 克隆反应转化至 HB101 感受态细胞 (Promega)。连接反应转化至 XL10-Gold 细胞。PCR 反应使用 KOD Xtreme Hot Start DNA 聚合酶 (EMD Millipore) 进行。
$\alpha$KG-RE 启动子/GFP 报告基因慢病毒载体：首先，将包含 $\alpha$KG-RE 合成启动子的正义和反义 ssDNA 退火产生 dsDNA。与此同时，将 5' 端由极小 CMV 启动子侧翼包围的 blasticidin-抗性-P2A-GFP cDNA 通过 In-Fusion 克隆（In-Fusion HD Cloning Kit, Takara 639650）克隆到 pEN_TTmcs (Addgene 25755) 中，以产生载体 pEN_TTmcs-PCMVmin-blastR-P2A-GFP。接着，使用 In-Fusion 克隆将 $\alpha$KG-RE 序列插入到 pEN_TTmcs-PCMVmin-blastR-P2A-GFP 中，同时从该载体中移除四环素响应元件 (TRE)。所得质粒被称为 pEN_TTmcs-[$\alpha$KG-RE]-PCMVmin-blastR-P2A-GFP。
为了在需要保留细胞 blasticidin 敏感性的环境下实现 $\alpha$KG-RE 启动子/GFP 报告基因的表达，通过 In-Fusion 克隆删除了 GFP cDNA 5' 端的 blastR-P2A 表达盒，从而产生 pEN_TTmcs-[$\alpha$KG-RE]-PCMVmin-GFP 载体。在测试 GFP 翻转率对 $\alpha$KG-ON 生物传感器系统动态范围影响的实验中，在 GFP 报告基因 3' 端附加了一个 hPEST 结构域，从而产生 pEN_TTmcs-[$\alpha$KG-RE]-PCMVmin-blastR-P2A-GFP-hPEST 载体。
为了创建无启动子的 Gateway 慢病毒目的载体，通过 In-Fusion 克隆从 pLenti PGK Neo DEST (w531-1) (Addgene 19067) 中移除了 PGK 启动子，以产生载体 pLenti Neo DEST。最后，在包含 $\alpha$KG-RE/GFP 报告基因的 pEN_TTmcs 载体与 pLenti Neo DEST 载体之间进行 Gateway LR 克隆反应（Invitrogen Gateway LR clonase, Fisher Scientific 11-791-100），以生成用于人类细胞转导的慢病毒载体。
用于 cDNA 表达的慢病毒载体：用于表达 NtcA 嵌合体和其他 cDNA 的 Gateway 目的载体包括：pLenti-Ubc-HA-Gate-PGK-HYG (Addgene 107396)、pLenti PGK Hygro DEST (w530-1) (Addgene 19066)、pLenti-EF1$\alpha$-Gateway-PGK-Hygro（由 W. G. Kaelin Jr. 赠送）以及 pLenti CMV Hygro DEST (w117-1) (Addgene 17454)。
CRISPR-Cas9 慢病毒载体：将 sgRNA（列于表 S5）克隆到载体中使用 FastDigest BsmBI (Esp3I) (Thermo Scientific) 消化质粒。使用 T4 PNK (NEB) 在 T4 连接缓冲液 (NEB) 中对寡核苷酸进行退火和磷酸化。使用 Quick Ligase (NEB) 将消化的 lentiGuide-puro (Addgene 52963)、lentiCRISPR_v2 (Addgene 52961)、lentiCRISPR_v2-blast (Addgene 83480) 或 lentiCRISPRv2-mCherry (Addgene 99154) 质粒与磷酸化寡核苷酸进行连接反应。
稳定细胞系构建：使用 TransIT-LT1 转染试剂 (Mirus Bio MIR 2304) 制作慢病毒。将 TransIT-LT1 转染试剂与表达载体（列于表 S4）以及包装质粒 psPAX2 (Addgene 12260) 和 pMD2.G (Addgene 12259) 按 4:3:1 的比例混合，对 HEK293T 细胞进行转染。在转染 48 和 72 小时后收集含病毒的培养基，并通过 0.45 μm 过滤器去除细胞碎片。将待转导的细胞以每孔 150,000 至 300,000 个细胞的密度接种在 6 孔板中。次日，加入慢病毒及 polybrene (MedChem Express HY-112735)，最终浓度为 8 μg/ml。细胞与慢病毒共同孵育过夜，随后弃去含慢病毒的培养基并扩增细胞。
用于筛选慢病毒转导细胞培养物的抗生素浓度如下：嘌呤霉素 (puromycin) (1 to 2 μg/ml)、潮霉素 (hygromycin) (500 μg/ml)、G418 (1 mg/ml)、志原体质粒素 (blasticidin) (50 μg/ml)、zeocin (50 μg/ml)。
$\alpha$KG-ON 生物传感器系统表达：在各图面板中用于表达 $\alpha$KG-ON 生物传感器系统的 NtcA 嵌合体和 $\alpha$KG-RE/GFP 报告组件的 DNA 质粒列于表 S6。使用 Lipofectamine 2000 转染试剂 (Invitrogen 11668027) 对 NtcA 嵌合体进行瞬时转染。稳定细胞系的构建如上所述。
CRISPR 筛选与分析：使用带有 zeocin 抗性标记的 Cas9 质粒转导表达 $\alpha$KG-ON 生物传感器系统的 U251 细胞。使用包含定制“$\alpha$KG 调节因子”CRISPR-Cas9 文库 (data S1) 的慢病毒进行感染，感染复数 (MOI) 约为 0.3。筛选每组感染 3E6 个细胞，细胞以每孔 1.5E6 个细胞的密度接种在 6 孔板中。转导后，每组细胞被分成三个重复样本，并使用嘌呤霉素进行筛选。转导一周后，细胞以每孔 250,000 个细胞的密度接种（每组每个重复共 1.5E6 个），每日更换培养基，直至转导后第十天，随后收集细胞进行 FACS 分析。对于每组的每个重复样本，将 GFP 表达最高的前 10% 细胞以及 GFP 表达最低的后 10% 细胞分别分选到不同的离心管中。
使用 Blood & Tissue DNeasy 试剂盒 (Qiagen) 从细胞中提取基因组 DNA。使用 KOD Xtreme Hot Start DNA 聚合酶 (EMD Millipore) 通过 PCR 扩增 sgRNA 盒并连接到 Illumina 引物。使用 0.7$\times$ 比例的 SPRI Right Side Size Selection 对扩增子进行纯化。使用 TapeStation 仪器 (Agilent) 进行文库质控 (QC)。在进行文库测序前，使用 Qubit 荧光计 (Thermo Fisher Scientific) 对文库 DNA 含量进行定量。测序结果随后通过 MAGeCK (88) 和 Apron (麻省理工学院和哈佛大学 Broad 研究所，遗传扰动平台) 进行分析。
免疫印迹法：细胞使用添加了蛋白酶抑制剂（Roche）的 EBC 裂解缓冲液进行裂解。使用 NE-PER 核与细胞质提取试剂（Thermo Scientific 78833）进行核与细胞质的分离。对于组蛋白 Western blot，细胞使用 2x 上样缓冲液进行裂解。裂解物的蛋白质浓度使用 Bio-Rad 蛋白质分析染料试剂（5000006）进行测定。提取的蛋白质在 100°C 下煮沸 10 min，使用 Mini-PROTEAN 系统（Bio-Rad）进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，并使用 Mini Trans-Blot Cell（Bio-Rad）转移至硝酸纤维素膜上。一抗（列于表 S1）悬浮于 5% BSA 的 TBST 中，二抗稀释于 5% 脱脂牛奶的 TBST 中。对于组蛋白 blot，二抗稀释于 5% BSA 的 TBST 中。使用 Immobilon Western 化学发光 HRP 底物（EMD Millipore）或 Clarity 和 Clarity Max ECL Western Blotting 底物（Biorad，用于组蛋白 blot）进行可视化，并使用 ImageQuant 800 生物分子成像仪（Amersham）进行成像。对于光密度分析，Western blot 图像使用 Adobe Photoshop（Adobe Systems Inc.）进行扫描，并使用 FIJI（NIH, https://imagej.net/software/fiji）中可用的凝胶分析宏进行定量。
使用来自 BD Biosciences 的 FACS Aria II SORP（4 或 5 个激光器）。流式细胞术和 FACS 数据的分析使用来自 De Novo Software 的 FCS Express 软件进行。用于分析的细胞悬浮在含有 50 ng/ml DAPI 的 Annexin 结合缓冲液中。
(
在确定最佳转录因子配置的初步实验中，细胞以每 6 孔板 150,000 个细胞的密度接种，并在次日（第 1 天）进行转染。从第 2 天起至第 4 天的细胞收获和分析，每天进行一次培养基更换。
对于使用单一载体转导 $\alpha$KG-RE 启动子/GFP 报告基因和 NtcA 嵌合体的细胞，细胞以 6 孔板每孔 125,000 个细胞的密度接种，随后在分析前进行三天的培养基更换 [包括谷氨酰胺剥离以及 dm-$\alpha$KG (Sigma 349631) 补充]。
对于使用不同载体分别转导 $\alpha$KG-RE 启动子/GFP 报告基因和 NtcA 嵌合体的细胞，细胞以 6 孔板每孔 250,000 个细胞的密度接种，并在分析前经历两天的培养基更换。
3 $\pi$
细胞周期同步化：为了将 U251 细胞同步化在 G1/S 期，细胞在 2 mM 胸苷 (Sigma T1895) 中培养 18 小时，用 PBS 洗涤，然后在新鲜培养基中培养 9 小时，之后再次用胸苷孵育 16 小时。为了将细胞同步化在 G2/M 期，由胸苷处理停滞的细胞在新鲜培养基中培养 10 小时。细胞用 20 $\mu$M Hoechst 33342 (Thermo Scientific 62249) 染色。
免疫荧光：将 500,000 个 HEK293 或 U251 细胞接种在带有 20 mm 微孔 1.5 盖玻片 (Cellvis P06- 20- 1.5- N) 的 6 微孔玻璃底板上。对于 HEK293 细胞，培养板预先用 0.01% 聚-L-赖氨酸溶液 (Sigma-Aldrich P4957) 处理。次日，在 2 ml 细胞培养基中加入 100 nM MitoTracker Red CMXRos (Cell Signaling Technology 9082S)，并在 37°C 下孵育 20 min。在去除含有 MitoTracker Red 的培养基后，向细胞中加入 4% 多聚甲醛，随后进行 0.2% Triton-X 1000 孵育，并用 0.2% 鱼皮明胶 (Sigma-Aldrich G7041) 封闭。将初级抗体添加到 0.2% 鱼皮明胶中，并在 4°C 下孵育过夜，包括抗-FLAG 标签 (1:800) 或抗-HA 标签 (1:1000) 抗体（列于表 S1）。将 2 mg/ml 的山羊抗小鼠 IgG (H+L) 交叉吸附二级抗体（偶联 Alexa Fluor 488）的储备液以 1:2000 稀释于 1 ml 0.2% 鱼皮明胶中，在初级抗体之后加入，并在摇床上的 4°C 环境中孵育 2 小时。在孵育的最后 5 min 加入 0.2% 鱼皮明胶中的 300 nM DAPI。图像在 CSU-W1 旋转盘共聚焦显微镜 (Nikon) 的双摄像头模式下获取。
血液和脑脊液 (CSF) 中的丙酮酸定量：儿童或成年人血液或 CSF 样本中的绝对丙酮酸浓度获取自 Geigy Scientific Tables, 1981 (89)。
液相色谱-质谱法和稳定同位素追踪：除非另有说明，所有 LC-MS 分析的细胞接种密度均为 6 孔板每孔 250,000 个细胞。为了对代谢物丰度进行相对定量，细胞在收集和分析前经历两天的培养基更换，并补充 (R)-2HG-TFMB [由 R. Looper (犹他大学) 慷慨提供]、琥珀酸二甲酯 (Sigma-Aldrich W239607) 或 DMSO。
对于稳定同位素追踪实验，细胞接种密度为 6 孔板每孔 25,000 个细胞。细胞在 1 mM 丙酮酸存在或不存在的情况下培养三天，每天更换一次培养基。在收获前两小时，再次将培养基更换为补充了 4 mM 未标记谷氨酰胺或 4 mM $\alpha$-15N-谷氨酰胺的无谷氨酰胺 DMEM，且包含或不包含 1 mM 丙酮酸。
样本用冰冷盐水洗涤两次，并用液氮快速冷冻。通过刮取收获细胞，代谢物直接在 80% 乙腈（每 1,000 个细胞 1 $\mu$l）中提取并涡旋混合。
在 4°C 下处理 20 min。随后，细胞在 4°C 的微量离心机中以最大速度离心 10 min。收集上清液并再次离心以去除碎屑。
为了利用同位素稀释质谱法定量细胞提取物中的 αKG，按照上述方法从细胞中提取代谢物。在每个提取物中加入 1,2,3,4- 13C4, αKG（Cambridge Isotope Laboratories, CLM- 4442- PK），使每个样本包含 200 nM 的最终内标浓度。与此同时，准备了一条由 10 个校准点组成的校准曲线，αKG (Sigma- Aldrich K1128) 的范围从 10 nM 到 10 μM。在每个校准物中加入 1,2,3,4- 13C4 αKG，使得内标的最终浓度同样为 200 nM。
为了对 αKG 进行绝对定量，使用 TraceFinder 5.2 SP1 软件 (Thermo Fisher) 对天然代谢物和内标的峰进行积分。将每个校准物的已知浓度输入软件，以生成具有 1/X2 权重的线性回归曲线。根据该曲线定量 αKG 水平。对于每种实验条件，使用重复细胞样本来测量细胞数量和体积。对每个孔的内容物进行胰蛋白酶消化，并使用 Beckman VI-CELL- XR 计数器测量细胞数量和体积。全细胞 αKG 浓度是通过全细胞样本中的总摩尔数、每个样本的总细胞数以及每个细胞的体积计算得出的。细胞 αKG 浓度的计算公式为 $C_{cell} = \frac{C_{meas} V_{ext}}{N_{cell} \cdot \frac{1}{6} \pi d^3}$。其中 $C_{cell}$ 是细胞 αKG 浓度，$C_{meas}$ 是基于标准曲线测得的提取物中 αKG 浓度，$V_{ext}$ 是最终提取体积，$N_{cell}$ 是提取的细胞总数，$d$ 是平均细胞直径。细胞被近似为球体，因此单细胞体积的计算为 $\frac{4}{3} \pi (d/2)^3$。
代谢物的分离和浓缩使用 Millipore ZIC- pHILIC 柱完成，采用 10 mM 醋酸铵水溶液（pH 9.8，流动相 A）和乙腈（流动相 B）的线性梯度，如前所述 (90)。代谢物使用 Q Exactive HF- X 或 Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific) 进行检测，半峰全宽 (FWHM) 处的分辨率为 120,000 或 240,000，扫描范围设定为 80–1,200 m/z，并采用极性切换，如前所述 (91)。为了确定 αKG 的相对丰度，使用 El- Maven 0.12.0 软件 (Elucidata) 对峰进行积分，并使用 TraceFinder 5.2 SP1 软件 (Thermo Fisher) 对总离子计数进行定量。使用 R 统计编程语言将峰值归一化至总离子计数。
对于稳定同位素示踪研究，使用 R 统计编程语言中的 AccuCor 包进行天然同位素丰度校正 (92)。
气相色谱-质谱法：稳态 αKG 水平的定量和分析采用此前描述的方法 (93)。简而言之，将细胞以每孔 125,000 个的密度接种在 6 孔板中。每天更换一次培养基，持续 3 天；在第 4 天，用冰冷的生理盐水洗涤细胞，并用液氮将平板快速冷冻。通过向每个孔中加入 350 μl 冰冷的 70% 甲醇来提取代谢物。将每个孔中的细胞刮下，并将细胞悬液转移至干冰上的 Eppendorf 管中。向每个样本中加入 150 μl 氯仿，并在 4°C 下涡旋 20 min，随后以 17,000 g 离心 10 min。将含有极性代谢物的甲醇上层液转移至单独的试管中，并在 4°C 的真空旋转蒸发仪 (CentriVap, Labconco) 上干燥过夜。未立即用于分析的样本储存在 - 80°C。
干样品的衍生化处理方法是：每份样品加入 20 μl 甲基羟胺 (MOX, Thermo Fisher 45950)，在 4°C 下涡旋振荡 20 分钟，随后在 37°C 下孵育 1 小时。接着向每份样品中加入 30 μl 含有 1% 叔丁基二甲基氯硅烷 (TBDMS, Sigma 375934) 的 N-叔丁基二甲基硅基-N-甲基三氟乙酰胺。样品
)3, 其中 Ccell 为估算的细胞内
Ncell ⋅4
使用 Agilent 7890B GC/5977A MSD 系统对衍生化样本进行 GC-MS 分析。峰积分使用 Metran 软件工具 (94) 完成。相对代谢物定量分析通过将代谢物离子计数归一化至每个样本内测得的总离子计数来实现。
DNA 甲基化：对于 U251 稳定细胞系的分析，细胞按照细胞培养方法所述，在补充了 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 中培养。基因敲除后，细胞被分为两组：一组补充 200 μM 抗坏血酸-2-磷酸，另一组则不补充。细胞在这些条件下维持 2.5 周后收获。
使用 Qiagen Blood & Tissue DNeasy 试剂盒从培养细胞或 Gpt2 WT 或 Gpt2 KO 小鼠的脑或肾组织中提取基因组 DNA (gDNA)，并加入 RNase (NEB) 以去除 RNA。DNA 用无核酸酶水洗出，并与 DNA Degradase Plus 和 Benzonase 共同孵育四个小时。用甲醇淬灭酶促反应，并将样本快速干燥。最后，将干燥的样本重新溶解在甲酸铵中，用于 UHPLC-MS/MS 分析。样本在 UT Southwestern 代谢表型核心设施进行分析。使用电喷雾离子源正极模式，将 5 μl 样本注入连接至 LCMS-8060 (Shimadzu Scientific Instruments) 三重四极杆质谱仪的 Nexera X2 UHPLC。通过以下转换进行选择性反应监测，分析 5-甲基脱氧胞苷 (5mC)、5-羟甲基脱氧胞苷 (5hmC) 和脱氧胞苷 (C)：5mdC 242 → 126, 5hmdC 258 → 124 和 258 → 142, dC 228 → 112。目标核苷在 Shimadzu 细胞培养分析柱上分离，使用溶剂 B MeOH/MeCN (1:1, v/v) 0.1% 甲酸相对于溶剂 A H2O 0.1% 甲酸的梯度，流速为 0.350 ml/min。
位点特异性 5mC 水平的检测通过 duet multiomics solution evoC (biomodal) 完成。duet multiomics solution evoC 方法 (95) 及其分析根据制造商的说明进行，使用来自 Gpt2 WT 或 Gpt2 KO 小鼠脑组织的 80 ng 基因组 DNA 作为起始材料。
线粒体功能 Seahorse 检测：使用 Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit 评估耗氧率 (OCR)。在检测前一天，每孔接种 10,000 个细胞。次日，将培养基更换为 OXPHOS 检测培养基，该培养基由不含酚红的 DMEM 组成，补充了 2 mM 谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸钠和 10 mM 葡萄糖， pH 调节至 7.4。培养板在非 CO2 培养箱中 37°C 预孵育 1 小时。首先在基础条件下测量 OCR，随后依次注入特定试剂：2 μM 寡霉素 (oligomycin)，一种复合物 V 抑制剂，用于计算线粒体 ATP 产量；1 μM 羰基氰化物-p-三氟甲基苯基肼 (CCCP)，一种用于确定最大呼吸和储备能力的解耦剂；最后，1 μM 抗霉素 A (antimycin A)，复合物 III 抑制剂，用于停止线粒体呼吸并允许测定非线粒体呼吸。
细胞增殖：使用 Celigo 图像细胞计 (Revvity) 进行细胞增殖分析。细胞接种在 96 孔板中，接种密度为每孔 5,000 个细胞。为了构建生长曲线，细胞与 20 μΜ Hoechst 33342 (Thermo Scientific 62249) 和 1.0 μg/ml 碘化丙啶 (PI) (Thermo Scientific P3566) 染料共同孵育，并从第 0 天到第 4 天每天测量活细胞数量。为了确保稳健性，我们针对每种条件进行了三次独立重复实验，每次实验包含三个技术重复。
系统 (BioHPC) 在一个已建立的 Nextflow (v 20.01.0) 平台上的 RNA-seq 分析流程 Astrocyte (v 2.1.0) 中运行。使用 TrimGalore (v 0.4.1) 对 reads 进行修整，随后使用 HiSAT (v2.0.1) 进行比对。接着使用 Picard (v 1.127) 标记并删除重复 reads。转录水平的剪接异构体表达分析采用了 HiSAT、StringTie (v 1.1.2) 和 Ballgown 方案，该方案已有相关描述 (96)。Ballgown 可通过 R 统计环境 (R v 4.1.1.) 的 Bioconductor 套件获得。U251 RNA-seq 数据获取自欧洲核苷酸档案项目 (编号 PRJEB3371) 以及 NCBI BioProject 数据库 (编号 PRJNA631805) (97)。正常人类星形胶质细胞对照 RNA-seq 数据获取自 NCBI (编号 PRJNA631805) (98)。
RNA-seq：根据制造商方案 (Qiagen 74004)，使用 RNeasy Mini Kit 从 10 mg 脑组织样本中提取总 RNA，并将其重新悬浮于 30 μl 无核酸酶水中。RNA-seq 由 Plasmidsaurus 执行并分析。
RNA-seq 分析：通过基因本体平台 (https://geneontology.org) 进行基因本体 (GO) 分析。使用 ggplot2 生成火山图，y 轴显示对数转换后的 P 值，x 轴显示 log2 倍数变化。使用 GSEA 软件 (v.4.3.3) (https://www.gsea-msigdb.org) 进行基因集富集分析 (GSEA)。通过对基因集类型进行置换计算标准化富集分数 (NES) 和错误发现率 (FDR) Q 值，并使用 FDR ≤ 0.25 的显著性阈值来鉴定显著富集的基因集。
ChIP-seq：每个样本和组蛋白标记取约 20 mg 脑组织，使用 TissueLyser (Qiagen) 裂解，然后在室温下用 1% 甲醛在 PBS 中交联 10 min。交联反应用甘氨酸淬灭 5 min，随后用冷 PBS 洗涤。交联后的组织在匀质化缓冲液 (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1% Nonidet P-40, 0.25% 脱氧胆酸, 1 mM EDTA) 中使用冷却的叶片匀质机进行匀质化。随后，使用 Farnham 缓冲液 (5 mM PIPES, pH 8.0, 85 mM KCl, 0.5% Nonidet P-40, 1 mM DTT, 0.1 mM PMSF) 裂解细胞，接着使用 SDS 裂解缓冲液 (50 mM Tris-HCl pH 7.9, 10 mM EDTA, 1% SDS, 1 mM DTT) 以获取可溶性染色质。
使用 Covaris M220 聚焦超声波破碎仪对染色质进行剪切，以产生大小约为 200 到 400 bp 的 DNA 片段，并通过凝胶电泳验证。将超声处理后的染色质在微量离心机中以最大速度在 4°C 下离心 1 min，以去除不溶性碎片。将可溶性染色质上清液用稀释缓冲液（20 mM Tris- HCl pH 7.9, 300 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0.5% Triton X- 100, 1 mM DTT, 0.2 mM PMSF）并添加蛋白酶抑制剂混合物（Roche）按 1:9 比例稀释。稀释后的染色质在 4°C 的旋转混匀仪上使用 20 μl/ml protein A- 琼脂糖珠（ThermoFisher Scientific）预清理 1 小时。在 4°C 下以 1000 g 离心 3 min 后，保留上清液用于免疫共沉淀，且每样本加入 24 ng 的内标染色质（Active Motif 53083），并预留 2% 作为输入 DNA。
对于免疫共沉淀，使用的抗体包括 5 μl H3K9me3（Abcam AB8898 1063771- 1）、5 μl H3K4me3（Active Motif 39159）或 15 μl H3K27me3（Cell Signaling 9733），以及 2 μg 的内标抗体（Active Motif 61686），这些抗体被结合到 50 μl protein G Dynabeads（Invitrogen）上。混合物在 4°C 下旋转孵育预清理后的上清液过夜。随后用以下缓冲液依次清洗 Dynabeads：低盐洗涤缓冲液（10 mM Tris- HCl, pH 8, 2 mM EDTA, 0.1% SDS, 1% Triton X- 100, 150 mM NaCl）、高盐洗涤缓冲液（10 mM Tris- HCl, pH 8, 2 mM EDTA, 0.1% SDS, 1% Triton X- 100, 500 mM NaCl）、LiCl 洗涤缓冲液（10 mM Tris- HCl, pH 8, 1 mM EDTA, 1% NP- 40, 1% Na- Deoxycholate, 250 mM LiCl），最后使用含有 50 mM NaCl 的 TE 缓冲液洗涤。洗脱染色质，在 65°C 下孵育过夜，并使用
在文库制备中，使用了 3 ng 的 H3K4me3 ChIP DNA、10 ng 的 H3K9me3 ChIP DNA 和 10 ng 的 H3K27me3 ChIP DNA，并采用 Illumina 的 NEBNext Ultra II DNA 文库制备试剂盒 (NEB)。文库质量通过在 Agilent 2200 TapeStation 上使用 High Sensitivity D5000 ScreenTape 进行评估，并使用 Qubit dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher) 进行定量。具有唯一接头条形码的文库经过多路复用，并在 Illumina NextSeq 2000 平台（双端，100 个碱基对读长）上进行测序，其中 H3K4me3 ChIP 的测序深度为每样本 30 million reads，H3K9me3 ChIP 为 50 million reads，H3K27me3 ChIP 为每样本 40 million reads。
ChIP-seq 分析：Fastq 文件使用 TrimGalore (v.0.6.10) 进行修剪，并在修剪前后使用 FastQC (v.0.12.1) 进行质量控制。ChIP-seq reads 使用 Bowtie2 (v.2.5.1) 比对到 mm10 参考基因组。sam 文件由 Samtools (v.1.6) 转换为 bam 文件。PCR 重复序列使用 PicardTools (v.3.0) 去除。信号通过样本和输入对照的内标（spike-in）值进行归一化。我们选择 Macs2 (v.2.2.9.1) 来调用 peak，对于 H3K9me3 和 H3K27me3 使用宽峰（broad peaks）设置 (FDR < 0.1)；在分析中对于 H3K4me3 使用窄峰（narrow peaks）(FDR < 0.1)。随后使用 R (v.4.2) 中的 DiffBind (v.3.16.0) 包鉴定在 Gpt2 KO 小鼠中显著增加或减少的 ChIP-seq peaks。用于生成热图的 Bigwig 文件通过 deepTools 中的 bamCoverage 函数从 bam 文件创建。为了进行可视化，使用 Integrated Genomics Viewer (IGV) (v.2.9.4) 生成代表性轨道图。
皮下异种移植：通过将 HCT116 细胞注射到 5 周龄 NCR/NU 雌性小鼠（Taconic）的侧腹部建立皮下 HCT116 异种移植瘤。简而言之，将 106 个细胞重悬于由 50 μl PBS 与 50 μl Matrigel (Corning 354234) 混合制备的 100 μl 悬浮液中，并皮下注射至侧腹部。植入四天后，小鼠每日通过腹腔注射给予溶媒或 600 mg kg−1 dm-αKG 处理。植入一周后使用卡钳测量肿瘤大小。当肿瘤达到 ~500 mm3 时处死小鼠，并采集肿瘤进行下游分析。
统计分析：使用 Graphpad Prism 软件进行统计分析。图注中包含所有执行的统计检验信息。对于涉及两个独立组比较的统计显著性检验，P 值通过非配对 t 检验计算。在培养细胞组蛋白甲基化标志的免疫印迹分析中，对于实验条件与指定对照条件之间的比较，使用单样本 t 检验计算实验条件相对于对照条件所建立的参考值（即 1.0）的 P 值。在培养细胞组蛋白甲基化标志的免疫印迹分析中，对于不包括指定对照条件的两组之间的比较，P 值使用配对 t 检验计算。对于组织中组蛋白甲基化标志的免疫印迹分析，P 值使用非配对 t 检验计算。对于涉及三个或更多组比较的统计显著性检验，P 值通过单因素方差分析 (one-way ANOVA) 计算。对于图 6, A 至 C 中 H3K4me3、H3K9me3 和 H3K27me3 分布的分析，P 值通过 Kolmogorov-Smirnov 检验计算。对于图 5D 中的全基因组 5mC 分析，P 值通过 Wilcoxon 符号秩检验计算。对于图 5K 中的基因表达变化比较，P 值通过 χ2 检验计算。对于方差显著不同的两组比较，使用 Welch's t 检验。对于所有检验，P 值小于 0.05 被认为具有统计学显著性。
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致谢 作者感谢 McBrayer、DeBerardinis、Morrow、Shi 和 Abdullah 实验室成员提供的富有启发性的反馈；感谢 I. Mellinghoff（纪念斯隆-凯特琳癌症中心）提供的 TS516 GBM 细胞；感谢 W. G. Kaelin Jr.（Dana-Farber）提供的 DNA 质粒；感谢 R. Pieper（加州大学旧金山分校）提供的 NHA 细胞；感谢 R. Looper（犹他大学）提供的 (R)- 2HG- TFMB；感谢麻省理工学院和哈佛大学 Broad 研究所遗传扰动平台 (GPP) 提供的 CRISPR 筛选资源；感谢 J. Florencio 和 M. I. Muro Pastor（植物生物化学与光合作用研究所）提供的 NtcA 抗血清；以及感谢 S. A. Sloan 和 L. Nieland 提供的实验协助（埃默里大学）。图表是在 Adobe Illustrator 中使用来自 Biorender (https://biorender.com) 和/或 Noun Project (https://thenounproject.com) 的材料制作的。资金支持：本工作由美国国立卫生研究院/国家癌症研究所资助 R01CA258586（授予 K.G.A. 和 S.K.M.）；美国国立卫生研究院/国家癌症研究所资助 R01CA289260（授予 K.G.A. 和 S.K.M.）；美国国立卫生研究院/国立神经疾病与脑卒中研究所资助 R01NS142141（授予 S.K.M.）；美国国立卫生研究院/国立通用医学科学研究所资助 R01GM158820（授予 S.K.M.）；美国国立卫生研究院/国家癌症研究所资助 P50CA165962（授予 S.K.M.）；美国国立卫生研究院/国家癌症研究所资助 U19CA264504（授予 S.K.M.）；德克萨斯州癌症预防与研究研究所资助 RR190034（授予 S.K.M.）；德克萨斯州癌症预防与研究研究所资助 RP230344（授予 S.K.M.）；德克萨斯州癌症预防与研究研究所资助 RP240489（授予 S.K.M.）；Sontag 基金会的杰出科学家奖（SKM）；Jonesville 基金会（授予 S.K.M.）；Nick Gonzales 脑肿瘤研究基金会（授予 S.K.M.）；美国国立卫生研究院/国家癌症研究所资助 K12CA0903354（授予 D.D.S.）；伯罗斯-惠康医学科学家职业奖（D.D.S.）；Lubin 家族基金会学者奖（D.D.S.）；美国国立卫生研究院/国家癌症研究所资助 F30CA271634（授予 M.R.S.）；美国国立卫生研究院/国家癌症研究所资助 K99CA277576（授予 Y.X.）；人类前沿科学计划博士后研究员奖 LT0018/2022- L（授予 Y.X.）；美国国立卫生研究院/国立通用医学科学研究所资助 DP2GM159178（授予 J.G.- B.）；美国国立卫生研究院/国立糖尿病、消化及肾脏疾病研究所资助 1R01DK145539- 01（授予 J.G.- B.）；德克萨斯州癌症预防与研究研究所资助 RR210059（授予 J.G.B.）；美国癌症协会资助 RSG- 24- 1255384- 01（授予 J.G.- B.）；Pew-Stewart 癌症学者（授予 J.G.- B.）；德克萨斯州癌症预防与研究研究所核心设施支持奖 RP240494（授予 L.G.Z.、T.P.M.、R.J.D. 及 CRI 代谢组学设施）；美国国立卫生研究院
卫生院/国家通用医学科学研究所拨款 R35GM124958（授予 L.A.B.）；国立卫生院/国家儿童健康与人类发育研究所拨款 R01HD109239（授予 L.A.B.）；Welch 基金会 I- 2025（授予 L.A.B.）；美国癌症学会拨款 134230- RSG- 20- 043- 01- DMC（授予 L.A.B.）；国立卫生院/国家糖尿病、消化及肾脏疾病研究所拨款 R01DK125713（授予 M.A.）；霍华德·休斯医学研究所 (.R.J.D)；国立卫生院/国家老龄化研究所拨款 R01AG0874550（授予 E.M.M.）；国立卫生院/国家神经系统疾病与中风研究所拨款 R01NS121618（授予 E.M.M.）；以及国立卫生院/国家神经系统疾病与中风研究所拨款 R01NS113141（授予 E.M.M.）。作者贡献：概念化：A.C.S., V.K., K.G.A., R.J.D., E.M.M.,
S.K.M. 数据整理：H.L. 正式分析：A.C.S., H.L., X.Z., J.I.T., L.G. 资金获取：E.M.M., S.K.M. 调查：A.C.S., H.L., K.G., Y.X., J.I.T., J.H.J., M.F., T.S., V.T.P., P.K., Q.O., M.S., D.D.S., A.C.- Y.T., J.H.L., R.G., Y.J.K., S.- C.T., L.G.Z., T.P.M., R.G. 方法论：A.C.S., K.G., J.H.J., M.F., Q.O., M.S., T.P.M., M.A. 项目管理：K.G.A., E.M.M., S.K.M. 软件：X.Z., M.R.S., C.A.B., L.A.B. 资源：K.G., X.Z., L.G., M.F., Q.O., M.S., M.R.S., J.G.- B., C.A.B., J.G.D., L.A.B. 监督：D.D.S., C.A.B., T.P.M., L.X., K.G.A., L.A.B., M.A., E.M.M., S.K.M. 验证：H.L. 可视化：A.C.S., H.L., S.K.M. 写作——初稿：A.C.S., H.L., S.K.M. 写作——审阅与编辑：A.C.S., H.L., E.M.M., S.K.M. 竞争利益：S.K.M. 接收来自 Servier Pharmaceuticals 的研究资金。S.K.M. 和 K.G.A. 拥有与脑肿瘤代谢相关的知识产权利益（美国专利申请序列号 63/597,523），且为 Gliomet 的共同创始人。S.K.M. 是 Gliomic 的创始人。R.J.D. 是 Atavistik Bioscience 的创始人兼顾问，同时是 Vida Ventures、Illumina 和 Faeth Therapeutics 的顾问。数据、代码和材料可用性：关于资源和试剂的进一步信息及请求应提交至首席联系人 S.K.M. (samuel. mcbrayer@ utsouthwestern. edu) 并由其提供。本研究中生成的 DNA 构建体可根据请求提供或从 Addgene 获取。数据可在正文或补充材料中找到。RNA-seq 数据已存储在基因表达综合数据库 (GEO) (GSE325502)。ChIP-seq 数据已存储在 GEO (GSE325503)。合成 DNA 序列已存储在 GenBank。许可信息：版权所有 © 2026 作者，保留部分权利；
独家被许可方为美国科学促进会。不主张对美国政府原始作品的所有权。https://www.science. org/about/science- licenses- journal- article- reuse
补充材料 science.org/doi/10.1126/science.adx8675 图 S1 至 S15；表 S1 至 S6；MDAR 重现性核查表；数据 S1 至 S9
10.1126/science.adx8675
2025 年 4 月 6 日提交；2026 年 2 月 12 日重新提交；2026 年 5 月 5 日接收
大洋转换断层上的周期性密封与排水
Hao Yang, Lingling Ye, Haijiang Zhang*
引言：大洋转换断层在相偏移的海岭段之间调节走滑运动，长期以来被视为由简单剪切主导且基本缺乏岩浆输入的保守板块边界。这种自板块构造理论出现以来就确立的二维 (2D) 范式，正日益受到观测结果的挑战，这些观测显示在海岭-转换交汇处存在显著的结构异质性、岩浆侵入和活跃的热液循环。这些断层的高分辨率地球物理图像显示，其三维 (3D) 损伤带具有强烈的沿走向变异性，尤其是在浅层地壳中。这种结构复杂性提供了一个将深层岩浆挥发分与海床联系起来的热液管道系统，表明该断层带是一个动态区域，流体在地震周期中起着关键作用。
基本原理：理解流体-岩石相互作用的关键是震颤（tremor），这是一种持续的、谐波地震信号，对微小的应力扰动（如地球潮汐）高度敏感。尽管俯冲带和火山环境中的震颤潮汐调制已有详尽记录，但此类现象是否发生在大洋转换断层内，以及它揭示了关于断层带渗透性和地震行为的什么信息，目前仍不清楚。我们分析了部署在东太平洋上升流 Gofar 转换断层上的密集海底地震仪阵列的连续波形，该地点以具有众所周知的重复性大破裂和地震屏障段而闻名。
结果：我们发现源自屏障区浅层深度（海床下方 0 至 4.5 km）的持续谐波震颤，该区域虽然阻碍了大破裂的传播，但存在丰富的微震活动。在 2020 年 9 月 8 日的一次 M4 级地震 (E2) 之前，震颤幅度紧随半日潮，具有较小的相位滞后，且与潮汐体积应变高度相关。这一高相关期与微震活动减少、b 值逐渐下降以及压波与剪波速度比 (Vp/Vs) 系统性下降相吻合，共同表明在密封且增压的裂缝网络中存在渐进性的气体积累。在 M4 级破裂发生后，震颤-潮汐相关性崩溃，地震活动激增，b 值回升，且 Vp/Vs 急剧上升，标志着破裂驱动的排水和快速的流体重新渗透。这种模式在多个地震周期中重复出现，随着热液通过矿物沉淀和压力溶解实现重新密封，潮汐耦合在数周内恢复。利用波形迁移定位的推断震颤源在空间上与屏障区重合，且观测到的相位滞后与渗透率演化介质中孔隙压力响应潮汐加载的孔隙弹性模型一致。
[[IMG_XXXX]] Gofar 转换断层上的震颤-潮汐相关性。（左上）震颤源区（红色轮廓）在空间上与屏障段一致，同时包含微震活动（灰色点）、两次 M4 级地震（E1 和 E2，红色星号）以及地震网络（红色三角形）。（右上）震颤区的示意性热液循环和深层挥发分供应。（下方）E2 破裂前震颤信号（红色）与潮汐体积应变（蓝色）之间的相关性，但该相关性在 E2 之后消失。
-4.5° -4.6° -106.1° -105.9° -105.8° 2.0 1.9 -25 8 纬度 振幅
结论：这些观测结果揭示了海洋转换断层内部运行的一种类似于阀门的密封、加压、破裂和排水循环。研究结果将转换断层从被动的剪切边界重新定义为活跃的、流体关键的系统，其能量释放由岩浆挥发分供应、渗透率演化和潮汐载荷的相互作用所决定。该机制可能在全球富含挥发分的转换断层中普遍存在，对于理解地震周期和灾害具有重要意义。
*通讯作者。电子邮件：zhang11@ ustc. edu. cn 引用本文请使用 H. Yang et al., Science 393, eaed5665 (2026). DOI: 10.1126/science.aed5665
经度
震颤-潮汐相关性 去相关
-10 -5 0 5 10 -15
相对于 E2 的沿断层位置 (km)
全文及作者单位列表： https://doi.org/10.1126/ science.aed5665
1.8
1.7
体积应变 (nstr)
大洋转换断层上的周期性密封与排水
Hao Yang1, Lingling Ye2, Haijiang Zhang1,3*
大洋转换断层一直被认为是保守的、由剪切主导的边界，但其与岩浆系统的接近暗示了流体的参与。在这项工作中，我们在东太平洋上升沿的 Gofar 转换断层发现了受潮汐调制的震颤（tremor）。在地震活动稀疏且原位纵波与横波速度比 (Vp/Vs) 较低的时期，震颤幅度与半日潮相关；但在伴随高 Vp/Vs 的地震群发生后，这种相关性减弱。我们提出了一个类似于阀门的“密封-排水”动态过程：密封作用捕捉挥发分并增强潮汐敏感性，维持震颤活动，直到破裂开启高孔隙度和高渗透性的通道，从而使震颤停止，触发微震，并通过热液重新密封来重置系统。因此，转换断层可能是可渗透且对潮汐敏感的，其能量释放在震颤与破裂之间摆动，并由岩浆挥发分的供应和愈合速度决定。
大洋转换断层用于协调偏移洋中脊段之间的走滑运动，长期以来被视为由简单剪切主导且基本缺乏岩浆输入的保守板块边界。这一自板块构造理论出现以来 (1) 建立的二维 (2D) 范式，正日益受到在脊-转换交汇处观察到显著结构异质性、岩浆侵入和活跃热液循环的挑战 (2–4)。高分辨率地球物理图像显示，这些断层并非简单的平面，而是复杂的 3D 损伤带，其断层结构和材料性质沿走向强烈变化 (5, 6)。这种结构复杂性（特别是在浅层地壳中）提供了一个将深层岩浆挥发分与海床联系起来的热液管道系统，表明在动态断层带中，流体在地震周期中起着至关重要的作用 (7, 8)。
理解这些流体-岩石相互作用的关键是震颤：一种持续的、非脉冲式的地震信号，其特点是窄带且通常具有谐波频谱，持续时间从数分钟到数天不等 (8–11)。在俯冲带和火山系统中，震颤对千帕 (kilopascal) 级的应力扰动（如潮汐引起的扰动）高度敏感，且通常与临界应力裂隙内的压力升高和流体流动相关 (8–11)。洋中脊和海底火山上震颤的存在及其与潮汐周期的同步性表明，浅层裂隙网络可以将微弱的周期性应力放大为可观测的震颤响应 (12–15)。然而，目前尚不清楚大洋转换断层内是否发生类似的受潮汐调制的震颤，以及此类震颤如何与断层带性质及微震相关联。
东太平洋脊 (EPR) 上的 Gofar 转换断层滑移速度约为 $\sim$14 cm yr$^{-1}$。在其西部的 G3 段，震级为 6 (M6) 的破裂大约每 5 到 6 年准周期性地在两个 $\sim$15 km 长的破裂片上重复发生，这两个破裂片沿走向被一个 $\sim$10 km 长的地震屏障分隔，该屏障阻止了 M6 地震在两侧的破裂传播，但
1中国科学技术大学地球与空间科学学院精密大地测量关键实验室，合肥，中国。 2南方科技大学地球与空间科学系，深圳，中国。 3中国科学技术大学孟城国家地球物理观测站，孟城，中国。 *通讯作者。电子邮件：zhang11@ ustc. edu. cn (H.Z.)
分布着丰富的微震活动，延伸至最上地幔 (16) (图 1)。来自广角地震折射成像 (17, 18)、利用局部密集阵列的地震活动分析 (19–23)、受控源电磁反演 (24) 以及动态源建模 (21) 的多项证据表明，深部流体升高和/或增强的断层损伤最有可能产生并维持这一地震屏障区。
在这项工作中，我们利用海底地震计 (OBS) 密集阵列的数据，报告了在 Gofar 转换断层地震屏障区发现的潮汐调制谐波震颤。我们表明，震颤幅度紧跟半日潮，尽管这种耦合在适度的 M4 级地震破裂后会突然中断。强震颤-潮汐相关周期与较低的地震活动率以及压波与剪切波速度比 (Vp/Vs) 的逐渐下降相吻合。相比之下，当相关性中断时，我们观察到微震活动增加以及 Vp/Vs 的迅速回弹。我们将这些观察结果解释为海洋转换断层内发生的循环密封和排水过程的证据，该过程受断层带渗透率与孔隙压力共同演化的控制：渐进的水热密封捕捉挥发物，放大潮汐应力并维持震颤，直到地震破裂重新连接流体路径、排走流体并重置系统。这种类似于阀门的机制将转换断层从被动的剪切边界重塑为主动的、流体控制的 3D 系统，其能量释放由潮汐加载、流体迁移以及断层带渗透率变化之间的相互作用决定。
谐波震颤的潮汐调制 我们在部署于 Gofar 转换断层 G3 段的密集 OBS 阵列 (25) 的连续波形中，识别出持久的谐波震颤信号，其特征为渐现式起始（信号缓慢开始并逐渐增加幅度）且持续时间从数十分钟到数小时不等（图 2, A 和 B）。该震颤表现出稳定的频谱结构，基频范围约为 2 到 8 Hz (图 2, B, D 和 E)，这与典型的流体诱发共振的窄带特征一致 (9, 12)。震颤信号在 2020 年 9 月 8 日发生一次 M4 级地震后显著减弱（在图 1 中标记为事件 E2；图 2, A 至 C），表明其源自自然的地下深处而非船只或海洋噪声。OBS 阵列表明，这是一种由浅层、复杂、小幅度波源叠加而成的混合震颤源 (图 S1)。其窄带、间歇性的能量释放以及不同台站间的差异反映了与流体填充裂缝或沸腾诱发空腔振荡相关的局部波源，在近场中是多个弱辐射源叠加，而非单一的紧凑波源。通过开启或关闭裂缝并改变流体路径，这些辐射源的共振可以被微小的外部应力扰动敏感地调制 (9, 26)，这与在 9°50′N EPR 和 Brothers 火山水热系统的观察结果一致 (12, 14)。
我们使用一种基于相似度成像条件的波形迁移方法对震颤源进行定位，该方法非常适合检测和定位连续的窄带震颤信号 (27, 28)。推断的波源位于海床下方约 4.5 km 处，且几乎与先前推断的 Gofar 转换断层 G3 段沿线的屏障区域重合 (图 1B 及图 S2 至 S5；参见材料与方法)。
在 2 至 8 Hz 频段内，震颤的均方根 (RMS) 幅度随计算出的总潮汐体积应变系统性地变化，该应变包括来自固体地球潮（或 (29) 中提到的体潮）、区域海洋质量加载以及直接水柱加载的贡献（图 S6；参见材料与方法）。M2 潮汐分量（~12.4 小时）是研究区域内总潮汐体积应变的主要贡献者，两者几乎重合，仅在幅度上存在细微差异（图 S7）。因此，我们使用 M2 潮汐分量来分析潮汐与 RMS 时间序列之间的相关性。在 E2 破裂之前，RMS 幅度表现出明显的半日调制，并伴有轻微但可分辨的相位滞后（图 2C）。相比之下，在 M4 E2 地震之后，这种调制发生了崩溃，
-4.5°
-4.5°
-4.0°
B
2.0
-4.6°
-106.0° -105.9° -105.8° -4.7°
图 1. Gofar 转换断层的构造背景与地震活动性。(A) EPR 中洋脊及其转换系统的平面图，其中 Gofar（G1、G2、G3 段）、Discovery 和 Quebrada 断裂带 (FZs) 承担了 EPR 扩张中心之间的转换滑动。蓝色三角形表示 2019 到 2022 年部署的海底地震仪。插图显示了区域板块边界背景。(B) Gofar 转换断层 (G3) 研究区域的放大图。震源机制显示了来自全球质心矩张量目录 (https://www.globalcmt.org/) 的历史矩震级 (Mw) ≥ 6.0 事件 (58, 59)。青色和黄色椭圆分别表示 M6 地震破裂带和屏障区 (22)。黑点代表本研究中重新定位的地震。红色等值线勾勒出包含前 25% 震颤能量的区域。(C) G3 段沿线地震活动性的深度（海平面以下）剖面，相对于 2020 年 9 月 8 日 M4 地震 (E2) 的位置。2020 年 8 月 11 日的 M4.1 地震 (E1) 亦被标记。该剖面定义了三个不同的域：浅层热液区（海底至 ~5 km）、中间脆性机制区 (~5- 9 km) 以及更深层的富含 $\text{CO}_2$ 的岩浆-挥发分域 (>9 km)，后者由低 Vp/Vs 异常证明。红色虚线表示近似的莫霍面深度。Vp/Vs 模型来自 (5)。
1.9
且 RMS 振幅由与局部微震相关的短促、高振幅峰值主导（图 2C）。幅度谱密度（在排除检测到的地震信号后）显示，在震颤-潮汐相关区间内 2- 至 8- Hz 能量升高，但在去相关区间内 2- 8- Hz 功率显著降低（图 2D）。M4 地震前 2 小时的时间序列进一步揭示了较为持续的窄带谐波能量，而随后的震颤带能量则较为微弱且断续（图 2E）。这种震颤-潮汐相关性在整个阵列中均有观察到，且在 A1 和 A2 台站集群中通常比在 A3 中更强（图 S8），表明震颤源强度存在横向异质性。
半日周期在频率域和相位域中均有清晰表达（图 3；见材料与方法）。在移除包含检测到地震的时间窗后，震颤-潮汐相关区间内震颤 RMS 时间序列的周期图在台站平均频谱中显示出精确位于 M2 周期的主频谱峰（图 3A 和 图 S8A）。K1 和 O1 处也存在较弱但明显的日周期峰。在相关区间内，RMS 时间序列的成对相关性较高（图 S9A）。在去相关区间内，这些潮汐峰显著降低（图 3A 和 图 S8B），且台站间的成对相关性明显下降（图 S9B）。在相关区间内，震颤 RMS 序列描绘出一条拟合 M2 潮汐信号的谐波曲线，具有较高的互相关系数 1.
我们在观测期间检测并重新定位了这些事件（图 S12；参见材料与方法）。在事件 E2 之前，地震活动率与 b 值及原位 Vp/Vs 比率同步下降（图 4；参见材料与方法）。Vp/Vs 的降低可以解释为向更富含气体的孔隙系统转变。气体具有高度可压缩性，因此它会降低有效流体体积模量并优先降低 P 波速度，从而降低 Vp/Vs，而液体主导的裂隙则会产生较高的 Vp/Vs (30, 31)。这一解释与持续的深部岩浆脱气补给浅层热液网络的现象一致，且在火山-热液环境中也报道过类似的 Vp/Vs 气-液控制机制 (32)。裂隙网络处于富气状态表明系统处于密封阶段。b 值的下降趋势以及较低的地震活动率还表明，随着浅层裂隙网络的收紧和密封的推进，剪切应力在逐步累积。在 E2 破裂后，这一模式突然反转：地震活动增强，b 值回升，且 Vp/Vs 瞬时升高（图 4），标志着破裂驱动了密封系统的开启。b 值的增加表明裂缝分布更广，而 Vp/Vs 的跳跃则表明发生了快速的水力重连和流体补给，气体通过新开启的裂缝逸出。综合来看，这些特征表明渗透率在应力驱动下发生了瞬时增加，从而破坏了震颤源处的潮汐耦合。关于 Vp/Vs 升高的其他解释（如裂缝闭合、孔隙坍塌或热瞬态）可能性较低，因为它们无法在这一时间尺度上同时解释 b 值和地震活动的同步上升。
-15
-10 -5 0 5 10
沿断层相对于 E2 的位置 (km)
E2 破裂后震颤-潮汐相关性的崩溃是预期的“阀门开启”事件的直接体现。同震破裂及随后的余震破裂瞬时增加了断层带的孔隙度和渗透率，增强了水力连通性并加速了孔隙压力的平衡，从而降低了孔隙压力的保持能力，削弱了潮汐加载向裂隙系统的传递。因此，震颤虽然有时
为 0.92，相位滞后为 – 21.0°，而脱相关区间则几乎平坦，与潮汐曲线的相似度较低（图 3B）。在与 2020 年三次 M~4 地震相关的另外三个时间段内也发生了类似的破坏-恢复循环，且推断的相位滞后在不同事件之间有所不同（图 S10 和 S11）。
破裂后震颤-潮汐相关性的崩溃与恢复 在 M4 地震破裂后，震颤-潮汐相关性崩溃，揭示了一种动态的类阀门机制。系统对 2020 年 9 月 8 日 M4.0 地震破裂 (E2) 的响应为潮汐耦合框架提供了一次敏感测试。在整个阵列中，震颤-潮汐相关性崩溃（图 3 和图 S8B）。与此同时，阵列内的站间相关性也随之崩溃（图 S9B），表明震颤产生过程发生了根本性变化。
1.8
1.7
C
E
震颤-潮汐相关性 去相关 A
-40
-40
-40
RMS
RMS
RMS
08-05 08-10 08-15 08-20 08-25 08-30 09-04 09-09 09-14 09-19 09-24 09-29
-25
-25
-25
-80
-80
B
频率 (Hz)
频率 (Hz)
频率 (Hz)
频率 (Hz)
08-20 08-21 08-22 08-23 08-24 08-25
09-13 09-14 09-15 09-16 09-17 09-18
-60
-60
-60
ASD (μm s-1 Hz-0.5)
2 4 6 8 10 12 14 16
图 2. 震颤能量的半日潮调制及其主震后的相关性丢失。(A) A301 测站的 RMS 速度幅值（2 至 8 Hz；红色），时间从 2020 年 8 月 1 日至 10 月 1 日，叠加了总潮汐体积应变（蓝色；正值为延伸）。灰色和黑色垂直线分别标志着 2020 年 8 月 11 日的 M4.1 (E1) 和 2020 年 9 月 8 日的 M4 (E2) 地震。(B) 功率谱密度 (PSD) 谱图，突出了 8 月 20 日至 9 月初 2 至 8 Hz 范围内持续的窄带谐波震颤能量。(C) 针对 8 月 20 日至 25 日的相关性窗口和 9 月 13 日至 18 日的去相关窗口的五日放大图，展示了从明显的潮汐调制到 E2 主震后相关性崩溃的转变。(D) 在去除地震信号后，为 (C) 中时间窗口计算的幅值谱密度 (ASD)。(E) 分别为 8 月 21 日和 9 月 13 日的两小时原始地震波形图和谱图。
存在，且失去了其潮汐相关性。事实上，震颤 RMS 与潮汐信号的相关性在 E2 主震前约 3 天开始下降（图 2A），这表明系统可能已经经历了一些无震滑动，以促进流体和气体的排泄。
在 E2 破裂后的几周内，随着余震活动的衰减，潮汐调制逐渐重新出现（图 S15, A 至 E）。这种恢复发生在由化学-力学密封过程控制的时间尺度上，例如压力溶解和矿物沉淀（如硅酸盐、碳酸盐），这些过程会降低渗透率 (7, 33)。随着系统重新密封，孔隙压力重建，气体比例增加，导致 Vp/Vs 逐渐降低。因此，增强的震颤-潮汐相关性追踪了渐进的重新加载过程。断层带回到了接近临界状态，具有接近岩石静力压的孔隙压力，此时半日潮可以再次有效地泵动震颤源。在 2020 年 11 月 27 日随后的 M4.3 破裂 (E4) 之后，
8 月 20 日至 8 月 25 日
9 月 13 日至 9 月 18 日
2020 年日期
2020 年日期
2020 年 8 月 21 日的两小时地震信号
02:00 03:00 04:00 2
02:30 03:30
2020 年 9 月 13 日的两小时地震信号
02:00 03:00 04:00 02:30 03:30
震颤-潮汐相关性再次减弱，表明渗透率再次增加，从而削弱了潮汐耦合（图 S15F）。
我们进一步评估了观测期内其他附近 M4 地震期间系统的行为，发现与 E2 事件相比，2020 年 8 月 11 日的 M4.1 地震 (E1) 对震颤-潮汐耦合的影响微乎其微（图 2 和图 S16）。E1 和 E2 的地震波形 (图 S17) 均表现出低频或混合频带特征，表明涉及流体且震源持续时间较长 (34)。关键区别在于 E2 发生在震颤源区内并破坏了浅层损伤区（图 1 和图 S10），因此比 E1 产生了强得多的震颤-潮汐相关性破坏。相比之下，E1 距离震颤区较远，可能主要影响深层岩浆减压和脱气，对震颤区影响很小。另外三次发生在震颤区内的地震 (D1, D2 和 E4)
体积应变 (nstr)
体积应变 (nstr)
-20 PSD(dB)
-20 PSD (dB)
-20 PSD (dB)
A
M2 K1 O1 相关性 去相关性
1.0
归一化幅度
归一化幅度
0.8
0.8
0.8
0.6
0.6
0.6
0.4
0.4
0.2
0.2
0.0
0.0
1.8
1.5
-21¡
12 15 18 21 24 27 30 周期 (小时)
B
M2 潮汐 B
0.5
-180° -60° 60° 180° 300° 420° 540° 潮汐相位
0.9
图 3. M4 破裂 (E2) 前后的潮汐相关性及其瓦解。(A) 相关性窗口（红色）和去相关性窗口（青色）（定义见图 2）在所有台站平均的垂直 RMS 均值周期图。虚线标出潮汐分量 M2 (12.4 小时)、K1 (23.9 小时) 和 O1 (25.8 小时)。(B) 所有可用台站相对于 M2 潮汐的相位折叠均值 RMS，相关性窗口和去相关性窗口的震颤-潮汐互相关系数分别为 0.92 和 0.44。黑色虚线显示相关性区间的正弦拟合。在此区间内，震颤能量（红色）随 M2 潮汐变化，相位滞后为 −21.0°。
深度 (km)
b值
0.7
1.9
08-10 08-20 08-30 09-09 09-19 09-29
原位 Vp/Vs
1.7
1.6
1.4
08-10 08-20 08-30 09-09 09-19 09-29 2020 年日期
图 4. 震 the 震级与断层带性质的协同演化。(A) 重新定位地震的时间变化。圆圈大小与地震震级成比例。三个 M4.0+ 地震 (E1 至 E3) 用红星标出。红色曲线显示每日地震率，品红色虚线显示 b 值的随时间演化。仅绘制并用于计算地震率和 b 值的完整震级 (Mc = 0.3) 以上的事件。(B) 五个固定空间锚点 (A0 至 A4) 原位 Vp/Vs 的时间变化。误差棒表示 Vp/Vs 估计值的 95% 置信区间，每个标记绘制在其估计窗口的中心。粗红线是五个锚点的平均 Vp/Vs 值。锚点位置、时间窗口和数据拟合的细节见补充材料 (图 S13 和 S14)。
RMS @相关性 RMS @去相关性
震颤-潮汐相关性 去相关性
观察到的这一序列——(i) 具有震颤-潮汐相关性、低地震率和低 Vp/Vs 的密封状态；(ii) 与破裂相关的震颤-潮汐相关性丧失、微震激增以及 Vp/Vs 增加；以及 (iii) 震颤-潮汐相关性的逐渐重新密封与恢复——捕捉到了 Gofar 转换断层屏障区浅层瞬态渗透率和孔隙压力演化的一个完整周期。它揭示了海洋转换断层带在两种状态之间动态切换：密封、高压且易发生震颤的状态，以及破裂、高渗透率且易发生小地震的状态。
转换断层对潮汐的孔隙压力响应 在孔隙弹性框架内，潮汐加载通过骨架体积变化与孔隙流体压缩或传输的耦合，扰动孔隙压力 (35, 36)。将质量守恒与达西定律结合，并针对小扰动进行线性化，可得出孔隙压力响应的一阶演化方程（见材料与方法）。我们构建了一个物理合理的模型，其中主震破裂短暂地重新连接了裂缝或流体通道，表示为渗透率 k 的阶跃增加（图 S18A）。随后，随着化学密封、矿物沉淀和颗粒重新桥接的进行，渗透率逐渐恢复，这已在观察中得到证实并在实验中得到证明 (37, 38)。通过将潮汐体积应变作为输入，我们对孔隙压力响应进行了正向建模，并将其与观察到的 M2 调制进行了比较（图 S18, B 和 C）。
该模型重现了两个关键观察结果。在 M4 破裂之前，断层相对密封（低 k 值），且孔隙压力对半日潮汐周期的响应处于一个由局部孔隙空间主导且扩散有限的机制中，产生了相对于潮汐体积应变的强调制作用，其互相关系数为 0.97，相位滞后为 −21.0°，这与观测到的相位滞后一致（图 3B）。负相位滞后源于模型的扩散流分量：随着应变率降低，响应变得更由排水主导，导致孔隙压力在潮汐体积应变之前达到峰值，并产生 −90° 到 0° 的相位滞后，这由特征扩散时间尺度控制。破裂后，渗透率的增加使得孔隙压力扰动能够在连通的裂隙网络中更轻易地扩散并达到平衡，从而降低了潮汐调制的幅度（图 S18B）。这一变化还改变了孔隙压力响应中瞬时加载与随时间变化的流动分量的相对贡献，导致相对于体积应变的相位滞后更加负值（图 S18C）。
每日地震 (EQ) 计数
A0 A1 A2 A3 A4 平均值
我们进一步将孔隙压力响应与流体诱导的震颤能量共振联系起来。随着断层在流体或气体富集的情况下接近临界状态，孔隙压力的逐渐积累降低了有效正应力，使得约 10 kPa 级别的半日潮汐扰动能够强力调制共振是否被激发以及辐射效率如何 (11)。在这一激发阈值附近，千帕级别的潮汐应力可以轻微地开启或闭合裂隙，并改变流体通过它们的难易程度，因此裂缝或空腔的振荡可以开启或关闭，且其幅度可能会剧烈变化，而主导频率
变化很小，因为这主要由裂缝的长度和形状以及流体粘度决定 (9, 26)。这一过程解释了我们在 Gofar 转换断层上观察到的破裂前震颤能量中显著的半日调制现象，并且与在俯冲环境下弱断层上震颤对微小潮汐应力高度敏感的观察结果具有可比性 (39)。破裂后，近临界状态被打破。渗透率的增加使得孔隙压力扰动在连通的裂缝网络中更容易地达到平衡，从而降低了潮汐孔隙压力调制的幅度，并削弱了震颤与潮汐的相关性；随着密封过程的进行和应力的积累，系统逐渐恢复到近临界状态，潮汐耦合随之恢复。
潮汐敏感型密封-破裂循环的概念模型 观察到的震颤、微震活动以及 Vp/Vs 的时间变化，可以映射到浅海转换断层带中由潮汐调节的类阀门行为概念模型中（图 5）。该模型将流体或气体的供应、渗透率、孔隙压力和潮汐耦合增益的共演化统一到一个可重复的三阶段循环中。
图 5. 海洋转换断层上浅层“密封-加压-破裂”循环的概念模型。(A) 示意截面图，阐明了 Gofar 转换断层西段 (G3)（图 1）沿线的地下地震活动（黑点）、热液循环（蓝色箭头）、CO2 脱气（渐变箭头）以及深层地幔熔体供应（红色箭头）之间的关系。含挥发分流体可沿断层带向上迁移，并调节震源层内的条件。红星分别代表 2020 年 8 月 11 日和 2020 年 9 月 8 日发生的两次 M4 地震 (E1 和 E2)。红色轮廓表示震颤源区。(B 至 D) 断层带代表性区域的三阶段演化循环，该区域具有主要流路和周围岩石中的微小裂缝。潮汐加载引起的体积应变 (εv) 对孔隙压力 (Δp) 的时间响应（图 S18）在每个阶段均以示意图形式展示，上方插图对应阶段 1，下方插图显示阶段 2 和 3 的演化。(B) 阶段 1，密封且加压：局部矿物密封降低了渗透率并隔离出富含挥发分的流体相，导致孔隙压力接近岩压，从而使得微小的潮汐应力扰动即可触发谐波震颤（震颤-潮汐相关性）。在此阶段，大多数裂缝被密封，含有少量气体或流体，渗透率较低。(C) 阶段 2，破裂开启通道：中等规模的 M4 地震 (EQ) 破裂破坏了密封，开启裂缝，并迅速增加渗透率和孔隙度，导致瞬时剪胀强化和局部孔隙压力下降。(D) 阶段 3，流体入渗与渐进密封：流体重新入渗到断层带的裂缝中，导致丰富的微震活动和高 Vp/Vs；随后，随着孔隙压力逐渐增加，密封重新开始，并渐进地降低渗透率和 Vp/Vs。
阶段 1：密封且加压（图 5B）。随着浅层裂缝网络被密封，来自深处的岩浆挥发分（例如 CO2，如图 5A 中低 Vp/Vs 条带所示）和热液流体的持续供应逐渐提高了断层带的孔隙压力。随着气体比例的增加，它驱动 Vp/Vs 系统性下降。当共振源在接近岩压的孔隙压力下接近临界状态时，潮汐体积应变足以调制震颤的激发和辐射强度，产生受潮汐调制的谐波震颤。渗透率进一步控制水力响应时间，导致潮汐强迫与震颤能量之间存在相位滞后。在此阶段，微震活动相对较低。
第 2 阶段：破裂开启通道（图 5C）。当不断升级的孔隙压力和差应力超过密封裂隙的强度时，M4 级地震破裂发生。这次“阀门开启”事件破坏了密封并产生了新裂缝，从而增加了孔隙度和渗透率。
孔隙度的增加驱动了瞬态扩张增强以及孔隙压力的局部下降。与此同时，随着可压缩气体的排出以及液体沿新连接路径的重新渗入，Vp/Vs 随之增加。
通道，从而实现孔隙压力的快速平衡。渗透率的增加缩短了水力响应时间，并打破了维持孔隙压力保持所需的密封条件，因此震颤能量不再追踪潮汐周期，震颤-潮汐相关性随之崩溃。与此同时，M4 破裂及随后的应力传递触发了一次瞬时的微地震群。
阶段 3：流体入渗与渐进式密封（图 5D）。在重新开启通道的破裂之后，热液循环促进了裂隙网络内部的愈合和矿物沉淀 (7, 33)。这种化学-力学密封降低了渗透率，逐渐降低水力连通性并增加孔隙压力，通常伴随有大量的小型地震。随后系统重置回阶段 1，因为密封作用隔离了富含挥发分流体，并恢复了强烈的潮汐耦合。
(
)
(
)
(1)
(3)
在这个框架中，存在流体情况下的地震破裂主要通过增加渗透率和重新连接裂隙通道起作用。因此，观察到的震颤-潮汐相关性崩溃标志着一个瞬时的“阀门开启”事件，其中增强的水力连通性削弱了潮汐耦合 (37, 40)。在实验室尺度上，短周期的孔隙压力振荡可重复地增加破碎岩石的渗透率，产生阶梯式增长，随后逐渐恢复到扰动前的状态。这种行为与裂隙通道的可逆脱堵一致，并提供了动态应力与瞬态水力开启之间的机制联系 (41)。
全球意义 我们的研究将大洋转换断层从保守的剪切边界重新定义为活跃的、潮汐-流体-岩浆耦合系统。观察到的自密封循环表明，大洋转换断层的能量预算不仅是弹性应变累积或释放的函数，而且还受到由周期性潮汐载荷和中等强度地震破裂调节的挥发分供应和渗透率演化内部动力学的影响。这一范式得到了全球范围内转换域中存在一级岩浆控制的日益增多的证据支持。两阶段地壳增生、转换内部扩张中心以及普遍的岩浆活动提供了持续的挥发分通量和几何通道，使周期性的密封、加压和排水成为可能 (2, 4, 42, 43)。由这种岩浆-构造相互作用塑造的断层带结构，为这种类似阀门的行为创建了必要的管道。
我们提出，震颤-潮汐相关性以及密封-破裂循环的现象并非 Gofar 地区特有，而可能是广泛存在的，尤其是在滑移率高且挥发分通量高的环境 (44) 中，例如偏移中印度洋海岭的 Marie Celeste 断裂带 (45)、具有转换内部火山活动的 Garrett 转换断层 (46)、具有宽广流体传输断层带的 Chain 转换断层 (47)，以及 Quebrada-Discovery-Gofar 系统的其他段 (48)。靠近海岭-转换交汇处的转换段、扩张速度较快的区域或受地幔热点影响的区域，应表现出更显著的震颤-潮汐相关性和更频繁的阀门式重置。这种观察到的震颤-潮汐相关性与俯冲带 (11) 和圣安德烈斯深层断层带 (8) 中受潮汐调节的震颤，以及卡斯卡迪亚 (Cascadia) 慢滑移的潮汐调节 (49) 相似，这表明在其他构造环境下，当断层接近近临界、流体加压状态时，可能会出现类似的潮汐敏感行为。这些诊断性特征——震颤-潮汐相关性、微地震活动率以及 Vp/Vs 的同步转变——为识别和量化大洋转换断层中的这些动态过程及潜在危险提供了模板。
材料与方法 数据 RMS 时间序列与潮汐相关性计算 我们使用了 2020- 08- 01 至 2020- 12- 31 期间，在 G3 周围 33 个三分量宽频带 OBS 站（图 1B）记录的连续波形。该数据集是一个 OBS 地震实验的子集，该实验在 2019–2022 年期间在 Gofar 部署了 94 个站点（图 1A）(25)。数据预处理遵循标准程序：我们对迹线进行了去均值和去趋势处理，使用网络清单移除了仪器响应，并将波形振幅转换为地面速度（单位：μm/s）。对于每个选定的站点，我们将连续速度波形带通滤波至 2- 8 Hz 频段，并使用 60 s 的滑动窗口（步长为 30 s）计算 RMS 时间序列。我们使用 Hanning 窗周期图计算了 RMS 时间序列的幅度谱，将频率转换为周期（小时），将显示范围限制在 10- 30 h，并根据峰值振幅进行归一化（图 3）。为了尽量减少局部地震的干扰，我们利用重新定位的地震目录，将地震震源时间前 10 s 至后 40 s 的时间窗进行了遮蔽。
$\epsilon_{ML}$
$\epsilon_{ML}$
$\epsilon_{ML}$
根据 (29) 中描述的潮汐计算框架，研究区域的总潮汐体积应变包含三个分量：体潮（或固体地球潮）、区域海洋质量加载以及覆盖水柱的直接加载。正应变表示膨胀。
我们首先使用 SPOTL (50) 计算体潮引起的水平应变分量 $\epsilon_{BT}^{xx}$ 和 $\epsilon_{BT}^{yy}$。该软件假设地球为弹性球体，并直接根据月球和太阳的位置计算潮汐应变。在平面应力假设下，垂直应变通过水平应变分量恢复为：
$\epsilon_{BT}^{zz} = -\frac{\nu}{1-\nu} (\epsilon_{BT}^{xx} + \epsilon_{BT}^{yy})$ (2)
我们采用了泊松比 $\nu = 0.23$，对应于 $V_p = 5.4 \text{ km/s}$，$V_s = 3.2 \text{ km/s}$，以及 $\rho = 2800 \text{ kg/m}^3$，这是基于该地区之前的地震层析成像研究 (5)。随后计算与体潮相关的体积应变：
$\epsilon_{BT}^{vol} = \epsilon_{BT}^{xx} + \epsilon_{BT}^{yy} + \epsilon_{BT}^{zz}$
对于海洋潮汐的贡献，我们首先使用全球海洋潮汐模型 EOT11a (51) 预测了 8 个主要短周期潮汐分量（K1, K2, M2, N2, O1, P1, Q1 和 S2）的潮高变化 $h(t)$。然后，我们将海洋潮汐效应分为两部分。第一部分是由区域海洋质量重新分布引起的弹性加载响应。对于该分量，我们使用带有质量加载格林函数的 SPOTL 计算水平应变分量 $\epsilon_{ML}^{xx}$ 和 $\epsilon_{ML}^{yy}$，并在平面应力假设下再次恢复垂直应变：
$\epsilon_{ML}^{zz} = -\frac{\nu}{1-\nu} (\epsilon_{ML}^{xx} + \epsilon_{ML}^{yy})$ (4)
来自区域海洋质量加载的相应体积应变为：
$\epsilon_{ML}^{vol} = \epsilon_{ML}^{xx} + \epsilon_{ML}^{yy} + \epsilon_{ML}^{zz}$
第二部分是由覆盖水柱局部变化产生的直接压力加载。海床处产生的垂直正应力由下式给出：
$\sigma_{WL}^{zz} = -\rho_w g h$ (5)
其中 $\rho_w = 1030 \text{ kg/m}^3$ 且 $g = 9.8 \text{ m/s}^2$。负号表示水柱高度的增加对应于更大的压缩应力。在单轴应变假设下，水平应变为 $\epsilon_{WL}^{xx} = \epsilon_{WL}^{yy} = 0$，而垂直应变为 $\epsilon_{WL}^{zz} = \frac{\sigma_{WL}^{zz}}{E} = \frac{1 - \nu}{E} \sigma_{WL}^{zz}$ (其中 $E$ 为杨氏模量)。
最后，我们将每个时间步长的体潮、区域海洋质量加载以及直接水柱加载的贡献相加，以获得总潮汐体积应变时间序列：
$\epsilon_{\text{total}}$
$\epsilon_{\text{WL}}$ (7) $v(t) = \epsilon_{\text{BT}}^v(t) + \epsilon_{\text{ML}}^v(t) + \epsilon_{\text{WL}}^v(t)$ (8)
我们将总潮汐应变在半日频带周围进行带通滤波，并计算其解包裹的瞬时相位。随后，我们在每个 RMS 采样时间点对潮汐序列进行插值。对于每个台站，我们计算每个 0.5° 相位区间内的平均 RMS 波形值，将其组合形成阵列平均 RMS 幅度曲线。我们使用正弦曲线拟合该阵列平均曲线，通过峰值的差异（范围为 −180° 到 180°）来测量相位滞后。此外，我们通过计算拟合正弦曲线与 M2 潮汐曲线在所有循环相位移中的最大皮尔逊相关系数，来量化相位折叠相似度。
为了评估震颤能量的空间相关性，我们使用 Welch 方法（Hanning 窗，50% 重叠），采用 12.4 h 的时间段长度，计算台站之间的两两相关性，以针对半日频带。对于每对台站，我们计算了 2- 8 Hz 的平均相关性。对于所有台站，构建一个 $N \times N$ 的相关矩阵，其中 $N$ 为台站数量。2020 年 9 月 8 日之前和之后的相关矩阵显示，破裂前存在阵列范围的高相关性 (CC > 0.4)，而破裂后则出现崩溃（图 S9）。
震颤源定位 我们使用基于波形迁移且带有相似度成像条件的方法来定位震颤源，该方法非常适用于连续的窄带震颤信号 (52)。我们首先在研究区域上方构建了一个 3D 网格，所有方向的间距为 0.2 km，并使用与 (5) 相同的剪切波速度模型计算从每个网格节点到每个台站的预测传播时间。对于每个网格节点，我们将台站 RMS 时间序列（三分量）按照预测的传播时间进行时间平移，并将它们叠加以计算相似度。在每个滑动窗口内，我们扫描整个网格，并将相似度最大的节点作为最可能的波源位置。
我们针对 56 个选定的 M3+ 地震验证了这种波形迁移法。地震波形经过 5- 10 Hz 的带通滤波，并使用 2 s 滑动窗口和 0.2 s 步长扫描震源时间后的前 8 s。为了在基于波形的定位与基于到达时间的定位之间进行直接比较，我们仅使用了包含在 tomoDD 重定位中的台站。在其中一个地震示例中，基于波形迁移定位方法的相似度值很好地聚焦在 tomoDD 定位点周围（图 S2）。总体而言，基于波形的定位与基于到达时间的 tomoDD 定位一致，平均偏差约为 1.5 km（图 S3）。然而，存在一个系统性偏差，即基于波形的定位结果稍微偏北且更深，这是因为基于波形的定位方法仅使用 S 波，且它给出的是质心位置，而非基于到达时间定位方法给出的起始位置。
对于震颤-潮汐相关时间段，我们使用 6 s 窗口和 6 s 步长扫描处理后的 RMS 时间序列。对于每个窗口，我们根据亮度保留前 2% 的网格节点，并通过叠加所有窗口的结果获得累积命中数和累积亮度分布（图 S4）。主震颤源集中在转换断层附近，位于海床下方约 4.5 km 处，比地震分布略浅。为了进一步评估定位的震颤源区的可靠性，我们在同一组台站上构建了随机噪声序列，并重复上述相同的分析。在缺乏相干波源的情况下，不存在能量聚焦现象（图 S4）。我们还使用了 2 小时的 RMS 时间序列
在震颤-潮汐相关区间内定位其震颤源，结果与使用所有均方根 (RMS) 时间序列定位的结果几乎完全一致（图 S5），这表明在震颤-潮汐相关区间内，震颤源是稳定且持久的。
OBS 阵列数据的地震事件检测 我们采用了基于深度学习的 AI–PAL 工作流 (53) 来检测和定位地震。我们使用了从 2020- 01- 01 到 2020- 12- 31 的连续数据来生成特定区域的高质量标签。PAL 使用了 STA/LTA 能量触发机制，其中 STA 窗口为 0.35/0.12/0.12 s（检测/P波/S波），LTA 窗口为 3/0.4/0.4 s，触发阈值为 12；S波幅度窗口为 [1, 4] s；最小检测间隔为 5 s；以及 5- 25 Hz 带通滤波。关联要求 18 个以上台站，震源时间偏差小于 0.6 s，且 P 相残差小于 0.8 s；位置通过网格搜索获得（经纬度间距 0.01°，侧向裕量 10%；深度 3.5- 20 km，间距 1 km），平均 Vp=5.9 km/s 且 Vp/Vs=1.85。经过人工筛选，得到了略多于 1000 个高质量地震用于训练（图 S12A）。
随后，我们在这些 PAL 标签上自监督训练了一个自注意力循环神经网络 (SAR/LoSAR) 拾波器（100 Hz 采样；三分量；10 s 滑动窗口，步长 4 s；128 个隐藏单元；3 层；0.2 s 步长，偏移 0.04 s；1000 个 epoch；批大小 128）。训练好的模型被应用于 2020- 08- 01 至 2020- 10- 01 以及 2020- 10- 01 至 2020- 12- 31 的连续数据，采用每个相的概率阈值 0.9；由 PAL 进行关联，要求 6 个以上台站，震源时间偏差小于 0.6 s 且 P 残差小于 0.8 s。两个时段共计分别获得了 24,126 和 34,594 个事件，形成了一个高质量的地震目录（图 S12B）。
利用双差定位方法进行地震重新定位 我们首先使用 HYPOINVERSE 方法 (54) 获取绝对位置。HYPOINVERSE 方法迭代地最小化走时残差，相权重根据震中距和残差自适应设置。一维 P 波速度剖面提取自三维 P 波速度模型 (5)；相应的一维 S 波速度模型是通过假设地壳中 Vp/Vs = 1.9 且地幔中 Vp/Vs = 1.8，莫霍面深度为 6.85 km 推导而出的。
随后，我们使用 tomoDD (55) 对 HYPOINVERSE 的位置进行了精化。tomoDD 利用绝对走时和相对走时共同反演速度结构和事件位置，它是双差定位方法 (56) 的一种扩展。在此，我们固定速度模型，并使用为 Gofar G3 段构建的高分辨率三维速度结构 (5) 来求解位置。我们首先根据走时-距离曲线剔除离群值，并构建事件对的走时差。波形互相关也被用于计算更精确的走时差。我们从 HYPOINVERSE 的位置开始，使用 tomoDD 在固定三维速度模型的情况下，利用三类走时对事件进行重新定位。采用了两阶段策略：(i) 通过提高绝对走时的权重来优化绝对位置；(ii) 增加目录走时差和互相关时间的权重，以锐化相对事件位置。利用海底地形剔除了被错误定位在水中的事件。最终，我们在 2020- 08- 01 至 2020- 10- 01 期间获得了 20,426 个事件，波形互相关时间的最终 RMS 走时残差为 11.1 ms；在 2020- 10- 01 至 2020- 12- 31 期间获得了 29,741 个事件，波形互相关时间的最终 RMS 走时残差为 9.7 ms。
原位 Vp/Vs 估算 我们遵循 (57) 的方法进行原位 Vp/Vs 估算。我们定义了五个空间锚点 A0- A4（图 S13），并在每个锚点周围扩展一个 3D 邻域，直到收集到 80- 90 个地震事件用于原位 Vp/Vs 估算。对于每个锚点周围选定的事件，我们构建了高质量的事件对 P 波和 S 波走时差。对于每对事件 (i, j) 和台站 k，我们测量了 P 波走时差
Sϵ
Sϵ
l
Sϵ
Sϵ
使用波形互相关计算 $\text{S}$ 波到达时间 $\Delta t_{\text{P}}(k; i, j)$ 和 $\Delta t_{\text{S}}(k; i, j)$，并保留波形互相关系数 $\text{cc} \geq 0.7$ 的测量值。对于每一对，随后对 $\Delta t_{\text{P}}$ 和 $\Delta t_{\text{S}}$ 在台站间进行去均值处理（减去该对的台站平均值），以消除特定对的时间偏移和公共项。在给定锚点处所有合格对产生的去均值差分值被汇总用于 $\text{V}{\text{p}}/\text{V}{\text{s}}$ 估计。在 $(\Delta t_{\text{P}}, \Delta t_{\text{S}})$ 域中使用密度滤波器（DBSCAN, $\text{eps} \approx 0.03\text{ s}$, $\text{min_samples} \approx 20$）抑制离群值。
) p
dp
dt
)
A V
dp
dε
dp
We estimated $\text{V}{\text{p}}/\text{V}{\text{s}}$ by fitting (57),
) = −αdεv
使用多轮 $2\sigma$ 截断的鲁棒最小二乘反演。在实践中，我们通过最小化正交不拟合度并剔除正交残差 $> 2\sigma$ 的点来重复进行线性拟合；最终的斜率 $b$ 被视为每个锚点周围事件簇的原位 $\text{V}{\text{p}}/\text{V}{\text{s}}$。我们通过对最终直线进行正交距离回归 (ODR) 并使用 ODR 斜率标准误差 $\text{SE}_{\hat{b}}$ 来计算 $b$ 的 95% 置信区间 (CI)：
通过时间间隔重复此过程，得出图 4B 中的 $\text{V}{\text{p}}/\text{V}{\text{s}}$ 序列。
孔隙压力对潮汐强迫响应的估计 遵循 (35)，孔隙弹性介质中的孔隙压力演化满足
) 这里，$p$ 是孔隙压力，$\epsilon_{\text{v}}$ 是体积应变，$\alpha = 1 - \text{K}/\text{K}{\text{s}}$ 是 Biot 系数，其中 $\text{K}$ 为排水骨架体积模量，$\text{K}{\text{s}}$ 为固体体积模量；$\text{S}{\epsilon} = \alpha^2/(\text{K}{\text{u}} - \text{K})$ 为受限存储压缩率，其中 $\text{K}_{\text{u}}$ 为不排水体积模量，$k$ 是渗透率，$\mu$ 是动力黏度，$p_0$ 是静水压力。
$\mu$
其中达西通量 $\text{q} = -\frac{k}{\mu} \nabla(p - p_0)$。
将方程 11 在代表性体积 $\text{V}$ 上进行积分并应用散度定理可得，
其中上横线表示体积平均值，$n$ 是外法线。我们将向压力为 $p_0$ 的外部储层净排水量参数化为跨越特征长度 $\ell$ 的薄层达西近似：
V ∮)V
1 V )V
其中 $\text{A}$ 是有效排水面积，$\nu \equiv \text{V}/\text{A}$ 吸收了几何因素。 代入方程 12 可得
将 $p(t) = p_0 + p'(t)$ 和 $\epsilon_{\text{v}}(t) = \epsilon_0 + \epsilon'_{\text{v}}(t)$ 进行分解。方程 14 变为
最后，在骨架近似不可压缩（使得受限存储由流体主导，$\text{S}{\epsilon} \simeq \phi \text{C}{\text{w}}$，其中 $\text{C}{\text{w}} \equiv 1/\text{K}{\text{f}}$ 为流体压缩率，$\phi$ 为孔隙率），$\alpha \simeq 1$ 的近似下，则，
$\Delta t_{\text{S}} = a + b\Delta t_{\text{P}}$ (9)
$\hat{b} \pm t_{0.975, n-2} \text{SE}_{\hat{b}}$ (10)
) t + \nabla \cdot \text{q} = -\alpha ) \epsilon_{\text{v}} (11)
$\mu \nabla(p - p_0)$
$(p - p_0)$
$(p - p_0)$
$\text{q} \cdot \text{n} \text{dA} = -\alpha \frac{d\epsilon_{\text{v}}}{dt} + \frac{1}{\text{V}} \int \frac{\partial p}{\partial t} \text{dV}$ (12)
$\frac{1}{\text{V}} \int \frac{\partial p}{\partial t} \text{dV} \approx -\frac{k}{\mu \nu} \frac{(p - p_0)}{\text{V}}$ (13)
$\frac{dp'}{dt} + \frac{k}{\mu \nu} p' = -\alpha \frac{d\epsilon'_{\text{v}}}{dt}$ (14)
$\frac{dp'}{dt} + \frac{k}{\text{S}{\epsilon} \mu \nu} p' = -\alpha \frac{d\epsilon'{\text{v}}}{dt}$ (15)
参数 $\tau$ 是孔隙压力平衡的特征扩散时间尺度，它决定了在给定渗透率和存储容量的情况下，对周期性体积应变加载响应的幅值及相关的相位滞后。
我们使用预测的总潮汐体积应变 $\epsilon_{\text{v}}^{\text{total}}(t)$ 作为外部加载。我们定义 $\phi(t) = \phi_0 + \phi'(t)$，其中背景孔隙率 $\phi_0$ 设为 0.03，$\phi'(t)$ 是使用 Biot 系数从体积应变转换而来的潮汐孔隙率扰动。为简单起见，我们取 $\alpha = 1.0$。流体属性规定为动力黏度 $\mu = 1.0 \times 10^{-3} \text{ Pa s}$ 和高压水压缩率 $\text{C}_{\text{w}} = 2.0 \times 10^{-10} \text{ Pa}^{-1}$。由于约束有限，几何因子 $\nu$ 设为 1，这主要影响绝对响应幅值和时间尺度，但不影响与渗透率 $k(t)$ 演化相关的相对趋势。这些参数范围参考了之前对 Gofar 转换断层 (21) 的研究。
为了表示通过破裂及随后的密封/愈合而产生的瞬时渗透率增强，我们设定了一个随时间变化的渗透率 $k(t)$，该值在 2020 年 9 月 8 日的 E2 附近迅速增加（在 1 天内），从 $k_{pre} = 3.5 \times 10^{-19} \text{ m}^2$ 增加到 $k_{peak} = 2.0 \times 10^{-16} \text{ m}^2$，随后呈指数级恢复至事件前水平，到建模时间段结束时达到剩余分数的 $10^{-5}$（图 S18A）。图 S18 的结果显示，在震颤-潮汐相关窗口期间，孔隙压力追踪 M2 潮汐信号，互相关系数为 0.97，相位滞后为 $-21^\circ$，这与观察到的 $-21^\circ$ 相位滞后一致（图 3B）。由于孔隙压力通过扩散做出响应，它不会瞬时地跟随体积应变。随着体积应变率降低，响应变得更由排水主导，且孔隙压力恢复更早，因此孔隙压力领先于体积应变，产生由特征扩散时间尺度 ($\tau$) 控制的 $-90^\circ$ 至 $0^\circ$ 的相位滞后；相比之下，由于高渗透率，在去相关区间内，孔隙压力对潮汐载荷的响应极低。
$$\tau_p = -\frac{1}{\phi C_w} \frac{v}{dt}, \quad \tau = \frac{\phi C_w \mu \nu}{k} \quad (16)$$
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位置和震级（美国地质调查局，2002）。
我们感谢两位匿名审稿人提供的建设性意见。感谢 Y. J. Tan 就海洋潮汐计算进行的讨论，以及使 Gofar 转换断层 OBS 数据公开的团队（M. Boettcher, M. Behn, W. Fan, J. Warren, J. McGuire, J. Collins, E. Roland, 和 Y. Liu）。 资金支持：本研究由中国国家重点研发计划（项目编号：2022YFF0800700，H.Z.）和中国国家自然科学基金（项目编号：42488301，H.Y.）资助。 作者贡献：监督：H.Z.；概念化：H.Z., H.Y., L.Y.；方法论：H.Y., H.Z.；调查：H.Y., H.Z.；可视化：H.Y.；论文写作——初稿：H.Y., H.Z.；论文写作——审阅与编辑：H.Z., L.Y., H.Y.。 竞争性利益：作者声明不存在竞争性利益。 数据、代码和材料可用性：本研究中使用的波形数据可通过 IRIS 数据管理中心 (25) 获取。本研究中使用的地震位置和必要代码可在 Zenodo (60) 获取。评估本文结论所需的所有其他数据均包含在正文或补充材料中。本研究未收集或产生新样本或物理材料。 许可信息：版权所有 © 2026 作者，保留部分权利；独家许可方为美国科学促进会（American Association for the Advancement of Science）。对原始美国政府作品不主张权利。https://www.science.org/about/science-licenses-journal-article-reuse
science.org/doi/10.1126/science.aed5665 材料与方法；图 S1 至 S18
2025 年 11 月 1 日提交；2026 年 5 月 4 日接受；2026 年 6 月 25 日在线发表
Vδ7 TCRs 与 IL17RA 的直接相互作用驱动了 TH1-like γδT 细胞的分化
V 7
IL17RA
TCRs
interaction
like
引言：与 B 细胞和 $\alpha\beta$ T 细胞形成鲜明对比的是，$\gamma\delta$ T 细胞是唯一一类其抗原识别原理仍然不明确的适应性淋巴细胞。尽管 $\gamma\delta$ T 细胞所识别的抗原性质在很大程度上难以捉摸，但多项证据表明，内源性配体通过刺激 $\gamma\delta$ T 细胞抗原受体 ($\gamma\delta$TCRs) 来驱动效应 $\gamma\delta$ T 细胞亚群的分化。虽然已经鉴定出几种此类分子，但在大多数情况下，这些配体的存在仍处于推测阶段，且大多数 $\gamma\delta$TCRs 仍为孤儿受体。最近，研究表明几种 butyrophilin 家族成员以非克隆型（nonclonotypic）方式调节大量的 $\gamma\delta$ T 细胞亚群，即通过与 V$\gamma$ 链的生殖系编码序列相互作用。然而，目前尚不清楚这种非克隆型的相互作用模式是 butyrophilins 所特有的，还是代表了一种塑造 $\gamma\delta$ T 细胞区室的更普遍的机制。
原理：为了研究 $\gamma\delta$TCRs 对内源性配体的识别，我们评估了一组小鼠 $\gamma\delta$TCRs 对代表胸腺微环境各种成分的细胞系的反应性，并试图为其鉴定配体。
结果：多个 $\gamma\delta$TCRs 对一种或多种细胞系显示出强反应性，且具有明显的激活模式，而这无法用识别先前已知的 $\gamma\delta$TCR 配体来解释。这表明很大一部分 $\gamma\delta$ T 细胞识别的一组多样化的未知内源性分子，这些分子不属于先前已知的 $\gamma\delta$TCR 配体类别。通过 cDNA 文库筛选，我们鉴定出白细胞介素 17 受体 A (IL17RA) 是其中两种 TCR 的配体，这是一种此前未被认为参与 $\gamma\delta$TCR 信号传导的促炎细胞因子受体链。
V$\delta$7 TCRs 与 IL17RA 的非克隆型相互作用驱动了具有多样化 CDR3 库的 TH1 样 $\gamma\delta$ T 细胞亚群的产生。左图：IL17RA- V$\delta$7 $\gamma\delta$TCR 相互作用的示意图。中图、右图：在野生型而非 Il17ra 缺陷型小鼠中，V$\delta$7 $\gamma\delta$TCRs 与 IL17RA 的相互作用驱动了具有多样化 CDR3 库的大量 V$\delta$7+ $\gamma\delta$ T 细胞亚群的选择（由不同颜色的 CDR3 环表示），诱导了 TH1 样效应程序（包括转录因子 Tbet 的上调），并促进了这些细胞依赖于 IL17RA 的周围稳态增殖。
Tbet
Tbet
Tbet
Tbet
Tbet
大量 V $\delta$7+ 亚群的选择
依赖于 IL17RA 的周围
稳态增殖
IL17RA 是小鼠 V $\delta$7 的配体
V $\delta$7 中的生殖系编码序列是
主要决定因素
进一步分析显示，小鼠次级淋巴器官中的大量 $\gamma\delta$ T 细胞表现出 IL17RA 反应性。这些对 IL17RA 有反应的 $\gamma\delta$ T 细胞具有高度多样化的 CDR3 环 [由 V(D)J 重组形成的接点] 库，但其 TCRs 始终使用 V$\delta$7。进一步实验表明，虽然 CDR3 环和 V$\gamma$ 链都能调节 IL17RA 反应性，但 V$\delta$7 中的生殖系编码序列是其主要决定因素，这表明 IL17RA 作为 V$\delta$7 $\gamma\delta$TCRs 的非克隆型配体发挥作用。对 $Il17ra^{-/-}$ 小鼠的分析表明，IL17RA 是胸腺选择、诱导分泌干扰素 $\gamma$ 的 T 辅助细胞 1 (TH1) 样效应程序以及 V$\delta$7+ $\gamma\delta$ T 细胞周围稳态增殖所必需的。
结论：我们的结果表明，在小鼠次级淋巴器官中发现的大量类 TH1 型 $\gamma\delta$ T 细胞亚群的发育，是由 V$\delta$7 $\gamma\delta$TCRs 对 IL17RA 的直接识别所驱动的。因此，除作为细胞因子受体外，IL17RA 在免疫系统中还具有第二个此前未被认识的功能，即作为非克隆型 TCR 配体。结合 butyrophilins 通过非克隆型模式与 $\gamma\delta$TCR 结合的情况，这些结果表明，此类相互作用所代表的生物学原理在 $\gamma\delta$ T 细胞区室的组织中比此前预期的更为普遍。这种对非克隆型配体的筛选可能演化为一种机制，用于选择并诱导大型 $\gamma\delta$ T 细胞亚群的功能成熟，同时确保所得效应群体具有高度的克隆多样性。
通讯作者：Taras Kreslavsky (taras. kreslavskiy@ ki. se)；Kewei Ye (kewei. ye@ ki. se) 引用本文请注明：K. Ye et al., Science 393, eadx9264 (2026). DOI: 10.1126/science.adx9264
II17ra-缺陷型
Tbet Tbet
具有多样化 CDR3 库的 T 细胞
诱导 TH1 样效应程序
V $\gamma$ 7+ T 细胞数量显著减少
残留的 V $\gamma$ 7+ T 细胞仍为幼稚型
全文及作者所属机构列表： https://doi.org/10.1126/ science.adx9264
Vδ7 TCR 与 IL17RA 的直接相互作用驱动了 TH1 样 γδT 细胞的分化
Kewei Ye1,2, Nimmy Francis1,2,3†, Josefine Dunst1,2†, Amanda Borgenstam2,4‡, Iris Rocamonde- Lago2,4,5‡, Stefanie Köhler6‡, Yuanyuan You1,2, Anatoly Dubnovitsky2,7, Anja Kramer1,2, Fanxi Meng1,2, Valentin Zollner1,2, Lisa Vogg8, Tomás J. Ryan9,10,11,12, Ken- ichi Hanada13, Tommy Regen14, Ari Waisman14, Vivianne Malmström2,7, Erik Benson5, Jan Kisielow15, Thomas Krey6,16,17,18,19, Thomas H. Winkler8, Leo Hanke2,4, Taras Kreslavsky1,2
在构成适应性免疫系统的三类淋巴细胞中，γδT 细胞是唯一一类其抗原识别原理仍然难以捉摸的细胞。尽管人们认为内源性 γδT 细胞抗原受体 (γδTCR) 配体调节 γδT 细胞的发育，但它们的身份在很大程度上仍不明确。在此，我们鉴定出白细胞介素 17 受体 A 链 (Il17RA) 是一种 γδTCR 配体，它驱动了小鼠中具有 T 辅助细胞 1 (TH1) 样效应程序的 Vδ7+ γδT 细胞的分化。Il17RA 通过涉及 Vδ7 链生殖系编码区域的相互作用促进这种分化，从而实现了具有多样化 CDR3 库的细胞选择，因此充当了一种非克隆型 γδTCR 配体。结合丁基素 (butyrophilins) 的非克隆型 γδTCR 结合模式，这些结果表明，此类相互作用代表了一种塑造 γδT 细胞群的通用生物学机制。
B 细胞、αβT 细胞和 γδT 细胞这三类淋巴细胞构成了有颌脊椎动物的适应性免疫系统。尽管 B 细胞和 αβT 细胞的抗原受体特异性已得到充分理解，但 γδT 细胞的抗原识别原理仍不清楚，且其抗原的性质在很大程度上仍不明确 (1)。尽管 γδT 细胞抗原受体 (γδTCRs) 使用一组相对有限的可变 (V) 片段，但它们可以表现出广泛的接点多样性，从而产生高度多样化的抗原受体库 (2)。然而，在 γδT 细胞的胸腺发育过程中，这种多样化的库是如何被选择的仍然未知。很大一部分胸腺 γδT 细胞获得了效应程序，并表现出抗原经历细胞特有的细胞表面表型 (3, 4)。这些类先天性属性表明，许多 γδT 细胞在与内源性 γδTCR 配体相互作用时经历了激动剂选择。对于大多数 γδT 细胞亚群，此类配体的存在仍处于假设阶段。尽管如此，已经发现了几种内源性 γδTCR 配体和候选配体。
1 瑞典斯德哥尔摩，卡罗林斯卡学院，卡罗林斯卡大学医院，索尔纳医学部，免疫与呼吸医学科。 2 瑞典斯德哥尔摩，卡罗林斯卡大学医院，分子医学中心。 3 美国伊利诺伊州芝加哥，芝加哥大学，病理学系。 4 瑞典斯德哥尔摩，卡罗林斯卡学院，卡罗林斯卡大学医院，索尔纳医学部，传染病科。 5 瑞典斯德哥尔摩，卡罗林斯卡学院，生命科学实验室 (SciLifeLab)，微生物、肿瘤与细胞生物学系。 6 德国吕贝克，吕贝克大学，生物化学研究所，医学结构与细胞生物学中心。 7 瑞典斯德哥尔摩，卡罗林斯卡学院，卡罗林斯卡大学医院，索尔纳医学部，风湿病科。 8 弗里德里希-亚历山大-
埃朗根-纽伦堡大学 (FAU)，德国埃朗根。9都柏林圣三一学院生物化学与免疫学系，爱尔兰都柏林。10都柏林圣三一学院神经科学研究所，爱尔兰都柏林。11弗洛里神经科学与精神健康研究所，墨尔本大脑中心，墨尔本大学，澳大利亚墨尔本。12儿童与大脑发育计划，加拿大高等研究院 (CIFAR)，加拿大安大略省多伦多。13外科分部，美国国家卫生研究院国立癌症研究所，美国马里兰州罗克维尔。14分子医学研究所与免疫治疗研究中心 (FZI)，美因茨约翰内斯·古腾堡大学医学中心，德国美因茨。15Repertoire Immune Medicines，瑞士施利伦。16病毒学研究所，汉诺威医学院，德国汉诺威。17德国感染研究中心 (DZIF)，
合作伙伴站点 Hamburg- Lübeck- Borstel- Riems，德国吕贝克。18卓越集群 2155 RESIST，汉诺威医学院，德国汉诺威。19结构系统生物学中心 (CSSB)，德国汉堡。*通讯作者。电子邮件：taras. kreslavskiy@ ki. se (T.K.); kewei. ye@ ki. se (K.Y.) †这些作者对这项工作做出了同等贡献。‡这些作者对这项工作做出了同等贡献。
迄今为止已鉴定出的配体 (1, 5)。尽管其中一些配体代表了一组看似无关的自我分子 (1, 5–8)，但主要组织相容性复合体 (MHC) 和丁蛋白 (butyrophilin) 家族成员被反复鉴定为 γδTCR 的内源性配体。
据报道的 MHC 相关配体和候选配体包括 MHC I 和 MHC I 样分子（例如，T10 和 T22, Qa- 1, CD1b/c/d, 以及 MR1）、MHC II，以及与 MHC 关系较远的分子（例如，ULBP4, MICA, 和 EPCR）(9–23)。对这些配体的识别通常涉及由 V(D)J 重组形成的 TCR 链的 CDR3 环。尽管在许多情况下，这些相互作用在免疫反应中的功能作用仍不清楚，但针对识别 MHC I 类 Ib 分子 T10 和 T22 的小鼠 γδT 细胞的实验表明，这些配体参与了这些细胞在胸腺中的选择，并诱导了分泌干扰素 γ (IFNγ) 的 T 辅助细胞 1 (TH1) 样效应程序的产生 (24, 25)。
第二组 γδTCR 配体包括丁蛋白家族成员。这些分子调节几个大型 γδT 细胞亚群的分化、组织定位和激活。在许多情况下，丁蛋白相关分子通过其 Vγ 链的胚系编码区域而非通过 V(D)J 重组产生的 CDR3 环与 γδTCR 结合，从而作为非克隆型 γδTCR 配体发挥作用 (26–34)。这与涉及 CDR3 区域强力贡献的克隆型相互作用形成对比。例如，丁蛋白相关分子 Skint1 和 Skint2 调节小鼠胎儿波 epidermal Vγ5Vδ1 γδT 细胞的胸腺选择和组织稳态 (26, 28, 35) [此处及下文的小鼠 Vγ 命名法参照 (36)]。与 T10/T22 反应性 γδT 细胞相似，Skints 的胸腺表达在胎儿 Vγ5Vδ1 中诱导了 Th1 样表型
γδT 细胞 (35)，这可能是通过 Skint1 与 Vγ5 中的胚系编码序列的相互作用实现的 (37)。同样，由肠上皮细胞表达的 Butyrophilin-like 1 (Btnl1)/Btnl6 和 Btnl1/Btnl4（人类中的 BTNL3/BTNL8）与 Vγ7（人类中的 Vγ4）中的胚系编码序列的相互作用，会诱导 γδ 肠上皮内淋巴细胞的周围扩增和功能成熟 (27–30)。最后，人类 Vγ9Vδ2 γδT 细胞通过一种涉及 BTN2A1 与 Vγ9 胚系编码序列结合的相互作用而被激活，而这种结合是通过“磷酸抗原”与 BTN3A1 细胞内部分相互作用所诱导的构象变化来实现的 (30–33, 38, 39)。因此，丁酰亲蛋白 (butyrophilin) 家族成员与 Vγ 链中胚系编码序列的非克隆型相互作用，可以调节那些在 TCRs 中使用特定 Vγ 段的 γδT 细胞亚群的胸腺选择、周围成熟、在特定组织中的积累以及激活。
通过与丁酰亲蛋白家族成员的非克隆型相互作用而激活的 γδTCRs，也可以通过额外的克隆特异性配体以 CDR3 依赖的方式被触发 (9, 30)。有观点认为，这种“双重反应性”的进化是为了在免疫应答过程中，既能实现大群体 γδT 细胞亚群的非克隆激动剂选择，又能实现随后的克隆激活 (30)。
迄今为止，丁酰亲蛋白家族成员仍是此类非克隆型 γδTCR 配体的唯一已知示例。在此，我们鉴定出白细胞介素 17 受体 A (IL17RA) —— 一个此前未被认为参与 γδTCR 信号传导的促炎细胞因子受体链 —— 是小鼠 Vδ7 γδTCRs 的一种非克隆型配体，它驱动了 γδT 细胞中一个类 TH1 亚群的分化。
结果 小鼠 γδTCR 对未知内源性配体的广泛识别 为了评估 γδTCR 识别内源性配体的程度，我们克隆了 55 个小鼠 γδTCR——其中 31 个 TCR 来自由胸腺 γδ T 细胞生成的 T 细胞杂交瘤，5 个 γδTCR 来自主要的 γδ T 细胞亚群，以及 19 个 TCR 来自小鼠脾脏 γδ T 细胞单细胞 RNA/VDJ 测序 (scRNA/VDJ-seq) 数据集 (40)（表 S1）中的 γδ T 细胞“效应”簇。我们将这些 TCR 置于逆转录病毒载体中，作为 Tcrg-P2A- Tcrd 表达框。我们将这些 γδTCR 在 TCR 阴性的 T 细胞杂交瘤细胞系 16.2c11 中表达，该细胞系携带一个用于 TCR 信号传导的激活 T 细胞核因子 (NFAT)–慢速荧光计时器 (sFT) 报告基因 (41)。我们将表达 TCR 的报告细胞与一组代表胸腺微环境组成部分的细胞系共培养。我们鉴定出 19 个与其中至少一种细胞系有反应的 TCR（图 1A 和表 S1）。由于许多此类 TCR 识别这些细胞系的不同组合，我们得出结论，观察到的反应模式可能是由多个不同的配体引起的。然而，许多此类 γδTCR 共同汇聚在胸腺淋巴瘤细胞系 BEKO 和/或原代胸腺细胞上（图 1A 和表 S1）。
BEKO 细胞的 RNA 测序 (RNA-seq) 未检测到丁基亲蛋白 (butyrophilin) 家族成员的表达，并且显示几种已知的非 MHC I/丁基亲蛋白相关 γδTCR 配体 (6, 7, 18, 22, 23) 的编码基因几乎没有表达，而几种 MHC I 相关分子的表达水平很高（图 S1A）。由于 MHC I 及相关蛋白的表面表达依赖于 β2- 微球蛋白 (B2m)，我们分析了 γδTCR 对 B2m–/– BEKO 细胞的反应性。在 11 个经过测试的 BEKO 反应性 TCR 中，只有一个（TCR44）在这种情况下失去了反应性（图 S1B）。进一步分析显示，该 TCR 识别先前已知的 γδTCR 配体：两种关系密切的非经典 MHC I 分子 T10 和 T22 (11, 42, 43)（图 S1C）。我们得出结论，许多小鼠 γδ T 细胞识别一组多样化的、尚未鉴定的内源性分子，这些分子不太可能属于已知的 γδTCR 配体家族。
cDNA 文库筛选将 IL17RA 鉴定为两个 Vδ7 γδTCR 的候选配体 为了寻找推定的 γδTCR 配体，我们利用 BEKO 细胞构建了 cDNA 文库，在 96 孔板格式中将包含约 200 个 cDNA 质粒的池转染至人胚肾 293T (HEK293T) 细胞中（每板约 200 × 96，相当于约 19,200 个克隆），并将这些馈养细胞与表达 TCR55 的报告细胞共培养（图 1B）。一个 cDNA 池强烈激活了报告细胞，通过其系列稀释，将 IL17RA 鉴定为该 TCR 的候选配体（图 1C）。
IL17RA 是诱导该 TCR 信号传导的必要且充分条件，因为在 BEKO 细胞中缺失 Il17ra 会取消反应性（图 1D），而用 IL17RA 蛋白涂覆细胞培养塑料在没有馈养细胞的情况下足以诱导 TCR 信号传导（图 1E）。对另外 10 个 γδTCR 的反应性评估表明，IL17RA 仅通过另一个 TCR（Vγ1Vδ7 TCR65）诱导信号传导（图 1F 和图 S1D），这证实了 IL17RA 对报告细胞的激活是由 TCR 信号传导介导的，且仅有部分 TCR 表现出这种反应性。
体内鉴定 IL17RA 反应性 γδT 细胞 我们试图使用多聚化重组 IL17RA 作为染色试剂，以检测 IL17RA 反应性 γδT 细胞。双链霉亲和素标签（dual-strep-tagged）IL17RA 与链霉亲和素的结合，或通过将 IL17RA 加载到含有 10 个链霉亲和素分子的右旋葡聚糖二聚体（dextramers）上进一步增加染色试剂的价数，能够使共转染了 TCR55 和 CD3 编码质粒并高水平过表达 TCR55 的 HEK293T 细胞显色。然而，这些试剂无法对在较低、更接近生理水平表达 TCR 的报告细胞进行染色（图 S2A）。利用包含数千个链霉亲和素分子 (44) 的复合物进行 IL17RA 多聚化，能够使表达 TCR55 的报告细胞显色，而在此之前未见染色。
使用 IL17RA 多聚体染色在淋巴结 (LNs) 和脾脏中检测到了一群结合 IL17RA 多聚体的 γδT 细胞（图 2A）。对单细胞分选的 IL17RA 结合 γδT 细胞进行 TCR 测序显示，尽管 CDR3 序列多样，但来自 IL17RA 结合 γδT 细胞的所有 10 条 TCRδ 链均使用了 Trav13- 4- dv7（编码 Vδ7）（图 2B）。在我们同样获得配对 Tcrg 序列的 7 个 TCR 中，6 个使用了 Vγ4，1 个使用了 Vγ1。流式细胞术分析确认，约 80% 的 IL17RA 结合 γδT 细胞为 Vγ4+，其余则使用 Vγ1（图 S2B）。在报告细胞中表达这 7 个 TCR 可赋予其对板结合 IL17RA 的反应性（图 2C），这证明了使用 IL17RA 多聚体对 γδT 细胞进行体外染色的结果反映了其 TCR 特异性。我们得出结论，有一群 γδT 细胞表达对 IL17RA 具有反应性的 TCR，且这种反应性与多样化的 CDR3 序列以及至少两种不同 Vγ 链的使用兼容，但似乎与 Vδ7 的利用有严格的相关性。
大多数体外 Vγ4Vδ7 TCR 表现出 IL17RA 反应性 为了在体内检测表达 Vδ7 的细胞，我们建立了一种 RNA 流式细胞术方法。Vδ7 RNA 的表达与抗 Vδ6.3 和抗 Vδ4 抗体染色互不兼容（图 S2C），且 Vδ7+ 细胞约占脾脏 γδT 细胞的 18%，在 Vδ7 表达细胞中，约 77% 的 TCR 使用了 Vγ4（图 S2C）。因此，我们研究了 IL17RA 反应性在 Vγ4Vδ7 γδT 细胞中的普遍程度。从脾脏 γδT 细胞的 scRNA/VDJ-seq 数据集 (40) 中随机筛选的全部 15 个 Vγ4Vδ7 TCR，尽管其 CDR3 序列多样（图 2D），但均表现出不同程度的 IL17RA 反应性（图 2E）。在我们最初收集的样本中（表 S1），通过 Vγ4Vδ7 TCR21 和 TCR33 传递的信号同样被 IL17RA 中度但明显地激活（图 S2D）。
由于约 13% 的脾脏 γδT 细胞使用了 Vγ4Vδ7 TCR（图 S2C），且所有测试的 Vγ4Vδ7 TCR 均表现出 IL17RA 反应性（图 2E），但体外 γδT 细胞中仅有 1 到 3% 能被 IL17RA 多聚体染色（图 2A），我们评估了不同的 Vγ4Vδ7 TCR 是否以不同的效率结合 IL17RA 多聚体。事实上，表达一组已确认具有 IL17RA 反应性的 Vγ4Vδ7 TCR 的报告细胞表现出不同的 IL17RA 多聚体结合能力，且某些 TCR 完全无法结合 IL17RA（图 2F 和图 S3A）。尽管如此，当 TCR 在 HEK293T 细胞中过表达至更高水平时，所有这些 Vγ4Vδ7 TCR 均能结合多聚化 IL17RA，而对照组 Vγ4Vδ10 G8 TCR (43) 则不能（图 S3B）。我们测试了这些 Vγ4Vδ7 TCR 对涂有亚适量浓度 IL17RA 的塑料表面的反应性（图 2F 和图 S3A），发现染色效率与 TCR 反应性正相关（图 2G）。这表明 IL17RA 多聚体染色优先检测出具有高亲和力 TCR 的细胞，因此可能低估了 IL17RA 反应性 γδT 细胞的数量。我们得出结论，大多数使用 Vγ4 和 Vδ7（小鼠 γδTCR 库中最常见的 γ/δ 链配对之一）的 γδT 细胞均表现出 IL17RA 反应性。
Vδ7 中的生殖系编码序列是 IL17RA 反应性的主要决定因素
我们的目标是确定 Vγ 和 Vδ 对 IL17RA 反应性的重要性。为了评估 Vγ 的贡献，我们将 TCR55 原始的 Vγ4-Jγ1-Cγ1 链替换为我们库中其他 TCR 的所有可能的 γ 链。Vγ2Vδ7 嵌合 TCR 未能在细胞表面表达（图 S4A），而其他嵌合 TCR 则表现出相当的细胞表面表达水平，并在响应抗 CD3 交叉链接时发出信号（图 S4B）。所有这些嵌合 TCR 也都表现出对 IL17RA 的结合能力和反应性，尽管程度不一（图 3A）。由于 Trav13-4-dv7（编码 Vδ7）也用于 Tcra 重排，我们评估了使用该 Trav 的三种 αβTCR 的 IL17RA 反应性 [在公开的 scVDJ-seq 数据集中鉴定 (45, 46)]。这些 αβTCR 均未被 IL17RA 激活（图 S4C）。我们得出结论，Trav13-4-dv7 的利用赋予了 γδ TCR 而非 αβ TCR 的 IL17RA 反应性，并且这种
E
胸腺 成纤维细胞
B
C
F
TST4
TCR15 V 7V 4
TCR15 V 7V 4
TCR55 V 4V 7
TCR55 V 4V 7
TCR55 V 4V 7
TCR55 V 4V 7
TCR44 V 4V 5
TCR53 V 7V 6 12
TCR22 V 7V 6.3
sFT-blue (近期 TCR 信号传导)
sFT-blue
G
sFT-blue
sFT-blue
sFT-blue
DTN40 V 1V 6.4
D
TCR65 V 1V 7
103 104
103104 0
sFT-red
细胞
BEKO
从 BEKO 细胞 构建 cDNA 文库
% NFAT-报告基因诱导
库 (200 cDNA) E5 的子库 (20 cDNA) 来自 4 和 14 的单个 cDNA
4 14
E5
0 20 40 60 80 0
库 子库 单克隆
Il17ra
Il17ra–/– BEKO WT BEKO
Il17ra
104 105 0 sFT-red
104 105 0 sFT-red
104 105 0 sFT-red
104 105 0 sFT-red
TCR53 V 7V 6 12 TCR22 V 7V 6.3 TCR55 V 4V 7
原代细胞
未刺激
共培养
未刺激
未刺激
共培养
图 1. 鉴定 IL17RA 为两种 Vδ7 γδTCR 的候选配体。(A) 所示 γδTCR 在 NFAT- 慢荧光计时器 (sFT) 16.2c11 报告细胞中表达。报告细胞与代表胸腺微环境各种成分的一组原代细胞和细胞系共培养，并通过流式细胞术进行分析。TCR 信号的激活诱导 sFT 报告基因的表达，该蛋白质的荧光随时间从蓝色变为红色。共培养后报告细胞中的 sFT 报告信号显示为红色轮廓；黑色轮廓表示未刺激对照（同一个未刺激对照可用于多种共培养）。图表中显示的变化
胸腺 淋巴瘤
胸腺上皮细胞
MVEC B3
cTEC 1.2 mTEC 3.10 胸腺细胞
将 200 个 cDNA 库 转染至 HEK293T 细胞
...
库 x
库 3
库 3
库 2
库 2
库 1
0 5 10 15 20 0
DTN40 V 1V 6.4 TCR65 V 1V 7
1B1 V 4V 6.3
T 细胞 淋巴瘤
EL4
LN 细胞
与 TCR + 报告细胞 进行迭代共培养
库 1 库 x ...
0 10 20 30 40 0
对照 TCR V 4V 10
重组 IL17RA
对照 Il17ra
对照 TCR V 4V 5
CD3
104105 0 IL17RA 多聚体
空载体
sFT-blue 的中值荧光强度（ΔMFI）（共培养组与未刺激对照组之间）≥300 的部分以绿色方框标出。此处及下文中，报告基因的诱导是通过对 TCRγδ+ 细胞进行门控分析来评估的，如图 S18A 所示。图中显示了两次独立实验的代表性结果。(B) 用于鉴定 γδTCR 配体的 cDNA 文库筛选实验设计。(C) 使用表达 TCR55 的报告细胞筛选来自 BEKO 胸腺淋巴瘤细胞的 cDNA 文库，鉴定出 IL17RA 是 TCR55 的候选配体。数据点代表表达 TCR55 的报告细胞与转染了指定 cDNA 文库质粒池（左侧和中间）或单个 cDNA 克隆（右侧）的 HEK293T 细胞共培养后，sFT-Blue+ 的频率。(D) 将表达 TCR55 的报告细胞与野生型（WT）或 $Il17ra^{-/-}$ BEKO 细胞共培养。通过流式细胞术测量 sFT 报告基因的上调情况。图中显示了三次独立实验的代表性结果。(E) 将表达 TCR55 或对照 Vγ4Vδ10 TCR [G8 TCR (43)] 的报告细胞培养在涂有重组 IL17RA 的孔板中或未涂覆的孔板中。通过流式细胞术测量 sFT 报告基因的上调情况。图中显示了至少五次独立实验的代表性结果。(F) 评估表达指定 γδTCR 的 16.2c11 NFAT-sFT 报告细胞（16.）对转染了编码 $Il17ra$ 的质粒 DNA 或空载体的 HEK293T 细胞的反应性。图中显示了两次独立实验的代表性结果。(G) 将 16.2c11 TCR– 细胞与表达 TCR55 或对照 γδTCR (Vγ4Vδ5 TCR44) 的 16.2c11 细胞的混合物，使用载有重组 strep 标签 IL17RA 的 streptactin 多聚体进行染色。使用 PE 偶联的抗链霉亲货蛋白（anti-streptavidin）抗体来检测 IL17RA 多聚体结合细胞。定量分析了 TCR 表达群体中 Il17RA 多聚体结合细胞的频率。多聚体结合是通过对 TCRγδ+ 细胞进行门控分析来评估的，如图 S18B 所示。图中显示了至少五次独立实验的代表性结果。
反应性与所有测试的 Vγ 片段兼容，但 Vγ 的使用（和/或 CDR3γ 序列）可能会调节其强度。
为了开始绘制负责该反应性的 Vδ7 区域图谱，我们生成了一组 TCR55 嵌合体，其中掺入了来自 Vδ10 的序列。Vδ10 是小鼠 Vδ 片段中与 Vδ7 最接近的旁系同源基因，且对 IL17RA 没有反应性（图 S5A），覆盖了 Vδ7 和 Vδ10 之间所有预测的溶剂暴露氨基酸差异（图 3B）。尽管所有嵌合 TCR 在与 CD3 共转染至 HEK293T 细胞后均表现出正常的表面表达，但其中三个失去了结合 IL17RA 多聚体的能力，一个的结合能力显著降低（图 3C）。对源自这四个无结合或低结合嵌合体的所有可能单氨基酸突变体进行分析，鉴定出六个取代位点（R31S, Y36R, P50A, H55E, T60K 和 T62A）能单独消除 IL17RA 的结合与反应性，以及一个（T56N）能强烈削弱该相互作用（图 3D 和图 S5B）。当将相应的氨基酸映射到 TCR55 的模型结构中时，其中大多数聚集在 Vδ7 表面的同一区域（图 3E 和图 S5C），提示这是一个可能的 IL17RA 相互作用位点。
观察到不同的 Vγ4Vδ7 TCR 表现出不同的 IL17RA 结合能力和反应性（图 2, D 至 G），这表明可变 CDR3 环调节了 IL17RA 识别的强度。为了确定 CDR3δ、CDR3γ 还是两者都参与了这种调节，我们通过在 TCR55 与 “Binder3” TCR（来自一个结合 IL17RA 多聚体的 γδT 细胞；图 2, B 和 C）之间交换 γ 链和 δ 链，构建了嵌合 TCR，并评估了两种亲本 TCR 和两种嵌合体对涂有不同浓度 IL17RA 的塑料表面的反应性。在次优的 IL17RA 浓度下，所有 TCR 均显示出明显的反应强度，且按以下顺序递减：(1) Vγ4Binder3Vδ7TCR55 嵌合体，(2) Binder3 TCR，(3) TCR55，以及 (4) Vγ4TCR55Vδ7Binder3 嵌合体 (图 S5D)。与此反应性等级一致，Vγ4Binder3Vδ7TCR55 TCR 在 HEK293T 细胞上实现可检测到的 IL17RA-链霉亲和素结合所需的过表达水平最低，其次是 Binder3 TCR，然后是 TCR55 (图 S5E)。我们得出结论，CDR3δ 和 CDR3γ 环都能调节 Vγ4Vδ7 TCR 的 IL17RA 反应性。
尽管还需要进一步的结构研究来绘制 IL17RA 与 Vδ7 TCR 之间实际的相互作用界面，但我们的结果表明，IL17RA 的识别主要由 Vδ7 的胚系编码区域决定，能够耐受多种 CDR3 序列，并受 CDR3 环序列和 Vγ 使用的共同调节。
表面等离子体共振分析确认 Vγ4Vδ7 TCR 与 IL17RA 之间的直接相互作用 为了确定 Vγ4Vδ7 TCR 与 IL17RA 之间的直接相互作用是否可以在无细胞环境中发生，我们制备了可溶性重组 Vγ4Binder3Vδ7TCR55 嵌合 TCR (图 S6A)，并将其作为分析物用于表面等离子体共振实验。Vγ4Binder3Vδ7TCR55 TCR 以低微摩尔范围的平衡常数 (KD) 结合固定化的鼠 IL17RA，但对人 IL17RA 没有显示出结合（后者不能激活鼠 Vγ4Vδ7 TCR 的信号传导；图 3F 和 图 S6B）。结合数据通过 1:1 动力学模型得到了良好描述，且与传感器图谱高度拟合。然而，由于未达到分析物饱和，无法准确测定表面的最大分析物结合能力 (Rmax)，从而限制了 KD 估计的精度。由于我们使用了更高亲和力的嵌合 TCR，所得出的估计值可能反映了 Vδ7 TCR 对 IL17RA 亲和力生理范围上限（或之上）的亲和力。我们得出结论，Vγ4Vδ7 TCR 在没有任何辅助组分的情况下能够直接与 IL17RA 相互作用。
IL17RA 的近膜 D2 结构域介导 Vδ7 TCR 信号的激活 我们研究了 IL17 受体的哪些部分介导了与 Vδ7 TCR 的相互作用。由于 IL17RA、IL17RB、IL17RC、IL17RD 和 IL17RE 均是远源旁系同源基因，我们评估了其他 IL17R 链是否能激活 Vδ7 TCR 信号传导或影响这些 TCR 对 IL17RA 的反应性。然而，这些链既不能单独激活 TCR55 信号传导，也不能在与 IL17RA 共表达时增强反应性 (图 S7A)。我们还测试了 IL17 细胞因子是否影响 IL17RA-TCR 的相互作用。将多聚化 IL17RA 与等摩尔量的 IL17A 预孵育，可阻断 IL17RA 多聚体与表达 TCR55 的细胞的结合 (图 S7B)，这表明 IL17RA 与 IL17A 及 Vδ7 TCR 的相互作用是互斥的。最后，完全去除两个 IL17RA 胞外结构域中的一个（远膜 D1 结构域）并不影响反应性 (图 S7C)，这表明剩余的近膜 D2 结构域足以激活 Vδ7 TCR 信号传导。
表达 IL17RA 反应性 γδTCR 引导 Th1 样分子程序的获取
为了表征 IL17RA 反应性 Vδ7 γδT 细胞的表型，我们评估了多个 γδT 细胞 scRNA/VDJ-seq 数据集 (40, 47, 48) 中 Vγ4Vδ7 细胞的分布和特性。Vγ4Vδ7 γδT 细胞主要分布在脾脏、肝脏、淋巴结 (LNs) 中，且如近期报道 (48) 所示，也分布在肺部，而在小肠中则较为稀少（图 4A 和图 S8, A 和 B）。大多数 Vγ4Vδ7 γδT 细胞出现在表达 Tbx21（编码转录因子 Tbet）、Ifng 以及其他指示 Th1 样表型的基因的细胞中，包括 Cd27, Il2rb（编码 CD122）和 Ly6c2 (49–51)，其中后两个标志物能最准确地定义 Th1 样群体（图 4A 和图 S8, A 至 C）。事实上，大多数离体总 Vδ7+、Vγ4+Vδ7+ 以及 IL17RA 结合 γδT 细胞均为 CD122+Ly6C+Tbet+，且分选出的 IL17RA 结合 γδT 细胞在刺激后产生 IFNγ（图 4, B 至 E）。在总 γδT 细胞和 IL17RA 结合 γδT 细胞中，CD122 和 Tbet 的表达均呈相关性（图 S8D），这与 Tbet 调节 Il2rb 表达的报道一致 (52, 53)。最后，对 Th1 样 γδT 细胞 (Tbet+) 进行门控分析显示，在淋巴结 (LNs) 中，Vδ7+ 细胞约占该群体的 37%（以及总 Tbet+ T 细胞的约 1.2%）（图 S8E）。
为了确定表达 Vγ4Vδ7 γδTCR 是否足以驱动该 Th1 样效应程序的获取，我们构建了一个 Vγ4Vδ7 TCR 转基因 (Tg) 小鼠系。为此，我们敲入了一个编码 Binder3 的 TCRγ(全长)- P2A- TCRδ(仅 VDJ) 的表达盒
S
LN 脾脏 单细胞指数分选 IL17RA-multimer+ T 细胞
ND
ND
ND
D
D
G
F
3.04 1.06
TCR
TCR
TCR
104105 0 IL17RA multimer
C
来自分选出的 IL17RA-multimer+ T 细胞的 TCRs
D
CDR3 CDR3
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
LG
LG
CSY
CS
CS
Y
CS
Y
SY
TCR55
SSG
SSG
SSG
SSG
SSG
SSG
SSG
SSG
SG
SSG
SSG
SSG
SG
SSG
SSG
SSG
SSG
SSG
SG
SSG
SSG
SSG
SSG
V 1
V 1
LRS
CAVW
CA
CAVW
CA
CA
CA
CA
TCR65
GTS
GTS
Binder 1
PY
CSYG
CSYG
CSYG
CSYG
CSYG
CSYG
CSYG
CSYG
CSYG
CSYG
CSYG
CSYG
CSYG
CSYG
CSYG
CSYG
CSYG
CSYG
Binder 2
Binder 3
QG
Binder 4
IY
Binder 5
AG
Binder 6
YGD
Binder 7
Binder 8
Binder 9
Binder 10
V 7
V 7
V 7
V 7
V 7
V 7
V 7
V 7
V 7
V 7
V 7
V 7
15 个随机选择的 V 4V 7 TCRs
V 7
V 7
V 7
V 7
V 7
V 7
V 7
V 7
LY
V 7
V 7
V 7
V 7
V 7
V 7
V 7
EKRDG
RD
QY
RY
RY
GG
PE
KGGY
Control TCR TCR957 TCR987 TCR1019 TCR1487 TCR2633 TCR3297
TCR1019 TCR1487
91 37 62 4 16 0.2
104 0 IL17RA multimer
103 105
使用低量重组 IL17RA 刺激
反应性
反应性
103 104
103 104
sFT-blue
sFT-blue
sFT-blue
69 64 50 33 21 8 4
104 0 sFT-red
104 0 sFT-red
评估 IL17RA 反应性
报告细胞
结合
图 2. ex vivo Vδ7 TCRs 的 IL17RA 反应性。(A) 脾脏和 LN γδT 细胞使用加载了 IL17RA 的多聚体进行染色（如 图 1G 所示）以及从结合 IL17RA 的 γδT 细胞中克隆的 TCRs 的 IL17RA 反应性评估实验示意图。代表性门控策略见图 S18C。(B) TCR55、TCR65 以及从单个 ex vivo 结合 IL17RA 的 γδT 细胞（标记为 “Binder 1-10”）中测序得到的 TCRs 的 Vγ/Vδ 利用情况和 CDR3 序列。ND，未测定。(C) (B) 中的 Binder 1 至 7 γδTCRs 通过基因合成产生，在 16.2c11 NFAT- sFT 报告细胞中表达，并评估了它们对重组 IL17RA 的反应性。使用 Vγ4Vδ4 TCR1128 作为阴性对照。
PLYRREA
CAM
CAM
CAM
CAM
CAM
CAM
CAM
CAM
CAM
CAM
CAM
CAM
CAM
CAM
CAM
PPHGIRGIRA
PYRRDTSWD
CAI
CAI
CAI
CAI
CAI
PGGIRA
GCPLGRRDRA
PYLPIGGIRA
VSGGIRAAPA
HMAYLGYEA
SYRRDTSFG
TKIGGTA
SYMAYLYRRDTT
IWHNIGGING
RIRA
VYRRGA
PHMAPSEGYA
WRNIGGIRA
PIYVGGIRA
DAAYDRRDTR
DYMAYLGGIRA
PGGIRS
GYMAYIGGIRA
KSEGYELA
GHIGGIP
RRDRG
KYGRDTR
RPRA
CAME
GGRRATRG
CAMEL
IL17RA 多聚体染色
测序
TDKLVF
TDKLVF
DKLVF
TDKLVF
DKLVF
TDKLVF
TDKLVF
TDKLVF
TDKLVF
TDKLVF
TDKLVF
DKLVF
TDKLVF
TDKLVF
TDKLVF
TDKLVF
TDKLVF
LVF
TDKLVF
DKLVF
TDKLVF
TDKLVF
TDKLVF
DKLVF
TDKLVF
TDKLVF
TDKLVF
Control TCR Binder 1 Binder 2 Binder 3
Binder 4 Binder 5 Binder 6 Binder 7
104 105 0 sFT-red
Control TCR TCR957 TCR974 TCR987 TCR1019 TCR1041
TCR1059 TCR1063 TCR1211 TCR1260 TCR1362 TCR1479
TCR1487 TCR2633 TCR2680 TCR3297
未刺激 重组 IL17RA
使用低量 IL17RA 刺激
TCR+ 报告细胞的激活百分比 %
R = 0.8070 p = 0.0002
TCR974 TCR1362 TCR2680 TCR1260
TCR3297 Control TCR
0 50 100 0
TCR+ 中 IL17RA-multimer+ 的百分比 %
TCR1211 TCR1041
TCR987 TCR1063
对照。此处及下文通过对 TCRγδ+ 细胞进行门控来评估报告基因的诱导情况，详见图 S18A。图中展示了两组独立实验的代表性结果。 (D 至 G) 从脾脏 WT γδT 细胞的 scRNA/VDJ-seq 数据集 (40) 中随机选择了 15 个 Vγ4Vδ7 TCR (D)，通过基因合成产生，并表达在 16.2c11 NFAT-sFT 报告细胞中，随后评估其对重组 IL17RA 的反应性 (E)。Vγ4Vδ10 TCR G8 被用作阴性对照。(F) 上图：表达所示 IL17RA 反应性 Vγ4Vδ7 TCR 的报告细胞的 IL17RA 多聚体染色。下图：当使用较低剂量 [2 μg/ml，而非 (E) 中使用的 8 μg/ml] 的重组 IL17RA 涂层刺激时，表达相同 TCR 的报告细胞的 TCR 信号诱导情况（下层面板）。Vγ4Vδ10 TCR G8 被用作阴性对照。(G) (D) 中列出的 15 个 IL17RA 反应性 Vγ4Vδ7 TCR 在使用 2 μg/ml 重组 IL17RA 刺激时，IL17RA 多聚体染色细胞频率与 TCR+ 报告细胞中 sFT-blue+ 频率之间的相关性。图中显示了 Pearson 相关系数和双侧检验的 P 值。黑线表示简单线性回归，虚线之间的灰色区域表示 95% CI。图中展示了三组 (E) 或两组 [(F) 和 (G)] 独立实验的代表性结果。
将 Vγ4Vδ7 TCR（来自一个 IL17RA 多聚体结合 γδT 细胞；图 2B）导入 Tcrd 基因座，使其模拟该基因座的重排配置，且 TCRδ VDJ 盒可以剪接到内源性 Cδ 外显子上（图 S9A）。在 TcrdBinder3/+ 小鼠中，Vγ4 γδT 细胞的积累在 CD4/CD8 双阴性胸腺细胞中已十分明显（图 S9B）。在周围组织中，约有一半的脾脏 T 细胞为 Tg TCR 阳性（图 4F），且其表达水平接近生理水平（图 S9C），且大多数此类 TCR Tg γδ 脾细胞获得了 CD122+Ly6C+Tbet+ Th1 样表型（图 4F）。我们得出结论，大多数 Vγ4Vδ7 γδT 细胞（一个表现出 IL17RA 反应性的群体）在体内获得了 Th1 样表型，且 Vγ4Vδ7 γδTCR 的 Tg 表达足以指导大多数 γδT 细胞获得这一效应程序。
IL17RA 调节 Vδ7 γδT 细胞的丰度及其功能成熟 为了确定 IL17RA 的表达是否在体内调节 IL17RA 反应性 γδT 细胞，我们比较了野生型 (WT) 和 Il17ra–/– 小鼠的 γδT 细胞。在 Il17ra–/– 小鼠的脾脏和淋巴结 (LN) 中，IL17RA 结合 γδT 细胞的频率和绝对数量均大幅降低（图 5A 和图 S10A）。由于在本研究使用的三个动物设施之一中，我们在 WT 和 Il17ra–/– 小鼠中均观察到 CD27–CCR6+ γδT 细胞 [可能是胎儿来源的 Th17 样细胞 (54)] 的扩增，且在某些 IL17RA 缺陷动物中这种现象更为显著（图 S10B），因此我们旨在确保这种扩增不会影响我们的分析。为了排除 IL17RA 结合细胞比例下降可能是由于被这一扩增子集“稀释”而导致的可能性，我们对以下频率进行了定量分析：
CD27+ γδT 细胞中结合 IL17RA 多聚体的细胞。即使在 CD27+ 组分中，IL17RA 反应性 γδT 细胞也显著减少（图 S10C）。IL17RA 反应性 γδT 细胞的减少并不局限于那些能用 IL17RA 多聚体染色的高亲和力细胞，因为脾脏（图 5B）和淋巴结（LNs）（图 S10D）中总 Vδ7+ 细胞的频率同样有所下降。在 Il17ra–/– 小鼠中，少数残存的结合 IL17RA 多聚体的 γδT 细胞在其 TCR 中主要使用 Vδ7（图 S11A），且在报告细胞中表达此类 TCR（而非少数污染的非 Vδ7 TCR）可赋予 IL17RA 反应性（图 S11, B 和 C），这表明在缺乏 IL17RA 的情况下仍能发育出少量的 IL17RA 反应性 γδT 细胞。与相应的 Il17ra+/+TcrdBinder3/+ 小鼠相比，Il17ra–/–TcrdBinder3/+ 小鼠中的 γδT 细胞数量也显著减少（图 5C）。Il17ra–/– 小鼠中 IL17RA 反应性 γδT 细胞的减少并非由于 IL17A/F 感知受损，因为 Il17a–/–Il17f–/– 小鼠的总 Vδ7+ 和 IL17RA 结合细胞并没有出现任何减少（图 5, A 和 B，以及图 S10, A 和 D）。
缺乏 IL17RA 暴露还影响了少数残存的 IL17RA 反应性 γδT 细胞的效应表型，因为与对照组小鼠相比，Il17ra–/– 小鼠中绝大多数的总 Vδ7+ 和 IL17RA 结合 γδT 细胞均未能上调 CD122 和 Ly6C（图 5, A 和 B，以及图 S10, A 和 D）。在 IL17RA 缺陷小鼠的 Vδ7− γδT 细胞群体中，我们没有观察到细胞数量减少或这种 Th1 样细胞表面表型的丢失（图 S12, A 至 C）。Il17ra–/–TcrdBinder3/+ 小鼠中残余的 γδT 细胞也大部分丢失了其 Th1 样表型（图 5C）。来自 IL17RA 缺陷动物的非 TCR Tg IL17RA 结合 γδT 细胞和 TcrdBinder3 γδT 细胞均未能上调 Tbet（图 5, C 和 D），且在经过佛波酯 12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯 (PMA)/离耐霉素 (ionomycin) 刺激后不产生 IFNγ（图 5, C 和 E），而其野生型 (WT) 对照组则有所不同。然而，与其他 γδT 细胞亚群的观察结果 (25, 35) 不同，配体暴露的缺乏并未导致 IL17RA 反应性 γδT 细胞获得 TH17 样的效应程序（图 5, D 和 E）。事实上，Il17ra–/–TcrdBinder3 γδT 细胞在非极化甚至 TH17 极化条件下经过数日的体外激活后，倾向于获得 Th1 样特性（图 S13）。
基于 Vγ 链使用情况对总多克隆 Vδ7+ 和 IL17RA 结合 γδT 细胞进行分层分析，揭示了 Vγ1+ 和 Vγ4+ 亚群之间的差异。尽管 Il17ra–/– 小鼠中的这两个群体都丢失了 CD122+Ly6C+ Th1 样效应表型，但只有 Vγ4+ IL17RA 反应性 γδT 细胞的数量在敲除组中显著减少（图 5B 以及图 S10D 和 S14, A 至 C）。
我们得出结论，IL17RA 对于 IL17RA 反应性 γδT 细胞的积聚和效应分化都是必需的。
体内 IL17RA 暴露设定了更高的 TCR 激活阈值，且为 IL17RA 反应性 γδT 细胞的稳态增殖提供必要条件 我们研究了外周 Vδ7 γδT 细胞是否对 IL17RA 保持响应。Il17ra+/+TcrdBinder3 细胞在与 IL17RA 和抗 CD3 体外刺激后上调了激活标志物 CD69 和 CD25，但与 Il17ra–/–TcrdBinder3 细胞相比，这些响应明显减弱（图 S15A）。此外，Il17ra–/–TcrdBinder3 γδT 细胞在响应 WT（而非 Il17ra–/–）脾细胞和胸腺细胞时会上调激活标志物，其中胸腺细胞诱导的响应更强（图 S15B），而 Il17ra+/+TcrdBinder3 γδT 细胞仅在响应 WT 胸腺细胞时才诱导低水平的 CD69（图 S15B）。这些结果表明，体内的 IL17RA 暴露提高了 TCR 信号传导的激活阈值，但来自 IL17RA 充足小鼠的 IL17RA 反应性 γδT 细胞仍能感知生理水平的 IL17RA。
为了评估成熟的 IL17RA 反应性 $\gamma\delta$ T 细胞在体内识别 IL17RA 的可能作用，我们将 CellTrace Violet 标记的 $Il17ra^{+/+}$ TcrdBinder3 $\gamma\delta$ T 细胞转移到 WT 或 $Il17ra^{-/-}$ 受体中。尽管转移到 $Il17ra^{-/-}$ 受体中的细胞没有增殖，但 WT 受体中的 TcrdBinder3 细胞经历了缓慢的自我更新（图 5F）。在多克隆环境下，部分 IL17RA 结合 $\gamma\delta$ T 细胞表达了增殖标志物 Ki67，且此类细胞的频率在 $Il17ra^{-/-}$ 小鼠中有所降低（图 5G）。我们得出结论，外周暴露于 IL17RA 会促进 IL17RA 反应性 $\gamma\delta$ T 细胞的稳态增殖。
IL17RA 调节 IL17RA 反应性 $\gamma\delta$ T 细胞的胸腺发育 我们评估了 IL17RA 是否调节 IL17RA 反应性 $\gamma\delta$ T 细胞的胸腺发育。在 WT、$Il17ra^{-/-}$ 和 $Il17a^{-/-}Il17f^{-/-}$ 小鼠中，胸腺中 IL17RA 结合 $\gamma\delta$ T 细胞的丰度远低于继发淋巴器官，但与对照动物相比，$Il17ra^{-/-}$ 小鼠胸腺中此类细胞的数量和频率有所增加（图 6A）。尽管来自对照小鼠的 IL17RA 结合 $\gamma\delta$ 胸腺细胞表现出一定程度的 CD122 上调，但这种上调在 $Il17ra^{-/-}$ 小鼠中被取消了（图 6A）。此外，虽然 WT IL17RA 结合 $\gamma\delta$ 胸腺细胞上调了 $\gamma\delta$ T 细胞谱系决定标志物 CD73 (3)，但这种上调在 $Il17ra^{-/-}$ 小鼠中很大程度上被消除了（图 6B）。在 $Il17ra^{-/-}$ 小鼠中，总 V$\delta$7+（但非 V$\delta$7–）胸腺细胞的 CD73+ 细胞频率也有所下降（图 S16, A 和 B）。CD73+ $\gamma\delta$ 胸腺细胞的减少
C
(在 CD3+ 上设门)
CD3
(在 CD3+ 上设门)
CD3
D
CD3
HEK293T
HEK293T
2 43 68 36 21 9
104 105 0 IL17RA 多聚体
104 105 0 IL17RA 多聚体
104105 0 IL17RA 多聚体
sFT-blue 16.2c11
B
F
104 105 0 sFT-red
10 20 30 40 50 60 70 80
V 7 V 10 V 7mut1 V 7mut2 V 7mut3 V 7mut4 V 7mut5 V 7mut6 V 7mut7
TCR55 WT V 7mut1 V 7mut2 V 7mut3 V 7mut4 V 7mut5 V 7mut6 V 7mut7
(在 CD3+ 上设门) HEK293T
46 48 3 43 3 24 2 36
TCR55 WT E20A Q22R R31S Y36R R38N P39S V44I
r3
50 41 51 3 3 58 45 47
L47F S48Y P50A H55E T56N T60K T62A S71T
P50
58 64 6 4 20 3 3 50
小鼠 IL17RA 人类 IL17RA
响应 (RU)
0 200 400 600 800
0 200 400 600 800
图 3. V$\gamma$ 使用情况和 V$\delta$7 生殖系编码序列对 IL17RA 识别的贡献。(A) 分析了原始 V$\gamma$4V$\delta$7 TCR55 或将 TCR$\gamma$ 替换为所示 V$\gamma$ 链的 TCR55 版本对 IL17RA 的结合能力和反应性。顶部：在 HEK293T 细胞中将编码这些 TCR 的质粒与编码所有 CD3 亚基的构建体共表达。转染细胞使用 IL17RA 多聚体染色。此处及下文，如图 S18D 所示，对 CD3+ 细胞进行设门。图 3C 中所示的 TCR55 突变体 6 用作阴性对照。底部：将相同的 TCR 表达在报告细胞中，并分析其对重组 IL17RA 的反应性。报告诱导通过如图 S18A 所示地对 TCR$\gamma\delta$+ 细胞设门来评估。显示两个独立实验的代表性结果。(B) V$\delta$7 与 V$\delta$10 的蛋白质序列，以及在 (C) 中评估的 7 个 V$\delta$7/V$\delta$10 嵌合 V 段序列的比较。V$\delta$7 与 V$\delta$10 之间的差异用红色字体标出。对应于
重组 IL17RA
FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3
r1
r2
V 7 与 V 10 之间的差异
不影响 IL17RA 反应性/结合
影响 IL17RA 反应性/结合
V 4Binder3V 7TCR55
嵌合体 1:1 拟合
时间 (秒)
未刺激
非溶剂暴露
ka (M$^{-1}$s$^{-1}$) kd (s$^{-1}$)
ka (M$^{-1}$s$^{-1}$)
KD (M)
8.98 x 10$^{3}$
5.32 x 10$^{-2}$
5.92
3.35 x 10$^{3}$
6.04 x 10$^{-2}$
18.0
5.26
6.27 x 10$^{3}$
3.30 x 10$^{-2}$
汇总
8.25
5.74 x 10$^{3}$
4.73 x 10$^{-2}$
估计值
HV4
100 nM 1 $\mu$M
100 10$^{-2}$ 10$^{-1}$ kd (s$^{-1}$)
T62 H55
(1.89-35.88 $\mu$M)
10 $\mu$M
独立实验
汇总估计值
100 $\mu$M
1 mM
预测为非溶剂暴露（因此未进一步测试）的残基用灰色阴影表示。对于 IL17RA 结合和/或反应至关重要的氨基酸 [在 (C)、(D) 和图 S5B 中确定] 用红色突出显示，而不影响 IL17RA 结合的差异用蓝色突出显示。序列中的 FR1, CDR1, FR2, CDR2 和 FR3（包括 HV4）区域已标注。(C) 将编码 WT TCR55 或其七个 Vδ7/Vδ10 嵌合版本的质粒与编码所有 CD3 亚基的构建体在 HEK293T 细胞中共表达。转染细胞使用 IL17RA 多聚体进行染色。采用了 CD3+ 细胞门控。显示了两次独立实验的代表性结果。(D) 生成了覆盖 Vδ7mut2, Vδ7mut4, Vδ7mut5 和 Vδ7mut6 中所有 Vδ7/Vδ10 氨基酸差异的 TCR55 单氨基酸突变体，并按照 (C) 中的方法进行评估。显示了两次
独立实验的代表性结果。(E) TCR55 结构模型（灰色表示 TCRγ，米色表示 TCRδ），其中突出了 Vδ7 中对 IL17RA 结合和反应至关重要的单个氨基酸（亮色）[在 (D) 和图 S5B 中确定]。(F) 通过表面等离子体共振评估了可溶性 Vγ4Binder3Vδ7TCR55 TCR 与固定化的小鼠（最左侧）或人类（左侧）重组 IL17RA 的结合。显示了一系列 2 倍稀释；使用的 TCR 最高浓度为 5 μM。显示了三次独立实验的代表性图表。右侧显示了三次独立实验 (r1, r2 和 r3) 的结合动力学。蓝色圆圈表示 KD 的 95% CI (1.89 至 35.88 μM)；红点是单个实验的测量值；十字线是三次实验的汇总估计值。由于 k = 3 次测量，数据使用带有 Hartung-Knapp-Sidik-Jonkman 95% CI 调整的随机效应模型进行分析。
在 TcrdBinder3 Tg γδ 胸腺细胞中，也观察到了在缺乏 IL17RA 时未能上调 CD122 的现象，但与非 Tg 情况相反，在 Il17ra–/–TcrdBinder3 小鼠中，胸腺内的 γδT 细胞已经减少（图 6C 和图 S17A）。将从 Il17ra–/–TcrdBinder3 小鼠胸腺中分选出的 CD73– γδ 胸腺细胞短暂地在体外暴露于板结合的 IL17RA，足以诱导 CD73 的上调（图 S17B），而 Il17ra+/+TcrdBinder3 胸腺细胞在没有重组 IL17RA 的情况下也上调了 CD73，这可能是由于既往体内暴露于 IL17RA 的历史（图 S17B）。我们得出结论，缺乏 IL17RA 导致 IL17RA 反应性 γδT 细胞的胸腺发育出现部分阻滞。
讨论 尽管许多 γδT 细胞在胸腺发育过程中已经获得了效应程序，但驱动这些分子程序诱导的 γδTCR 配体在很大程度上仍然难以捉摸。在这里，我们证明了在小鼠次级淋巴器官中发现的 ≥10% 的总 γδT 细胞的选择是由 Vδ7 γδTCRs 与细胞因子受体链 IL17RA 之间的直接相互作用驱动的。
与在其他几个 γδT 细胞亚群中观察到的配体依赖性 TH1 样分子程序的获得一致 (25, 27, 35)，Vδ7 γδT 细胞以 IL17RA 依赖的方式获得了 TH1 样效应特性。这种 IL17RA 驱动的分化还导致了 TCR 信号阈值的调整，使得这些细胞对它们通常接触的 IL17RA 水平的激活具有抗性。尽管如此，成熟的外周 IL17RA 反应性细胞仍然能够感知生理水平的 IL17RA，而这种识别驱动了它们的稳态增殖。
尽管多样化的 CDR3 序列以及所有测试的 Vγ 链都允许 IL17RA 反应性，但 IL17RA 反应性 γδT 细胞在其 TCR 中始终使用 Vδ7。TCR 诱变实验确定了 Vδ7 中的几个点突变，这些突变消除了 IL17RA 的结合和反应性。这些结果表明，IL17RA 主要与 Vδ7 链中的生殖系编码序列相互作用，这让人想起丁酸蛋白 (butyrophilin) 家族成员与 Vγ 中生殖系编码序列的非克隆型相互作用。因此，γδTCR 与内源性细胞表面蛋白的非克隆型相互作用并不限于丁酸蛋白相关分子。
将 IL17RA 鉴定为不属于丁酸蛋白家族的非克隆型 γδTCR 配体，表明此类相互作用在 γδT 细胞识别其内源性 TCR 配体中是一种比此前预期的更普遍的模式，这引发了关于支持此类相互作用的进化压力的疑问。在两种 T 细胞谱系中，αβT 细胞已经进化出复杂的选择机制，使其能够将 TCR 库集中在内源性配体（MHC 分子）上，并在保持高 TCR 多样性的同时，将其分化程序与其 TCR 特异性耦合。这种 αβTCR 库向 MHC 分子的聚焦在很大程度上基于利用 CD4 和 CD8 作为 MHC 的共受体 (55)。据我们所知，由于 γδT 细胞缺乏这样一套复杂的基于共受体的选择系统，可以想象，与 γδTCR 生殖系编码部分相互作用的非克隆型配体的选择，可能已进化为一种更为原始的机制，用于选择并诱导大型 γδT 细胞亚群的功能成熟，同时在产生的效应群体中保留高克隆多样性。与这一观点一致的是，一些能够与非克隆型配体相互作用的 γδTCR 也被证明能通过 CDR3 介导的相互作用识别额外的克隆特异性配体 (9, 30)。有观点认为，这种“双重反应性”允许在非克隆型配体（调节大型 γδT 细胞亚群的激动剂选择和稳态）与克隆特异性配体（可能在免疫反应中发挥作用）之间进行区分 (30)。在进化后期，一些内源性非克隆型 γδTCR 配体可能获得了额外的功能，例如通过检测 Vγ9Vδ2 人类 γδT 细胞在响应微生物和应激诱导化合物时 BTN3A1/BTN2A1 的构象变化，从而实现免疫监视 (31–34, 56, 57)。IL17RA 是否在 γδT 细胞生物学中获得了此类额外作用仍有待确定。尽管 IL17RA 广泛且组成型表达 (58)，但其表达水平在不同群体中有所不同，根据 Tabula Muris 数据库，单核细胞在所有细胞类型中表现出最高的 Il17ra 表达 (59)。可以想象，例如，这种表达的异质性可能会在组织中产生 IL17RA 高丰度和低丰度的生态位，从而反过来调节 IL17RA 反应性 γδT 细胞在组织内的定位。此外，IL17RA 的上调，或者 IL17RAhi 细胞与 IL17RA 反应性 γδT 细胞的可诱导共定位（例如，炎症时单核细胞流入 Vδ7 γδT 细胞丰度较高的组织），也可能导致后者的激活。最后，还可以想象，额外的可诱导分子成分（如 IL17RA 的翻译后修饰，甚至尚未确定的复合配体元件）调节 Vδ7 γδT 细胞的激活。然而，IL17RA 仍有可能主要作为多样化 TH1 样 γδ 效应群体的选择和稳态决定因子，而该群体随后可以以独立于 IL17RA 的方式发挥功能。
材料与方法 小鼠 Il17ra–/– 小鼠和 Il17a–/–Il17f–/– 小鼠此前已有描述 (54, 60)。 WT C57BL/6J 小鼠购自 Janvier Labs。小鼠在卡罗林斯卡学院（瑞典，斯德哥尔摩）的比较医学生物医学设施、美因茨约翰内斯·古腾堡大学（德国，美因茨）的转化动物研究中心或芝加哥大学（美国，芝加哥）的动物资源中心进行繁殖和饲养，并将其置于特定无病原体条件下，相对湿度为 30–70%，温度为 22°C，采用下午 6:00 至上午 6:00 的夜间暗-光周期。在所有实验中，性别和年龄匹配的小鼠被随机分配到实验组。小鼠通过 5 min 的 CO2 窒息随后进行颈椎脱臼而安乐死。在美因茨的小鼠饲养符合美因茨约翰内斯·古腾堡大学转化动物研究中心的指南，并符合联邦（莱茵兰-普法尔茨州）、州（德国）和欧盟的政策。所有在卡罗林斯卡学院进行的小鼠实验均根据有效的伦理许可执行
B
TCR
E
TCR
V 4
TCR
-5
UMAP2
-15
-5 0 5
UMAP1
Gating for IL17RA-multimer+ (Spleen)
IL17RA-multimer+
IL17RA-multimer+
F
Ly6C
Ly6C
Ly6C
Ly6C
Ly6C
104 0 CD122
104 0 CD122
Gating for V 7+ (Spleen)
104 29
103 0 CD122
103 0 CD122
TCR Tg (Spleen)
(TCR Tg)
Total splenocytes
Tcrd+/+
(Polyclonal)
TcrdBinder3/+
6 33 103 0 TCR
ROR t
IL17A
V 7+ T cells
V 4+V 7+ T cells
TCR Tg T cells
V 1
图 4. IL17RA 反应性 $\gamma\delta$TCR 的表达与 TH1 样效应程序的获得相关。(A) UMAP 图显示了 WT 脾脏 $\gamma\delta$ T 细胞中具有 V$\gamma$4V$\delta$7 TCR 的细胞分布 [scRNA/VDJ-seq 数据集来自 (40)]（左），以及 Th1 样（Ifng, Ly6c2, Tbx21 和 Il2rb）和 TH17 样（Rorc）$\gamma\delta$ T 细胞特征基因的表达。共描绘了 10,179 个 $\gamma\delta$ T 细胞。(B) 总脾脏 $\gamma\delta$ T 细胞（左）和 IL17RA 多聚体结合 $\gamma\delta$ T 细胞（右）的 Ly6C 和 CD122 表达。代表性门控策略见图 S18C。显示了至少 5 次独立实验的代表性结果。(C) 总脾脏 $\gamma\delta$ T 细胞（蓝色）或 IL17RA 多聚体+ $\gamma\delta$ T 细胞（红色）的 Tbet 和 ROR$\gamma$t 表达。5 次独立实验的代表性结果。(D) PMA/ionomycin 刺激后，总脾脏 $\gamma\delta$ T 细胞（蓝色）或 IL17RA 多聚体+ $\gamma\delta$ T 细胞（红色）产生的 IFN$\gamma$ 和 IL17A。显示了 3 次独立实验的代表性结果。(E) 脾脏 V$\delta$7+ $\gamma\delta$ T 细胞（上）和 V$\gamma$4+V$\delta$7+ $\gamma\delta$ T 细胞（下）的表征。通过流式细胞术评估 Ly6C, CD122 和 Tbet 的表达（蓝色，总脾脏 $\gamma\delta$ T 细胞；红色，如图所示的 V$\delta$7+ 或 V$\gamma$4+V$\delta$7+ $\gamma\delta$ T 细胞）。通过 RNA 流式细胞术检测 Trav13- 4- dv7（编码 V$\delta$7）的表达。$\gamma\delta$ T 细胞的代表性门控策略见图 S18E。3 次（表面标志物）或 2 次（Tbet 染色）独立实验的代表性结果。(F) WT 小鼠（上）和 TcrdBinder3/+ TCR Tg 小鼠（下）脾脏 $\gamma\delta$ T 细胞的表征。通过流式细胞术评估 Ly6C, CD122 和 Tbet 的表达（蓝色，多克隆非 TCR Tg $\gamma\delta$ T 细胞；红色，来自 TCR Tg 小鼠的 $\gamma\delta$ T 细胞）。显示了 4 次（表面标志物）或 2 次（Tbet 染色）独立实验的代表性结果。
TcrdBinder3 TCR Tg 小鼠是通过在小鼠合子中进行 CRISPR-Cas9 介导的基因组编辑而产生的。Tcrd 基因座的靶向操作是
0 1 2 3
0 1 2 3
0 1 2
Total T cells
Total T cells
Total T cells
Total T cells
Total T cells
Total T cells
Total T cells
103 105
104 0 IL17RA multimer
102 0 Trav13-4-dv7 (V 7)
103 103 0 CD122
104 103 0 V 4
C D
103 Tbet
103 0 IFN
104 103 Tbet
104 103 Tbet
Polyclonal T cells
% IL17RA-multimer+
IL17RA-multimer+
IL17RA-multimer+
F
G
Il17ra–/–
Il17ra–/–
Il17ra–/–
Il17ra+/+
Il17ra+/+
Il17ra–/–
Il17ra–/–
Control
Control
Control
TCR
TCR
TCR
1.18 0.37 2.32
104 0 IL17RA multimer
73 11 69
Ly6C
Ly6C
Ly6C
Ly6C
104 0 CD122
104 0 CD122
104 0 CD122
0 CD122
0 CD122
Control Il17ra–/–
IL17A
Control Il17ra–/– Il17a–/–Il17f–/– B
Control Il17ra–/– Il17a–/–Il17f–/–
Control Il17ra–/–
Il17a–/–Il17f–/–
Il17a–/–Il17f–/–
V $\delta$ 7+ 门控（脾脏，总 T 细胞）
% V $\delta$ 7+
V $\delta$ 7+
% V
V
16 6 17
104 0 Trav13-4-dv7 (V $\delta$ 7)
104 0 Trav13-4-dv7 (V $\delta$ 7)
58 15 58
V $\gamma$ 4+V $\delta$ 7+ 门控（脾脏，总 T 细胞）
% V $\gamma$ 4 V $\delta$ 7+
V $\gamma$ 4 V $\delta$ 7+
V $\gamma$ 4
V $\gamma$ 4 V $\delta$ 7+
12 3 12
69 15 70
C TCR Tg（脾脏，总活细胞）
Il17ra+/+ Il17ra–/–
TcrdBinder3
TcrdBinder3
TcrdBinder3/+
TcrdBinder3/+
14 3
0 V $\gamma$ 4
IL17RA-multimer+ 的
% CD122+Ly6C+
CD122+Ly6C+
NS
NS
% CD122+Ly6C+
NS
NS
NS
%CD122+Ly6C+
CD122+Ly6C+
图 5. IL17RA 是大多数 V $\delta$ 7 $\gamma \delta$ T 细胞中 TH1 样效应程序的积累和诱导所必需的。(A) 通过流式细胞术分析了对照组 (WT)、Il17ra–/– 和 Il17a–/–Il17f–/– 小鼠脾脏中 IL17RA multimer 结合 $\gamma \delta$ T 细胞的频率（上图）以及 IL17RA multimer 结合 $\gamma \delta$ T 细胞中 CD122 和 Ly6C 的表达（下图）。显示了代表性图表（左）以及 IL17RA 结合 $\gamma \delta$ T 细胞的绝对数量量化、具有 TH1 样 CD122+Ly6C+ 表型的 IL17RA 结合 $\gamma \delta$ T 细胞的数量及其在总 $\gamma \delta$ T 细胞中的频率。代表性门控策略见图 S18C。显示了两组独立实验的代表性结果；结果汇总自三组独立实验（WT 组 n = 7 只小鼠，Il17ra–/– 和 Il17a–/–Il17f–/– 组 n = 5 只）。对于绝对数量的量化，WT 组 n = 6 只小鼠，Il17ra–/– 组 n = 4 只小鼠，Il17a–/–Il17f–/– 组 n = 5 只。(B) V $\delta$ 7+ $\gamma \delta$ T 细胞（上图）和 V $\gamma$ 4+V $\delta$ 7+ $\gamma \delta$ T 细胞（下图）的 CD122 和 Ly6C 表达，以及它们的频率和绝对数量。
**
**
**
总 T 细胞中的
总 T 细胞中的
总 T 细胞中的
*
**
**
**
V $\delta$ 7+ T 细胞中的
V $\gamma$ 4 V $\delta$ 7+ T 细胞中的
T 细胞计数 (x 10$^6$)
总活细胞中的
103 0 Ly6C
104 103 105
104 103 Tbet
103 104
103 104
T 细胞计数 (x 10$^3$)
T 细胞计数 (x 10$^3$)
ROR $\gamma$ t
103 0 Tbet
分选的 IL17RA-multimer+ T 细胞 E
103 0 IFN $\gamma$
0 IFN $\gamma$
T 细胞计数 (x 10$^4$)
T 细胞计数 (x 10$^4$)
T 细胞计数 (x 10$^4$)
T 细胞计数 (x 10$^4$)
CTV 标记的 V $\gamma$ 4V $\delta$ 7 细胞
来自 TcrdBinder3
CD122+Ly6C+V $\delta$ 7+
至 WT
至 Il17ra–/–
103 0 CTV
IL17RA-multimer+CD27+ T 细胞
104 0 Ki67
% Ki67+
PMA/Ionomycin
PMA/Ionomycin
Il17ra+/+TcrdBinder3/+
Il17ra–/–TcrdBinder3/+
74 15 2 7
88 15 0 3
在第 8 天和 第 23 天收获
WT 或 Il17ra–/–
供体 T 细胞
第 8 天 第 23 天
104 103 0
IL17RA-multimer+CD27+ 的
通过流式细胞术评估了对照组 (Il17a+/–Il17f+/–)、Il17ra–/– 和 Il17a–/–Il17f–/– 小鼠脾脏中的相应子集。图中显示了代表性散点图（左）以及 Vδ7+ 和 Vγ4+Vδ7+ γδT 细胞的绝对数量定量，以及具有 TH1 样 CD122+Ly6C+ 表型的 Vδ7+ 和 Vγ4+Vδ7+ γδT 细胞的绝对数量及其在总 γδT 细胞中的频率（右）。γδT 细胞的代表性门控策略见图 S18E。结果为两次独立实验的代表性结果。每组 n = 3 只小鼠。(C) 分析了 Il17ra+/+TcrdBinder3/+ (蓝色) 和 Il17ra–/–TcrdBinder3/+ (红色) 小鼠脾脏中 Vγ4+ γδT 细胞的频率（顶部，门控为总活细胞）、稳态下 Ly6C、CD122 和 Tbet 的表达，以及 PMA/ionomycin 刺激后 IFNγ 的产生（底部）。图中显示了 Vγ4+ γδT 细胞的代表性散点图及其绝对数量的定量
以及它们在总脾细胞中的频率。结果为三次独立实验的代表性结果。Il17ra+/+TcrdBinder3/+ 组 n = 4 只小鼠，Il17ra–/–TcrdBinder3/+ 组 n = 5 只小鼠。(D) 对照组 (WT) 和 Il17ra–/– 小鼠分选的 IL17RA 多聚体+ γδT 细胞（汇总自脾脏和淋巴结 LNs）中 Tbet 和 RORγt 的表达。图中显示了四次独立实验的代表性散点图。(E) 对照组 (WT) 和 Il17ra–/– 小鼠分选的 IL17RA 多聚体+ γδT 细胞（汇总自脾脏和淋巴结 LNs）在 PMA/ionomycin 刺激后产生 IFNγ 和 IL17A 的情况。图中显示了三次独立实验的代表性散点图。(F) 从 Il17ra+/+TcrdBinder3 小鼠脾脏中分离并富集的 TCR Tg γδT 细胞用 CTV 标记，并静脉转移至 WT 或 Il17ra–/– 小鼠体内。在转移 8 天和 23 天后，通过流式细胞术分析受体小鼠脾脏中 TcrdBinder3 γδT 细胞的 CTV 稀释情况。代表性门控策略见图 S18F。图中为两次独立实验的代表性散点图。(G) 对照组 (WT) 和 Il17ra–/– 小鼠脾脏 IL17RA 多聚体+CD27+ γδT 细胞中 CD122 和 Ki67 的表达。图中显示了流式细胞术散点图（顶部，由 n = 3 只小鼠连接而成）以及 IL17RA 多聚体+CD27+ γδT 细胞中 Ki67+ 频率的定量。结果为两次独立实验的代表性结果。每组 n = 3 只小鼠。数据以平均值 ± 标准差 (SD) 表示。NS，无显著差异 (P > 0.05)，P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，以及 **P < 0.0001。每个点代表一只小鼠。数据通过双尾 Student's t 检验 [(C) 和 (G)] 或配合 Holm-Sidak 多次比较检验的一路方差分析 (one-way ANOVA) [(A) 和 (B)] 进行分析。
将修复模板 (6 ng/μl) 注射到 C57BL/6 胚胎中。通过测序确认了正确的靶向。
T 细胞杂交瘤的制备 T 细胞杂交瘤的制备方法此前已有描述 (41)。简而言之，通过磁珠富集或荧光激活细胞分选从 WT C57BL/6J 小鼠的胸腺中分离 $\gamma\delta$ T 细胞。$\gamma\delta$ T 细胞在预先涂有 10 $\mu$g/ml anti-CD3 (17A2, BioLegend) 抗体的培养板中，在 2 $\mu$g/ml anti-CD28 (37.51, BioLegend) 抗体和 10 ng/ml IL2 (Miltenyi Biotec) 存在的情况下进行培养。48 小时后，收集并计数受刺激的 $\gamma\delta$ T 细胞，并以 1:1 或 1:2 的比例与 BW5147 融合伴侣混合。使用不含添加剂的 Iscove 改良 Dulbecco 培养基 (IMDM) 洗涤后，通过敲击试管三次使细胞沉淀松散，并在 37°C 下恒速摇晃。在摇晃开始后分别 60 和 90 s，向沉淀中逐滴加入 0.5 ml PEG-1500 (Roche) 和 2.5 至 3 ml 不含添加剂的 IMDM。随后将细胞离心，并重悬于含有 10% 胎牛血清 (FCS)、1% L-谷氨酰胺、1% penicillin/streptomycin、20 $\mu$M 2-mercaptoethanol、1$\times$ HAT (Sigma) 和 10 $\mu$g/ml 环丙沙星 (Ciprofloxacin, Sigma) 的 IMDM 中，密度为 300 个受刺激 T 细胞/ml。细胞在 96 孔 U 型底板中培养，从融合后第 5 天起监测杂交瘤的生长情况。通过流式细胞术评估 TCR 的表达。
质粒 TCR 以 Tcrg-P2A-Tcrd 表达框的形式，利用 BglII 和 XhoI 限制性酶切位点克隆到 IRES-GFP 逆转录病毒载体 pCMMP-MCS-IRES-eGFP (61) (Addgene, 36953) 中，具体操作如前所述 (62, 63)。在对某些 TCR 进行克隆时，在 CDR3$\delta$ 正下游的 Trdc 区域引入了一个同义突变，以增加一个 KflI 限制性酶切位点。这使得能够使用 BglII 和 KflI 位点克隆较短的表达框。为了从 T 细胞杂交瘤中获得 $\gamma\delta$TCR 的序列，使用 ZYMO Quick-RNA Microprep Kit (ZYMO) 从杂交瘤中分离 RNA，随后使用 RevertAid RT 逆转录试剂盒 (Thermo Fisher Scientific) 进行逆转录。扩增 Tcrd 和 Tcrg 序列，通过重叠 PCR 生成 Tcrg-P2A-Tcrd 表达框，并如前所述克隆到逆转录病毒载体中 (62, 63)。在 scRNA/VDJ-seq 数据集中鉴定出的 $\gamma\delta$TCR 编码表达框，以及编码 TCR 突变版本的表达框，由 Twist Bioscience 或 Integrated DNA Technologies 通过基因合成产生。
pCMV-Sport6 载体中的小鼠 Il17ra 是从下文描述的 cDNA 库中分离的。为了制备截短的“仅 D2”版本 IL17RA，利用 NheI 和 AflII 限制性酶切位点，将编码 IL17RA 胞外部分的序列替换为一个删除了 D1 结构域的合成 DNA 片段。pcDNA3.1 载体中的小鼠 Il17rd 和 pcDNA3.1 载体中的小鼠 Il17re 购自 GeneScript。小鼠 Il17rb 和 Il17rc 扩增自购自 Sino Biological 的构建体，并使用 AflII 和 BamHI 限制性酶切位点克隆到 pcDNA3.1 载体中。
为了制备用于在 BEKO 细胞中敲除 B2m 的逆转录构建体，将编码靶向 B2m 位点的 sgRNA 的寡核苷酸 (5′-CACCGAGTATACTTGAATTTGAG-3′ 和 5′-AAACCTCAAATTCAAGTATACTC-3′) 进行退火，并克隆到经 BbsI 限制性内切酶消化后的 pSIN-Cas9-mCherry 载体中。为了制备用于在 BEKO 细胞中敲除 Il17ra 的逆转录构建体，将编码靶向 Il17ra 位点的 sgRNA 的寡核苷酸 (5′-CACCGGCTGGCCACGGGTCGTCCCC-3′ 和 5′-AAACGGGGACGACCCGTGGCCAGCC-3′) 进行退火，并克隆到经 BbsI 限制性内切酶消化后的 pSIN-Cas9-thy1.1 载体中。pSIN 质粒由 J. Zuber (维也纳 IMP) 慷慨提供。
为了构建编码 Binder3 TCRγ 胞外域的表达载体，将一段包含 N 端人类 IL2 信号肽（UniProtKB: P60568，残基 1 至 20）、Binder3 TCRγ 胞外域、TEV 蛋白酶切割位点、酸性亮氨酸拉链 (RR12EE345L) (64) 以及 Flag 标签的合成序列，利用 XhoI 和 HindIII 限制性内切酶位点克隆到 pcDNA3.1 载体中。为了构建编码 TCR55 TCRδ 胞外域的载体，将一段包含 N 端人类 IL2 信号肽、编码 TCR55 Vδ7 胞外域的基因、TEV 蛋白酶切割位点、碱性亮氨酸拉链 (EE12RR345L) (64) 以及 Twin-StrepII 标签的合成序列，利用 XhoI 和 HindIII 限制性内切酶位点克隆到 pcDNA3.1 载体中。
可溶性 TCR 的制备 使用 ExpiFectamine 293 转染试剂盒 (Gibco)，将表达质粒 pcDNA3.1 Binder3 TCRγ 和 pcDNA3.1 TCR55 TCRδ 以 1:2 的比例瞬时转染至 Expi293F 细胞中。转染后的细胞在 Expi293F 表达培养基 (Gibco) 中，于摇床培养箱 (37°C, 8% CO2) 中培养。转染五天后，通过离心收集上清液，并使用 0.45- μm 过滤器过滤澄清。在上清液中加入 Biolock 溶液 (IBA Life Sciences) 至最终浓度为 1.8% (v/v)，并在冰上孵育 20 分钟。上清液再次通过 0.45- μm 过滤器过滤，并加载到 1- ml StrepTrap HP 柱 (Cytiva) 上。使用 100 mM Tris-HCl, pH 8, 150 mM NaCl 和 1 mM EDTA 缓冲液洗涤色谱柱，并使用 100 mM Tris-HCl, pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA 和 2.5 mM 脱硫生物素 (desthiobiotin) 洗脱蛋白。含有可溶性 TCR 的组分使用 PD- 10 脱盐柱更换为 1× HBS EP+ 缓冲液，随后对样品进行浓缩。通过使用抗 Strep 和抗 Flag 标签抗体进行 Western blot 验证了可溶性 TCR 的表达和完整性。
重组 IL17RA 的制备 小鼠和人类 IL17RA 的可溶性胞外域在黑腹果蝇 (Drosophila melanogaster) S2 细胞中制备。为了实现高效纯化，一个
C
% IL17RA-multimer+
IL17RA-multimer+
Il17ra–/–
Il17ra–/–
Il17ra–/–
Il17ra+/+
Il17ra+/+
Il17ra–/–
Il17ra–/–
Il17ra+/+
Il17ra+/+
Il17ra+/+
Il17ra+/+
Il17ra–/–
Il17ra–/–
Il17ra–/–
Il17ra–/–
Il17a–/–Il17f–/–
Il17a–/–Il17f–/–
Control
Control
Control
1.0
1.0
1.0
1.0
TCR
TCR
0.33 0.70 0.36
104 0 IL17RA multimer
0.5
0.5
0.5
0.5
32 11 32
Ly6C
Ly6C
% CD122+
104 0 CD122
% CD122+
0 CD122
0 CD122
TCR Tg (Thymus, total live cells)
Il17ra+/+ Il17ra–/–
Il17ra+/+ Il17ra–/–
TcrdBinder3/+ TcrdBinder3/+
TcrdBinder3/+ TcrdBinder3/+
6 1
% CD73+
103 105 0 CD73
% CD73+
% V 4
V 4
0 V 4
*
**
52 14
CD24
* NS **
NS
of IL17RA-multimer+
of IL17RA-multimer+
CD24
of V 4 T
of V 4 T
CD122+V 4
Il17ra+/+TcrdBinder3/+
Il17ra–/–TcrdBinder3/+
图 6. IL17RA 调节 IL17RA 反应性 γδT 细胞的胸腺发育。(A) 分析方法如 图 5A，但是在相同小鼠的胸腺中进行。结果由三次独立实验汇总而成。(B) 对对照组 (WT) 和 Il17ra–/– 小鼠胸腺中 IL17RA multimer+ γδT 细胞的 CD24 和 CD73 表达进行了分析。图中显示了代表性图谱（上）以及 IL17RA multimer+ γδT 细胞中 CD73+ 频率的定量分析（下）。结果由四次独立实验汇总 (每组 n = 4 只小鼠)。(C) 在 Il17ra+/+TcrdBinder3/+ (蓝色) 和 Il17ra–/–TcrdBinder3/+ (红色) 小鼠的脾脏中分析了 Vγ4+ γδT 细胞的频率（上，在总活细胞中设门），以及 Ly6C 和 CD122 的表达（中和下）。图中显示了代表性图谱（左），以及 Vγ4+ γδT 细胞和 CD122+Vγ4+ γδT 细胞的绝对数量及其在总胸腺细胞中频率的定量分析。小鼠与 图 5C 所示相同，Il17ra+/+TcrdBinder3/+ 组 n = 4 只，Il17ra–/–TcrdBinder3/+ 组 n = 5 只。显示为三次独立实验的代表性结果。(D) 分析方法如 (B)，但是在 (C) 中所示相同小鼠的胸腺中进行。显示为三次独立实验的代表性结果。数据以平均值 ± 标准差 (SD) 表示。NS，无显著性差异 (P > 0.05)；P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001, 以及 **P < 0.0001。每个点代表一只小鼠。数据通过双尾 Student’s t 检验 [(B) 至 (D)] 或带有 Holm-Sidak 多重比较检验的一路方差分析 (ANOVA) (A) 进行分析。
双 Strep-tag 与肠激酶 (EK) 切割位点一起融合在蛋白质的 C 端，以便于受控的蛋白水解切割。使用昆虫细胞表达载体 (65)，按照此前描述的方法 (66) 对 S2 细胞进行转染，并进行了优化以提高性能。转染使用了 2 μg 质粒 DNA，并结合 0.1 μg 的 pCoPuro 质粒 (67)。在筛选 6 天后，稳定细胞系被驯化至 Insect-XPRESS 培养基 (Lonza)。
为了启动可溶性蛋白表达，将驯化后的细胞扩大培养，并在细胞密度为 6 × 106 cells/ml 时用 4 μM CdCl2 诱导。诱导 5 天后，通过离心收获细胞，并使用 Strep-Tactin XT 4Flow 柱 (IBA Lifesciences) 进行亲和层析从上清液中纯化可溶性蛋白，随后使用 HiLoad 26/600
1.5
of total T
T cell count
T cell count (x 106)
T cell count (x 106)
T cell count (x 106)
of total live cells
Superdex 200 pg 柱 (Cytiva)，平衡液为 20 mM HEPES, pH 7.4, 和 150 mM NaCl。
表面等离子体共振 利用 Biacore 1K 仪器 (Cytiva) 通过表面等离子体共振评估了 IL17RA 与 TCR 之间的结合动力学。将 10 mM 乙酸钠 (pH 5.0) 中的小鼠或人类 IL17RA 用作配体，通过胺耦合 (Cytiva, BR100050) 捕获到 CM5 芯片 (Cytiva, 29104988) 的活性流路表面，捕获量为 400 到 500 RUs。参照流路以相同方式处理，但不固定任何配体。相互作用采用单周期动力学设置进行测量，使用五种摩尔浓度的 TCR 进行 2 倍稀释系列，根据实验情况，起始浓度为 12 μM (r1) 或 5 μM (r2 和 r3)。流速设定为 30 μl/min，接触时间
T 细胞计数 (x 103)
41 17 58 83
103 0 CD73
CD122+ IL17RA-multimer+
D 胸腺 TCR Tg T 细胞
77 16
103104
CD73+V 4
每个浓度持续 60 s，以及最后的解离相持续 600 s。所有步骤均在 25°C 下进行，并使用含有 10 mM HEPES (pH 7.4)、3 mM EDTA、150 mM NaCl 和 0.05% Tween 20 的 HBS-EP+ 运行缓冲液。原始数据通过在分析物之前注射缓冲液空白以及利用参考流体池的数据进行双重参照。传感器图使用 Biacore Insight 评估软件进行拟合，假设 1:1 Langmuir 结合模型以获取结合速率常数 (ka)、解离速率常数 (kd) 和 $K_D$。鉴于 k = 3 次测量，结合与解离速率及其各自的拟合标准误差 (SE) 采用随机效应模型并结合 Hartung Knapp Sidik Jonkman 95% 置信区间 (95% CI) 调整进行汇总。估计值及其量化不确定性被用于计算 $K_D$ 和速率常数 (ka 和 kd) 的汇总估计值。
细胞系 所有细胞均保存在 37°C、含 5% $\text{CO}_2$ 的加湿培养箱中。BW5147 融合伴侣细胞、16.2c11 T 杂交瘤细胞系、DP 胸腺淋巴瘤 (BEKO) (41)、胸腺上皮细胞系 (mTEC 3.10, cTEC 1.2) (68) 以及胸腺成纤维细胞系 (TST4) (69) 均在补充了 10% FCS、100 U/ml L-谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素/链霉素和 50 $\mu$M 2-巯基乙醇的 IMDM 中培养。为了提高 BEKO 细胞的存活率，使用 pMIG-BCL2-IRES-GFP 构建体对其进行逆转录病毒转导。内皮细胞系 MVEC-B3 在补充了 10% FCS、100 U/ml L-谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素/链霉素和 50 $\mu$M 2-巯基乙醇的 RPMI 1640 中培养。HEK293T 和周围 T 细胞淋巴瘤细胞系 EL4 在补充了 10% FCS、100 U/ml L-谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素/链霉素和 50 $\mu$M 2-巯基乙醇的 DMEM/HG 中培养。
逆转录病毒感染 将总计 $6 \times 10^5$ 个 HEK293T 细胞接种于 6 孔板中并培养。当汇合度达到 70% 时，使用前述的磷酸钙法 (70)，将 $2.8\ \mu\text{g}/\text{孔}$ 的目标构建体与 $1.4\ \mu\text{g}/\text{孔}$ 的 pCL-Eco (Addgene, 12371) 逆转录病毒包装质粒转染至 HEK293T 细胞中。转染 24 小时后，将培养基更换为目标细胞培养基。在转染后 42 和 48 小时收集病毒上清液，并通过 $0.45\ \mu\text{m}$ 滤膜过滤。将总计 $4 \times 10^4$ 个 16.2c11 细胞与病毒上清液在室温下以 500 g 离心感染 1 小时。转导后，通过磁力富集或分选 TCR 表达的细胞。
瞬时表达实验 将 HEK293T 细胞接种于 96 孔板中，密度为每孔 $2 \times 10^4$ 至 $3 \times 10^4$ 个细胞。当汇合度达到 70% 时，按照制造商说明，使用 Lipofectamine 3000 转染试剂盒 (Invitrogen, L3000001) 将 $200\ \text{ng}$ 质粒转染至 HEK293T 细胞中。随后将细胞在 37°C 下培养 24 小时，然后进行共培养实验。在 $\gamma\delta\text{TCR}$ 和 $\text{CD3}$ 共转染的实验中，每孔使用 $67\ \text{ng}$ 的 $\gamma\delta\text{TCR}$ 编码构建体和 $133\ \text{ng}$ 的 $\text{CD3}$ 编码构建体。在 $\text{IL17RA}$ 及其旁系同源物共转染的实验中，每孔使用 $2\ \text{ng}$ 的 $\text{IL17RA}$ 编码构建体和 $200\ \text{ng}$ 的旁系同源物编码构建体。
与表达 TCR 的报告细胞共培养 对于与贴壁细胞的共培养，将 TST4 细胞 (每孔 $5 \times 10^3$)、MVEC 细胞 (每孔 $5 \times 10^3$)、mTEC 3.10 细胞 (每孔 $1.5 \times 10^4$) 或 cTEC 1.2 细胞 (每孔 $1.5 \times 10^4$) 接种于 96 孔平底板中。当汇合度达到 90% 时，加入每孔 $4 \times 10^4$ 个 16.2c11 报告细胞，并在 37°C 下与目标细胞共培养 14 至 18 小时。对于与悬浮细胞系和原代细胞的共培养，将每孔 $1 \times 10^4$ 个 16.2c11 报告细胞与每孔 $1.5 \times 10^5$ 个目标细胞在 96 孔 V 型底板中于 37°C 下共培养 14 至 18 小时。对于 $\text{IL17RA}$ 蛋白的刺激，96 孔平底板预先涂覆有
重组 IL17RA（8 μg/ml，除非另有说明，在 37°C 下处理 1 至 2 小时） 以及 4 × 104 16.2c11 报告细胞在这些孔中培养 14 至 18 小时。作为 TCR 信号传导的正对照，细胞在预涂有 10 μg/ml anti-CD3ε (145- 2C11, BioLegend) 抗体的 96- 孔平底板中，于 37°C 下孵育 14 至 18 小时。共培养后，使用流式细胞术测量 γδTCR+ 报告细胞表达的蓝色荧光蛋白 (sFT-Blue) 水平。
TCR Tg γδT 细胞的刺激 为了对 γδ 脾细胞进行短期体外刺激，从 Il17ra+/+TcrdBinder3 和 Il17ra–/–TcrdBinder3 小鼠脾脏中提取的 γδT 细胞通过使用异染料花青素 (APC) 偶联的 anti-CD19、 anti-CD11c、anti-TCRβ、anti-Ter119、anti-CD11b 和 anti-CD4 进行染色，随后使用 anti-APC 磁珠 (Miltenyi Biotec) 进行磁性去除而富集。 对于与离体细胞的共培养，将每孔 2 × 104 个富集的 γδT 细胞与从 WT 或 Il17a–/– 小鼠中分离的 2 × 105 个总脾细胞或胸腺细胞在 96- 孔 V-底板中共培养 16 小时。对于使用 IL17RA 蛋白的刺激，96- 孔平底板预先涂有重组 IL17RA 的系列稀释液（从 60 μg/ml 开始进行 2- 倍稀释，37°C 下处理 2 小时），并将每孔 2 × 104 个富集细胞在这些孔中培养 16 小时。作为 TCR 信号传导的正对照，细胞在预涂有 5 μg/ml anti-CD3ε (145- 2C11, BioLegend) 抗体的 96- 孔平底板中，于 37°C 下孵育 16 小时。在所有条件下，细胞均在添加了 10% FCS、100 U/ml L-谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素/ 链霉素、50 μM 2-巯基乙醇和 10 ng/ml 重组小鼠 IL7 (PeproTech) 的 IMDM 中培养。共培养后，收集细胞进行染色并用流式细胞术分析。分析 Vγ4+TCRγδ+ 细胞上 CD69 和 CD25 的上调情况。
为了对 γδ 脾细胞进行体外极化，如上所述分离 Il17ra+/+TcrdBinder3 和 Il17ra–/–TcrdBinder3 小鼠脾脏中的 γδT 细胞。对于非极化条件，将富集的 γδT 细胞培养在 48- 孔板中 [在磷酸盐缓冲液 (PBS) 中预涂有 3 μg/ml anti-CD3ε (145- 2C11, BioLegend)，37°C 下处理 2 小时]，培养基为添加了 10% FCS、100 U/ml L-谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素/链霉素、50 μM 2-巯基乙醇和 3 μg/ml anti-CD28 (37.51, BioLegend) 的 IMDM。对于 Th1- 极化条件，将富集的 γδT 细胞培养在 48- 孔板中 [在 PBS 中预涂有 3 μg/ml anti-CD3ε (145- 2C11, BioLegend)，37°C 下处理 2 小时]，培养基为添加了 10% FCS、100 U/ml L-谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素/ 链霉素、50 μM 2-巯基乙醇、0.5 μg/ml anti-CD28 (37.51, BioLegend)、10 μg/ml anti-IL4 (11B11, BioLegend)、5 ng/ml 重组 小鼠 IL2 (PeproTech) 和 10 ng/ml 重组小鼠 IL12 (PeproTech) 的 IMDM。对于 Th17- 极化条件，将富集的 γδT 细胞培养在 48- 孔板中 [在 PBS 中预涂有 5 μg/ml anti-CD3ε (145- 2C11, BioLegend)，37°C 下处理 2 小时]，培养基为添加了 10% FCS、100 U/ml L-谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素/ 链霉素、50 μM 2-巯基乙醇、0.5 μg/ml anti-CD28 (37.51, BioLegend)、10 μg/ml anti-IL4 (11B11, BioLegend)、10 μg/ml anti-IFNγ (XMG1.2, BioLegend)、 50 ng/ml 重组小鼠 IL6 (PeproTech)、5 ng/ml 重组 小鼠 IL23 (PeproTech) 和 1 ng/ml 重组人类 TGFβ (PeproTech) 的 IMDM。在培养开始 4 天后，将细胞用于细胞因子产生测定。为此，使用 PMA/ionomycin 对细胞进行再次刺激，并按照“细胞因子产生测定”部分所述进行分析。
为了进行 $\gamma\delta$ 胸腺细胞的体外分化，从 $Il17ra^{+/+}$ $Tcrd^{Binder3}$ 和 $Il17ra^{-/-}$ $Tcrd^{Binder3}$ 小鼠的胸腺中分选出 $\text{CD4}^{–}\text{CD8}^{–}\text{CD24}^{+}\text{CD73}^{–}$ 细胞（注意：为避免无意识刺激而省略了抗-TCR抗体），并将其培养在 96 孔平底板中。这些平板未经包被，或预先包被有 5 $\mu$g/ml 抗-$\text{CD3}\epsilon$ (145-2C11, BioLegend) 或 50 $\mu$g/ml 重组 IL17RA（溶于 PBS），并在 37°C 下处理 2 小时。培养基为 IMDM，添加了 10% FCS、100 U/ml L-谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素/链霉菌以及 50 $\mu$M 2-巯基乙醇。12 小时后，收集细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析。分析时采用了 $\text{V}\gamma 4^{+}\text{TCR}\gamma\delta^{+}$ 细胞的门控。
cDNA 库的构建 整体 cDNA 筛选方法基于此前用于鉴定非传统 $\alpha\beta$TCR 配体的策略 (71, 72)。从 BEKO 细胞系中分离总 RNA，并使用 oligo-dT 磁珠 (Thermo Fisher Scientific) 富集 poly(A)+ mRNA。根据制造商说明，使用 In-Fusion SMARTer 方向性 cDNA 库构建试剂盒 (Takara) 合成 cDNA 并将其克隆到 pCMV-Sport6 载体中。将该文库电穿孔到感受态大肠杆菌 (Escherichia coli) 细胞中，通过系列稀释测定转化细胞的滴度，并建立 96 孔微量制备培养，目标是每孔涂布约 200 个克隆。使用 ZymoPURE 96 孔板试剂盒 (ZYMO Research) 纯化质粒，使用 Lipofectamine 3000 (Invitrogen) 将其转染至 96 孔平底板中的 HEK293T 细胞中，并在共培养（如上所述）前过夜。
cDNA 库的筛选 将分选出的 TCR+ 报告细胞与转染了 cDNA 池的 HEK293T 细胞进行共培养分析，共培养在上述平底 96 孔板中。每个池使用 180 至 500 ng 的质粒 DNA 进行转染。共培养 14 至 18 小时后，收集细胞并在配备高通量采样器 (HTS) 的 LSR Fortessa 流式细胞仪上进行分析。通过绿色荧光蛋白 (GFP) 的表达将报告细胞与 HEK293T 细胞区分开。分析 sFT-blue+ 报告细胞的频率。
为了鉴定导致 E5 池观察到反应性的单个 cDNA，通过在 LB 琼脂平板上划线，从 E5 池的甘油保藏株中回收大肠杆菌细胞。挑选 20 个单个菌落，并将其汇集，为 19 个子池中的每一个进行微量制备培养。使用 ZR 质粒微量制备 (ZYMO Research) 试剂盒纯化子池中的质粒，并按上述方法用于 HEK293T 转染和共培养分析（每个子池使用 200 ng 质粒进行转染）。从阳性子池 4 和 14 中，共选取 40 个单个菌落（每个子池 20 个），进行接种并处理以纯化质粒。纯化后的质粒用于上述共培养分析（每个克隆使用 200 ng 质粒进行转染）。阳性克隆被送往 Sanger 测序 (Eurofins)。
过继转移分析 按照“TCR Tg $\gamma\delta$T 细胞的刺激”部分所述，富集来自 $Il17a^{+/+}$TcrdBinder3 小鼠 (CD45.2) 脾脏的 $\gamma\delta$T 细胞。根据制造商说明，使用 CellTrace Violet (CTV) (Thermo Fisher Scientific) 标记富集细胞，并通过流式细胞术确认标记情况。通过流式细胞术定量富集细胞中 $\gamma\delta$T 细胞的频率，并将 $1 \times 10^5$ 个 $\gamma\delta$T 细胞经静脉转移至 WT (CD45.1) 或 $Il17a^{-/-}$ 小鼠体内。转移后 8 或 23 天采集小鼠，并通过流式细胞术分析 CTV 的稀释情况。
流式细胞术染色试剂 针对 CD3 (17A2, 目录号 100236, RRID: AB_2561456; 目录号 564010, RRID: AB_2738540; 目录号 100241, RRID: AB_2563945)、Ly6C (HK1.4, 目录号 128033, RRID: AB_2562351; 1G7.G10, 目录号 130-102-207, RRID: AB_2660032)、CD19 (6D5, 目录号 115512, RRID: AB_313647; REA749, 目录号 130-112-038, RRID: AB_2655832)、CD11c (N418, 目录号 117310, RRID: AB_313779; 目录号 130-122-016, RRID: AB_2783919)、TCR$\beta$ (H57-597, 目录号 109212, RRID: AB_313435; REA318, 目录号 130-120-289, RRID: AB_2752053)、TCR$\gamma\delta$ (GL3, 目录号 118116, RRID: AB_1731813; 目录号 118124, RRID: AB_11204423; 目录号 118105, RRID: AB_313829)、CD4 (GK1.5, 目录号 100412, RRID: AB_312697; 目录号 100414, RRID: AB_312699; 目录号 100433, RRID: AB_893330)、CD8$\alpha$ (53-6.7, 目录号 100744,
RRID: AB_2562609), Ter119 (Ter119, 目录号 116212, RRID: AB_313713), CD122 (TM- β1, 目录号 562960, RRID: AB_2737918; 目录号 62- 1222- 82, RRID: AB_2762652; 目录号 123209, RRID: AB_940615), CD27 (LG.7F9, 目录号 416- 0271- 80, RRID: AB_2925677), CCR6 (REA277, 目录号 130- 103- 816, RRID: AB_2655942), Ki67 (SolA15, 目录号 47- 5698- 82, RRID: AB_2688065), TCR Vγ4 (UC310A6, 目录号 137703, RRID: AB_10569563), TCR Vγ1 (2.11, 目录号 141112, RRID: AB_2750517; 目录号 141109, RRID: AB_ 2750498), TCR Vδ4 (GL2, 目录号 134905, RRID: AB_1877234), TCR Vδ6.3 (C504.17C, 目录号 154803, RRID: AB_2728218), CD24 (M1/69, 目录号 101813, RRID: AB_439715; 目录号 101831, RRID: AB_2563894), CD73 (TY/11.8, 目录号 127223, RRID: AB_ 2716102; QA20A48, 目录号 101703, RRID: AB_2941372), CD44 (IM7, 目录号 103019, RRID: AB_493682), CD25
(PC61, 目录号 102037, RRID: AB_11125760), CD69 (QA17A41, 目录号 164203, RRID: AB_2936560), CD45.1 (A20, 目录号 110725, RRID: AB_ 893347), CD45.2 (REA1223, 目录号 130- 124- 080, RRID: AB_ 2811590), T- bet (4B10, 目录号 644823, RRID: AB_2561760; 目录号 644809, RRID: AB_2028583), RORγt (B2D, 目录号 17- 6981- 80, RRID: AB_2573253), IFNγ (REA638, 目录号 130- 123- 283, RRID: AB_2819467; XMG1.2, 目录号 505807, RRID: AB_315401), 以及 IL- 17A (TC11- 18H10.1, 目录号 130- 103- 007, RRID: AB_2660785; 目录号 506915, RRID: AB_536017) 购自 BioLegend, BD Biosciences, Miltenyi Biotec 或 Thermo Fisher Scientific。抗链霉亲和素抗体 (3A20.2, 目录号 410504, RRID: AB_2571915) 购自 BioLegend。所有抗体和染色试剂均按照制造商指定的稀释度使用，或通过实验确定。
流式细胞术 小鼠脾脏组织、淋巴结 (LNs) 和胸腺经采集，通过 70- μm 细胞筛过滤切碎以获得单细胞悬液。在使用 IL17RA-链霉亲和素进行染色时，将 APC 偶联的链霉亲和素以 1:2 的摩尔比添加到双链霉亲和素标签重组 IL17RA 中。链霉亲和素分 4 次逐步添加，每次添加后在冰上孵育 10 分钟。细胞在 96 孔板中预先与 10 μl 的 dasatinib (20 nM) 在 37°C 下孵育 12 分钟，随后与 10 μl 的 IL17RA-链霉亲和素混合物（包含 28 ng/μl 链霉亲和素标签 IL17RA 和 20 ng/μl 链霉亲和素的 PBS 溶液）在室温下孵育 1.5 小时，每 15 分钟通过轻敲平板进行温和混合。用 2% FCS/PBS 洗涤后，用表面抗体对细胞进行染色。在使用 IL17RA- 异二聚体 (dextramer) 进行染色时，将 APC 偶联的链霉亲和素异二聚体 (FinaBio) 以 1 分子 IL17RA 对 2 分子链霉亲和素的摩尔比添加到重组 IL17RA 中。随后的染色步骤与上述 IL17RA-链霉亲和素的操作相同。为了使用 IL17RA- 多聚体 (multimer) 检测 IL17RA 特异性 T 细胞，先用 APC 或 APC-Cy7/APC-Vio770 偶联的抗 CD11c, CD19, TCRβ, Ter119 和 CD4 (仅限胸腺) 抗体对细胞进行染色，随后使用抗 APC 微珠 (Miltenyi Biotec) 进行磁力剔除。剔除后，细胞在 96 孔板中与 20 nM dasatinib 溶液在 37°C 下孵育 12 分钟，随后与 10 至 20 μl 的 IL17RA-多聚体混合物（包含 0.1 μg/μl 链霉亲和素标签-IL17RA 和 0.2 μg/μl streptactin 多聚体 (IBA Lifesciences) 的 PBS 溶液）在室温下孵育 1.5 小时，每 15 分钟通过轻敲平板进行温和混合。用 2%FCS/PBS 洗涤后，用表面
抗体以及抗链霉亲和素 PE 抗体 (3A20.2, BioLegend) 在冰上孵育 30 min。根据制造商的说明，使用 7- 氨基- 锕丁诺明 D (7- AAD) (Thermo Fisher Scientific)、适用于 405- nm 激发光的 Live/Dead 可固定水蓝色死细胞染色试剂盒 (Thermo Fisher Scientific) 或可固定生存染料 eFluor780 (eBioscience) 检测死细胞，并将其从后续分析中排除。我们注意到，当样本通过分选仪运行时，IL17RA 多聚体染色的信噪比最高，这可能是由于去除了
由于剪切力可能导致非特异性结合的多聚体解离。因此，在大多数多聚体染色实验中，样本都经过了“模拟分选”（mock sorting）。为此，在染色后，将包含所有淋巴细胞的宽门内细胞进行分选、收集并再次分析。为了对 IL17RA multimer+ 细胞进行细胞内染色，分选出的 IL17RA multimer+ 细胞用 10 mM 脱硫生物素（desthiobiotin，IBA Lifesciences）溶液洗涤 2 次以去除多聚体。转录因子的细胞内染色是使用 Foxp3/转录因子染色试剂盒（Thermo Fisher Scientific）并按照制造商说明进行的。数据在 LSR Fortessa 或 FACSCanto II（BD Biosciences）流式细胞仪上获取，并使用 FlowJo 软件 v10.10（BD Biosciences）进行分析。细胞分选使用 FACSAria III 和 FACSAria Fusion 细胞分选仪（BD Biosciences）完成。
Trav13- 4- dv7 mRNA 的细胞内染色使用 PrimeFlow RNA Assay 试剂盒（Thermo Fisher Scientific）并按照制造商说明进行，并做了微小修改。简而言之，在固定后的所有步骤中，所有试剂均使用推荐体积的 1/5，且所有孵育步骤均在 PCR 热循环仪中完成。为了特异性靶向 Trav13- 4- dv7，使用了包含覆盖 Trav13- 4- dv7 mRNA（GenBank: M26299）116- 至 344- bp 区域寡核苷酸的 1 型探针（Assay ID: VP7DPMJ）。
细胞因子产生分析 细胞在含有 10% FCS、100 U/ml L-谷氨酰胺、100 U/ml penicillin/streptomycin、50 μM 2- 巯基乙醇、50 ng/ml PMA（Sigma）和 1 μg/ml 离子霉素（ionomycin，Sigma）的 IMDM 培养基中，在 37°C 和 5% CO2 环境下孵育。1 小时后，加入 3 μg/ml brefeldin A（Thermo Fisher Scientific），细胞继续孵育 4 小时。孵育后，收集细胞进行表面抗体染色和活力染色，随后按照制造商说明使用 BD Cytofix/Cytoperm 试剂盒（BD Biosciences）进行细胞内染色。
单细胞 PCR 和测序 单细胞被索引分选到 96 孔 PCR 板中，每孔含有 5 μl 裂解缓冲液，其中包含 5× 第一链缓冲液（Thermo Fisher）、5.6 mM DTT、0.28% IGEPAL 和 4.4 个单位的 RNaseOUT，并储存于 –80°C。对于逆转录，在冰上解冻板后，向每孔中加入 0.45 μl 10 mM dNTP、100 ng 随机六聚体和 22 个单位的 SuperScript III。逆转录在以下条件下进行：42°C 10 分钟，25°C 10 分钟，50°C 60 分钟，以及 94°C 5 分钟。跨越 VDJ 接头的片段通过嵌套 PCR 扩增，使用之前描述的引物 (73) 和 HotStarTaq Plus DNA 聚合酶试剂盒（Qiagen）。第一轮 PCR 在 12- μl 反应混合物中进行，包含 1 μl cDNA、10× PCR 缓冲液、250 μM dNTP、1.5 mM MgCl2、每种前向引物 0.36 μM、每种反向引物 0.6 μM 和 0.6 个单位的 HotStarTaq Plus DNA 聚合酶。第二轮 PCR 在 12- μl 反应混合物中进行，包含 1 μl 第一轮 PCR 产物、10× CoralLoad PCR 缓冲液、5× Q- 溶液、250 μM dNTP、每种前向引物 0.36 μM、每种反向引物 0.6 μM 和 0.6 个单位的 HotStarTaq Plus DNA 聚合酶。PCR 启动条件为 95°C 5 分钟，随后进行 50 个循环：94°C 30 秒，62°C 1 分钟（第二轮 PCR 为 64°C），以及 72°C 1 分钟，最后在 72°C 延伸 5 分钟。PCR 产物使用 DNA Clean & Concentrator- 5 试剂盒（ZYMO research）进行纯化，并送往 Sanger 测序（Eurofins）。
BEKO 细胞的 RNA-seq 分析 使用 ZYMO Quick- RNA Microprep 试剂盒（ZYMO）分离 BEKO 细胞的总 RNA，并将其发送至 Novogene（英国）进行文库构建和测序（NovaSeq 6000 PE150）。分析按照之前描述的方法进行 (74)。
公共 scRNA-seq 数据集的视觉化 使用 Seurat 软件包 (75, 76) 对先前报道的 scRNA/VDJ-seq 数据集 (40, 47, 48) 进行分析和视觉化。
TCR 建模 使用 SWISS-MODEL (77) (https://swissmodel.expasy.org) 生成了 Vγ4Vδ7 TCR55 的结构模型，并将可变域叠加在已报道的 Vγ4Vδ10 TCR G8 晶体结构 (1ypz.pdb) (21) 上。使用 UCSF Chimera 1.17.3 和 UCSF ChimeraX (78, 79) 对模型进行可视化和标注。鉴定了 Vδ 域中 Vδ7 与 Vδ10 之间存在差异且具有溶剂可及性的残基（非疏水核心的一部分且未埋在 Vγ- Vδ 界面中）。
统计分析 统计分析使用 GraphPad Prism 9 软件进行。除非另有说明，误差线代表生物学重复的标准差 (SD)。使用双尾非配对 Student's t 检验来评估两组实验组之间一个观测参数的统计学显著性。当比较两个以上的实验组时，使用带有 Holm-Sidak 多重比较检验的非配对方差分析 (ANOVA)，或带有 Dunnett's T3 多重比较检验的 Brown-Forsythe 和 Welch ANOVA。对于图 2G 所示的散点图，使用了 Pearson 相关分析和双侧检验。
参考文献与注释
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致谢 (acKNOWleDGMeNts) 我们感谢 D. Wiest 提供的编码 T10 和 T22 的构建体；感谢 F. Wermeling, T. Willinger, A. Krueger, V. Bekiaris 和 V. Glaros 对本手稿的批判性审阅；感谢 F. Van Laethem 针对 cDNA 文库筛选进行的讨论；以及 J. Rorbach 和 K. H. Ngo 开展的未包含在手稿最终版本中的实验。我们同时感谢由 KI/SLL 支持的 Biomedicum 流式细胞术核心设施（卡罗林斯卡学院）、人类疾病与免疫发现设施（芝加哥大学）以及细胞术与抗体技术设施（芝加哥大学）提供的细胞分选和分析服务。资金支持：本研究得到了瑞典研究委员会（grants 2021- 01468 和 2025- 02610 给 T. Kreslavsky, 2021- 01723 给 L.H., 以及 2022- 04147 给 E.B.）；癌症基金会 Cancerfonden（grants CAN 2018/710 和 21 1602 Pj 给 T. Kreslavsky）；儿童癌症基金会 Barncancerfonden（grants PR2021- 0117 和 PR2023- 0091 给 T. Kreslavsky）；Radiumhemmets 研究基金会（grants 211192 和 231233 给 T. Kreslavsky）；Knut and Alice Wallenberg 基金会（KAW 2024.0097 给 T. Kreslavsky 作为共同申请人）；Hypothesis 基金（T. Kreslavsky）；德国科学基金会 (DFG grants 490846870- TRR355/1 给 A.W. 和 T.R., grant 532695030 给 T.R., grant 395236335 给 T. Krey 和 T.H.W., 以及 stipend DU 1964/1- 1 给 J.D.)；以及中国国家留学基金会 (China Scholarship Council)（stipend 给 Y.Y.）。作者贡献：J.D. 制作了 T 细胞杂交瘤，构建了 cDNA 文库，并完成了图 1 中显示的大部分实验。K.Y. 完成了大部分其他实验，并指导了 A.K.，后者完成了图 3 中显示的 TCR 诱变实验。F.M. 和 V.Z. 贡献了图 5 和 6 中显示的实验。S.K. 和 T. Krey 产生了重组 IL17RA 蛋白，并进行了未包含在手稿最终版本中的实验。N.F. 完成了所有涉及 TCR Tg 小鼠的实验。Y.Y. 贡献了多个质粒的克隆、图 1 中部分实验以及许多动物实验。A.D. 和 V.M.
进行了 TCR55 结构建模并设计了 Vδ7/Vδ10 嵌合体。L.V. 和 T.H.W. 在发表前提供了 scRNA/VDJ-seq 数据集并培育了 TCR Tg 小鼠。A.B.、I.R.L.、E.B. 和 L.H. 产生了可溶性 TCR 并进行了表面等离子体共振实验。T.J.R. 提供了 Il17ra–/– 小鼠。K.H. 提供了 cDNA 库制备和筛选方面的专业知识。T.R. 和 A.W. 提供了 Il17ra–/– 和 Il17a–/–Il17f–/– 小鼠初步表征的材料以及 IL17/IL17R 生物学方面的专业知识。J.K. 生成并提供了 16.2c11 sFT 报告细胞、BEKO 细胞，以及 1A1 和 1B1 TCR 编码构建体，并提供了报告实验和 γδT 细胞生物学方面的专业知识。T. Kreslavsky 提出了该项目，监督了研究并撰写了初稿。所有作者均审读并编辑了该手稿。利益冲突：J.K. 是 Repertoire Immune Medicines 的员工和股东。其余作者声明不存在利益冲突。数据、代码和材料可用性：大体 RNA-seq 数据已提交至基因表达综合数据库 (GEO)，登录代码为 GSE292182。本研究中使用的公开 scRNA/VDJ-seq 数据集获取自 GEO（登录代码 GSE225036、GSE222454 和 GSE262064）。评估本文结论所需的所有其他数据均见于正文或补充材料。本研究中未生成新代码。本研究中使用的报告细胞系 16.2c11 可由 J.K. 提供，需由 Repertoire Immune Medicines 与学术及非商业科学组织签署材料转移协议，用于科学目的及重复本研究。本研究中产生的所有其他材料和新动物系可根据请求提供，无需签署材料转移协议。许可信息：版权所有 © 2026 作者，保留部分权利；独家许可方为 美国科学促进会 (AAAS)。对原美国政府作品不主张权利。https://www.science.org/about/science-licenses-journal-article-reuse。本研究全部或部分由瑞典研究委员会 (2021-01468, 2021-01723, 2022-04147, 和 2025-02610) 以及德国研究基金会 (395236335, 532695030, 和 490846870-TRR355/1) 资助。作者将根据 CC BY 公开版权许可协议提供作者接受稿 (AAM) 版本。
补充材料 science.org/doi/10.1126/science.adx9264 图 S1 至 S18；表 S1；数据 S1；MDAR 可重复性检查清单
10.1126/science.adx9264
2025 年 4 月 11 日提交；2026 年 2 月 5 日重新提交；2026 年 4 月 29 日接收
追踪圣海伦娜岛获释非洲人的起源
Xueye Wang†, Judy Watson†, Helena Bennett, Andrew Pearson, Geoff M. Nowell, Joanne Peterkin, Kate Robson Brown, Alistair Pike, Jason Laffoon, Vicky M. Oelze, Hannes Schroeder
引言：跨大西洋奴隶贸易强制迁移了 12.5 million 名非洲人，但大多数人的地理起源和生命史仍然未知。恢复这些被抹去的历史片段是后代社区和学者的优先事项。在圣海伦娜岛，一项由社区主导的计划致力于恢复并纪念该岛获释非洲人的生活——这些人是从非法奴隶船上获救并被带到该岛的，其中许多人在抵达后不久便去世，并被埋葬在两处无标记的墓地中。
基本原理：虽然历史资料可能会记录沿海的登船港口，但很少记录内陆起源或早年的迁徙情况。结合更广泛的社区主导计划，我们使用了锶同位素 (87Sr/86Sr) 分析和概率空间指派，以及档案和可获取的古 DNA 证据，来重建圣海伦娜岛获释非洲人的地理起源和早年迁徙，为当地关于纪念、伦理管理和重新埋葬的讨论提供信息。
结果：我们报告了来自 152 人的 193 份牙釉质 87Sr/86Sr 测量值。由于牙釉质在童年和青春期形成，并吸收当地饮食中的锶，因此它保留了早年居住地的地球化学记录。所有个体的 87Sr/86Sr 比率均远高于圣海伦娜岛的基准线，证实他们并非在岛上出生。数值范围之广表明其非洲起源具有多样性，包括在离散背景中罕见报道的高放射性特征。
为了确定他们可能的故乡，我们将每个 87Sr/86Sr 比率与撒哈拉以南的锶同位素图谱 (isoscape) 相对比，生成概率性的起源估计。将这些结果与档案和先前发表的古 DNA 数据相结合，进一步限定了起源：虽然
[[IMG_XXXX]] 87Sr/86Sr 分析与同位素图谱建模
圣海伦娜岛获释非洲人的多样化故乡与早年迁徙。来自 152 人的锶同位素比率，通过非洲同位素图谱解读并结合历史和古 DNA 证据限定，表明其起源多样。大多数可能来自西中非的近海地区，但有相当数量的人显示出指向深层内陆起源的特征，意味着经历了数百公里的强制迁移。高分辨率的牙内剖面记录了童年时期的迁徙。
大多数个体可能来自西中非的沿海或近海地区，而其他人似乎起源于更深远的内陆，这意味着在登船之前经历了数百至数千公里的强制迁移。
通过比较童年早期和晚期形成牙齿中的 87Sr/86Sr 特征，并且对于一小部分样本，使用高分辨率激光剥离技术追踪单颗牙齿上的变化，我们可以窥见登船前在非洲内部的移动情况。对于大多数人来说，信号保持一致，表明他们在童年和青春期早期一直留在同一地区。然而，在少数个体中，特征发生了剧烈变化，表明在童年时期发生了重新定居和迁徙，在某些情况下，这发生在到达海岸线之前的数年。
结论：本研究证明了将锶同位素分析与基于同位素景观 (isoscape) 的归属分析、历史记录以及现有的古 DNA 数据相结合，可以精确地确定人类遗骸的来源，并还原强制迁移的痕迹（包括童年时期的迁移）。在社区参与的框架下，研究结果为当地关于纪念、潜在遣返以及人类遗骸护理的讨论提供了参考。在本案例中，推断出的来源多样性凸显了遣返的复杂性，并促成了 2022 年在圣海伦娜岛通过公开仪式重新安葬遗骸的决定。更广泛地说，我们的研究表明，整合多条证据线索如何支持在离散背景下，就祖先遗骸做出基于伦理且由社区主导的决策。
*通讯作者。电子邮件：hschroeder@ sund. ku. dk (H.S.); voelze@ ucsc. edu (V.M.O.) †这些作者对本工作做出了相等贡献。引用本文请注明：X. Wang et al., Science 393, eaeb3661 (2026). DOI: 10.1126/science.aeb3661
底层地质结构
全文及作者所属机构列表： https://doi.org/10.1126/ science.aeb3661
M2 磨牙 (~3-7 岁)
M3 磨牙 (~9-14 岁)
概率
追踪圣海伦娜岛获释非洲人的起源
Xueye Wang1,2†, Judy Watson3†, Helena Bennett4, Andrew Pearson5, Geoff M. Nowell6, Joanne Peterkin6, Kate Robson Brown3, Alistair Pike7, Jason Laffoon8, Vicky M. Oelze2, Hannes Schroeder9,10
在19世纪中期，圣海伦娜岛成为了由英国皇家海军从非法奴隶船上“解救”出的非洲人的关键接收点。在约 27,000 名登岛者中，约 8000 人在抵达后不久死亡并被就地埋葬。结合一项更广泛的社区主导的纪念活动，我们分析了 152 人的牙釉质锶同位素 (87Sr/86Sr) 数据，包括高分辨率的牙内分布剖面，以确定可能的起源并推断登船前的强迫移动。基于同位素景观 (Isoscape) 的概率分配，结合历史证据和已发表的古 DNA 数据，将原籍地限定在从中非沿海到深远内陆的区域，揭示了有时始于童年时期的长距离移动。通过精确定位来源地，这些数据为当地关于护理和潜在遣返的决定提供了信息，突显了回归的复杂性，并最终支持在圣海伦娜岛进行重新安葬。
跨大西洋奴隶贸易是历史上规模最大且影响最深远的强迫迁移事件之一，将超过 12.5 million 非洲人运送到大西洋彼岸，据估计有超过 1.8 million 人在“中间航程”中死亡 (1)。档案研究揭示了主要趋势，包括 17 和 18 世纪的强化、非洲沿海地区相对重要性的转移，以及被俘者的性别和年龄构成的变化 (2, 3)。然而，许多个体的精确地理起源仍然难以重建。跨大西洋奴隶贸易数据库记录了登船港和下船港 (1)，但沿海运输点往往吸引来自广阔集水区的被俘者。古 DNA (aDNA) 研究正开始为个体起源提供新线索 (4–7)，但解析精细尺度的地理起源仍然具有挑战性。在本研究中，我们利用锶同位素分析来帮助填补这一空白，并为那些被跨大西洋奴隶贸易强迫迁移的人群的多样化起源提供见解。
圣海伦娜岛位于南大西洋中部，在跨大西洋奴隶贸易的最后几十年中发挥了关键作用（图 1A）。在 1807 年《废除奴隶贸易法》出台后，该岛成为了皇家海军西非分队的海上中转站，该分队的任务是在非洲海岸拦截从事人口贩卖的奴隶船。被拦截的船只随后被带到塞拉利昂、开普殖民地或圣海伦娜岛的副海军法院接受审判 (8)。因此，圣海伦娜岛的角色从一个海上中转站转变为获释非洲人的存放地。
1中国成都，四川大学考古科学中心。 2美国加利福尼亚州圣克鲁兹，加州大学圣克鲁兹分校人类学系。 3英国布里斯托尔，布里斯托尔大学考古与人类学系。 4圣海伦娜岛，Jamestown，Mainstreet，Broadway House，圣海伦娜国家信托基金会。 5英国 Kemble，Cotswold Archaeology。 6英国达勒姆，达勒姆大学地球科学系。 7英国南安普敦，南安普敦大学考古系。 8荷兰莱顿，莱顿大学考古学院。 9丹麦哥本哈根，哥本哈根大学健康与医学科学学院 Globe 研究所。 10丹麦哥本哈根，哥本哈根大学人文学院考古学院。 *通讯作者。电子邮件：hschroeder@ sund. ku. dk (H.S.); voelze@ ucsc. edu (V.M.O.) †这些作者对本工作贡献相同。
档案记录显示，在 1840 和 1863 年之间，圣海伦娜岛接收了 26,866 名非洲人 (1)。大多数人是从中非西部的港口出发的，较少部分源自西非和东南非（图 1 和数据 S1）。这些人中的大多数并未在岛上长期停留，随后被重新安置在南非或英国在加勒比地区和南美洲的殖民地 (8, 9)。然而，许多人在抵达时营养不良且健康状况糟糕，据估计有 8000 人在抵达圣海伦娜岛后不久死亡 (9)。他们的遗骸被埋葬在岛北侧鲁珀特山谷 (Rupert’s Valley) 的两处无名墓地中 (8, 9)。
2007 和 2008 年，在建设圣海伦娜岛首个商业机场相关的考古挖掘中，在鲁珀特山谷的两处大型墓地中发现了 325 人的关节连接遗骸，以及来自未知数量个体的额外离散人体遗骸 (9)（图 S1 和补充文本 S3）。位置和埋葬环境表明，这些坟墓与 1840 年至 1860 年代初在岛上死亡的获释非洲人有关。在这一时期，获释非洲人安置所 (Liberated African Establishment) 同时收容数百人，为他们提供基本的住所、食物和医疗护理 (8)。
在这些发现之后，当地利益相关者和国际专家就如何最好地研究、纪念和安置这些遗骸进行了随时间演进的讨论。这些努力最终促使 Liberated African Advisory Committee (LAAC) 于 2016 年在圣海伦娜国家信托基金会 (St Helena National Trust) 的支持下成立。LAAC 致力于恢复关于获释非洲人的来源及其生存经历的知识，指导人体遗骸及相关随葬品的伦理处置和最终重新埋葬，并倡导在该遗址建立一座纪念与解说中心。作为这些更广泛且不断演进的努力的一部分，我们对 152 个体进行了锶同位素分析，将这些结果与先前发表的 aDNA (7) 和历史证据 (1, 8) 相结合，以完善对其地理来源的理解，并评估此类证据在多大程度上能为有关其遗骸潜在遣返的讨论提供信息。
锶同位素 (87Sr/86Sr) 分析已成为考古学中识别移民的一种宝贵方法，包括在跨大西洋非洲奴隶贸易背景下的强迫移民 (10–17)。人体牙釉质中的 87Sr/86Sr 比值主要反映了个体在牙釉质形成期（即童年和青少年时期；补充文本 S4）所生活地区的底层地质情况 (18)。鉴于非洲广泛分布的古前寒武纪岩层及其相应的高 87Sr/86Sr 比值 (19, 20)，该方法在识别非洲离散人群中的第一代被奴役非洲人方面尤为有效 (11, 13, 16, 21)。然而，精准定位他们的确切来源要困难得多，因为多种地理位置可能出现相似的同位素特征，且缺乏来自非洲的合适参考数据 (12)。空间分配建模的最新进展 (22, 23)，以及撒哈拉以南非洲大规模生物可利用锶同位素图 (isoscape) 的开发 (19)，现在为更准确地估算跨大西洋奴隶贸易期间被俘非洲人的地理来源提供了重要基础。
通过地理分配建模 (24) 和已发表的锶同位素景观图 (19)，我们根据 152 名获释非洲人的牙釉质 87Sr/86Sr 比值，估算了他们最可能的来源地。通过将这些基于同位素的分配结果与历史证据以及先前发表的部分个体 aDNA 数据 (7) 相结合，我们进一步细化了潜在的故乡，凸显了结合多线证据的价值。此外，我们分析了 41 人的成形早晚牙齿对（例如前臼齿和第三磨牙），以重建他们在登船前的活动轨迹。对于 10 个人，我们还利用激光剥离多接收电感耦合
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被俘人数
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图 1. 历史背景。(A) 地图显示了圣海伦娜岛的位置以及被带到圣海伦娜岛的获释非洲人的非洲启运港（1840–1863）；圆圈大小表示估计人数。底图来自 Natural Earth (https://www.naturalearthdata.com)。(B) 按启运港划分的在圣海伦娜岛登陆的获释非洲人数（1840–1863）。数据源自跨大西洋奴隶贸易数据库 (data S1) (1)。
耦合等离子体质谱法 (LA-MC-ICP-MS) 来揭示牙齿形成期间的个体内部迁移模式。综合来看，这些分析阐明了关于被奴役非洲人贸易中难以重建的两个方面：个体的可能原籍地及其在启运前的强迫迁移。
圣海伦娜岛获释非洲人的原籍 圣海伦娜岛获释非洲人的原籍可能十分多样，尽管历史记录表明，绝大多数人来自中非西部，较少数量来自贝宁湾和东南非的基利马内港 (Fig. 1)。跨大西洋奴隶贸易数据库的数据表明，在 1840 到 1863 年间被运送到圣海伦娜岛的被俘者中，>90% 运自中非西部的 11 个沿海港口，包括安哥拉中部的本格韦拉、诺沃雷东多和基孔博，以及北部的卢安达和安布里斯港 (Fig. 1B 和 data S1)。只有两艘船从中非以外的港口启运——即莫桑比克和贝宁湾——分别仅占运往圣海伦娜岛被俘总人数的 2 和 1.3% (1)。圣海伦娜岛副海军法院的数据进一步支持了这一点，该数据揭示了大多数被英国皇家海军拦截并带到圣海伦娜岛的船只是在中非西部海岸被截获的 (8)。
中非西部
安布里斯
卢安达
本格韦拉
东南非
基利马内
遗传学证据进一步支持了历史数据：对来自鲁珀特谷 (Rupert’s Valley) 的 20 个个体进行的 aDNA 分析显示，他们与现今加蓬和安哥拉北部的种群具有亲缘关系，同时也显示出相当大的多样性，表明他们并非源自单一的族群或种群 (7)。这些结果与岛上英国皇家海军人员的目击描述一致，他们报告被俘者中使用了多种语言，包括刚果语和本格韦拉方言 (25)。这些结果也与来自古巴、安哥拉和巴西档案的历史证据一致，该证据表明在 1831 到 1855 年间从中非港口运出的被俘者中，约 72% 原产于安哥拉和刚果河流域的三个语言组 (26, 27) (supplementary text S2)。综合这些多方面的证据，有助于缩小圣海伦娜岛获释非洲人的可能原籍范围；然而，他们具体原产于何处仍不确定。
刚果河
锶同位素确认原籍多样性 来自 152 个个体的 193 份样本的 87Sr/86Sr 结果显示出广泛的数值范围，从 0.71278 到 0.77254 (data S2)。绝大多数个体 (152 人中的 116 人) 落在 0.712 到 0.730 之间，
刚果北部
卡宾达
科安扎河
1840 1841 1842 1843 1844 1846 1847 1848 1849 1850 1857 1859 1860 1861 1862 1863
年份
500 1000 1500 2000 2500 3000
其余个体的 $^{87}\text{Sr}/^{86}\text{Sr}$ 比值超过 0.730，表明他们在具有高放射源基岩的地区生长。相比之下，来自圣海伦娜岛的 3 个现代微小动物牙釉质样本的 $^{87}\text{Sr}/^{86}\text{Sr}$ 比值明显较低，范围在 0.70783 和 0.70832 之间（图 2A 和数据 S3），反映了该岛年轻的火山地质特征以及大量的海洋锶输入 (28)。所有分析个体所表现出的 $^{87}\text{Sr}/^{86}\text{Sr}$ 比值均显著高于当地基准值，证实了其非本地起源，而数值的广泛分布则表明其起源具有高度多样性，这与档案证据一致。与其他与奴隶贸易相关的殖民时期遗址相比，圣海伦娜岛的获释非洲人表现出最高的一组 $^{87}\text{Sr}/^{86}\text{Sr}$ 比值（图 S2 和数据 S4）。非洲离散群体中唯一具有类似数值范围的另一个遗址是巴西里约热内卢的 Pretos Novos 墓地 (13)，该墓地用于埋葬抵达后不久便去世的被奴役非洲人。
同位素图谱建模约束撒哈拉以南非洲的可能起源地
为了进一步研究这些个体的地理起源，我们结合最近发布的撒哈拉以南非洲锶同位素图谱 (19, 24)，利用个体牙釉质 $^{87}\text{Sr}/^{86}\text{Sr}$ 数据进行了基于同位素的地理归属分析。数据集被分为 10 组，间隔为 0.005（图 2A），每组的代表性个体被绘制在图上以说明总体趋势（图 2B 和图 S3）。$^{87}\text{Sr}/^{86}\text{Sr}$ 比值在 0.710 和 0.730 之间的个体可能来自广泛的潜在地点，反映出该区间内有限的地理分辨率；然而，在较高数值时的预测准确度有所提高。Group 1 (n = 11) 最有可能起源于中非西部沿海或喀麦隆以北地区。Groups 2 to 4 (n = 137) 构成了数据集的最大部分，表明其起源广泛分布于中非西部。Group 2 涵盖该地区的大部分区域，包括安哥拉西北部，whereas group 3 表现出类似的分布，但在赤道以北的概率较低。In group 4, 起源于喀麦隆以北的可能性降低，而起源于现今安哥拉的可能性更强。对于 $^{87}\text{Sr}/^{86}\text{Sr}$ 值 >0.730 的个体，我们的建模提供了更精细的预测。Group 5 (n = 25) 与安哥拉的相关性最强，在刚果民主共和国 (DRC) 的概率较低。Group 6 (n = 11) 局限于安哥拉中部的一个高度特定区域，whereas individuals in groups 7 to 9 (n = 10) 可能起源于南部非洲各地的分散内陆地区，包括现今的安哥拉、纳米比亚、博茨瓦纳、 4,
贝宁湾， 地点未指定
未指定
马由姆巴 (Mayumba) 罗安哥 (Loango)
基孔博 (Quicombo) 新雷东多 (Novo Redondo)
非洲，港口未指定 中西非及 圣海伦娜岛，港口未指定
图 2. 地理归属建模结果。(A) 埋葬在圣海伦娜岛 Rupert's Valley 的获救非洲人的牙釉质 87Sr/86Sr 比率直方图，附有核密度覆盖图以及来自现代微动物群的局部生物可利用基线。(B) 基于牙釉质 87Sr/86Sr 测量值和已发表的锶同位素分布图 (19) 为撒哈拉以南非洲各个体进行的归一化概率分配。图中为 (A) 中 10 个 87Sr/86Sr 分组中的每个分组显示了一个代表个体。地图聚焦于中非（完整范围见图 S3）；较高比率组（组 7 至 10）延伸至中非和东南部非洲。橙色虚线标记了距离海岸约 200 和 400 km 的近似距离。标记为 # 符号的个体同时具有 87Sr/86Sr 和 aDNA 数据 (7)。阴影越深表示来源的可能性越高。
赞比亚、津巴布韦和马拉威。值得注意的是，一名具有最高 87Sr/86Sr 比率的青少年（个体 476）指向现今津巴布韦的区域为其最可能的来源地。
整合历史、同位素和遗传证据 整合历史、同位素和遗传证据为精炼圣海伦娜岛获救非洲人的可能故乡提供了一个强大的框架。档案资料确定了登船港口和相关的民族语言群体，而锶同位素和 aDNA 则提供了独立证据来测试并缩小这些历史限制。在之前发表过 aDNA 数据的 20 个个体中 (7)，有 15 个在本研究中也进行了 87Sr/86Sr 分析（图 S1），从而实现了更具体的地理归属。
个体 289 是一名具有牙齿修饰、在约 26 至 35 岁时去世的成年男性，他阐明了这种方法（图 3A）。仅凭其 87Sr/86Sr 值就与非洲多个地区相匹配，包括西非、中非西部和刚果盆地，以及南非和东非。当我们随后使用历史证据 (1) 来限制这些基于同位素的概率时，我们可以排除大部分西非和东非，从而大幅缩小可能的故乡范围。aDNA 提供了额外的独立限制，将其可能的来源进一步缩小到现今加蓬南部和安哥拉北部的区域（图 3A）(7)。
对于那些具有高放射性 87Sr/86Sr 值（组 4 至 9）的个体，同位素、遗传和历史证据的结合使其能够精确地定位到安哥拉境内的特定区域，特别是对于组 6 至 9 的个体，其可能的来源可缩小到极小区域（图 3B）。对于具有较常见 87Sr/86Sr 值（组 2 和 3）的个体，我们可以排除大陆上的许多地区，并将其最可能的故乡限制在安哥拉和加蓬之间的区域（图 2B 和 3B）。总的来说，这些结果证明了整合多条证据线如何系统地约束不确定性，从而为 19 世纪奴隶贸易期间被捕个体的地理来源和强迫迁移描绘出一幅更清晰的图景。
尽管 aDNA 是重建祖先关系的强大工具，但在来源地判定方面存在一些局限性 (4, 7, 29–31)。首先，遗传亲缘关系反映的是祖先来源和群体历史，而非个体的出生地或童年居住地。其次，在撒哈拉以南非洲，来源地推断较为复杂，因为极高的遗传多样性和强烈的群体亚结构 (32) 与不均匀且不完整的参考数据集相交——特别是对于像刚果盆地这样代表性不足的地区 (7, 30)。第三，大多数分析依赖于现今的参考群体，考虑到长期的迁徙、冲突、强迫流离失所和社会重组的历史 (30, 31)，以及许多群体跨越现代国家边界或保持流动状态 (30)，这可能无法准确捕捉到跨大西洋奴隶贸易时期的群体结构。在我们的数据集中，这些
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图 3. 通过整合 87Sr/86Sr、历史记录和 aDNA 证据来精炼个体的地理起源。(A) 个体 289（第 2 组）展示了起源估算的渐进式约束，分别使用了（左）仅 87Sr/86Sr 证据、（中）87Sr/86Sr 和历史证据 (1)，以及（右）结合 87Sr/86Sr、历史和 aDNA 证据 (7)。(B) 对具有 aDNA 数据的个体在 87Sr/86Sr 组中应用的归一化概率分配，采用了相同的顺序过滤框架。颜色较深表示起源的相对可能性较高；灰色区域被历史和/或遗传证据排除。橙色虚线标出距离海岸约 200 和 400 km 的近似距离。
这些挑战因已公布 aDNA 数据的个体数量有限而进一步加剧，强调了需要更广泛的采样以构建更完整的图景。在这种背景下，增加锶同位素证据——特别是通过基于同位素图谱 (isoscape) 的分配进行解读，并与历史记录进行三角验证时——有助于在遗传数据能够解决的范围之外，进一步缩小可能的起源区域。
奴隶贸易深入非洲内陆 锶同位素结果还表明，虽然大多数个体（第 1 至 3 组）来自距离海岸几百公里以内的地区，但有几个个体（在第 4 至 10 组中）可能起源于更遥远的内陆，如安哥拉、津巴布韦或南部非洲的其他内陆地区（图 2B）。这与历史证据一致，历史证据表明，在古巴、巴西和安哥拉的奴隶登记册中出现的大多数获救非洲人可能起源于距离海岸不超过 400 km 的地区 (27)（图 S4 及补充文本 S2）。同时，这些结果呼应了目击者和自传式描述，表明一些被俘虏者在到达沿海贸易港口之前，被迫在陆地上长途跋涉 (25, 33)。这些结果为关于跨大西洋奴隶贸易内陆延伸范围的长期争论提供了贡献 (27)。虽然一些学者认为大多数被俘虏者来自相对靠近海岸的地区 (34)，但其他人指出，随着贸易的加强，奴隶贸易的地理范围逐渐向内陆扩张 (35, 36)。综合来看，我们的结果表明圣海伦娜岛呈现出一种更微妙的模式：虽然大多数人可能起源于沿海或近海地区，
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但有几个个体在登船前经历了显著更长距离的强迫迁移。
早年迁移的信号 对 41 个个体的早发育齿和晚发育齿中的 87Sr/86Sr 比率进行分析，为他们在登船并被运送到圣海伦娜岛之前的童年时期发生的迁移提供了直接证据。对于大多数个体而言，配对牙齿中相似的 87Sr/86Sr 比率表明其在童年和青春期早期一直居住在同一地区（图 4A），这意味着任何随后的迁移发生在晚发育牙釉质矿化之后（即约 13 至 14 岁之后）。然而，有 10 个个体在早发育齿和晚发育齿的 87Sr/86Sr 比率之间显示出显著差异 (>0.002)，表明在童年或青春期早期发生了迁移。类似的个体迁移模式在其他被奴役人群中已有记载——例如在加勒比地区 (12, 14)——这表明强迫迁移通常在到达海岸之前很久就已开始。在这些个体中，有 5 人的 87Sr/86Sr 比率偏移超过 0.005，且晚发育齿一致显示出较低的比率，这或许反映了向沿海地区的移动。
人类牙釉质在童年时期递增形成且不会重塑 (18)。因此，牙釉质中的 87Sr/86Sr 反映了牙齿形成期间的当地环境，它整合了数周至数月的饮食和水分输入，而非记录单一时刻 (18)（补充文本 S4）。因此，整体分析提供了童年居住地的平均信号，而高分辨率激光剥蚀采样则可以检测到单颗牙齿在生长期间的转变
0.7420
0.7370
0.7320
87Sr/86Sr
87Sr/86Sr
0.7270
0.7220
0.7170
0.7120
具有牙齿修饰的个体 当地生物有效 87Sr/86Sr 范围 不具有牙齿修饰的个体
0.7070
个体 217
个体 242
个体 315
个体 316
个体 316
个体 331
个体 214
大鼠
M1 M2 M3 前臼齿 人类遗骸 女性 男性 兔子 大鼠 未鉴定 动物遗骸
B C 个体 242 ♂ 成年
0.7350
0.7300
0.7250
0.7200
0.7150
0 100 200 300 400 500
激光剥离剖面（从牙尖到牙颈）
图 4. 童年迁移的证据。(A) 来自圣海伦娜岛 Rupert’s Valley 的 41 名获释非洲人的成对牙齿 87Sr/86Sr 比率，对比了早期发育和晚期发育的牙齿。 (B) 来自原位 LA-MC-ICP-MS 的牙内 87Sr/86Sr 剖面（来自 10 个个体的 11 个牙釉质截面；个体 242 包括 M2 和 M3；数据 S5）。(C) 基于早期发育（M2）和晚期发育（M3）牙齿的个体 242 的归一化概率分配，这两颗牙齿显示出该样本组中观察到的最大同位素偏差。较深的阴影表示来源的相对可能性更高；灰色区域由历史证据排除。橙色虚线标志着距离海岸约 200 和 400 km 的距离。
(37–39)。为了更好地限定时间，我们对来自 10 个个体的 11 颗牙齿沿牙釉质生长轴进行了原位 LA-MC-ICP-MS 分析。六个个体在整个生长序列中显示出近乎恒定的值，这与早年居住地的稳定性一致（图 4B）。相比之下，三个个体（206, 316, 和 343）显示出明显的牙内偏移，包括与牙釉质形成期间一次或多次迁移相一致的峰值变化（图 4B 和图 S5），为早年流离失所提供了更高分辨率的洞察。
一名在 19 至 25 岁之间死亡的成年男性（242）阐明了结合牙间和牙内同位素方法如何帮助限定迁移发生的具体时间。他的第二磨牙和第三磨牙（M2 和 M3）在“整体”值上存在差异（图 4A），但每颗牙齿在形成期间的牙冠内显示出稳定的数值（图 4B）。这种模式最符合在 M2 牙冠完成之后但在 M3 牙冠形成开始之前的居住地变更，对应于在 $\sim$7 至 9 岁时迁移 (40)。基于同位素图谱（Isoscape）的分配进一步表明，其童年早期起源于安哥拉内陆，随后居住在较低 87Sr/86Sr 值的海岸地区，靠近可能的登船港口（图 4C）。综上，这些结果为跨大西洋奴隶贸易中儿童贩卖的时间提供了罕见的限定，并为大西洋登船前的强迫迁移提供了一个时间分辨率更高的窗口。
对纪念与遣返的启示 我们的研究表明，当通过基于同位素图谱的分配进行解释，并结合历史和
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遗传证据可以显著缩小被跨大西洋奴隶贸易强制迁移个体的可能原籍区域。这种细化原籍地来源的能力，对于目前关于离散背景下的人类遗骸是否以及如何归还，以及哪些形式的证据在引导此类决定中最具参考价值的讨论具有直接影响 (41–43)。由于被解放的非洲人本身无法对参与本研究表示同意，因此本研究的伦理基础建立在以下方面：(i) 获得圣海伦娜岛政府（包括当地社区的选举代表）的正式托管许可；(ii) 通过 LAAC 建立的社区监督；以及 (iii) 与当地利益相关者的持续接触。
与此同时，我们记录的广泛原籍地范围凸显了离散背景下归还工作的一个核心挑战：即使原籍地可以被细化，个体可能也来自多个且相距甚远的地区，导致难以确定单一的归还目的地。对于鲁珀特谷 (Rupert’s Valley) 的样本集，圣海伦娜岛的社区咨询因此同时聚焦于科学能为确定原籍地做出什么贡献，以及如何最好地确保体面的护理与纪念。尽管这些人被称为“被解放的非洲人”，但没有证据表明他们曾有机会返回其非洲故土，且尝试联系潜在原籍国的努力并未导致持续的接触。因此，将遗骸重新埋葬在圣海伦娜岛的决定是通过一个由政府发起的、由 LAAC 领导并指导的流程制定的。
Ind. 384
Ind. 361
Rabbit 1
Ind. 393
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Ind. 372
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Ind. 508
通过社区咨询，并在 2020 年 (44) 获得纪念计划总体方案批准后正式确定。这一过程最终促成了 2022 年在岛上对遗骸进行的庄重重新安葬。
从更广泛的层面来看，圣海伦娜岛的案例凸显了这样一个问题：决定在岛上重新安葬遗骸，而非将返回非洲大陆视为唯一可能的结果，这引发了关于离散身份、社区能动性，以及非洲离散遗骸遣返与重新安葬的重要探讨。它表明，与非洲的联系以及对“家”的概念——进而延伸到关于回归的偏好——是复杂、多样且依赖于具体语境的 (42, 45–47)。在这种背景下，我们的研究证明了通过整合同位素、遗传学和历史证据，可以比任何单一证据线索更精确地细化来源地，同时也承认仍存在的不确定性。这些方法并非旨在确定一个唯一的回归目的地，而是提供了一个实证框架，以支持在知情的情况下由社区主导地决定关于纪念和潜在遣返的方案。
材料与方法 社区参与、咨询与批准 围绕鲁珀特谷 (Rupert’s Valley) 被解放非洲人遗骸群的参与活动持续了十多年，并随着研究的深入而演进。初步讨论于 2012 年在作为 EUROTAST 项目 (2011–2015) 一部分而进行的实地考察期间举行，参与者包括当地社区成员、圣海伦娜岛国家信托基金会以及圣海伦娜岛政府代表。经过这些咨询，圣海伦娜岛政府批准了采样、同位素分析和 aDNA 分析 (补充文本 S1)。
随着当地治理结构的建立，社区参与活动得以延续。2016 年底，在圣海伦娜岛国家信托基金会的支持下成立了 LAAC，旨在指导关于遗骸研究和重新安葬的纪念活动、伦理关怀和决策。随着管理计划的制定（包括纪念计划总体方案 (44) 中提出的方案），作者团队成员与 LAAC 成员及其他当地利益相关者保持对话。该方案建议在鲁珀特谷建立一座纪念碑、一个现场解读中心，并将挖掘出的遗骸及相关随葬品重新安葬。
2020, 11 月，我们在圣海伦娜岛与当地利益相关者和社区成员共同举办了一场研讨会，分享 EUROTAST 项目的阶段性发现，并共同考虑鲁珀特谷遗骸的后续处理步骤。研讨会结合了 EUROTAST 团队关于 aDNA 和锶同位素结果的简短演示，以及由当地参与者主导的开放式讨论。参与者提出了问题，提供了阐释，并明确了关于体面关怀、纪念以及遗骸未来处理（包括重新安葬和遣返可行性）的优先事项。这些由当地引导的讨论，结合在圣海伦娜岛开展的更广泛的公众咨询过程，决定了在 2022 年的一场公开仪式上将遗骸庄重地重新安葬在岛上。
历史估计 人口统计估计源自跨大西洋奴隶贸易数据库 (www.slavevoyages.org/voyage/database; 访问日期 2025 年 3 月 22 日)。查询记录时将圣海伦娜岛设为主登陆地，并将时间范围限制在 1840–1863 年；结果以单个年份作为行分组导出。
年龄与性别评估 骨骼年龄和性别估计采用了此前已发表的评估结果 (9)，这些结果是根据既定方案 (48, 49) 对骨盆和颅骨形态进行分析得出的。对于具有 aDNA 数据的个体，通过 X/Y 读数比率 (50) 推断出的遗传性别判定 (7) 被用作独立检查，且与骨骼评估完全一致。缺乏足够骨骼保存情况或遗传数据的个体被分类为无法鉴定。
抽样策略 我们选择了来自 152 人的 193 份牙釉质样本进行 87Sr/86Sr 分析，其中包括 41 人的配对牙齿。被抽样的个体包括 96 名男性（84 名确定；12 名可能）、23 名女性（10 名确定；13 名可能）以及 33 名性别不明者，且绝大多数为成年人（n = 111；约 18 至 45 岁），其中 41 人年龄 ≤18 岁，114 人有牙齿修饰（数据 S2）。当地生物可利用的 87Sr/86Sr 范围是根据在圣海伦娜岛 Rupert’s Valley 挖掘区周围约 1 英里内采集的三颗现代微型动物门牙（一只大鼠，两只兔子）估算而出的。
由于牙釉质记录了特定牙齿形成窗口期（51）的童年居住地，我们优先抽样了前臼齿（n = 106）和第三磨牙（M3；n = 70），第二磨牙（M2；n = 14）和第一磨牙（M1；n = 2）的样本量较少。牙釉质形成的大致时间跨度为：M1 为 0 至 3 岁，M2 为约 2.5 至 7/8 岁，前臼齿为约 2.5 至 6/8 岁，M3 为约 8/9 至 13/14 岁（40, 52）。对于配对牙齿分析，大多数情况使用了前臼齿-M3 组合（34/41）；当无法获取前臼齿或 M3 时，则分析替代配对（M1-M2，M2-M3 或前臼齿-M2）（n = 7）。为了评估牙齿内部的变异性，使用 LA-MC-ICP-MS 为来自 10 人的 11 颗牙齿生成了高分辨率的原位 87Sr/86Sr 剖面图。
抽样过程对破坏性极小：对于基于溶液的 87Sr/86Sr 测量，从牙冠上取下少量牙釉质碎片并在分析过程中完全溶解；LA-MC-ICP-MS 分析则在切片牙齿上原位进行。因此，仅剩下极少量的残留物，由少量小型牙釉质碎片组成，这些碎片将在本研究发表后，根据圣海伦娜岛政府授予的许可（补充文本 S1）被送回圣海伦娜岛重新埋葬。
样本制备 所有牙齿在抽样前均拍摄了照片。牙釉质抽样遵循既定方案（53）。工具在样本之间经过超声清洗（5% Decon-90，5 分钟），用 Milli-Q 水冲洗并干燥。为了尽量减少表面污染，使用碳化钨钻头去除了外层约 100 μm 的牙釉质。使用两次约平行（间隔 2 至 4 mm）且与颈缘垂直的切口取下牙釉质碎片；在某些情况下，需要进行第三次切口。碎片经过进一步清理，以去除任何附着的牙本质以及变质/与裂缝相关的牙釉质，直到仅剩致密的内核牙釉质；保存状况较差的样本被剔除。清理后的牙釉质被转移至预先清洗并贴标签的微离心管中，用于消解和锶分离。
用于 LA-MC-ICP-MS 分析的牙釉质样本通过使用配备金刚石嵌入刀片的旋转工具，从牙尖到牙颈切割出楔形切片进行制备。切片的定位为薄边面向牙本质，厚边与外部牙釉质表面对齐。由于牙釉质固有的脆性，部分切片在制备过程中发生断裂，导致无法在所有案例中恢复完整的从牙尖到牙颈的横截面。
基于溶液的 MC-ICP-MS 分析
锶同位素的 MC-ICP-MS 分析在英国达勒姆大学地球科学系的洁净实验室中完成。牙釉质在 500 μl 3 M HNO3 中、75° 至 100°C 下过夜溶解，并按照既定方案 (54) 使用 Sr-Spec 树脂纯化 Sr。在测量前对样本进行预筛，以将 Sr 浓度调整至一致的光束强度。87Sr/86Sr 比率在 Thermo Fisher Neptune MC-ICP-MS 上进行测量，样本之间使用 3 M HNO3 冲洗约 30 s。结果经过同量异位素干扰、质量分馏和仪器漂移校正。平均程序空白值为 11 pg，相对于牙釉质样本的锶浓度可忽略不计。所有结果均归一化至 NIST SRM 987 的 87Sr/86Sr 值 0.710250 (54, 55)，分析不确定度不超过 ±0.00002 (2σ)。
高分辨率 LA-MC-ICP-MS 分析 原位 $^{87}\text{Sr}/^{86}\text{Sr}$ 剖面是在英国南安普敦大学使用 New Wave UP193FX 激光器耦合 Thermo Fisher Neptune MC-ICP-MS 生成的。尽管其外部精度低于基于溶液的测量方法 (56, 57)，但 LA-MC-ICP-MS 提供了亚毫米级的空间分辨率，适用于评估牙齿内部的同位素变异性，并已广泛应用于迁移研究 (37, 39, 58)。在经过预烧蚀以去除表面物质且避开牙本质后，沿牙尖至牙颈的截面分析牙釉质。典型条件为 8 至 10 Hz 的重复频率、90% 的激光能量以及 150-$\mu\text{m}$ 的光斑尺寸。同位素比值使用 NIST SRM 610 (59) 以及一个由球磨、灰化牛长骨组成的基质匹配内部二级标准品进行校准和修正。对于采用两种方法分析的个体，LA-MC-ICP-MS 的 $^{87}\text{Sr}/^{86}\text{Sr}$ 值与基于溶液的 MC-ICP-MS 测量结果一致，支持了牙齿内部剖面的可靠性（图 S6）。在个体 389 和 343 中，牙颈缘最后的四个或五个点被排除在图表和解读之外，因为该区域的牙釉质矿化程度较低，更容易与发生改变的牙本质混合 (60)。
人类 $^{87}\text{Sr}/^{86}\text{Sr}$ 比值的地理归属建模 为了估算地理起源概率，我们使用了一份已发表的撒哈拉以南非洲锶同位素景观图，该图提供了通过使用无穷小折刀法 (infinitesimal jackknife method) 进行随机森林回归得出的 $^{87}\text{Sr}/^{86}\text{Sr}$ 平均值及相关的标准误差 (19)。地理归属分析使用 R 语言包 “AssignR” (pdRaster 函数) 中实现的连续表面框架进行 (24)。对于每个个体，将所得的概率表面通过用每个单元格值除以最大概率来进行归一化，从而实现个体间的比较。
参考文献与注释
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(2026); https://doi.org/10.5281/zenodo.19605943.
致谢 我们感谢圣海伦娜岛社区、圣海伦娜岛政府、圣海伦娜岛国家信托基金会以及圣海伦娜岛研究机构为本研究提供的便利。我们特别感谢 R. Cairns-Wicks 和 LAAC 的成员，感谢他们为纪念和缅怀圣海伦娜岛获释非洲人所提供的支持和持续努力，这些非洲人无法就其遗骸作为本研究的一部分被分析而给予同意。我们还感谢 M. T. P. Gilbert 和三位匿名审稿人对本手稿早期版本提出的 thoughtful 且具有建设性的意见。资金来源：本项目由第七次欧洲框架计划 (FP7) 下的玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里行动 (grant 290344) 和 Webster 基金会资助。作者贡献：H.S., H.B., K.R.B., 和 A.Pi. 设计了研究并获得了资金。J.W., G.M.N., 和 J.P. 生成了数据。
X.W. 和 J.W. 分析了数据。X.W., J.W., H.B., A.Pe., J.L., V.M.O., H.S., 和 A.Pi. 解释了数据。K.R.B., A.Pe., V.M.O., H.S., 和 A.Pi. 监督了工作。X.W., J.W., 和 H.S. 撰写了手稿，J.L., V.M.O., H.B., A.Pe., 及其余作者提供了建议。竞争利益：作者声明不存在竞争利益。数据、代码和材料可用性：支持本研究结果的所有数据均包含在正文和补充材料中。本研究未产生新材料。所有分析均使用公开软件进行。用于数据分析和图表生成的 R 脚本已存档在 Zenodo (61) 并在 GitHub (https:// github.com/XY2025- Archaeology/StHelena_isotope) 上提供。有关相关记录和材料的访问请求可向圣海伦娜岛国家信托基金会的 H.B. 提出。许可信息：版权 © 2026 作者，保留部分权利；独家许可方为美国科学促进会。不对原美国政府作品主张权利。https://www.science.org/about/science- licenses- journal- article- reuse
补充材料 science.org/doi/10.1126/science.aeb3661 补充正文；图 S1 至 S7；参考文献 (62–102)；MDAR 可重复性清单； 数据 S1 至 S5
10.1126/science.aeb3661
2025 年 8 月 11 日提交；2026 年 5 月 27 日接收
树突状细胞控制癌症中三级淋巴结构的形成与维持
Raphaël Mattiuz 等
引言：淋巴聚集体在包括肿瘤在内的慢性炎症病灶中累积。它们是由产生于非淋巴组织的先天性和适应性免疫细胞组成的有组织集群，被认为作为淋巴细胞招募、(再)激活和维持的局部枢纽。最成熟的聚集体能够发育出具有生发中心的 T 细胞区和 B 细胞区，被称为三级淋巴结构 (TLSs)。TLSs 的存在与癌症中更好的预后以及对免疫检查点阻断 (ICB) 治疗的反应相关，这使得这些结构成为极具吸引力的治疗靶点。
原理：先前的研究已将由成熟树突状细胞 (DCs) 表达的 DC-LAMP 确定为人类 TLSs 的特异性标志物。研究还发现，在小鼠肺部感染模型中，包括 DCs 和其他髓系群体在内的 CD11c+ 细胞是维持 TLS 持久性所必需的。然而，主要组织相容性复合体 I 类 (MHC-I) 和 MHC-II 抗原呈递（包括特定树突状细胞亚群的交叉呈递）在癌症中对 TLS 的启动、维持和功能的确切贡献仍然未知。鉴于 TLS 的存在与 ICB 反应之间强烈的相关性，定义癌症中 TLSs 的细胞和分子驱动因素目前是一项关键的优先任务。
结果：为了探讨 DCs 在 TLS 形成和维持中的作用，我们建立了一种非小细胞肺癌 (NSCLC) 小鼠模型 (KP-HELLO-2)，该模型可形成成熟的 TLSs，其中包含具有生发中心的 B 细胞滤泡，以及含有 T 滤泡辅助 (TFH) 细胞和 TCF1+PD-1+ 前体耗竭 CD8+ T (TPEX) 细胞的 T 细胞区。我们表明，在肿瘤发展的早期阶段，TLS 的形成依赖于干扰素-γ (IFN-γ) 驱动的 1 型常规树突状细胞 (cDC1s) 的成熟、cDC1s 向肿瘤引流淋巴结 (tdLNs) 的迁移、WDFY4 依赖性的交叉呈递，以及最终将激活的 T 细胞招募到肿瘤部位。
随着肿瘤的进展，TLS 的维持变得不再依赖于 T 细胞从 tdLNs 出离，这与 cDC1 向 tdLNs 迁移的显著减少相一致。相反，成熟的 cDC1s 在肿瘤内 CCR7 配体富集的基质枢纽中累积。值得注意的是，在 TLSs 形成后，定时清除 cDC1s 或阻止它们向这些基质枢纽迁移，会破坏 TLS 的功能结构和维持。我们发现，cDC1 介导的向 CD4+ 和 CD8+ T 细胞同时进行 MHC-II 和 MHC-I 抗原呈递，以及完整的 CD40 信号传导，对于维持 TLSs、保留 TFH 细胞池、生发中心形成、肿瘤特异性免疫球蛋白 G (IgG) 产生以及 TPEX 细胞的分化至关重要。此外，使用 FLT3L-Fc 或 CD40 激动剂扩增或激活 DCs 可扩增 TLSs。通过对多种人类肿瘤进行空间转录组学和多重成像分析，我们证实表达高水平 CCR7 的成熟 DCs 在靠近 CCL19+ 基质枢纽的 TLSs 中累积，并与 TFH 细胞、TPEX 细胞和 B 细胞相互作用。此外，
成熟 cDC1s 通过向 CD4+ 和 CD8+ T 细胞同时进行抗原呈递来协调 TLS 的形成和维持。(1) TLS 的形成需要 cDC1s 的成熟及其向 tdLNs 的迁移，随后 (2) 将启动的 T 细胞招募到肿瘤微环境中。随着肿瘤的进展，(3) cDC1s 向肿瘤内 CCR7 配体富集基质枢纽的迁移对于 TLS 的维持变得至关重要。这一过程 (4) 依赖于向 CD4+ 和 CD8+ T 细胞同时进行抗原呈递，以维持 TFH 细胞池并驱动 TPEX 细胞分化，并且 (5) 支持生发中心 (GC) 的形成和肿瘤特异性 IgG 的产生。
成熟 DC 或 TLS 的存在与非小细胞肺癌 (NSCLC) 的总生存期提高以及肝细胞癌的无病生存期相关。
结论：这些研究结果强调了成熟 cDC1 在建立和维持功能性 TLS 中的关键作用，其主要通过在肿瘤病灶内同时向 CD4+ 和 CD8+ T 细胞呈递 MHC-II 和 MHC-I 抗原来实现。此外，它们进一步突显了针对 cDC1 的治疗策略在增强 TLS 功能和提高癌症患者抗肿瘤免疫力方面的潜力。
全文及作者所属机构列表： https://doi.org/10.1126/ science.ady1678
树突状细胞控制癌症中三级淋巴结构的形成与维持
Raphaël Mattiuz1,2, Jesse Boumelha1,2†, Emmanouil Aerakis1,2,3†, Jessica Le Berichel1,2†, Pauline Hamon1,2†, Laszlo Halasz1,2, Abishek Vaidya1,2,4, Brian Y. Soong1,2, Emir Radkevich1,2,5, Hye Mi Kim6, Matthew D. Park1,2, Romain Donne1,2,7,8, Leanna Troncoso1,2, Rachel A. Kaplan1,2, Clotilde Hennequin1,2, Isaias Hernández- Verdin9, Lucía López10, Frederika Rentzeperis1,2, Darwin D’Souza1,2,5, Medard Ernest Kaiza6, Ian P. MacFawn6,11, Meriem Belabed1,2, Guillaume Mestrallet1,2,8,12, Etienne Humblin1,2, Raphaël Merand1,2,5, Samarth Hegde1,2, Jean- Christophe Lone13, Giorgio Ioannou1,2, Sinem Ozbey1,2, Igor Figueiredo1,2, Alexander Tepper1,2,14, Hajer Merarda1,2, Nadine Serhan1,2, Maximilian M. Schaefer1,2, Jinping An15, Ray A. Ohara16, Erika Nemeth1,2, Simon Goldstein1,2, Amanda M. Reid1,2, Moataz Noureddine4,17, Alexandra Tabachnikova1,2, Giulia Maria Piperno10, Maria Tsoumakidou3, Jalal Ahmed1,2, Alexandros D. Polydorides18, Nina Bhardwaj1,2,8,12, Amaia Lujambio1,2,7,8, Zhihong Chen1,2,5, Edgar Gonzalez Kozlova1,2, Seunghee Kim- Schulze1,2,5, Joshua D. Brody1,2, Michael Schotsaert1,2,13,17, Christine Moussion19, Sacha Gnjatic1,2, Vladimir Roudko1,2,5, Florent Ginhoux20, Kenneth M. Murphy16, Catherine Sautès- Fridman9, Wolf Herman Fridman9, Brian D. Brown1,2,14, Thomas U. Marron1,2,12,21, Federica Benvenuti10, Jason G. Cyster15, Hélène Salmon22, Tullia C. Bruno6, Nikhil S. Joshi23, Alice O. Kamphorst1,2,8,24,25, Miriam Merad1,2,5*
三级淋巴结构 (TlSs) 与免疫治疗反应相关，但控制其形成和维持的机制尚不清楚。利用人类肿瘤的空间转录组学和多重成像，我们发现 CCR7+ 成熟树突状细胞 (DCs) 在 TlSs 中积累。在一种能形成成熟 TlSs 的小鼠非小细胞肺癌模型中，我们表明 TlS 的早期发育需要干扰素- γ (IFN- γ) 驱动的 1 型常规树突状细胞 (cDC1) 成熟、迁移至肿瘤引流淋巴结 (tdlNs) 以及 T 细胞的招募。随着肿瘤进展，TlSs 的持久存在独立于 tdlN T 细胞的流出，这与 cDC1 在肿瘤内 CCl19 间质枢纽中的积累相一致。在这些枢纽中，cDC1 与主要组织相容性复合体 I 类 (MHC- I) 和 II 类 (MHC- II) 的协同抗原呈递，以及 CD40 信号传导，共同维持了 TlS、T 滤泡辅助 (TFH) 细胞池、生发中心和肿瘤特异性免疫球蛋白 G (IgG)。这些发现强调了局部成熟的 cDC1 是 TlS 的关键协调者，并且是增强抗肿瘤 TlS 功能的潜在靶点。
三级淋巴结构 (TLSs) 是组织有序的免疫聚集体，类似于典型的二级淋巴器官，包含分别组织在 T 细胞区和 B 细胞滤泡中的幼稚及抗原经验 T 细胞和 B 细胞 (1, 2)。除少数例外情况外，TLSs 丰富的肿瘤患者具有更好的预后，并对免疫检查点阻断 (ICB) 治疗表现出增强的反应 (3–7)，这表明 TLSs 可能有助于幼稚 T 细胞的启动，或在 ICB 治疗后使有效的 T 细胞反应重新激活 (8)。
之前的研究报道，非小细胞肺癌 (NSCLC) 中的 TLSs 与 DC- LAMP+ 成熟树突状细胞 (DCs) 相关 (5)。然而，抗原呈递在维持……
而 TLS 的功能仍然不清楚 (8)。常规树突状细胞 (cDCs) 专门负责启动和教育 T 细胞 (9)。在人类和小鼠中已鉴定出两种 cDCs 亚群，包括 1 型 cDCs (cDC1s)，它们擅长将细胞相关抗原（交叉）呈递给 CD8+ 和 CD4+ T 细胞，以及 cDC2s，它们在向 CD4+ T 细胞呈递可溶性蛋白抗原方面最为强大 (9, 10)。cDC1s 和 cDC2s 在捕捉抗原后都会上调类似的基因表达程序，从而成为专门调节 T 细胞的成熟 DCs (11)。通过对多种人类肿瘤进行空间转录组学和多重成像分析，我们发现病理标注的 TLSs 由处于成熟分子状态的 cDCs 以及 T 滤泡辅助 (TFH) 细胞、TCF1+PD-1+ 前体耗竭 CD8+ T (TPEX) 细胞和 B 细胞组成。综合这些结果，促使我们探索 cDCs 对肿瘤病灶中 TLSs 形成和维持的贡献。
鉴于 cDCs 既能在肿瘤引流淋巴结 (tdLNs) 中启动 T 细胞，又能在肿瘤部位重新激活 T 细胞，因此开发能够条件性操纵 cDCs 的模型，以剖析它们在这些不同组织部位的具体贡献变得至关重要。为了解决这个问题，我们构建了一种能够稳定形成成熟 TLSs 的肿瘤模型，并制定了在肿瘤发展后不同时间点对 cDCs 进行组成性或条件性清除或基因操纵的策略。在这项工作中，我们证明成熟 DCs，特别是成熟 cDC1s，在肿瘤中 TLS 的形成、维持和功能中起核心作用。
结果 成熟 DCs 在人类 TLSs 中富集，并在多种肿瘤类型中与 TFH 细胞和 B 细胞相互作用 成熟 DCs 表现出一种离散的细胞程序，该程序在 cDC1s 和 cDC2s 捕捉肿瘤病灶中的细胞碎片后会上调，并反映了 cDCs 与 T 细胞相互作用的状态 (11, 12)。为了绘制人类肿瘤内 cDC 亚群和状态的空间分布图，我们对人类非小细胞肺癌 (NSCLC)、肝细胞癌 (HCC)、结直肠癌 (CRC) 和透明细胞肾细胞癌 (ccRCC) 进行了空间转录组学 (Visium SD, 10x Genomics) 分析 (13)。我们发现，在病理标注的瘤内 TLSs 中，成熟 DC (CCR7, FSCN1, CD40, CD80, CCL17, 和 CCL22)、cDC1 (XCR1, CLNK, 和 CADM1)、TFH 细胞 (CXCL13, TCF7, ICOS, CD40LG, 和 PDCD1)、PD-1+ CD8+ T 细胞 (PDCD1, CD8A, 和 CD8B)、初Наи T 细胞 (IL7R, CCR7, 和 TCF7)、记忆 B 细胞 (CD19 和 BANK1) 以及生发中心 B 细胞 (LMO2, MEF2B, 和 RGS13) 的分子程序显著富集，但在肿瘤核心区域则不富集 (图 1A 和图 S1, A 至 C; https://rstudio-connect.hpc.mssm.edu/mattiuz_science2026_tls_spatial_data/)。相比之下，单核细胞和巨噬细胞的基因程序在 TLSs 内部和外部均有分布 (图 S1B)。我们还检查了与成熟 DCs 相关的基因表达通路，方法是通过表征空间映射的人类肿瘤病灶中成熟 DC 富集的 TLS 区域 (图 S1D)，或者通过单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 在 TLS 富集的 NSCLC 和 HCC 病灶中鉴定成熟 DCs (14, 15) (表 S1)。在这两项分析中，我们发现 TLS 富集病灶中的成熟 DCs 上调了主要组织相容性复合体 II 类 (MHC-II) 和 MHC-I 抗原呈递机制以及 CD40 信号通路 (图 S1, E 和 F)。
为了在单细胞水平上研究非小细胞肺癌 (NSCLC) 和肝细胞癌 (HCC) 中三级淋巴结构 (TLSs) 内部成熟树突状细胞 (DC) 的细胞相互作用，我们采用了目标空间转录组技术 (MERFISH)，对 500 个基因探针进行绘制，这些探针此前已被我们通过单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 鉴定为在肿瘤病变中高度富集 (14–16)（表 S2）。我们确认，与未成熟的对应细胞（cDC1s 和 cDC2s）相比，成熟 DC 在肿瘤内的 TLSs 中显著富集（图 1B 和图 S1G）。值得注意的是，与 cDC2s 相比，肿瘤 cDC1s 显示出更高的成熟 DC 相关基因表达（图 S1H）。由于 DC 的成熟与细胞碎片的摄取相关 (11, 12)，这表明 TLSs 内部积累了更多负载肿瘤抗原的 cDC1s。
邻近分析显示，在三级淋巴结构 (TLSs) 中，成熟 DC 紧邻（半径 30- μm 内）初始 B 细胞和 T 细胞、生发中心 B 细胞，以及 TFH 和 TPEX 细胞（图 1, C 以及附图 S1, G, I 和 J）。通过单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 发现，由 LAMP3 编码的 DC-LAMP 在非小细胞肺癌 (NSCLC) 和肝细胞癌 (HCC) 的免疫区中仅由成熟 DC 表达（附图 S1K）。利用多重成像技术，我们在蛋白质水平上证实，DC-LAMP+ 成熟 DC 和 CLEC9A+ cDC1s 在 TLSs 中富集（图 1, D，附图 S1L 和表 S3）。此外，我们鉴定出一种处于 cDC1 向成熟 DC 过渡的中间状态，该状态在 TLSs 中富集，并共表达 CLEC9A 和 DC-LAMP（附图 S1M）。我们还发现，成熟 DC 主要位于 T 细胞区或紧邻高内皮静脉 (HEVs) 的 T-B 细胞区边界，这与它们在淋巴结中的定位相似 (17)（图 1, E 以及附图 S1, N 和 O），且无论 TLSs 是否具有生发中心，其成熟 DC 的密度相似（附图 S1P）。
在铂类治疗失败的局部晚期或转移性 NSCLC 患者中，一项比较 PD-L1 阻断剂 (atezolizumab) 与化疗 (docetaxel) 的随机 2 期临床试验 (POPLAR) 报告称，PD-L1 阻断比化疗具有显著的生存获益 (18)。该队列中治疗前活检样本的批量 RNA 测序 (Bulk RNA-seq) 分析显示，经病理学家标注为 TLS 密度较高的患者表现出强烈的成熟 DC 基因特征和更优的生存结果（图 1, F 和附图 S2A）。此外，在这些患者中，成熟 DC 特征与 TLSs 组件的特征相关，包括 TFH 细胞、TPEX 细胞以及初始 B 和 T 细胞（附图 S2B 和表 S4）。这些观察结果强烈表明，成熟 DC 的富集与 TLS 的出现相关，并可作为提高生存率的预后标志物 (5)。我们在 BIONIKK 试验的治疗前活检样本中确认了这种特征相关性，该试验涵盖了 199 名接受 anti-PD-1 (nivolumab)、anti-PD-1 和 anti-CTLA4 (nivolumab 和 ipilimumab) 或 VEGFR 酪氨酸激酶抑制剂治疗的转移性肾癌患者 (19)（附图 S2C）。此外，在接受新辅助 anti-PD-1 (cemiplimab) 治疗的 HCC 患者队列中 (20)，治疗后肿瘤切除样本中 TLS 富集的患者其无病生存期有所提高，这与成熟 DC 的肿瘤浸润增加以及局部 T 细胞克隆扩增相关（图 1, G 以及附图 S2, D 和 E）。总之，这些发现强调了 TLSs 中的成熟 DC 在促进人类肿瘤对免疫检查点阻断 (ICB) 反应中的潜在关键作用，这促使我们致力于探讨成熟 DC 在肿瘤中 TLS 形成、维持和功能方面的贡献。
成熟 cDC1s 在临床前肺癌肿瘤的 TLSs 中积聚 为了研究 cDCs 在癌症 TLSs 形成和功能中的作用，我们使用了一种改良的小鼠肺腺癌 (LUAD) 细胞系，命名为 KP-HELLO- 2，该细胞系衍生自表达模型抗原 HELLO（B 细胞抗原 HEL、CD8 表位 GP33 和 CD4 表位 GP66 的新抗原融合蛋白） (22) 以及 Thy- 1.1 抗原 (CD90.1) 的 KRASLSL- G12D;Trp53fl/fl (KP) 小鼠 (21)（图 2, A）。通过静脉注射 KP-HELLO- 2 细胞，导致形成了原位肺腺癌病灶，其中含有大量具有明确 T 细胞区和
1Marc and Jennifer Lipschultz 精准免疫学研究所，西奈山医学院，纽约，纽约州，美国。2免疫学与免疫治疗系，西奈山医学院，纽约，纽约州，美国。3生物创新研究所，“亚历山大·弗莱明”生物医学科学研究中心，瓦里，希腊。4生物医学科学研究生院，西奈山医学院，纽约，纽约州，美国。5人类免疫监测中心，西奈山医学院，纽约，纽约州，美国。6肿瘤微环境中心，免疫学系，匹兹堡大学 UPMC Hillman 癌症中心，匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国。7肝癌项目，肝病科，内科学系，西奈山医学院，纽约，纽约州，美国。8Tisch 癌症中心，西奈山医学院，纽约，纽约州，美国。9免疫学、炎症、补体与癌症系，Cordeliers 研究中心，索邦大学，INSERM，巴黎市立大学，巴黎，法国。10细胞免疫学，国际遗传工程与生物技术中心 (ICGEB)，的里雅斯特，意大利。11生物学系，格罗夫城学院，格罗夫城，宾夕法尼亚州，美国。12血液学与医学肿瘤科，西奈山医学院，纽约，纽约州，美国。13GIMM，古本基安分子医学研究所及里斯本大学医学院，里斯本，葡萄牙。14Icahn 基因组学研究所，西奈山医学院，纽约，纽约州，美国。15霍华德·休斯医学研究所及微生物学与免疫学系，加州大学旧金山分校，旧金山，加利福尼亚州，美国。16病理学与免疫学系，圣路易斯华盛顿大学医学院，圣路易斯，密苏里州，美国。
17全球健康与新兴病原体研究所及微生物学系，西奈山医学院，纽约，纽约州，美国。18Henry D. Janowitz 胃肠病科，内科学系，以及病理学、分子与细胞医学系，西奈山医学院，纽约，纽约州，美国。19Genentech，南旧金山，加利福尼亚州，美国。20巴黎-萨克雷大学，Gustave Roussy，INSERM U1015，维勒茹伊夫，法国。21胸腔肿瘤研究所，西奈山医学院，纽约，纽约州，美国。22居里研究所，巴黎，法国。23免疫生物学系，耶鲁大学医学院，纽黑文，康涅狄格州，美国。24肿瘤科学系，西奈山医学院，纽约，纽约州，美国。25研究生教育系，西奈山医学院，纽约，纽约州，美国。*通讯作者。电子邮件：
miriam. merad@ mssm. edu †这些作者对这项工作贡献均等。
B 细胞区域（图 2B；附图 S3, A 至 C；以及视频 S1 和 S2），其中许多区域显示出显著的生发中心，其中包含 CD21+ 间质滤泡树突状细胞 (FDCs)，且邻近激活诱导胞苷脱氨酶 (AID)+ 生发中心 B 细胞（图 2C）。与我们在人类肿瘤病变中观察到的一致，小鼠 TLSs 中富集了生发中心 B 细胞 (B220+BCL6+)、TFH 细胞 (CD4+PD- 1+TCF1+/BCL6+) 和 TPEX 细胞 (CD8+TCF1+PD- 1+) 且彼此紧密相邻（图 2D，附图 S3D，以及表 S5），以及肿瘤抗原特异性的预转移 CD4+ T 细胞 (CD4+CD45.1- SMARTA+) 和内源性 B 细胞 (B220+HEL+)（图 2E）。此外，表达高水平 CCR7、MHC- II 和 CD86 的 DCs 在 TLSs 中聚集，并在此与 CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞和 B 细胞相互作用（图 2F）。
TLSs 与肿瘤负荷呈负相关，这表明这些结构有助于抗肿瘤免疫 (Fig. 2G)。对 Xcr1mCherry cDC1- 报告小鼠肿瘤病变的成像分析证实，与在人类癌症病变中观察到的情况一样，cDC1s (CD11c+Xcr1- mCherry+) 积聚在靠近 T 细胞和 B 细胞的 TLSs 中 (Fig. 2H)，且大多数携带肿瘤抗原 (mScarlet+) 的 cDC1s 处于成熟状态 (CD40+CD86+) (Fig. 2I 和 fig. S3E)。我们通过多重免疫荧光证实，成熟 cDC1s (F4/80−CD11b−CD11c+CD86+) 在 TLSs 中富集 (Fig. 2J)，且与 TLSs 外部相比，它们在此处表现出更多的细胞间相互作用，特别是与 TLSs 中最富集的细胞类型，包括 TFH 细胞、TPEX 细胞和生发中心 B 细胞 (fig. S3F)。我们使用 Ms4a3Cre;Rosa26lox−stop−lox- Tdt 小鼠和可诱导的 Ms4a3CreERT2; Rosa26lox−stop−lox- Tdt 小鼠——这些小鼠能够组成性或条件性地追踪单核细胞来源的细胞 (23, 24)——证实，积聚在 TLSs 中的 cDCs 是真正的、谱系决定性的 cDC1s 和 cDC2s，而非单核细胞来源的 DCs (fig. S3, G 和 H)。
为了探究 cDCs 或特定的 cDC 子集是否在 TLS 形成中发挥作用，我们将 KP- HELLO- 2 细胞注射到特异性缺乏 cDC1s 的 Xcr1- DTA 小鼠中 (fig. S3I)。我们通过将 Xcr1Cre 小鼠 (25) 与 Rosa26lox−stop−lox- DTA 小鼠杂交，以实现 XCR1+ cDC1s 的组成性缺失，同时保留 cDC2s (26, 27)。cDC1s 的缺失导致肿瘤内 TLSs 的数量和尺寸显著减少，且 TFH 细胞 (CXCR5+PD- 1+ CD4+ T 细胞)、干扰素- γ (IFN- γ+) CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞以及生发中心 B 细胞减少，并伴随肿瘤负荷增加 (Fig. 2K 和 table S6)。在将 KP- HELLO- 2 细胞注射到 cDC1- 缺陷型 Batf3−/− 小鼠中时，获得了相似的结果 (fig. S3, I 和 J)。cDC1 的缺失还对剩余淋巴聚集体的功能架构产生了重大影响，使其失去了生发中心 B 细胞、TFH 细胞和 TPEX 细胞 (fig. S3K)。此外，使用缺乏 cDC1 介导的交叉呈递能力的 Wdfy4−/− 小鼠 (28)，我们观察到 TLS 数量显著减少以及 PD- 1+ CD8+ T 细胞减少 (fig. S3L)，表明肿瘤特异性 CD8+ T 细胞的诱导受损。鉴于 cDC1 交叉呈递的作用及其与 CD8+ 和 CD4+ T 细胞的紧密相互作用，我们研究了 T 细胞是否同样是 TLS 形成所必需的。缺失 CD4+ 或 CD8+ T 细胞均导致 TLS 数量显著减少 (fig. S3M)。
在 KP 基因工程小鼠模型 (GEMM) 的原发性肺腺癌中，cDC1s 同样是肿瘤内 TLS 形成所必需的；在接种原位 Hep- 53.4 肝癌细胞的小鼠中，
B C
D
F
图 1. 成熟 DC 在多种人类癌症的 TLS 中积聚。(A) 对 NSCLC 肿瘤 (n = 2 名患者) 进行的 FFPE Visium SD 空间转录组分析。代表性 Visium SD 切片显示了病理标注的 TLS (左；比例尺，1 mm)；TLS 及边界点 (位于 TLS 之外的两层点)；以及根据 scRNA-seq 参考文献推断的成熟 DC、cDC1、TFH 细胞、PD-1+ CD8+ T 细胞和生发中心 (GC) B 细胞基因特征的热点图 (右)。(B 和 C) 对 NSCLC (n = 6 名患者及切片) 和 HCC (n = 14 名患者及 16 张切片) 肿瘤进行的 MERFISH 空间转录组分析。在 HCC 中，GC B 细胞仅在 MERSCOPE 面板 2 (n = 7 名患者及切片) 中被识别。(B) NSCLC (上) 和 HCC (下) 中 TLS 区域与非 TLS 区域中成熟 DC、cDC1 和 cDC2 种群的倍数变化。P < 0.05; P < 0.001; **P < 0.0001 (Wilcoxon 秩和检验)；柱条表示平均值。(C) 细胞邻近分析显示了 TLS 区域内成熟 DC 30 μm 范围内的免疫种群富集分值；箱线图
E
G
图表显示中位数（中心线）、四分位距（方框）以及最小至最大须线，其中代表性的 TLS 区域展示了 NSCLC [顶部；比例尺，左侧 100 μm，右侧 10 μm] 和 HCC [底部；比例尺，左侧 200 μm，右侧 10 μm] 中成熟 DC、TFH 细胞、TPEX 细胞和 B 细胞之间的相互作用。(D) 通过多重免疫组化 (MICSSS) 对 NSCLC 患者 (n = 23 patients) 中非 TLS 区域与 TLS 区域的成熟 DC (DC-LAMP+) 和 cDC1 (CLEC9A+) 密度进行定量分析；表达 DC-LAMP 的上皮细胞被排除在分析之外。P < 0.001; *P < 0.0001（配对 t 检验）；数据表示平均值 ± SEM。(E) 成熟 TLS 的代表性多重免疫荧光 (IF) 染色 (CD4, CD20, CD21, AID, Ki67, PNAd, DAPI)，并配以 NSCLC 肿瘤的连续 DC-LAMP IHC 染色。代表 14 个成熟 TLS（来自 41 名患者队列的组织微阵列）。比例尺，100 μm（概览）和 50 μm（放大）。(F) NSCLC 中的批量转录组与 TLS 注释配对 (n = 168 patients，包括来自 Genentech POPLAR 数据集的 60 名 TLSHI 患者)。Kaplan-Meier 分析比较了 TLS 阳性与 TLS 阴性患者、成熟 DC 高表达与成熟 DC 低表达患者，以及 TLS 阳性/成熟 DC 高表达患者与所有其他患者的总生存期。统计学采用对数秩 (Mantel-Cox) 检验。(G) Kaplan-Meier 分析比较了接受新辅助 PD-1 阻断治疗的 TLS 高表达与 TLS 低表达 HCC 患者 (n = 18 patients) 的无病生存期 [P = 0.0310, 对数秩 (Mantel-Cox) 检验]。
肿瘤，以及在具有原位 AKPS 结肠肿瘤的小鼠中观察到瘤周 TLS 的形成（图 S3, N 和 O）。值得注意的是，在体外捕获凋亡的 KP-HELLO-2 肿瘤细胞后生成的成熟 cDC1s，在与肿瘤球体内的纯化瘤内 T 细胞和 B 细胞共培养时，也足以在离体状态下驱动免疫聚集体的形成（图 S3P）。
cDC 上的 CCR7 和 IFN-γ 受体表达对 TLS 形成至关重要 我们随后试图研究调节肿瘤中 TLS 形成的 cDC 分子信号。利用 Visium SD 空间转录组平台对成熟 DC 富集的 TLS 斑点中的基因特征评分进行定量，我们观察到 IFN-γ 基因特征的富集（图 S3Q）。IFN-γ 受体 (IFN-γR) 信号传导可促进 cDC 的免疫原性功能及其引导有效的抗肿瘤 T 细胞反应的能力 (11, 26, 29)。为了检查 cDC 中的 IFN-γ 信号是否在 TLS 形成中发挥作用，我们培育了 cDC 区域特异性缺失 IFN-γR 的小鼠 (Zbtb46Cre;Ifngr1fl/fl mice) (图 2L)。我们发现，缺乏 IFN-γR 信号会阻止 cDC 成熟 (CD40+)，减少 TLS 形成，并增加肿瘤负荷，同时伴随肿瘤内 TFH 细胞、IFN-γ+ CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞的显著减少 (图 2L)。这促使我们鉴定局部及 tdLNs 中 IFN-γ 的来源。我们发现，IFN-γ 在担瘤肺部主要由 PD-1+ CD8+ T 细胞和 ICOS+ CD4+ T 细胞产生，在 tdLNs 中则由 T 辅助 1 (TH1) 样 (CXCR6+) 和 TFH 样 (PD-1+ICOS+) 细胞产生（图 S3R）。此外，多重免疫荧光显示，IFN-γ 在 TLSs 中主要由 TFH 细胞分泌，其次是 TPEX 细胞（图 S3S）。
CCR7 的上调是 cDC 迁移至继发淋巴器官 T 细胞区所必需的，这一过程受 T 细胞区内淋巴内皮细胞和基质细胞产生的 CCR7 配体引导 (30, 31)，有助于将携带组织抗原的 cDC 定位于一个与幼稚 T 细胞接近的位置，从而使肿瘤特异性免疫的启动成为可能。为了探究通过 CCR7 配体向继发（或三级）淋巴器官迁移的 cDC 是否有助于 TLS 的形成，我们培育了在 cDC 组分中特异性缺失 Ccr7 的小鼠 (Zbtb46Cre;Ccr7fl/fl 小鼠) (图 2M)，并使用 KP-HELLO-2 肿瘤对这些小鼠进行挑战。cDC 中 CCR7 的缺失显著破坏了 TLS 的发育，并增加了肿瘤负荷，且肿瘤中的 TFH 细胞、IFN-γ+ CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞和生发中心 B 细胞显著减少 (图 2M)。总而言之，这些结果证明，IFN-γ 驱动的成熟以及 CCR7 依赖的 cDC 向淋巴结构的迁移，有助于肺癌病灶中 TLS 的形成。
cDC1s 在局部对于 TLS 的维持是必需的 cDC 是 tdLN 中 T 细胞启动所必需的，而 T 细胞的高效启动可能有助于 TLS 的形成，但 cDC 也会在肿瘤组织内与 T 细胞相互作用，并可能在局部有助于 TLS 的维持。为了检查 TLS 的形成是依赖于 tdLN 中的 cDC 还是肿瘤部位的 cDC，我们首先使用 FTY720 抑制从 tdLN 出来的淋巴细胞外流 (32)，以此探索在 tdLN 中启动的 T 细胞对 TLS 形成的贡献。我们发现，在肿瘤植入后的前 9 天内抑制 T 细胞外流显著减少了 TLS 的形成，而 9 天后抑制 T 细胞外流对肿瘤中 TLS 的数量几乎没有影响 (图 3A)。这些结果表明，tdLN 中的 T 细胞启动对于 TLS 的形成至关重要，但对于肿瘤病灶局部 TLS 的维持并非必需，这促使我们测量与肿瘤中 TLS 形成和维持相关的免疫细胞组成的纵向变化。
肿瘤病灶的纵向分析显示，瘤内不成熟的 TLS 起源于血管或位于血管附近，并在随后的时间点随着 B 细胞滤泡和 T 细胞区的形成而演变为成熟的 TLS (图 3B)。具体而言，我们观察到在肿瘤进展过程中 TLS 的数量和规模显著增加，且 TLS 的增加在第 8 天后尤为剧烈 (图 3B)。值得注意的是，携带肿瘤相关抗原 (mScarlet+) 的成熟 cDC1s 和 cDC2s 在 tdLN 中的数量在肿瘤植入后直到第 8 天一直增加，之后它们在 tdLN 中的累积大幅减少，而转而开始在肿瘤部位局部累积 (图 3C)。肿瘤特异性 CD4+、TFH 细胞和 TH1 细胞群体随时间维持稳定 (图 3D)，而抗原经历过的 (PD-1+) 和终末耗竭的 (CD39+TCF1–PD-1+) CD8+ T 细胞在肿瘤进展过程中稳步累积 (图 3E)。在随后的时间点，与 TLS 的最大扩张期相吻合，我们还观察到 TPEX 细胞 (CD39–TCF1+PD-1+) 的大量扩张 (图 3E)，同时伴随着生发中心 B 细胞频率的显著增加以及类别转换的肿瘤特异性免疫球蛋白 G (IgG) 抗体增加 (图 3F)。总而言之，这些观察结果表明，成熟 cDC1s 和 cDC2s 在肿瘤中的累积与 TPEX 细胞的累积、生发中心 B 细胞、IgG 抗体产生以及肿瘤部位 TLS 的扩张相关，这促使我们进一步探索肿瘤浸润 cDC 在局部 TLS 维持中的作用。
为了探究 cDC 在 TLS 维持中的作用，我们构建了两种模型，分别在肿瘤植入后第 8 天开始清除整个 cDC 库或专门清除 cDC1，以允许 T 细胞的启动、从 tdLN 迁出以及在肿瘤组织中的积聚。我们使用从在 ZBTB46+ cDC 中表达白喉毒素受体 (DTR) 的小鼠 (Zbtb46- DTR) 中分离出的骨髓细胞重建了野生型 (WT) 小鼠，这使得在注射 DT 后能够选择性地清除 cDC，同时不影响同样表达 Zbtb46 的内皮细胞 (33) (图 S4A)。我们还通过将 Xcr1Cre 小鼠与 Rosa26lox−stop−lox- DTR 小鼠杂交，培育了 Xcr1- DTR 小鼠，以实现对 XCR1+ cDC1 及表达过 Xcr1 的成熟 cDC1 的定时删除，而保留 cDC2 (25–27) (图 S4A)。我们发现，在肿瘤植入后第 8 天清除整个 cDC 库或专门清除 cDC1 亚群，均能显著且程度相近地减少肿瘤组织中的 TLS 数量 (图 3G)，因此我们随后重点研究了 cDC1 在肿瘤承载小鼠中对 TLS 维持的作用。
cDC1 的清除降低了肿瘤中 TFH 细胞的频率 (图 3H)，导致生发中心消失 (图 3I)，减少了 TLS 内 CD8+ T 细胞和增殖细胞的数量，并减少了 AID+ Ki67+ 生发中心 B 细胞的数量 (图 3J) 以及肿瘤特异性 IgM 和类别转换 IgG 抗体的数量 (图 3K 和 图 S4B)。综上所述，这些结果证明 cDC1 在局部对于 TLS 的维持和功能是必需的。
为了进一步确认 cDC1 是否通过与肿瘤浸润 T 细胞的局部相互作用来促进 TLS 维持，我们在启动发生后阻断了后期的 tdLN 迁出。我们发现，尽管阻断了
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M
图 2. 成熟的 cDC1s 控制 TLS 的形成。(A) 用于产生 KP- HELLO- 2 的构建方案示意图。(B 至 H 以及 J) 野生型 (WT) 小鼠在植入后第 15 天，代表性 KP- HELLO- 2 TLS 的免疫荧光分析。(B) 使用 B220 和 CD3 对 B 细胞区和 T 细胞区进行染色。比例尺，100 μm。(C) 使用 AID, CD19, CD4, CD8, CD21, 和 Ki67 对 GC+ TLS 进行染色。代表 7 只小鼠。比例尺，50 μm。(D) TLS 区域与非 TLS 区域（通过 CD4, CD8, PD- 1, B220, 和 DAPI 染色识别 TLS）中 GC B 细胞 (B220+ BCL6+), TFH 细胞 (CD4+ PD- 1+ TCF1+/BCL6+), 以及 TPEX 细胞 (CD8+ PD- 1+ TCF1+) 的代表性图像 (CyCIF) 和密度定量分析。n = 6 只小鼠。比例尺，100 μm。P < 0.05; P < 0.01; **P < 0.001 (配对 t 检验)；条形图表示平均值。(E) 采用 CD45.1, PD- 1, 和 CD4 染色的过继转移抗原特异性 CD4 T 细胞 (SMARTA CD45.1)；采用 HEL 抗原, B220, 和 GL7 染色的内源性抗原特异性 B 细胞。代表 10 只小鼠。比例尺，100 μm。(F) 成熟 TLSs 内部成熟 DCs (CD11c+ MHC- II+ CCR7+ CD86+) 的染色，标记物为 B220, CD4, CD8, TCF1, BCL6, 和 Ki67。代表 8 只小鼠 (CyCIF)。比例尺，100 μm。(G) 植入后第 15 天，对连续切片中 TLS (染色为 CD3, B220, 和 DAPI) 和通过 H&E 评估的肿瘤区域进行的免疫荧光分析。在 WT 小鼠中，TLS 面积与肿瘤面积（占肺部面积的百分比）呈负相关 (n = 196, 汇总自 27 个独立实验)。线性回归分析，P = 0.0005。(H) 代表性图像：
D
来自 Xcr1- mCherry- Cre 小鼠的 TLS 显示 CD3 和 B220 免疫荧光，并配以 CD11c 和 mCherry 的连续 IHC 染色，以及 TLS 和非 TLS 区域中 cDC1 密度的定量分析（n = 5 只小鼠）。比例尺，100 μm。P < 0.01（配对 t 检验）；条形图表示平均值。(I) 植入后第 12 天的 cDC1 成熟状态（mScarlet+ cDC1s 中的 CD40 和 CD86 表达）（代表两组独立实验中的 13 只小鼠）。(J) TLS 和非 TLS 区域（通过 CD4, CD8, PD-1, B220 和 DAPI 染色识别）中成熟 cDC1s (F4/80− CD11b− CD11c+ CD86+) 的密度定量 (CyCIF)。n = 6 只小鼠。P < 0.01（配对 t 检验）；条形图表示平均值。(K 至 M) TLS 的免疫荧光（CD3, B220 和 DAPI；比例尺，200 μm）数量和平均大小，通过连续切片的 H&E 染色评估的肿瘤区域（比例尺，1 mm），以及第 15 天通过流式细胞术对 Xcr1- DTA 组 (n = 12 每组，代表两组独立实验；数据表示平均值 ± SEMs) (K)、Zbtb46Cre; Ifngr1fl/fl 组 (n = 10 至 11 每组，代表两组独立实验；数据表示平均值 ± SEMs) 且包含第 15 天肿瘤承载肺中 cDC1s 上 CD40 表达的流式细胞术定量 (L)，以及 Zbtb46Cre; Ccr7fl/fl 小鼠组 (n = 13 至 20 每组，合并自两组独立实验；数据表示平均值 ± SEMs) (M) 与同窝对照组的肿瘤承载肺中 TFH 细胞 (PD-1+ CXCR5+ CD4+)、GC B 细胞 (CD19+ IgD− IgM− GL7+)、IFN-γ+ CD4+ 和 CD8+ T 细胞的定量。P < 0.05; P < 0.01; P < 0.001; **P < 0.0001（非配对 t 检验）。
肿瘤植入后第 8 天的 T 细胞流出不影响 TLS 数量，而第 9 天伴随的 cDC1 耗竭显著降低了肿瘤中 TLS 的维持（图 3L）。相应地，我们发现肿瘤植入后第 8 天给予与 Fc 结构域融合的 DC 生长因子 FMS 样酪氨酸激酶 3 配体激动剂 (FLT3L-Fc)，显著增加了 cDCs 和 cDC1s 的数量（图 S4C），并使肿瘤中 TLS 的数量翻倍（图 3M）。此外，在植入不形成成熟 TLS 的亲本 KP-HELLO 肿瘤细胞的小鼠中，给予 FLT3L 倾向于增加 TLS 的形成（图 S4D）。同时，在转移性乳腺癌患者中，我们观察到 6 名患者中 1 名在 FLT3L 治疗后，与治疗前活检相比，TLS 形成有所增加（图 S4E）。综合而言，这些结果表明，肿瘤组织中 TLS 的维持和功能依赖于肿瘤浸润的成熟 cDC1s，且增强瘤内 DCs 的治疗策略可促进 TLS 的形成。与 TLS 在抗肿瘤免疫中的作用以及 cDC1s 对 TLS 维持的需求一致，肿瘤植入后第 8 天耗竭 cDC1s 显著降低了肿瘤承载小鼠的总体生存率（图 3N）。
cDC1 向 CCR7 配体富集的基质中心迁移局部控制 TLS 维持。关于 cDCs 在肿瘤植入后第 8 天后显著改变迁移轨迹，使其在肿瘤组织而非 tdLNs 中积累的观察结果表明，它们被积极招募到组织中心。为了探索促进 cDC 迁移到特定肿瘤部位的分子信号及其对局部 TLS 维持的贡献，我们使用 MERFISH 绘制了人类 NSCLC 病变中构成 TLS 的不同细胞区室的配体-受体分析图（图 4A）。我们发现，TLS 内的成熟 DCs 表达了与 CD4+ T 细胞相互作用的最高水平的配体-受体对，包括 PD-L1 (CD274), PD-L2 (PDCD1LG2), ICOSLG, CD80/86, CCR4 配体 (CCL17 和 CCL22) 以及 CD40。成熟 DCs 表达高水平的 CCR7，而我们已经
此前已经表明，CCR7 的配体之一，即 CCL19，在 ADH1B+ 癌症相关成纤维细胞 (CAFs) 和周细胞中高度表达 (16)。随后，我们使用 Visium HD 验证了配体-受体对的空间接近性 (图 S5A)。据此，对非小细胞肺癌 (NSCLC) 的空间转录组分析显示，表达 CCL19 的周细胞和 ADH1B+ CAFs 在三级淋巴结构 (TLSs) 内成熟树突状细胞 (DCs) 的附近富集 (图 S5, B 至 E)。我们通过对三名 NSCLC 患者使用 Visium HD，在单细胞分辨率下确认了 TLSs 内部 CCL19 表达细胞、基质细胞、成熟 DCs 和 T 细胞之间的密切相互作用 (图 S5F)。利用多重成像分析，我们确认在人类 NSCLC 中，TLSs 富集了产生 CCL19 的 ADHB1+ CAFs 和位于成熟 DCs 附近的 MYH11+ 周细胞 (图 4B)。同样在小鼠肿瘤中，TLSs 富集了
CCL19，且 cDCs 在 TLSs 内的 CCL19+ 区域积聚 (图 4C)。由于 CCR7 是 CCL19 的主要受体，我们研究了在 T 细胞被启动并招募到肿瘤部位后，cDC1s 中 CCR7 的缺失是否会损害肿瘤组织中 TLS 的维持。为了实现 cDC1 子集 CCR7 的时空特异性缺失，我们使用 1:1 (Xcr1- DTR CD45.2+:Ccr7−/− CD45.1+/CD45.2+) 混合骨髓细胞重建了 CD45.1+ 小鼠 (图 4D)。在肿瘤植入后第 8 天给予 DT 处理，导致
整个 CCR7 熟练的 WT cDC1 组分被清除，而剩余的 cDC1s 缺乏 CCR7 (图 S6A)。值得注意的是，在肿瘤植入后第 8 天缺失 cDC1s 的 CCR7，显著减少了肺部肿瘤中 TLSs 的数量和大小，并减少了 TFH 细胞的数量 (图 4E)。
在使用 1:1 (Zbtb46- DTR CD45.2+:Ccr7−/− CD45.1+/CD45.2+) 混合骨髓重建的小鼠中，对整个 cDC 组分进行 CCR7 缺失后，获得了类似的发现 (图 S6, A 和 B)。cDC1s 中 CCR7 的时空缺失阻止了它们在 TLSs 中的积聚，并改变了剩余淋巴聚集体的功能结构，其中生发中心 B 细胞、TFH 细胞、TPEX 细胞和初始 T 细胞均有所减少 (图 S6, C 和 D)。此外，CCR7 缺陷减少了成熟 cDC1s 的细胞相互作用 (图 S6E)，并阻止了它们向表达 CCL19 的细胞迁移 (图 S6F)。成熟 DCs 同样表达 CCL19 (图 4A 和 图 S5A)；然而，cDC1s 中 CCL19 的条件性缺失并未改变肿瘤中 TLS 的维持 (图 4F)，也未影响 CCR7+ cDC1s 和 T 细胞在荷瘤肺部的积聚 (图 S6G)。这些数据有力地表明，cDC1 迁移到 CCR7 配体富集的基质中心对于肿瘤病变中 TLS 的维持是必需的。
cDC1s 通过向 CD4+ 和 CD8+ T 细胞进行局部同步抗原递呈来协调 TLS 的维持 成熟 cDC1s 的一个主要作用是向 T 细胞递呈组织相关抗原。在 DC 组分中，已知 cDC1s 在二级淋巴器官中擅长向 CD4+ 和 CD8+ T 细胞进行细胞相关抗原的（交叉）递呈 (34, 35)。cDC1s 还被证明提供了招募 CD4+ 和 CD8+ T 细胞的关键支架，使 CD4+ T 细胞能够在 CD8+ T 细胞附近提供辅助细胞因子，从而促进它们分化为 CD8+ 效应 T 细胞，这一过程需要 cDC1s 中的 CD40 信号传导 (25, 34, 35)。为了研究 CD4+ T 细胞对 cDC1s 的 CD40 许可化是否为肿瘤中 TLS 的维持所必需，我们使用 1:1 (Xcr1- DTR:Cd40−/−) 混合骨髓细胞重建了小鼠，以便在给予 DT 处理后能够时空性地清除 CD40+ cDC1s，同时保留缺乏 CD40 的剩余 cDC1s。在肿瘤植入 8 天后给予 DT 处理，减少了 TLS 的数量和大小以及 CD8+ T 细胞的数量 (图 S7A)。
为了评估 cDC1 对 CD4+ T 细胞的持续抗原递呈是否是维持局部 TLS 的必要条件，我们使用来自 Xcr1- DTR 和 MHC- II 敲除（MHC- II–KO）小鼠的混合骨髓细胞重建小鼠，并在植入后第 8 天使用 DT 进行处理。值得注意的是，在肿瘤植入 8 天后删除 cDC1 的 MHC- II（图 S7B）显著减少了 TLS 的数量和尺寸，导致组织内 T 细胞和 B 细胞的分散（图 5A）。这还减少了 TFH 细胞、CD8+ T 细胞和 PD- 1+ CD8+ T 细胞的数量；增加了该区室中 TPEX 细胞的相对频率；并减少了肿瘤结合 IgG 抗体（图 5, B 和 C, 以及图 S7C）。采用相同的策略，我们还通过条件性删除 cDC1 的 B2m 来消除肿瘤抗原的 MHC- I 交叉递呈。在肿瘤植入 8 天后删除 MHC- I+ cDC1（图 S7B）显著减少了 TLS 的数量和尺寸，尽管程度低于删除 MHC- II+ cDC1（图 5A）。破坏
B
D F E
G
J I
M L N
C
H
K
图 3. 成熟 cDC1 在局部对于 TLS 的维持和功能至关重要。(A 至 C, G, I, J, L 和 M) TLS 的免疫荧光分析 (CD3, B220 和 DAPI 染色) 及在第 15 天或指示时间点的定量分析。(A) 在肿瘤植入后第 1 天至第 4 天，第 5 天至第 9 天，或第 10 天至第 15 天使用 FTY720 阻断 T 细胞从 tdLNs 迁出。在第 15 天进行 TLS 定量分析 (每组 n = 5 至 6，代表两次独立实验；数据表示平均值 ± SEM)。标尺，200 μm。(B 至 F) TLS 形成动力学 (每个时间点 n = 6 至 7，代表两次独立实验；数据表示平均值 ± SEM)，连续切片的 H&E 染色显示血管 (标尺，100 μm) (左)，TLS 数量和平均尺寸 (右) (B)，以及通过流式细胞术对肿瘤和 tdLNs 中免疫群体的动力学分析，包括摄取肿瘤碎片 (mScarlet+) 的 DC 百分比 (左) 及其成熟度 (CD40+ CD86+) (右) (C)。(D) CD4+ T 细胞中的肿瘤抗原特异性、T-bet+ 和 TFH (PD-1+ CXCR5+) 细胞。(E) 免疫细胞中的 CD8+ PD-1+ T 细胞，进一步细分为 CD39+ TCF1− 和 CD39− TCF1+ 群体。(F) B 细胞中的 GC B 细胞 (左) 以及在指示时间点离体结合肿瘤细胞的血清 IgG 和 IgM 动力学 (右)。(G 至 K) 在 DTR 小鼠中使用 DT 从第 8 天至第 15 天清除 DC 或 cDC1。(G) 经 DT 处理或未处理的 Zbtb46- DTR, Xcr1- DTR 和对照小鼠的 TLS 定量分析 (每组 n = 8 至 14，汇总自两次独立实验；数据表示平均值 ± SEM)。标尺，200 μm。(H) 在经 DT 处理的 Xcr1- DTR 小鼠与对照小鼠中，第 15 天负瘤肺中 CD4+ T 细胞内的 TFH 细胞定量分析 (每组 n = 14 至 25，汇总自四次独立实验；数据表示平均值 ± SEM)。(I 和 J) 经 DT 处理的 Xcr1- DTR 小鼠与对照小鼠的 GC+- TLS 染色 (AID, CD19, CD4, CD8, CD21 和 Ki67)，其中放大图描绘了 GC+- TLS 内的滤泡 DC (CD19− CD21+) 以及每张全肺切片中具有 ≥1 个 GC+- TLS 的小鼠比例 (每组 n = 3 至 7，分析了 196 个 TLS，包括 7 个 GC+- TLS) (I)。标尺，100 μm。(J) TLS 内的 AID, Ki67 和 CD8 染色，以及经 DT 处理的 Xcr1- DTR 小鼠与对照小鼠 TLS 中 CD8+ T 细胞、Ki67+ 细胞和 AID+ Ki67+ B 细胞的定量分析 (每组 n = 3，分析了 229 个 TLS；数据表示平均值 ± SEM)。标尺，100 μm。共表达 AID (绿色) 和 Ki67 (橙色) 的 GC B 细胞显示为黄色。(K) 来自幼稚小鼠、对照小鼠、Batf3−/− 小鼠以及经 DT 处理的 Xcr1- DTR 小鼠的离体血清 IgG 与肿瘤细胞的结合情况 (每组 n = 8 至 14，汇总自两次独立实验；数据表示平均值 ± SEM)。血清采集于第 15 天。(L) 从第 8 天开始使用 FTY720 处理且在第 9 天开始使用或不使用 DT 的 Xcr1- DTR 小鼠的 TLS 定量分析 (每组 n = 6 至 8；数据表示平均值 ± SEM)。标尺，200 μm。(M) 在第 8 天使用或不使用 FLT3L-Fc 处理的 WT 小鼠的 TLS 定量分析 (每组 n = 7 至 8，代表两次独立实验；数据表示平均值 ± SEM)。标尺，200 μm。[(A), (G), (H), 以及 (J) 至 (M)] P < 0.05; P < 0.01; P < 0.001; P < 0.0001 (非配对 t 检验)。(N) 经 DT 处理 (第 8 天至第 15 天) 的 Xcr1- DTR 小鼠与对照小鼠的总生存率 (每组 n = 21 至 29，汇总自三次独立实验)，所有小鼠在植入后第 15 天前均达到人道终点。**P < 0.0001 [对数秩 (Mantel-Cox) 检验]。
MHC- I 交叉呈递不影响 TFH 细胞的比例（图 5B）或肿瘤结合 IgG 抗体的比例（图 5C）。然而，与在 cDC1s 中缺失 MHC- II 时观察到的结果相似，取消 cDC1s 的 MHC- I 抗原呈递降低了 CD8+ T 细胞以及经历过抗原的 PD- 1+ CD8+ T 细胞的相对数量，并增加了该区室中 TPEX 细胞的相对频率（图 5B 和图 S7C）。由于 cDC1 对 CD4+ T 细胞的抗原呈递是维持 TLS 的必要条件，已有研究表明 CD40 激动剂可扩增患者和小鼠体内的肿瘤内 TLSs (36)。为了探究 CD40 激动剂的这种效应是否依赖于 MHC- II 呈递，我们使用 CD40 激动剂处理了携带肿瘤的对照小鼠或接受 DT 处理的 Xcr1- DTR:MHC- II–KO 小鼠（图 5D）。与对照小鼠相比，当 cDC1s 上的 MHC- II 呈递被取消时，CD40 激动剂无法扩增 TLSs，这凸显了 MHC- II 抗原呈递在 TLS 扩增中的关键作用。为了确定 cDC1 共表达 MHC- I 和 MHC- II 是否为局部 TLS 维持所必需，我们用混合骨髓重建了小鼠——50% 来自 Xcr1- DTR 小鼠，25% 来自 MHC- II–KO 小鼠，25% 来自 B2m−/− 小鼠——并在肿瘤植入后第 8 天给予 DT（图 5E）。为了确保 25% 的 WT 骨髓足以产生能够维持 TLSs 的功能性 cDC1s，我们使用 75% Xcr1- DTR 和 25% WT 骨髓重建小鼠，并在给予 DT 后观察到 TLS 数量没有显著减少（图 S7D）。至关重要的是，选择性地清除 MHC- I+ MHC- II+ cDC1s（图 S7B）显著降低了 TLS 的数量和尺寸，这表明 cDC1s 同时向 CD8+ 和 CD4+ T 细胞进行抗原呈递对于在局部维持 TLSs 至关重要（图 5F 和图 S7D）。我们无法测量对肿瘤负荷的影响，因为这些肿瘤进展迅速，在给予 DT 时已处于相当晚期的阶段。
在 cDC1s 中条件性地缺失白细胞介素- 12 (IL- 12) 或 IFN- γR 并不影响 TLS 的维持（图 S7，E 和 F），这表明 cDC1s 中完整的 IFN- γR 信号传导对于 tdLNs 中 T 细胞的高效启动以及 TLSs 的形成至关重要，但对于肿瘤中 TLSs 的维持并非必不可少。与这些结果一致，人类 NSCLC 和 HCC 肿瘤病灶中 TLS 内部的成熟 DCs 与 cDC1s 相比，显示出干扰素刺激基因 (ISGs) 的下调（图 S7G），这表明一旦 DCs 成熟，IFN- γR 信号不再控制 TLS 中的 DC-T 细胞相互作用。综上所述，我们的结果揭示，原位 cDC1 迁移至产生 CCR7 配体的基质枢纽，以及在肿瘤部位持续地向 CD4+ 和 CD8+ T 细胞共呈递肿瘤抗原，控制了 TLSs 的数量和质量，并实现了 TFH 细胞的维持、肿瘤特异性 IgG 抗体的产生以及 TPEX 细胞的分化。
讨论 通过利用多种人类肿瘤的空间转录组学和多重成像分析，以及一个能够形成成熟 TLSs 的 NSCLC 小鼠模型，我们确定了 DC 亚群 cDC1s 在 TLSs 的形成、维持和功能中的关键作用。我们表明，在肿瘤植入后的第一周内，TLS 的形成依赖于 IFN- γ 驱动的 cDC1s 成熟、它们向 tdLNs 的迁移以及随后活化 T 细胞向肿瘤部位的招募。随着肿瘤的进展，TLS 的维持不再依赖于 tdLN T 细胞的流出，而是取决于 cDC1 迁移到富含 CCR7 配体的基质枢纽、向肿瘤内 CD4+ 和 CD8+ T 细胞的持续抗原呈递以及 CD40 信号传导。这些相互作用对于维持 TFH 细胞池、形成生发中心以及产生肿瘤特异性抗体至关重要，共同维持了肿瘤微环境内 TLS 的功能和适应性免疫应答。
这些结果扩展了之前的研究，即 DC 在肿瘤相关的 TLS 中将抗原呈递给肿瘤特异性 T 细胞 (37)，并且 DC 在肠道 (38) 和病毒感染的肺部 (39, 40) 的稳态条件下控制 TLS 的维持。我们的发现与最近的观察结果一致，即新辅助瘤内注射 poly-ICLC（一种 DC 激活剂）可以在前列腺癌中诱导 TLS 和临床反应 (41)。
cDC1 能够向 CD4+ 和 CD8+ T 细胞呈递抗原，并能通过 CD40 信号由 CD4+ T 细胞许可，从而在 tdLN 中对 CD8+ T 细胞进行交叉启动，这已被证明对于最佳的抗肿瘤免疫 (25) 和抗病毒免疫反应 (34, 35) 是必需的。通过在 TLS 不再依赖于从 tdLN 招募 T 细胞的阶段耗竭 cDC1，我们证明了局部 cDC1 介导的向瘤内 CD4+ 和 CD8+ T 细胞的同时抗原呈递以及 CD40 信号，对于维持 TLS 的结构和功能至关重要。我们确认了 CD40 激动作用可扩增 TLS (36)，并进一步表明这种扩增关键取决于 cDC1 的抗原呈递。旨在增加瘤内 DC 数量并促进其激活的疗法，代表了促进 TLS 反应的最佳策略。
与淋巴结中非常相似，TLS 内部的 DC 战略性地分布在 T 细胞区或 T 区与 B 区的交界面。我们发现 TFH 细胞在生发中心形成之前就存在于 TLS 中，而耗竭 cDC1 则显著减少了 TLS 中的生发中心 B 细胞，这表明成熟 DC 与 TFH 细胞之间的相互作用有助于生发中心反应。此外，类似于在慢性病毒感染中 cDC1 通过脾脏生态位内的 MHC-I 依赖性相互作用来维持 TPEX 细胞 (42)，我们
E
图 4. 局部 cDC1 向 CCR7 配体中心迁移控制 TLS 的维持。(A) 热图显示通过 MERFISH 检测到的 NSCLC 患者 TLS 内 ADH1B+ CAF、CCL19 周围血管细胞、DC 和 T 细胞群体之间配体-受体对的相对表达量 (n = 6 名患者)。(B) 典型的 NSCLC 肿瘤 TLS 多重 IHC 染色（染色标记为 ADH1B, CCL19, CD3, CD20, DC-LAMP 和 MYH11），代表三名患者。图板 1 显示 CCL19 与 ADH1B+ 和 MYH11+ 细胞共存，图板 2 显示 CCL19 与 ADH1B+ 细胞共定位，图板 3 显示 CCL19 位于 MYH11+ 细胞周围。比例尺，200 μm（概览）和 50 μm（放大）。(C) 移植后第 15 天 WT 小鼠的 TLS 显示 CD11c, CCL19 和 DAPI 免疫荧光，并配以连续染色的 CD3, B220 和 DAPI。代表四只小鼠。比例尺，100 μm。(D) Xcr1-DTR: KO 1:1 混合骨髓嵌合体实验示意图；从肿瘤移植后第 8 天开始给予 DT 处理，导致整个 WT cDC1 库被清除，仅留下目标基因 KO 的 cDC1。(E 和 F) TLS 的免疫荧光分析（染色标记为 CD3, B220 和 DAPI），以及第 15 天 TLS 数量和平均面积的定量。(E) Xcr1-DTR 对照组与 DT 处理的 Xcr1-DTR:Ccr7−/− CD45.1.2 小鼠的比较 (每组 n = 5，代表两次独立实验；数据表示平均值 ± SEM)。比例尺，200 μm。第 15 天通过流式细胞术定量携带肿瘤肺部 CD4+ T 细胞中的 TFH 细胞。(F) 对照骨髓嵌合体与 DT 处理的 Xcr1-DTR:Ccl19−/− 小鼠的比较 (每组 n = 7 到 8；数据表示平均值 ± SEM)。P < 0.05; *P < 0.01 (未配对 t 检验)。
D
F
发现 cDC1 中 MHC-II 和 MHC-I 的缺失促进了 TPEX 细胞的积累，这表明肿瘤相关 TLS 内的 cDC1 通过直接的 MHC-I 相互作用以及通过 MHC-II 抗原呈递提供近端 CD4+ 帮助，从而促进 TPEX 细胞分化为效应 CD8+ T 细胞。这种物理相互作用可能会促进 TFH 细胞对 TPEX 细胞的帮助，包括此前建议的通过 IL-21 实现的途径 (15, 22)。为了支持这一点，我们的研究结果表明，cDC1 在 TLS 内同时与 CD4+ 和 CD8+ T 细胞进行同源相互作用，而非在不同的时空壁龛中进行。与这一观点一致，最近的研究表明，在免疫治疗后的肿瘤中，cDC1 能同时与 CD4+ 和 CD8+ T 细胞相互作用 (43)。MHC-II 呈递在抗肿瘤免疫中的重要性证实了以下证据：在临床前肿瘤模型中，ICB 反应依赖于肿瘤新抗原的 MHC-I 和 MHC-II 呈递 (44)，且 DC 向 CD4+ 和 CD8+ T 细胞同时呈递抗原的能力是过继 T 细胞疗法产生高效肿瘤反应所必需的 (45)。此外，TFH 细胞和效应 CD8+ T 细胞的克隆扩增与 HCC 患者的 ICB 反应强相关 (15)。同样，我们发现改变 TLS 的维持会影响肿瘤抗体的形成，这进一步增强了 TLS 在产生肿瘤特异性抗体中的重要性 (13)。
E F
图 5. 局部 cDC1 同时进行 MHC- I 和 MHC- II 抗原提呈控制 TLS 的维持。(A, D 和 F) TLS 的免疫荧光分析（ CD3、B220 和 DAPI 染色）以及第 15 天 TLS 数量的定量。(A 和 B) DT 处理的 Xcr1- DTR:WT 与 Xcr1- DTR:MHC- II–KO 和 Xcr1- DTR:B2m−/− 小鼠的比较（每组 n = 4 到 8，代表两次独立实验；数据表示平均值 ± SEM）。(A) 面板 1 和 2 描绘了 B 细胞和 T 细胞的分散情况（右图）。比例尺，200 μm（概览）和 100 μm（放大）。TLS 数量和平均面积取自第 15 天。(B) 第 15 天通过流式细胞术对荷瘤肺部进行的定量，包括 CD4+ T 细胞中的 TFH 细胞、免疫细胞中的 CD8+ PD- 1+ T 细胞，以及 CD8+ PD- 1+ T 细胞中的 TCF1+ 细胞。(C) 来自对照组、Xcr1- DTR:WT、Xcr1- DTR:MHC- II–KO 和经 DT 处理的 Xcr1- DTR:B2m−/− 小鼠（每组 n = 4 到 6，代表两次独立实验；数据表示平均值 ± SEM）的血清 IgG 对离体肿瘤细胞的结合情况。血清收集于第 15 天。(D) WT 处理同型对照或抗- CD40 与 DT 处理的 Xcr1- DTR:WT 处理同型对照对比 Xcr1- DTR:MHC- II–KO 处理抗- CD40 的比较（每组 n = 5 到 9；数据表示平均值 ± SEM）。(E) (1)Xcr1- DTR:(0.5)MHC- II–KO:(0.5)B2m−/− 混合骨髓嵌合体实验示意图；在肿瘤植入后第 8 天开始给予 DT，导致整个 WT MHC- Ipos MHC- IIpos cDC1 库被清除，仅留下 MHC- Ineg MHC- IIpos 或 MHC- Ipos MHC- IIneg 的 cDC1。(F) DT 处理的 (1)Xcr1- DTR:(1)WT 嵌合体与 (1)Xcr1- DTR:(0.5)MHC- II–KO:(0.5)B2m−/− 嵌合体的比较（每组 n = 8 到 9，代表两次独立实验；数据表示平均值 ± SEM）。TLS 数量和平均面积取自第 15 天。[(A) 和 (C)] P < 0.05; P < 0.01 (Mann- Whitney U 检验)。[(B) 和 (F)] P < 0.05; P < 0.01; P < 0.0001 (非配对 t 检验)。(D) P < 0.05; **P < 0.01; *P < 0.0001 (单因素 ANOVA，随后进行 Tukey 多次比较检验)。
在启动后对 DC 功能进行条件性靶向处理，并未显著改变终点的肿瘤负担，尽管 TLS 的维持受到了损害。这可能是由于肿瘤模型的进展迅速，可能没有足够的时间观察到更显著的效果。使用攻击性较低的 GEMMs 可能更适合研究 TLS 功能对肿瘤进展的影响。
我们观察到 TLS 相关 DC 表现出一种独特的成熟分子状态，称为 “mregDC” (11)。mregDC 程序由肿瘤碎片摄取和胆固醇动员驱动 (12)，并导致 CCR7 的表达，从而使成熟 DC 能够迁移到 CCR7 配体富集的部位并进行高效的 T 细胞启动。成熟 DC 在 TLSs 中的富集表明，抗原捕获是其迁移和积累的前提。我们进一步确定产生 CCL19 的成纤维细胞和周细胞是潜在的关键 TLS 组织者，它们形成了富含趋化因子的中心，引导 CCR7+ 成熟 DC、T 细胞和 B 细胞的招募与相互作用 (46)。CCR7+ DC 在 CCL19+ 周细胞生态位中的定位可能也有助于抗肿瘤免疫 (47)，并可能早于成熟 TLSs 的发育。未来的谱系追踪和时间戳研究将检查 tdLNs 与 TLSs 中 cDC1 的命运，包括它们的迁移和半衰期。值得注意的是，最近研究表明产生 CCL19 的成纤维网状细胞能够促进 T 细胞聚集，包括
B C D
TLS 在非小细胞肺癌 (NSCLC) (48) 和结直肠癌 (CRC) 肝转移 (49) 中均有出现。肺部长期的微生物暴露会促进基质细胞中的 CCL19 表达，并驱动肺内 TLS 的形成 (50)，在慢性炎症性银屑病皮肤病变中也观察到了类似的 CCL19 中心 (51)。这些观察结果强调了 CCL19 在 TLS 形成中潜在的关键作用，尽管 CCL19 与另一种 CCR7 配体 CCL21 在维持肿瘤 TLS 中的具体贡献仍有待研究。与许多趋化因子受体一样，CCR7 在长时间接触其配体后可能会脱敏或下调。这一现象可以将我们的观察结果与之前的研究结果相调和，即 MHC- II+ CCR7− cDC1s 能够将抗原交叉呈递给 CD8+ T 细胞 (52)。除了基质中心外，DC 和 TFH 细胞也可能是 TLS 的关键组织者 (15, 53)。成熟的 DC 产生 CCL17 和 CCL22，这两种趋化因子配体已知可招募 CCR4+ CD4+ T 细胞 (11, 54)，而 TFH 细胞则高表达胆固醇 25-羟化酶 (CH25H)，这种酶产生的氧甾醇梯度已知可招募 Ebi2+ 细胞 (55)，其中包括 DC 和 TPEX 细胞 (15)。此外，cDC1s 特异性地表达 XCR1 趋化因子受体，而其配体 XCL1 则由 TPEX 细胞产生 (56)。这些分子对 TLS 动态变化的具体贡献仍有待考察。
以及在肿瘤内部的维持，强调了 cDC1 在协调 TLS 功能中的重要性。TLS 与 tdLN 在介导肿瘤特异性免疫中的相互作用可能在肿瘤进展过程中发生变化，在更晚期的肿瘤中，TLS 成为关键的贡献者。在这种情况下，TLS 可能提供必要的枢纽，以支持抗原经历淋巴细胞的生存，并增强针对肿瘤抗原的适应性免疫反应效率。我们的研究结果为旨在增强癌症患者体内有效的抗肿瘤 T 细胞和 B 细胞反应的治疗策略提供了潜在基础。
Materials and methods TLS 空间数据 探索 TLS 空间数据（Visium SD/HD, MERFISH, 和 CyCIF）的交互式网站可见于：https://rstudio-connect.hpc.mssm.edu/mattiuz_science2026_tls_spatial_data/。
小鼠品系 C57BL/6, B6.Cg- Zbtb46tm3.1(cre)Mnz/J (品系号 028538), B6.129P2(C)- Ccr7tm1Rfor/J (号 006621), C57BL/6N- Ifngr1tm1.1Rds/J (号 025394), B6.129S(C)- Batf3tm1Kmm/J (号 013755), C57BL/6- Gt(ROSA)26Sortm1(HBEGF)Awai/ J (号 007900), B6.129P2- Gt(ROSA)26Sortm1(DTA)Lky/J 品系 (号 009669), B6.Cg- Gt(ROSA)26Sortm14(CAG- tdTomato)Hze/J (号 007914), B6(129S4)- Xcr1tm1.1(cre)Kmm/J (号 035435), SMARTA (H2- I- Ab- 限制性 LCMV GP61- 80 表位, B6.Cg- Ptprca Pepcb Tg(TcrLCMV)1Aox/PpmJ) CD45.1 (号 030450) 小鼠购自 JAX；Ccr7 floxed 小鼠由 M. Bogunovic 和 I. Aifantis 捐赠；C57BL/6J- Ms4a3em2(cre)Fgnx/J (号 036382) 和 Ms4a3CreERT2 由 F. Ginhoux 捐赠。对于骨髓移植实验，CD45.1, B6.129P2- Cd40tm1Kik/J (品系号 002928), B6.129P2- B2mtm1Unc/DcrJ (号 002087), B6.129S2- H2dlAb1- Ea/J (号 003584), B6(Cg)- Zbtb46tm1(HBEGF)Mnz/ J (号 019506), B6.129S1- Il12btm1Jm/J (号 002693) 小鼠亦购自 JAX；Ccl19−/− 小鼠由 J. G. Cyster 捐赠；C57BL/6NF- Wdfy4em1(IMPC)J/J (号 029334 和 MMRRC 号 051082- JAX) 由 K. M. Murphy 捐赠。本研究中进行的所有动物实验均通过了 Mount Sinai 医学院机构动物护理和使用委员会的批准 (IACUC 号 LA10- 00021 和号 04- 0274)。实验中的小鼠在年龄和性别上进行了匹配。肿瘤植入在 7 至 15 周龄的小鼠中进行。小鼠饲养在 Mount Sinai 特异性无病原体 (SPF) 设施的独立通风笼具中，自由提供食物和水，条件维持在 21° 至 23°C，湿度 39 至 50%，光暗周期为 12 小时–12 小时。
B6.129P2- Trp53tm1Brn/J (p53LoxP, Trp53fl/fl) 和 B6.129S4- Krastm4Tyj/ J (KrasLSL- G12D) 购自 JAX (分别为号 008462 和号 008179)，并通过杂交产生 KP GEMM 诱导小鼠品系 (KrasLSL- G12D/+; Trp53fl/fl)。KP- GEMM- Xcr1- Venus 品系是通过将 KP GEMM 与 Xcr1- Venus 小鼠 (57) (由德国维尔茨堡大学 W. Kastenmüller 提供) 杂交建立的。KP- GEMM- Batf3−/− 通过将 KP GEMM 与 Batf3−/− 小鼠 (由埃朗根大学医院 C. Lehmann 捐赠) 杂交产生。KP- GEMM 品线的实验由 Benvenuti 实验室在意大利 Trieste 的国际遗传工程和生物技术中心 (ICGEB) 进行。
Bone marrow transplantation 通过向亚致死量辐照的 6 周龄受体小鼠眼眶内注射 1 至 10 × 106 个总供体细胞 (新鲜或冷冻保存的 BM) 来产生骨髓 (BM) 嵌合体 (两剂 5.5 Gy 间隔 6 小时给药)。给予 9 至 12 周的时间以确保植入。
受体小鼠补充使用磺胺甲恶唑/甲氧苄啶 3 周。在第 9 周，通过外周血流式细胞术分析评估成功重建的情况 (最低 90%)。
KP- HELLO- 2 肿瘤模型的构建 KP- HELLO- 2 细胞最初衍生自 KP- HELLO 细胞（由 N. S. Joshi 提供）(22)，并在内部进行了修改。MSCV- IRES- Thy1.1 DEST 为 A. Rao 赠送（Addgene 目录号 17442），编码 Thy1.1 的 $\gamma$- 逆转录病毒是通过将 Thy1.1 载体与 $\gamma$ 逆转录病毒包装质粒共同转染至 HEK 293T 细胞而产生的。简而言之，KP- HELLO 细胞在组织培养涂层平板上扩增。在达到 60% 汇合度时，使用 polybrene（最终浓度为 8 μg/ml）通过离心感染（spinfection）使其转导逆转录病毒颗粒。细胞在补充了 10% 胎牛血清 (FBS) 和 1% 青霉素-链霉素 (Pen-strep)、Glutamax 和 HEPES 的 RPMI 中扩增，并使用 CytoFLEX SRT 细胞分选仪 (Beckman) 对 Thy1.1+ 细胞（使用 anti–Thy- 1.1 PE- Cy7 染色，克隆号：OX- 7, BioLegend 目录号 202518）在 10 代中进行了两次分选。
细胞系 KP- HELLO- 2, KP- HELLO 和 KPAR1.3 [由 J. Downward 提供 (58)] 细胞衍生自 KrasLSL- G12D/+;p53fl/fl 背景；AKPS 结直肠肿瘤类器官衍生自 Apcfl/fl;KrasLSL- G12D/+;p53fl/fl;Smad4fl/fl 背景 [由 Ö. H. Yilmaz 提供 (59)]；Hep- 53.4 HCC 细胞源自致癌物诱导的肝脏模型 [(60) Cellosaurus CVCL_5765]，由 J. Llovet 提供，最初购自 Cytion（产品号 400200）。所有细胞系均在完全细胞培养基 [Dulbecco 修改 Eagle 培养基 (DMEM) + 10% FBS + 1% P/S] 中生长。
原位肿瘤模型 对于原位肺肿瘤，将 1.5 × 105 个 KP- HELLO- 2, KP- HELLO 或 KPAR1.3 细胞通过尾静脉注射。除非图注中另有说明，否则在注射 15 天后分析承瘤肺和肿瘤引流淋巴结。对于 KPAR1.3，在注射 21 天后收获肿瘤。为了评估肿瘤负荷，将左肺叶固定在多聚甲醛 (PFA) 中，包埋在石蜡中，并切成 5 μm 截面进行检查。经苏木精-伊红 (H&E) 染色后，使用 Olympus 数字扫描仪对肺组织切片进行扫描，并使用 Panoramic 浏览器和 QuPath 软件进行分析。对于原位 CRC 肿瘤，小鼠在 10 μl 基底膜提取物 (BME)（R&D Systems 目录号 35- 330- 0502）中接受 1.5 × 105 个 AKPS 细胞的盲肠内注射，并在注射 6 周后分析肿瘤。对于原位 HCC 肿瘤，将 1 × 106 个 Hep53- 4 细胞在 10 μl 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS) 中原位注射到肝脏的左外叶，并在注射 2 周后收获肿瘤。
自体肿瘤诱导 通过气管内管理 2.5 × 107 个编码 Cre 重组酶的复制缺陷型腺病毒载体（Ad- CMV- iCre, Vector Biolab, 目录号 1045）感染颗粒，在 KP- GEMM- Xcr1- Venus 和 KP- GEMM- Batf3−/− 小鼠中启动肺肿瘤。小鼠在接种后 5 到 8 周被安乐死，并收集承瘤肺用于分析。
体内治疗 为了长期且有效地条件性清除 cDCs 或 cDC1s，Zbtb46- hDTR 和 Xcr1Cre/wt; Rosa26DTR/wt 小鼠接受初始剂量的 DT（每克体重 32 ng，List Biological Laboratories 目录号 150），随后每 60 小时注射 20 ng/g。为了抑制淋巴细胞从外周淋巴器官流出，在指定时间段内每天给小鼠施用 20 μg FTY720（Cayman Chemical, 目录号 10006292）。为了增加 DC 数量，小鼠在肿瘤植入后第 8 天接受 75 μg FLT3L-Fc (Gilead)。从第 7 天起，连续 9 天每天施用一次 FLT3L（30 μg; Celldex, 目录号 CDX- 301）。为了向 DC 提供外源性授权信号，小鼠在肿瘤植入后第 7 天和第 11 天接受 100 μg anti- CD40 激动剂抗体（克隆号 FGK4.5, BioXCell, 目录号 BE0016- 2）治疗。为了清除 CD4+ T 细胞，小鼠接受 500 μg
在肿瘤植入后的第 5 和 10 天，注射抗 CD4 抗体（克隆 GK1.5, BioXCell, 目录号 BE0003- 1）。为了清除 CD8+ T 细胞，小鼠在同一时间点接受 200 μg 的抗 CD8β（克隆 Lyt 3.2, BioXCell, 目录号 BE0223）抗体。对照组小鼠在相同的剂量和时间表下接受相应的同型对照抗体。为了标记 GMP 来源的细胞，Ms4a3CreERT2;RosaTdT 小鼠在肿瘤植入后从第 10 天到第 15 天每天接受 2.5 mg 溶解在玉米油中的他莫昔芬（Sigma-Aldrich, 目录号 T5648）。为了阻断细胞因子的分泌，小鼠预先使用 125 μg 的 Brefeldin A（Sigma- Aldrich, 目录号 B7651）处理 12 小时 (61)。所有药物均通过腹腔注射给药。
过继细胞转移 在通过成像分析肿瘤特异性 CD4 T 细胞（SMARTA；针对 LCMV GP66–77 表位特异的 CD4+ T 细胞）的实验中，使用 EasySep 小鼠 CD4+ T 细胞分离试剂盒（StemCell, 目录号 19852）从初次接触抗原的 SMARTA CD45.1 转基因小鼠血液中分离 CD4+ T 细胞。在肿瘤注射前 1 天，将 20 至 50 × 103 个初次接触抗原的 SMARTA CD4+ T 细胞通过静脉转移至 C57BL/6 recipient 小鼠体内。
流式细胞术 使用 0.25 mg/ml 胶原酶 IV（Sigma, 目录号 C5138- 1G）在 37°C 下消化 30 分钟（肺）或 25 分钟（淋巴结），随后通过 70- μm 细胞筛过滤并进行红细胞裂解（RBC 裂解缓冲液, BioLegend, 目录号 420301），在室温 (RT) 下处理 2 分钟，从而获得携带肿瘤的肺和肿瘤引流淋巴结的单细胞悬液。为了进行 T 细胞细胞因子评估，将细胞与 1 μg/ml brefeldin A、1 μg/ml ionomycin 和 50 ng/ml 佛波酯 12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯 (PMA)（全部来自 Sigma, 目录号 B7651, I0634, P1585）在 37°C 下共同孵育 4 小时。细胞在荧光激活细胞分选 (FACS) 缓冲液 [PBS 补充 10% 牛血清白蛋白 (BSA) 和 2 mM EDTA] 中，在 4°C 下染色 25 分钟。对于 CCR7 和 CXCR5 染色，细胞在 37°C 下孵育 30 分钟。为了评估肿瘤特异性 CD4+ T 细胞，使用 1:100 稀释的 APC 偶联 MHC- II LCMV Gp66 四聚体（由 NIH 四聚体核心设施生产的 I- Ab LCMV GP 66- 77 DIYKGVYQFKSV 单体制备，由 A. O. Kamphorst 提供）在 37°C 下染色 2 小时。固定和通透化后，使用 Foxp3/转录因子染色缓冲液套装（eBioscience, 目录号 00- 5523- 00）对细胞因子和转录因子进行染色。使用 BD LSR Fortessa 或 BD FACSymphony 分析仪 (BD Biosciences) 对细胞样本进行分析。流式细胞术数据使用 FACS Diva 软件 v.9 (BD) 获取，所得数据使用 FlowJo (LLC) 进行分析。所用抗体列于表 S3 中。门控策略见表 S6。
肿瘤特异性抗体结合分析 为了测量肿瘤结合抗体，在终点收集携带肿瘤小鼠的血清，并在 56°C 下热灭活 10 分钟。使用血清 (1:50) 在 4°C 下对 KP-HELLO- 2 细胞染色 40 分钟，随后使用抗小鼠 IgG (1:200, Poly4053- PE- Cy7, Biolegend, 目录号 405315) 或抗小鼠 IgM (1:200, II/41- PerCP- eFluor710, eBioscience, 目录号 46- 5790- 82) 在 4°C 下进行二次染色 40 分钟。
使用与 mutuDCs 和 TILs 共培养的 KP- HELLO- 2 拟球体形成免疫聚集体 如前所述 (62)，KP- HELLO- 2 拟球体培养 7 天，每个拟球体包含 10,000 个表达 mScarlet 的 KP- HELLO- 2 细胞，使用 Spherotribe 套件 (Idylle)。与此同时，使用 KP- HELLO- 2 细胞碎片培养 mutuDCs 以诱导成熟，并通过流式细胞术确认 (12, 63)。另行地，在注射 7 天后从 KP- HELLO- 2 肿瘤中收获并分选 TILs，保持内源性 T 细胞/B 细胞比例，并使用 DeepRed 细胞追踪剂标记 30 分钟。将成熟的 mutuDCs 添加到 KP- HELLO- 2 拟球体中 4 小时，随后加入 TILs（每个拟球体 30,000 个 mutuDCs 和 30,000 个 TILs）。5 天后，通过显微镜和 ImageJ 评估 KP- HELLO- 2 拟球体的大小及其随后的免疫吸引情况。在 mutuDCs 存在的情况下，通过双光子 (BiPhoton) 显微镜测量 TILs 对拟球体的浸润以及三维 (3D) 聚集体的形成，并使用 QuPath 进行分析。同时使用流式细胞术测量与 mutuDCs 共培养的 KP- HELLO- 2 拟球体中 TILs 的总数。
用于 TLS 评估的免疫荧光成像 左肺叶在 4% PFA 中固定过夜，随后存储在 70% 乙醇中直到进一步处理。将肺组织制成厚度为 5 μm 的福尔马林固定-石蜡包埋 (FFPE) 组织切片。5 μm FFPE 切片在脱蜡前于 60°C 下烘烤 2 小时。切片在二甲苯中脱蜡（处理两次），并通过一系列浓度递减的乙醇溶液（从 100% 到 70%）进行复水，随后用 PBS 冲洗。为了抗原修复，将切片浸入预热的 DAKO pH 9 溶液（含或不含 10% 甘油）中，温度为 95°C，然后使其冷却至室温 (RT) 并用 PBS 洗涤。在加湿腔室中使用封闭缓冲液（1× TBS, 10% BSA, 0.1% Triton X- 100）进行封闭。使用 TrueBlack 溶液淬灭自荧光，随后用 PBS 洗涤。切片与初级抗体（1:200）在封闭缓冲液中 4°C 下孵育过夜。经过 PBS 洗涤后，切片与次级抗体孵育，次级抗体在 PBS 中稀释 1:500 且含有 2% 来自宿主物种的血清，并用 4′,6- 苯基吲哚 (DAPI) 进行复染。最后，使用 ProLong Gold 抗褪色封片剂 (Invitrogen, 目录号 P36930) 封片，盖上盖玻片并存储于 4°C。完整的染色切片在配备 20× 镜头的 CyteFinder HT II 荧光扫描仪 (RareCyte) 上进行扫描。图像经过光学畸变矫正、拼接，并使用车载 CyteHub 软件进行本地处理。或者，使用 Leica DMi8 显微镜获取全片图像。所使用的抗体列于表 S3 中。
使用 Qupath 进行机器学习 TLS 检测 为了在全片水平上检测整个左肺叶中的 TLS，在 QuPath (64) 中应用随机树 (Random Trees) 像素分类器，分辨率设置为 5.20 μm/pixel，在 2.0 和 4.0 的尺度下选择三个通道（Alexa 488, Alexa 647, 和 DAPI），使用无需归一化的高斯特征。分类器在至少 5 个手动标注的 TLS 区域（B220+ 细胞、CD3+ 细胞和 DAPI+ 细胞的聚集体）和 5 个非 TLS 区域上进行训练。随后将输出的分类结果分割为面积超过 1500 μm2 的单个标注区域。免疫聚集体分类由一名经过培训的病理学家进行审查和验证。
肿瘤抗原特异性 B 细胞和 T 细胞成像 在免疫荧光染色之前，10 μm OCT 切片在 −20°C 的丙酮中固定 10 至 15 min 并干燥。为了检测针对鸡蛋溶菌酶 (HEL) 的肿瘤抗原特异性 B 细胞，按照 20 至 50 kDa 蛋白质方案，使用 Alexa Fluor 488 蛋白质标记试剂盒 (ThermoFisher) 将 HEL 蛋白 (Sigma, 目录号 10837059001) 与 Alexa Fluor 488 偶联。OCT 嵌入切片用 HEL-Alexa488 (1:500) 染色，并与 B220、GL7 和 DAPI 共染。为了检测识别 LCMV GP66–77 表位的肿瘤抗原特异性 CD4+ T 细胞，采用过继转移 SMARTA CD45.1 小鼠的 OCT 嵌入切片用 CD45.1 染色，并与 CD4、PD-1 和 DAPI 共染（表 S3）。
用于 TLS 成熟度评估的多光谱成像 对于多光谱染色，每个抗原染色周期按以下步骤处理。组织在 AR6 或 AR9 柠檬酸盐缓冲液 (Akoya Biosciences) 中进行 HIER。抗原检索后，切片用 1× 抗体稀释/封闭液 (Akoya Biosciences) 封闭 10 min，随后用一抗染色 30 min。每个染色步骤均在室温 (RT) 下的加湿腔中进行。用 1× TBS-Tween (TBST) 缓冲液洗涤（3 次，每次 2 min）后，切片用 HRP 偶联的二抗染色，为抗兔 IgG
(Fisher, 目录号 MP740150) 或抗鼠 IgG (Biocare, 目录号 RT517L) 孵育 30 分钟。随后经 1× TBST 洗涤，为每个标志物使用单独的 Opal 检测荧光团。TLS 成熟度面板如下：CD4 (1:200)/Opal 480, CD8 (1:400)/Opal 780, CD19 (1:1000)/Opal 520, Ki67 (克隆 SP6, ThermoFisher, 1:100, 目录号 MA5- 14520)/Opal 570, CD21 (克隆 SP186, Abcam, 1:50, 目录号 ab227662)/Opal 620, 以及 AID (克隆 mAID- 2, ThermoFisher, 1:800, 目录号 14- 5959- 82)/Opal 690。最后一轮染色在进行额外的抗原修复和 DAPI 核染色后执行。染色通过手动或自动化机器进行 (Opal 6- Plex 检测套件, Akoya Biosciences, 目录号 NEL871001KT)。随后，染色组织切片使用 Diamond Anti-fade 封片剂封片，并使用 Vectra (Perkin Elmer) 进行全片扫描成像。图像经解混后在 QuPath 上进行分析。
用于 TLS 成熟度评估的 QuPath 组织分析 使用 QuPath 软件进行定量分析。细胞检测和分割使用基于 DAPI 核染色的 StarDist 扩展程序进行 (65)。对于单个细胞的表型分析，采用机器学习方法为每个标志物生成对象分类器。对于互斥的标志物，我们生成了一个包含所有这些标志物的组对象分类器。然后，将这些个体分类器汇总并应用于多光谱图像以对细胞进行表型分析。对于 TLS 的标注，再次采用机器学习方法生成像素分类，标注尺寸大于 1500 μm2 (66, 67)。
循环免疫荧光 (CyCIF) 染色与成像：按照先前描述的 CyCIF 方法，准备 FFPE 切片并使用 20- 标志物抗体面板进行染色。在样本准备阶段，切片在 60°C 下自动烘烤 30 分钟，并使用 BOND 脱蜡溶液在 72°C 下脱蜡。使用 Leica Bond RX 系统，在 BOND 抗原检索溶液 2 (ER2) 中，于 100°C 下进行 20 分钟的抗原修复。为最大限度减少自发荧光，切片使用漂白溶液 (4.5% H2O2, 20 mM NaOH 溶于 PBS) 处理，并暴露在发光二极管 (LED) 光下，共 2 个循环，每个循环 45 分钟。为减少非特异性抗体相互作用，切片在 PBS 中冲洗 3 × 5 分钟，并在 4°C 下与稀释于 150 μl Odyssey 阻断缓冲液中的二抗 (1:1000) 避光孵育过夜。随后，切片用 PBS 洗涤三次，并再次漂白 2 × 45 分钟。在每轮 CyCIF 中，样本在 4°C 避光环境下过夜孵育 Hoechst 33342 (1:10,000; Thermo Fisher Scientific, 目录号 H3570) 进行核染色，同时使用原位共轭抗体或按指定比例 (表 S3) 稀释在 150 μl Odyssey 阻断缓冲液 (LI-Cor) 中的原位非共轭抗体。在使用原位非共轭抗体时，随后在黑暗中与二抗进行 2 小时的室温 (RT) 孵育。随后，切片洗涤 3 × 5 分钟，并使用 200 μl 70% 甘油封片。成像在 RareCyte Cytefinder II HT 系统上自动执行，曝光设置根据通道优化，以在防止信号饱和的同时保持样本间的一致性。成像后，将切片置于 1× PBS 中并在水浴中加热 1 小时以去除盖玻片。在循环之间，切片进行 2 × 45 分钟的光漂白，并在 PBS 中洗涤 3 × 5 分钟 (68–70)。
图像预处理与质量控制：整个预分析 CyCIF 图像处理工作流，包括拼接、注册、照明校正、分割和单细胞特征提取，均使用 MCMICRO 管道完成，这是一个开源的多选择显微成像平台（完整代码可在 GitHub 获取：https://github.com/labsyspharm/mcmicro）。为了生成概率图，应用了一个预训练的 U-Net 模型 UnMicst v2，随后采用标记控制的分水岭算法进行单细胞分割。细胞核检测在 3 到 60 像素的直径范围内进行。
由 UnMicst 生成的概率图随后通过 S3segmenter 处理以产生细胞核分割掩模，而细胞质区域则通过将细胞核掩模向外扩展 3 像素来定义。在创建分割掩模后，计算了每个细胞中每个标记的平均荧光强度，从而产生一个与每张获取的全片 CyCIF 图像相对应的单细胞数据表。全片图像上标注的组织学区域被用于提取位于指定 ROI 范围内的细胞的定量单细胞数据（TLS 通过 QuPath 使用 CD4, CD8, PD-1, B220 和 DAPI 染色进行识别）。采用了多种策略以确保单细胞数据的准确性和可靠性。在图像层面，审查了跨周期图像注册情况和组织完整性，并识别出注册较差的区域或组织变形、有伪影的区域，将其从分析中剔除。通过视觉检查确定地表现出低置信度染色模式的抗体也被从分析中移除。对分割质量进行了严格评估，并迭代优化分割参数，以提高分割掩模的精度。在单细胞数据层面，评估了不同周期中 DNA 染色强度的相关性，以过滤掉在循环过程中丢失的细胞，排除标准为相关系数小于 0.8 (71)。
单细胞表型分析：为了进行表型驱动的门控，我们使用了开源软件 Gater (https://github.com/labsyspharm/minerva_analysis)，该软件允许定义门控阈值，即用于区分标记阳性细胞与标记阴性细胞的截断值。此门控过程独立应用于每幅图像。
总之，细胞根据标记表达的有无被分配到特定的表型类别中，具体定义见关系逻辑表（参见 CyCIF 门控策略，表 S5）。不满足表型分析工作表中定义的任何布尔逻辑规则的细胞被标记为“未知”。逻辑运算符 AND、OR、ANY 和 ALL 与 POS（阳性）和 NEG（阴性）表达标准结合使用，用于表征通过无监督聚类和组织图像人工审查所识别的细胞类型。在确定细胞身份后，我们通过 Napari 并在 scimap (https://napari.org/stable/) 嵌入的 image_viewer 函数调用，将表型标签叠加到原始图像上，从而验证这些注释。
邻域分析：空间邻域是通过计算细胞质心的欧几里得距离来定义的。对于每种参考细胞类型，识别半径 30 μm 范围内的邻近细胞。生成交互表，记录每对“参考-邻居”细胞及其细胞类型和距离。交互情况被总结为每个参考细胞的绝对计数和相对比例。TLS 关联通过与 TLS 多边形的空间重叠来分配（TLS 通过 QuPath 使用 CD4, CD8, PD-1, B220 和 DAPI 染色进行识别），从而允许比较 TLS 区域与非 TLS 区域内的交互情况。
多重免疫组化 (IHC) 成像 使用之前描述的 (72) 单片载玻片多重免疫组化连续染色 (MICSSS) 方案对 FFPE 切片 (4 μm) 进行染色。简而言之，载玻片在 50°C 下烘烤过夜，在二甲苯中脱蜡，并在递减浓度的乙醇 (100%, 90%, 70%, 50% 和 dH2O) 中复水。样本载玻片在 pH6 或 pH9 缓冲液中 95°C 下孵育 30 min 以进行抗原修复，随后在 3% 过氧化氢中处理 15 min，并在无血清蛋白阻断液 (Dako, 目录号 X090930- 2) 中处理 30 min。初级抗体染色使用优化后的稀释比例，在室温下处理 1 小时或 4°C 下过夜，随后使用结合了辣根过氧化酶的相关次级抗体在 30 min 内进行信号放大。显色反应使用 AEC (Vector, 目录号 SK- 4200) 进行。组织切片使用苏木精进行复染，并使用基于甘油的封片剂封片且
最后通过扫描获得数字图像（Aperio AT2, Leica）。扫描后，在热水（~50°C）中去除载玻片盖玻片。原代抗体列于表 S3 中。
为了定量分析定位和共表达模式，首先由病理学家使用 QuPath 软件进行组织注释。在分析中，我们使用了染色后每个标记物获得的 svs 多分辨率金字塔图像。AEC 发色剂染色和苏木精核反染均通过动态确定的解卷积矩阵从每幅图像中提取。然后，每幅图像被分割成较小的瓦片以进行计算分析。第一幅染色图像中的每个瓦片与后续染色图像中的相应瓦片相匹配，然后使用提取的苏木精核染料和 SimpleElastix 开源软件进行弹性注册。接着，通过使用 STARDIST 进行迭代细胞核掩膜处理，我们为位于一系列瓦片中的细胞核生成了复合语义分割。每个细胞核被人工扩展了若干像素，以模拟每个细胞的细胞质，并使其与膜标记物染色保持一致。最后，获取了最终细胞掩膜中所有细胞的细胞分辨率元数据。为了客观地确定每个标记物的阳性细胞和阴性细胞，我们使用无监督分类技术对细胞群进行聚类，随后采用监督方法评估每个聚类在每个标记物下是阳性还是阴性。首先，收集每个样本聚合的元数据，将其转换为 z-分数，随机化并按批次分割成子样本。每个批次并行处理：每个标记物的数据经过转换、聚类，并通过主成分分析 (PCA) 和统一流形近似与投影 (UMAP) 合并为多个组。然后，我们执行最终的质量控制，手动归属哪些聚类为阳性或阴性。这产生了一个最终的细胞分辨率数据框，包含二元标记分类，用于后续的定位、标记共表达、组织注释与协调以及统计分析 (73)。
使用光片显微镜进行 TLS 3D 成像 小鼠通过 $\text{CO}_2$ 处死，并用 10 ml 1× PBS 进行经心灌注。从每只小鼠中采集后腔叶，并在 4°C 下置于 4% PFA 中过夜。随后使用 LifeCanvas 环氧树脂固定剂准备肺部：样本在新鲜的 50% SHIELD Epoxy/25% SHIELD 缓冲液/25% 水中震荡 1 天，然后在 4°C 下于 7:1 SHIELD ON/SHIELD Epoxy 中过夜。随后，样本被转移至 37°C 的 100% SHIELD ON 中放置 2 天。接着，样本在 37°C 的 LifeCanvas 脱脂缓冲液中震荡 11 天进行被动脱脂。样本在阻断缓冲液——PBSTN（1% TritonX, 0.02% 叠氮化钠, 1× PBS）含 5% 驴血清中于 37°C 下透化 2 天，然后在阻断缓冲液中的原代抗体（1:200）中于 37°C 下孵育 4 天。样本在 37°C 的 PBSTN 中洗涤 6 小时，并在室温 (RT) 下于 4% PFA 中固定过夜。经过 4 小时的 PBSTN 洗涤后，样本在阻断缓冲液中的二抗（1:500）中于 37°C 下孵育 4 天。与原代抗体一样，样本在 PBSTN 中洗涤 6 小时，在 4% PFA 中固定过夜，然后再次在 PBSTN 中洗涤 4 小时。为了使样本透明化，将其转移至 50% LifeCanvas EasyIndex（折射率 1.52）/50% 水中于 37°C 下过夜，然后转移至 100% LifeCanvas EasyIndex 中于室温下过夜。样本被安装在 100% EasyIndex 的低熔点琼脂凝胶中，随后在 SmartSPIM 光片显微镜上使用 EasyIndex 匹配浸油和 9× 物镜进行成像。
体内研究的实验研究设计 样本量确定：未采用统计学方法预先确定样本量。样本量的选择是基于领域标准以及对类似模型的既往经验。样本量与体内肿瘤免疫学实验中常用的样本量一致，且被认为足以检测到稳健且具有生物学意义的效果。
随机化：在可能的情况下，动物被随机分配到治疗组或对照组以尽量减少偏差。这是通过将来自不同笼子的鼠标交替分配到不同组别来实现的。未使用正式的随机化软件。
盲法：在可能的情况下采用了盲法。进行组织学定量和流式细胞术门控分析的研究人员在分析过程中对治疗/基因组组别采取盲法。
纳入-排除标准：鼠标的纳入基于正确的基因型、性别匹配，以及在肿瘤注射时无疾病迹象或健康状况不佳。随机化后，除非出现无关的健康问题或实验误差（如肿瘤注射失败），否则不排除任何鼠标。
人类受试者 肿瘤样本获取自在西奈山医院（纽约州纽约市）接受手术切除的患者。样本获取遵循由西奈山伊坎医学院机构审查委员会（IRB）审查并批准的方案（HCC 样本为 IRB Human Subjects Electronic Research Application 18- 00407；NSCLC 样本为 10- 00472 和 10- 00135；CRC 样本为 18- 00407 和 18- 00855），并与生物样本库和病理科合作。在匹兹堡大学（宾夕法尼亚州匹兹堡市）进行的患者 TLS 成熟度多路成像研究，是在 IRB 方案 STUDY19060269（NSCLC 患者）和 PRO17080326（HGSOC 患者）下进行的。
针对具有可切除肿瘤的 HCC 患者的单臂、开放标签、2 期试验已在 ClinicalTrials.gov 注册（NCT03916627, Cohort B）。共入组 20 名患者，并在手术切除前接受两个周期的 Cemiplimab 治疗，具体描述见 (20)。治疗反应由病理学家定义为：切除肿瘤的坏死率超过 50%（部分缓解）或超过 70%（完全缓解）。同样，TLSHi 与 TLSLo 状态基于病理学家的标注和 H&E 评分确定：当切除组织中识别出 3 个或更多 TLS 时，患者被分类为 TLSHi；当观察到 0 到 2 个 TLS 时，分类为 TLSLo。
术后，患者每 6 个月接受一次标准护理筛查；复发定义为：使用肝脏成像报告与数据系统 (LIRADS) 评分，肝内病灶（HCC 复发最常见部位）评分为 5，或出现与转移性疾病一致的动脉增强新肝外转移病灶 (74)。NSCLC POPLAR 队列 (18) 和 ccRCC BIONIKK 队列 (19) 的详细临床信息见相应发表论文。
转移性乳腺癌 (MBC) 组织来自一项针对淋巴瘤、乳腺癌和头颈癌的原位疫苗临床试验（NCT03789097, Marron et al., SITC 2022）。一名 MBC 伴有皮肤浸润的患者入组了一项原位疫苗临床试验，该方案包括：每天在肿瘤内注射 FLT3L 持续 2 周，以招募 DC 进入肿瘤微环境和引流淋巴结 (dLNs)；随后对注射病灶进行低剂量放疗以释放肿瘤抗原；接着在肿瘤内注射 poly- ICLC（TLR3 配体）以激活 cDC1。患者在给药 FLT3L 之前和之后接受活检，以评估其对肿瘤微环境的影响。
患者临床元数据可见表 S1。
10x Visium SD 空间转录组学 10x Visium 空间测序库制备：处理前 在 Visium 基因表达样本中，测量了从 FFPE 蜡块中分离的 RNA 的 DV200，以评估 RNA 的完整性。选择 DV200 大于 50% 的样本进行后续步骤。经过质量控制后，对蜡块进行修整，切取 5- μm 的组织切片，并将其放置在用于 FFPE 的 Visium 空间基因表达载玻片（10x Genomics）的捕获区域上。该载玻片在热循环仪中进行孵育
在 42°C 下处理 3 小时，然后置于干燥器中在室温 (RT) 下过夜。随后的组织染色和文库构建步骤按照制造商的指令执行 (CG000407_VisiumSpatialGeneExpressionforFFPE_RevC)。文库质量使用 Agilent 4200 TapeStation 进行评估。文库使用 NovaSeq 6000 平台在 NovaSeq SP 流式细胞池上以 150 双端配置进行测序。
含免疫聚集体的 Visium FFPE 测试样本：测试样本包括内部生成的肺癌 (n = 3)、肝癌 (n = 3) 和结直肠癌 (n = 6) 人类癌症数据，以及第三方肾癌 (n = 6; GSE175540) 人类癌症数据集。所有测试样本均使用 H&E 染色。Visium 转录组数据使用 10x Genomics 为 FFPE 组织切片提供的标准程序获取。读取数据使用 10x Genomics Space Ranger 流程 (10x Genomics) 进行处理并比对到人类参考基因组 GRCh38。样本的过滤和分析在 python 中使用 scanpy (v1.9.1) 且采用默认参数完成。在下游分析中，保留用于进一步研究的样本是那些经病理学家确认每块组织区域至少包含一个 TLS 的样本。
用于空间细胞类型映射的 Visium spot 解卷积：在解卷积步骤中，我们使用了 Cell2location 算法 (75)，得出了每个 Visium spot 中解卷积细胞的比例。我们还使用 StarDist (65) 进行了基于 H&E 的细胞分割，以量化每个 Visium spot 的细胞数量。然后，我们将细胞的解卷积比例乘以每个 spot 中分割细胞的绝对数量，从而获得每个 Visium spot 中解卷积细胞的绝对数量。
TLS 区域的空间富集：对于每个 Visium 样本，我们以 TLS 的组织病理学注释为基础，测试推断细胞类型的富集或缺失。首先，推断的细胞类型丰度值根据其空间自相关性使用 Voyager (https://pachterlab.github.io/voyager/index.html) (76) 进行二值化。使用 runUnivariate 函数 (Getis-Ord GI* 结合置换检验；type = “localG_perm”) 计算单变量局部统计量，若值 > 2 则判定为 spot。富集倍数变化和统计量使用 LotOfCells (77) 计算。相关性和层次树通过 cor 和 hclust 函数计算。可视化在 R 中生成。
梯度分析：梯度分析包含两个步骤。首先，它识别与选定结构边界距离相等的 Visium spots，无论它们是在结构内部（内部层）还是远离结构（外部层）。然后，它在这些层中对基因表达或细胞计数进行回归，从而可以探索选定组织区域的微环境 (78)。
来自 TLS 区域的径向距离分析：对于每个 Visium 样本，我们使用 TLS 注释，通过 semla (convert_to_microns = T; v1.1.6; cit) (79) 中的 RadialDistance 函数来提取径向距离 $d$。0 μm 的距离代表紧邻 TLS 标记 spot 外部的 spot 外线。距离 >1000 μm 的数据被舍弃，以排除遥远的组织区域。在 ggplot2 中，使用局部估计散点平滑法 (“loess,” span = 0.45) 的 geom_smooth 对细胞密度数据进行可视化。
Visium 样本的通路富集分析：我们使用了 GSEApy (80) 实现的基因集富集分析。使用的通路数据库包括：GO 细胞组分 (https://geneontology.org/)、KEGG (https://www.genome.jp/kegg/)、LINCS (https://lincsproject.org/)、MSigDB (https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb) 以及 Reactome (https://reactome.org/)。
Visium 样本分析的代码共享声明：所有用于 Visium 样本细胞分割的代码均可在人类免疫监测中心 (HIMC) 的 GitHub 页面获取：https://github.com/ismms- himc/visium_segmentation。梯度分析的代码存储在 HIMC 的 GitHub 页面：https://github.com/ismms- himc/Visium_analysis。
Visium 分析中使用的其他软件包：Seurat (81), Simple features (82), Tidyverse (83), Scran (84), 以及 Scater (85)。
10x Visium HD 空间转录组学细胞核分割与邻域分析：人类肺部 Visium HD 数据集的 Space Ranger 输出结果获取自 10x Genomics 网站。全分辨率组织图像 (TIFF) 与每个样本相应的 2 mm 空间转录组输出一起读取，并使用 sopa (86) 和 spatialdata (87) 软件包进行处理。细胞核分割采用 stardist (88) 算法，其中 FFPEIF_Experiment1 样本使用 2D 通用荧光模型，所有其他样本使用默认的 2D 通用 HE 模型（概率阈值 0.2, 非极大值抑制 0.6, 最小面积 30）。分割后的细胞边界导出为 GeoPackage 文件，单细胞特征通过一个细胞直径的半径扩展进行聚合。基因表达表经过过滤，仅保留在 ≥10 个细胞中表达且细胞计数 ≥3 的基因，并使用 scanpy (89) 进行归一化和对数转换。所有处理后的数据，包括分割图像、多边形文件和 AnnData 对象 (90)，均被保存用于 R 语言的下游分析和可视化。细胞类型标注是通过在 R 中实现 K-最近邻 (KNN) 分类方法完成的，使用了 scop 软件包 (https://github.com/mengxu98/scop) 中的 RunKNNPredict 函数，并结合了 GSE154826、GSE206325、GSE183219 的人类参考模型以及人类 CRC 数据集（未发表）。空间邻域通过计算细胞质心之间的欧几里得距离来定义。对于每种参考细胞类型，识别其 30 μm 半径内的邻近细胞。生成的交互表记录了每对参考-邻居细胞、它们的细胞类型及距离。交互作用被汇总为绝对计数和每个参考细胞的相对分数 (82)。三级淋巴结构 (TLS) 的关联通过与 TLS 多边形（此前使用 QuPath 识别）的空间重叠来判定，从而允许对比 TLS 区域与非 TLS 区域内的交互。
scRNA-seq 和单细胞 T 细胞受体测序 (scTCR-seq) 分析 分析了此前发表的 NSCLC 和 HCC scRNA-seq 数据集 (GSE154826, GSE206325)。使用 Seurat 确定差异表达基因。使用推算的平均 UMI 计数来计算不同细胞状态之间表达的对数倍数变化，以进一步分析感兴趣的标志物。使用 Enrichr 数据库进行基因集富集分析。使用的其他 R 软件包包括 scDissector v1.0.0, shiny v1.7.0, ShinyTree v0.2.7, heatmaply v1.3.0, plotly v4.10.0, ggvis v0.4.7, ggplot2 v3.3.5, dplyr v1.0.7, Matrix v0.9.8, 以及 seriation v1.3.5。预处理的原始计数矩阵在通过 Scanpy (89, 90) 中的 sc.tl.score_genes() 对成熟 DC 特征进行评分前，经过了归一化和 log1p 转换。每簇细胞数 <10 的患者被剔除出后续分析。使用的其他 Python 库包括：Scanpy v1.9.8, anndata v0.10.5.post1, umap v0.5.5, numpy v1.26.4, scipy v1.12.0, pandas v2.2.3, scikit-learn v1.4.0, statsmodels v0.14.1, igraph v0.11.3, pynndescent v0.5.11。scTCR-seq 按照之前描述的方法进行 (15)。
MERFISH 为了使用 MERFISH 识别转录截然不同的细胞群，我们使用了如前所述 (15) (表 S2) 的两组基因面板。来自 HCC 和 NSCLC 患者的 FFPE 或新鲜冷冻样本被
按照前述方法进行处理，组织切片在 37°C 下使用定制设计的 MERSCOPE 基因面板混合物 (Gene Panel Mix) 孵育 36 至 48 小时。样本经过凝胶包埋并按照前述方法进行组织透明化处理。组织载片按照前述方法准备成像并加载到 MERSCOPE 系统 (Vizgen 10000001) 中。样本最初使用 10× 倍率进行低分辨率成像，以选择感兴趣区域，随后使用 60× 倍率进行高分辨率成像。
图像使用 MERSCOPE Vizualizer (v2.1.2593.1) 进行可视化，单细胞分析使用前述的 scanpy (v1.9.1) Python 软件包进行。简而言之，移除了计数 <10 和 >750 或表达的唯一基因 <10 的细胞。此外，过滤掉空白计数比例较高（前 5% 分位数）或点密度/polyT 信号染色强度过高或过低（前 0.0005 和后 0.0005 分位数）的细胞，以去除碎片、凋亡细胞及疑似双细胞。使用 TACCO (v0.2.2) 将标签从注释的单细胞数据转移到 MERFISH 数据中，以 MERFISH 原始计数作为输入并采用标签转移的默认参数。对于 HCC 样本，使用了先前发表的单细胞参考数据集 (15)。对于 NSCLC 样本，由于肝脏数据中所需免疫细胞亚型的分辨率更高，因此使用了肝肿瘤单细胞参考数据集与先前肺腺癌图谱 (14) 的混合数据集。具体而言，HCC 数据集中标记为 T、NK、DC、B 记忆细胞 (B memory) 和 B 幼稚细胞 (B naïve) 的集群取代了 NSCLC 数据集中相应的细胞类型。将所得标签与基于 scanpy 的 MERFISH 数据 Leiden 聚类进行对比，以验证大类细胞群的一致性。标签转移后，使用 Shapely (v2.0.1) 和 GeoPandas (v0.14.0) 在标记为幼稚 B 细胞和记忆 B 细胞的细胞周围绘制组织区域，并将其注释为“免疫聚集体”。在 HCC 样本中，在肿瘤细胞、内皮细胞和肝星状细胞周围绘制区域，并将其注释为“基质”。在 NSCLC 切片中，在上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞类型周围创建类似的“基质”区域。区域是以 alpha 形状在细胞周围绘制的，使用每个细胞的质心 x 和 y 坐标作为输入。为了平滑稀疏细胞区域，所有区域均缓冲了 30 μm。区域重叠部分的处理原则是免疫聚集体区域优先于基质区域。针对基质和免疫聚集体区域中的感兴趣细胞，分别使用 squidpy (v1.5.0) (91) 进行共现分析，在 0 到 500 μm 的常规间隔内使用 squidpy.gr.co_occurrence() 函数，并以 TACCO 分配的细胞类型标签作为输入。30 μm 处每种细胞类型的富集值通过 $\ln(1 + x)$ 进行归一化处理以便可视化，其中 $x$ 是由 squidpy 导出的共现富集值。共现结果还通过 squidpy.gr.nhood_enrichment() 函数计算的基于排列的邻域富集分析进行了一致性检查。基因模块得分采用与 scRNA-seq 得分类似的方式，使用 sc.tl.score_genes() 计算。所有 MERFISH 下游处理和分析均在分布式高性能计算集群上完成。本工作部分得到了西奈山伊坎医学院 (Icahn School of Medicine at Mount Sinai) 科学计算部门提供的计算资源和人员专业知识的支持，并得到了国家转化科学中心 (National Center for Advancing Translational Sciences) 临床与转化科学奖 (CTSA) 拨款 UL1TR004419 的支持。
POPLAR 队列 生存分析：POPLAR 队列的总体生存分析 (18, 92, 93) 采用 Kaplan-Meier 估算量和 Cox 回归，在根据是否存在三级淋巴结构 (TLS) 或淋巴聚集体 (LAs) 对患者进行分层后执行。TLS 或 LA 的标注由组织学成像确定。使用的 R 软件包包括：survival, survminer 和 gtsummary。
免疫细胞评分和通路分析：根据既往文献 (14, 15)（表 S4）生成不同免疫细胞类型的基因特征。每个特征的评分计算为该基因在所有患者样本中 z-score 的平均值。为了确定免疫细胞评分之间的相关性，计算了 Pearson 相关系数（双尾，95% 置信区间）。这些特征还用于通过基因集富集分析 (94) 确定显著的细胞信号通路。
统计学 在数据符合正态分布假设时，采用参数统计检验，如双尾 Student's t 检验（用于非配对比较）和配对 t 检验（用于配对比较）来评估两组之间的差异。对于非参数比较，首先使用 Kolmogorov-Smirnov 检验（用于非配对数据）或 Shapiro-Wilk 检验（用于配对数据）评估正态性。如果数据显著偏离正态分布，则非配对比较采用 Mann-Whitney U 检验，配对样本则采用 Wilcoxon 符号秩检验。对于涉及两组以上的比较，在满足正态分布假设时，采用单因素方差分析 (ANOVA) 随后进行 Tukey 多重比较检验。Kaplan-Meier 曲线使用对数秩 (Mantel-Cox) 检验进行比较。
参考文献与注释
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致谢 我们感谢 Mount Sinai 的 Marc and Jennifer Lipschultz 精准免疫学研究所的 Merad、Kamphorst 和 Brown 实验室的成员提供的富有洞察力的讨论和反馈。我们感谢 Mount Sinai 的流式细胞术核心设施、显微成像和高级生物成像核心设施、人类免疫监测中心 (HIMC)、比较医学与手术中心（负责动物饲养）以及 Mount Sinai Icahn 医学院的生物样本库与病理核心实验室（特别是 A. Soto 和 S. El Naggar）提供的支持。我们感谢 NIH 四聚体核心设施 (NIH 合同 75N93020D00005 和 RRID:SCR_026557) 提供的 I- Ab LCMV GP 66- 77 DIYKGVYQFKSV 单体。我们感谢参与临床研究的患者及其家属。我们认可 B. Y. Nabet (Genentech)、M. Dalod、R. Akyol、E. Tomasello (马赛-卢米尼免疫中心)、A. R. Sanchez- Paulete、J. A. Grout、M. Buckup、D. Feng、A. Lozano、C. M. Wilk、A. Saffon、N. Yatim、C. Azimi、L. Montégut、T. Chin、C. Noel、E. Katzin、C. Falcomatà、S. Balan、S. S. Nair (Mount Sinai Icahn 医学院)、Z. Yin (耶鲁大学医学院)、A. V. Tumanov (圣安东尼奥德克萨斯大学健康科学中心) 以及 M. Meylan (丹纳-法伯癌症研究所) 提供的宝贵帮助。总结图表是使用学术许可的 BioRender 创建的。这项工作部分得到了 Mount Sinai Icahn 医学院科学计算部门提供的计算资源和专业人员知识的支持。我们感谢勃林格殷格翰公司 (Boehringer Ingelheim, Inc.) 在 CRC 样本采集资源方面的赞助和支持。我们感谢 Vizgen, Inc. 对本研究中 MERFISH 数据生成的赞助和支持。Genentech/Roche 资助了 POPLAR 试验。资金：R.Ma. 由 2021 AACR- 阿斯特拉捷尼卡免疫肿瘤学研究奖学金（grant no. 21- 40- 12- MATT）资助；J.- C.L. 由 FCT - 科学技术基金会, I.P. (grant nos. 2023.15874.PEX 和 2024.17879.PEX) 资助。J.B. 由 CRI 2025 Irvington 博士后奖学金 (CRI12960) 资助。E.A. 由 Bodossaki 基金会访问研究科学家奖学金计划 (grant no. 9755) 资助。B.Y.S. 由美国国家卫生研究院 (NIH) 医学科学家培训计划 (T32GM146636) 和国家癌症研究所博士前奖学金 (F30CA301790) 资助。M.D.P. 由美国衰老研究联合会 (2021 Diana Jacobs Kalman 衰老生物学研究奖学金) 资助。S.H. 由国家癌症研究所 (K00CA223043 和 K99CA293148) 资助。M.T. 由欧洲研究委员会 (ERC) CoG 资助 (artFibro, 101088596)。A.L. 由 NIH/NCI R37CA230636, NIH/NCI R01CA251155 以及 Damon Runyon- Rachleff 创新奖资助。S.K.- S. 由 NIH 资助 (U24 CA224319, R01 DK1222853, U2C ES030859, DA055434, 1R01 HL166720- 01A1, 以及 U01OH012621) 和 Caribou Biosciences, Inc. 的资金资助。M.S. 由 R21AI180874, R21AI176069, R01AI160706 和 R01DK130425 等资助项目支持。S.Gn. 部分由 NIH 资助项目 CA224319, DK124165, CA263705 和 CA196521 支持。A.O.K. 和 T.U.M. 部分由 Tisch 癌症研究所癌症中心支持基金 (P30 CA196521) 资助。M.M. 部分由 NIH 资助项目 CA257195, CA254104 和 CA154947 支持。作者贡献：R.Ma. 和 M.M. 构思了该项目并获得了资金。R.Ma. 和 J.L.B. 进行了实验...
由 J.B., E.A., P.H., A.V., M.D.P., C.H., L.L., M.B., E.H., R.Me., S.H., J.An, R.A.O., E.N., 和 G.M.P. 提供帮助。L.H., B.Y.S., E.R., M.D.P., I.H.- V., D.D., J.- C.L., I.F., M.M.S., E.G.K., 和 V.R. 执行了计算分析。P.H. 设计了 MERFISH 库。R.Ma. 和 M.D.P. 设计了用于大体测序分析的基因列表。A.V., R.D., 和 J.B. 修改了 KP- HELLO 细胞系。R.Ma., E.A., P.H., A.V., H.M.K., L.T., R.A.K., C.H., L.L., F.R., M.E.K., I.P.M., G.I., S.O., A.Te., H.M., N.S., E.N., S.Go., A.M.R., A.Ta., 和 H.S. 执行了多路成像实验和分析。F.R. 和 R.Ma. 执行了光片实验。M.B., G.M., 和 R.Ma. 进行了类球体实验。R.Ma., P.H., L.T., 和 S.H. 处理了人类样本。C.H. 协调了临床和研究团队，并管理临床标本。S.O. 和 A.D.P. 为组织注释提供了病理学专业知识。M.N., M.T., J.Ah., N.B., A.L., Z.C., S.K.- S., J.D.B., M.S., C.M., S.Gn., F.G., K.M.M., C.S.- F., W.H.F., B.D.B., T.U.M., F.B., J.G.C., H.S., T.C.B., N.S.J., 和 A.O.K. 提供了知识投入、关键试剂和数据集。M.M. 监督了本研究。R.Ma. 撰写了初稿。R.Ma., J.B., 和 M.M. 撰写、审校并编辑了手稿。所有作者均对手稿初稿提供了反馈。
竞争利益：M.M. 在 Dren Bio Inc., Owkin Inc., Larkspur Inc., 和 Myeloid therapeutics Inc. 的科学顾问委员会任职并持有其股票；在 OSE Inc. 的科学顾问委员会任职；并收到来自 Regeneron Inc. 和 Boehringer Ingelheim Inc. 的合同研究资助。T.C.B. 是 Galvanize Therapeutics, Mestag Therapeutics, Tallac Therapeutics, Attivare Therapeutics, 和 Kalivir Therapeutics 的顾问，并在 Tabby Therapeutics 的科学顾问委员会任职。T.U.M. 曾在 Rockefeller University, Regeneron Pharmaceuticals, Abbvie, Bristol- Meyers Squibb, Boehringer Ingelheim, Atara, AstraZeneca, Genentech, Celldex, Chimeric, Glenmark, Simcere, Surface, G1 Therapeutics, NGMbio, DBV Technologies, Arcus, 和 Astellas 的顾问和/或数据安全监测委员会任职，并获得来自 Regeneron, Bristol- Myers Squibb, Merck, 和 Boehringer Ingelheim 的研究资助。M.S. 实验室在与 Phio Pharmaceuticals, 7Hills Pharma, ArgenX NV, Ziphius, 和 Moderna 的赞助研究协议中获得了无关的资金支持。S.Gn. 报告过去曾担任 Merck 和 OncoMed 的顾问或咨询角色，并获得来自 Regeneron Pharmaceuticals, Boehringer Ingelheim, Bristol Myers Squibb, Celgene, Genentech, EMD Serono, Pfizer 和 Takeda 的研究资助，均与当前工作无关。S.Gn. 和 M.M. 是一项已颁布专利（US20190120845A1）的共同发明人，该专利涉及用于表征肿瘤和治疗反应的多路 IHC 技术的。该技术通过 Mount Sinai 的 Icahn 医学院 (ISMMS) 提交，目前尚未许可。此技术被用于本研究中的组织评估，其结果可能会影响该技术的价值。C.M. 在执行此项工作时是 Genentech Inc. 的员工并持有公司股票。C.M. 是 Genentech, Inc. 持有的专利 US20230279067A1 的发明人，该专利涵盖“用于 FLT3 的配体融合蛋白及其使用方法”。N.B. 是帕克癌症免疫治疗研究所 (PICI) 的外部成员，持有 BreakBio 的股票期权，担任 Genotwin 和 DC Prime 的顾问和/或董事会成员并持有其股票期权，担任 Cell BioEngines 的顾问和/或董事会成员并持有其股权，持有 Barinthus 的股票，是一个
为默克研究实验室（Merck Research Laboratories）提供咨询并获得了其资助，接收了 Oncovir 的药物产品，并担任 Aikium（持有股票期权）和 Epitopea 的科学顾问委员会成员。I.P.M. 是 Galvanize Therapeutics, Inc. 的有偿顾问。其余作者声明不存在竞争利益。数据、代码和材料可用性：用于探索 TLS 空间数据（Visium SD/HD、MERFISH 和 CyCIF）的交互式网站可见于 https://rstudio-connect.hpc.mssm.edu/mattiuz_science2026_tls_spatial_data/。本研究除相关“材料与方法”部分以及 (78) 中所述的软件流水线外，未使用新软件流水线。所有数据分析脚本均采用现有方法，并提供在本文配套的 GitHub 仓库中（https://github.com/Merad-Lab/Mattiuz2026_Manuscript_Code/）。本研究生成的用于人类癌症 FFPE Visium SD 数据集以及人类 HCC 和 NSCLC MERFISH 数据集的处理矩阵文件和元数据，可通过登录号 GSE322553 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?&acc=GSE322553) 和 GSE327192 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?&acc=GSE327192) 获取。重新分析的已发表数据集登录号包括：人类肾癌 FFPE Visium SD 数据集 (GSE175540)、外部 NSCLC 批量 RNA-seq 数据集 (EGAS00001005013)，以及 NSCLC 和 HCC scRNA-seq 数据集 (GSE154826, GSE206325, 和 GSE183219)。公开的 10x Genomics Visium HD NSCLC 数据集可通过以下链接获取：lunghd_1, https://www.10xgenomics.com/datasets/visium-hd-cytassist-gene-expression-human-lung-cancer-post-xenium-expt; lunghd_2, https://www.10xgenomics.com/datasets/visium-hd-cytassist-gene-expression-human-lung-cancer-post-xenium-expt; lunghd_3, https://www.10xgenomics.com/datasets/visium-hd-cytassist-gene-expression-libraries-of-human-lung-cancer-if; 以及 lunghd_4, https://www.10xgenomics.com/datasets/visium-hd-cytassist-gene-expression-human-lung-cancer-fixed-frozen。Xcr1-Venus 小鼠可通过 T. Kaisho 在与和歌山医疗大学（Wakayama Medical University）签署的材料转移协议（MTA）下提供。KP-HELLO-2 细胞可通过 R.Ma. 和 M.M. 经由西奈山伊坎医学院（Icahn School of Medicine at Mount Sinai）在材料转移协议下获取用于研究。解释本文报道数据所需的任何额外信息，可通过请求联系通讯作者 M.M. 获取。许可信息：版权所有 © 2026 作者，保留部分权利；独家许可方为美国科学促进会 (AAAS)。不对原始美国政府作品主张权利。https://www.science.org/about/science-licenses-journal-article-reuse。
本研究全部或部分由 ERC (artFibro, 101088596) 资助)；根据要求，作者将根据 CC BY 公共版权许可协议提供“作者接受稿”（AAM）版本。
补充材料 science.org/doi/10.1126/science.ady1678 图 S1 至 S7；表 S1 至 S6；MDAR 可重复性检查表；视频 S1 和 S2
通过组织驻留巨噬细胞恢复对衰老中性粒细胞的清除可限制器官衰老
Yuting Jessy Tan, Travis E. Conley, Fuwen Yao, Fernando J. García- Marqués, Damilola E. Akinyemi, Van Vuong Dinh, Qian Wang, Abel Bermudez, Jieun Kim, Julia A. Belk, Oliver Soehnlein, Sharon J. Pitteri, Katrin I. Andreasson*
引言：衰老伴随着各器官功能的并行下降，但其细胞驱动因素尚不明确。组织驻留巨噬细胞 (TRMs) 是长寿细胞，构成了主要器官中 60 到 90% 的巨噬细胞，通过对凋亡细胞和衰老细胞的胞葬作用（efferocytosis）来维持稳态。中性粒细胞是产生最丰富且寿命最短的白细胞（人类每天产生超过 100 billion 个），需要 TRM 持续清除；未被清除的老化中性粒细胞会释放蛋白酶和细胞外陷阱，从而损害组织并加速衰老。TRMs 表达前列腺素 E2 (PGE2) 受体 EP2，该受体在衰老过程中会抑制巨噬细胞的代谢和吞噬作用。TRM 胞葬作用受损是否驱动了促进器官衰老的老化中性粒细胞的积累，以及抑制 EP2 信号传导是否能恢复这一过程，目前仍不清楚。
理论依据：我们研究了 TRMs 上的 EP2 信号选择性降低的老年小鼠（通过基因手段 [TRM 特异性 EP2 缺失] 或药理学手段），以定义 TRM 功能障碍如何塑造全器官的衰老。TRMs 是组织稳态的长寿门卫，而 EP2 是一个易于处理的靶点，因为其活性在老年巨噬细胞中增加，并抑制其代谢和吞噬功能。通过互补的基因和药理学方法，我们测试了恢复 TRM 功能是否能逆转器官衰老，并确定了哪种胞葬底物受影响最严重。同样的实验设计还定义了 EP2 在 TRMs 内部作用的分子步骤，并将我们的发现扩展到人类衰老组织。
结果：在老年小鼠中，TRM 特异性 EP2 缺失恢复了线粒体健康和免疫稳态，并将认知能力下降、衰弱、肌肉减少症、肥胖和心脏功能障碍逆转至年轻状态。血浆蛋白质组学确定肝脏是与年龄相关的免疫变化的主要来源。小鼠肝脏的单细胞 RNA-seq 和多器官流式细胞术显示，在衰老过程中，胞葬器官中积累了衰老的 CXCR4⁺ 中性粒细胞。这些细胞表现出衰老相关分泌表型 (SASP)、DNA 损伤反应激活、细胞周期抑制剂诱导、NETosis 以及抗凋亡程序，并在 EP2 缺失后被高效清除。肝脏多路成像将旁分泌压力定位在衰老中性粒细胞相邻的实质细胞中。离体胞葬实验表明，与凋亡底物相比，老年 TRMs 在清除衰老中性粒细胞方面的功能受损最为严重，而 EP2 缺失或药理学拮抗均能恢复这两种功能。在机制上，EP2 信号抑制了衰老中性粒细胞在 TRMs 上的整合素依赖性稳定化及其下游的吞噬作用。对人类肝脏和心脏数据集的分析显示，老年 TRMs 中存在保守的 EP2 上调、衰老中性粒细胞富集以及 TRM-中性粒细胞相互作用减少。
组织驻留巨噬细胞 (TRM) 对衰老中性粒细胞的清除作用可通过删除或抑制 EP2 来恢复，从而限制器官衰老。(顶部) 在衰老的 TRM 中，EP2 信号传导抑制了 (1) 与清除衰老中性粒细胞 (Neu) 配体所需的整合素结合，以及 (2) 将衰老中性粒细胞吞噬至吞噬溶酶体中，从而导致衰老中性粒细胞积累，(3) 发生脱颗粒作用和 NETosis，并 (4) 对相邻的实质细胞产生旁分泌压力，(5) 共同驱动器官衰老。(底部) EP2 的删除或抑制恢复了 (1) 整合素介导的相互作用和 (2) 吞噬溶酶体吞噬，从而限制了 (3) 脱颗粒作用和 NETosis、(4) 旁分泌压力以及 (5) 器官衰老。 NETosis，中性粒细胞胞外陷阱 (NET) 形成；AC，腺苷酸环化酶；PKA，蛋白激酶 A；TFs，转录因子。
衰老中性粒细胞的清除，将衰老重新定义为一种主动细胞清除的失效，而非被动的退化。随着年龄增长，中性粒细胞获得与衰老相关的特征，其积累通过两种趋同的机制驱动组织损伤：内在的脱颗粒作用和 NETosis，以及对相邻实质细胞的外在旁分泌压力。药理学抑制 EP2 可恢复 TRM 的胞葬能力并促进衰老中性粒细胞的清除，使 EP2 拮抗成为一种可行的治疗策略，用于应对与年龄相关的器官和功能衰退。
全文及作者单位列表： https://doi.org/10.1126/ science.aea3075
组织驻留巨噬细胞恢复对衰老中性粒细胞的清除可限制器官老化
Yuting Jessy Tan1, Travis E. Conley1, Fuwen Yao1, Fernando J. García- Marqués2, Damilola E. Akinyemi3, Van Vuong Dinh3, Qian Wang1, Abel Bermudez2, Jieun Kim4, Julia A. Belk5, Oliver Soehnlein3, Sharon J. Pitteri2, Katrin I. Andreasson1,6,7,8*
衰老破坏了整个器官系统的组织稳态。在本文中，我们将组织驻留巨噬细胞 (TRMs) 鉴定为与年龄相关的器官衰退的核心协调者，其机制是通过受免疫调节前列腺素 E2 (PGE2) 受体 EP2 调控的衰老中性粒细胞清除功能受损而实现的。在老年小鼠中降低 TRM EP2 信号传导可维持年轻状态的线粒体健康，并预防认知能力下降、衰弱、肌肉减少症、肥胖、心脏功能受损及全身性炎症。血浆蛋白质组学表明，肝脏是与年龄相关的免疫变化的主要来源，其中降低 TRM EP2 信号传导可挽救中性粒细胞的胞葬作用 (efferocytosis)，并防止邻近细胞的旁分泌应激。在老年及患病的人类组织中也观察到了 TRM EP2 表达升高和衰老中性粒细胞。药物性 EP2 抑制可恢复年轻状态的中性粒细胞清除，证明了 TRM 胞葬作用受损是导致衰老过程中器官衰退的一个可逆驱动因素。
衰老的标志是组织完整性、再生能力和免疫平衡的渐进性崩溃 (1, 2)。这种衰退与全身性炎症以及多种慢性衰老疾病的发展密切相关，包括认知能力下降、血管疾病、衰弱、肌肉减少症和代谢综合征。尽管已经鉴定出衰老的分子特征，但启动并推动组织衰退的细胞事件仍缺乏明确定义 (3)。
巨噬细胞是组织稳态、炎症和修复的核心调节因子 (4)。在衰老过程中，巨噬细胞表型向慢性炎症和吞噬功能障碍转变，但这些变化是因果关系还是补偿机制尚未解决 (5)。在巨噬细胞亚型中，组织驻留巨噬细胞 (TRMs) 因其早期的发育起源、长寿及其在组织生态位中的整合，作为衰老潜在启动因子而引起了越来越多的关注 (6, 7)。TRMs 主要起源于卵黄囊祖细胞和胎肝单核细胞，具有自我更新能力且终身存在，同时在出生后根据组织不同程度地由单核细胞衍生巨噬细胞 (MDMs) 贡献，而 MDMs 本身寿命较短且自我更新能力有限 (7–12)。
在脑、肝、肺、心和肾中，TRMs 占巨噬细胞的 60 到 90% (7–9, 13, 14)，且其较长的寿命使其特别容易受到衰老的影响，因为它们在数年到数十年间累积了代谢、氧化和炎症损伤 (15, 16)。大脑中几乎全部由 TRMs 组成，估计有 10 到 20 billion 个。
1美国加利福尼亚州斯坦福，斯坦福大学医学院神经学与神经科学系。 2美国加利福尼亚州帕洛阿尔托，斯坦福大学医学院放射学系。 3德国北莱茵-威斯特法伦州明斯特，明斯特大学实验病理学研究所 (ExPat)，分子炎症生物学中心 (ZMBE)。 4美国加利福尼亚州斯坦福，斯坦福大学吴在璀神经科学研究所，神经科学临床前成像实验室。 5美国加利福尼亚州斯坦福，斯坦福大学病理学系。 6美国加利福尼亚州斯坦福，斯坦福大学吴在璀神经科学研究所。 7美国加利福尼亚州斯坦福，斯坦福大学吴在璀神经科学研究所，Phil and Penny Knight 脑韧性计划。 8美国加利福尼亚州旧金山，陈赞德伯格生物枢纽 (Chan Zuckerberg Biohub)。 *通讯作者：kandreas@ stanford. edu
小胶质细胞，而外周组织则共同包含约 200 billion 个组织驻留巨噬细胞 (TRMs) (17, 18)。鉴于其数量之多且遍布于各个器官，TRMs 的年龄相关变化可能是器官功能障碍和系统性衰老的重要细胞驱动因素。
TRM 的一个核心功能是胞葬作用（efferocytosis），即清除凋亡、衰老和受损的细胞，这对于防止慢性炎症至关重要 (19)。TRM 的主要目标之一是中性粒细胞，它是产生最丰富的免疫细胞，小鼠和人类每天分别产生超过 10 billion 和 100 billion 个 (20, 21)。中性粒细胞是寿命最短的免疫细胞之一，在血液循环中几小时内即发生衰老，并需要持续清除 (22, 23)。未被清除的衰老中性粒细胞会释放蛋白酶和细胞外陷阱，从而损害组织、传播炎症并促进衰老 (24–26)，而这些细胞通常由肝脏、脾脏和骨髓中的 TRMs 高效清除 (27–30)。
TRMs 还表达免疫调节信号的受体，包括脂质信使前列腺素 E2 (PGE2) 的受体，后者是炎症环氧合酶-2 (COX-2) 通路的一种下游产物。PGE2 通过四种 G 蛋白偶联受体 (EP1 至 EP4) 诱导促炎或抗炎效应。在衰老的巨噬细胞中，PGE2-EP2 信号传导会抑制糖酵解和线粒体呼吸，从而干扰吞噬作用和炎症消退 (31)。在此，我们确定 TRM 对衰老中性粒细胞的清除是器官衰老的一个关键驱动因素，并证明该过程受 PGE2 受体 EP2 的调节。
结果 衰老 TRMs 中的 EP2 缺失可维持线粒体健康和器官免疫稳态 TRMs 主要在产前由卵黄囊来源的红细胞-髓系祖细胞 (EMPs) 产生，并在整个生命周期中进行局部自我更新；而单核细胞来源的巨噬细胞 (MDMs) 则在产后由骨髓造血干细胞 (HSCs) 产生，并由血液循环持续补充，且 MDMs 会根据组织的具体情况转化为长期驻留的类 TRM 细胞 (图 1A) (8, 11, 12)。CX3CR1 在 TRMs 中高度表达，但在 MDMs 中表达较低，使其成为偏向性靶向 TRM 的实用标记物，我们随后利用驻留特异性读数对其进行了进一步优化。为了研究 TRMs 中的 EP2 信号传导，我们将 Cx3cr1CreER 小鼠与 Ptger2lox/lox 小鼠杂交，以便在妥姆昔芬处理后条件性地删除 CX3CR1+ 细胞中的 EP2 (EP2 cKO；图 1B)。
我们验证了在年轻（6 至 8 个月大）的野生型 (WT)、(Cx3cr1CreER) 以及在 2 个月前给予妥姆昔芬的 EP2 cKO 小鼠中，TRM 选择性 EP2 删除的情况。在肝脏、肺和心脏中，TRMs 占组织巨噬细胞的 65 到 80%，且 EP2 表达率 >95%，而在 cKO 小鼠中删除率约为 50 到 60%。仅在肝脏和肺部检测到的 MDM EP2 减少幅度极小 (<10%)，这是由于 CX3CR1 表达量低，且 MDMs 由 CX3CR1− HSCs 持续补充 (32, 33)，从而稀释了 Cre 介导的删除，而 TRM 的自我更新则使其删除状态保持稳定 (图 S1)。总体而言，在 cKO 小鼠中，EP2+ 巨噬细胞比例从约 80 降至约 40%，这几乎完全是由 TRMs 驱动的。
由于 CX3CR1 在组织驻留巨噬细胞 (TRMs) 和单核细胞来源巨噬细胞 (MDMs) 中均有表达，Cre 介导的缺失在原则上可以作用于任何一个群体，而与其在组织中的驻留时间无关。因此，我们通过 TIM4（一个独立于发育起源的经典驻留标志物）对肝脏和肺部巨噬细胞进行分层，以测试是驻留状态而非发育起源决定了 EP2 的缺失 (34, 35)。在两种基因型的年轻和年老小鼠中，TIM4 在约 80 到 90% 的肝脏和肺部巨噬细胞中表达，且 TIM4+ 细胞中 Clec4f（肝脏）和 SiglecF（肺部）的共表达率约为 85 到 95%，而 TIM4− 细胞表达这些标志物的比例 <10%，这确立了 TIM4+ 巨噬细胞为真正的 TRMs。在 WT 小鼠中，约 90 到 95% 的 TIM4+ TRMs 表达 EP2，而在 cKO 小鼠中该比例约为 45 到 50%；与之相对，无论基因型如何，TIM4− 巨噬细胞的 EP2 表达率均维持在约 25%，且这一模式在年老小鼠中得以保留 (fig. S2)。因此，Cx3cr1CreER 驱动的 EP2 缺失与驻留状态相关：TIM4+ TRMs 优先丢失 EP2，而 TIM4− 非驻留巨噬细胞则不然，这表明存在一种独立于发育起源的 TRM 偏向性缺失。
接下来，我们比较了年轻和年老（23 至 25 个月大）的 WT 和 EP2 cKO 小鼠的肝脏、肺和大脑。在大脑中，我们进一步区分了小胶质细胞 (TRMs)、损伤相关巨噬细胞 (DAMs)、边界相关巨噬细胞 (BAMs) 和 MDMs (36, 37)（图 S3A）。无论年龄如何，TRMs 在肺（~70 至 80%）和大脑（>90%）中均占主导地位，而年老肝脏中的 TRMs（~55%）明显少于年轻肝脏（~75 至 80%），且这种缺失在年老 EP2 cKO 小鼠中得到了恢复（图 1C）。在不同器官和年龄中，CX3CR1 在 TRMs 中保持稳定高表达（~70 至 90%），在 MDMs 中保持低表达（~10 至 30%）（图 1D）。EP2 在所有器官的 TRMs 中表达最高，年老 TRM 的缺失效率（~50 至 60%）与年轻小鼠相当（图 1E）；在大脑中，EP2 也能在 DAMs（~70%）、BAMs（~80%）和 MDMs（~50%）中检测到，cKO 将 TRMs、DAMs 和 BAMs 中的 EP2 降低了 ~40 至 50%，而 MDM 的缺失则可忽略不计。淋巴样 EP2 在肝脏和肺中较低（<5%），但在脑膜固有淋巴细胞 (ILCs)、自然杀伤 (NK) 细胞和 CD4 T 细胞中较高（>40%），反映了独特的脑膜免疫环境 (38)。由于 TRMs 占总 EP2 损失的 >95%，跨器官的 EP2+ 细胞总体比例下降了 ~50%（图 1, F 和 G），证实了强有力的、TRM 偏向性的 EP2 缺失在衰老过程中得以维持。
为了比较衰老对 TRMs 与 MDMs 的影响，我们使用既定标记物检查了腹腔，以区分 TRMs (CD45+CD11bhiF4/80+) 和 MDMs (CD45+CD11bintF4/80−CCR2+) (39)（图 S3B）。与 MDMs 相比，TRM 的丰度随年龄增长而显著下降，而这种损失在年老 EP2 cKO 小鼠中得到了防止（图 1H）。这种选择性保护促使我们检查线粒体功能，它是 TRM 生存和吞噬能力的关键决定因素 (40)。年老 TRMs 显示出线粒体质量和膜电位降低以及超氧化物升高，而这些指标在年老 EP2 cKO 小鼠中基本恢复到了年轻水平（图 1, I 至 K, 以及图 S3, C 至 E）。MDMs 仅显示超氧化物增加，而在比例、质量或膜电位方面没有变化。
衰老伴随着低级别的全身性炎症，这是血管、代谢和神经退行性疾病的基础。我们测试了 TRM EP2 缺失是否能逆转血浆和主要器官中的这种炎症状态。在年老小鼠中，TRM EP2 缺失将血浆、肝脏、结肠、心脏、肾脏和海马体的炎症图谱恢复到了年轻状态（图 1, L 至 Q, 以及图 S4, A 至 F）。年老 EP2 cKO 小鼠的血浆内毒素恢复到接近年轻的浓度（图 1R），反映了肠道屏障完整性的改善或血液内毒素清除能力的增强。因此，TRMs 通过 PGE2-EP2 信号传导驱动全身和器官范围的年龄相关炎症。
TRM EP2 缺失限制了器官功能的年龄相关下降 由于 TRM EP2 缺失恢复了多个器官和血液中的年轻免疫特征（图 1），我们测试了这些变化是否伴随着器官功能的改善。
小胶质细胞是大脑的 TRMs，源自卵黄囊并强表达 Cx3cr1 (41)。为了测试小胶质细胞是否影响认知功能，我们在 Barnes 迷宫（海马依赖性空间记忆）和新物体识别（皮层依赖性识别记忆）任务中检查了年轻（6 至 8 个月大）和年老（23 至 25 个月大）的雄性 EP2 cKO 和 WT 小鼠。与年老 WT 小鼠相比，年老 EP2 cKO 小鼠的短期和长期空间记忆（第 4 天和第 14 天）均得到了显著改善（图 2A, 以及图 S4, G 和 H）。年老 EP2 cKO 小鼠还重新获得了基于物体的情景记忆，表现与年轻小鼠相当（图 2B）。因此，小胶质细胞 EP2 信号传导是年龄相关记忆下降的一个重要驱动因素。
在常规处理过程中，年长的 EP2 cKO 小鼠看起来比同窝的 WT 小鼠更苗条且身体状态更好。全身 MRI 证实，年长 EP2 cKO 小鼠的肢体肌肉体积增加且内脏脂肪减少，接近年轻小鼠的水平（图 2, C 至 E）。这些变化以及皮下脂肪的减少（图 S4I），与衰弱评分的改善（图 2F）、前肢力量的增强（图 2G 和图 S4I）以及肌肉纤维组成和结构的维持（图 2, H 和 I）相关。MHCIIa+ 纤维通过氧化代谢提供耐力 (42)，这类纤维在年长 WT 小鼠中大幅减少，但在年长 EP2 cKO 小鼠中得到了恢复。异常的肌核定位（sarcopenia 即肌肉减少症和肌肉再生受损的标志 (43)）也很大程度上恢复到了年轻模式（图 2J 和图 S4J）。
随后，我们测试了年长 EP2 cKO 小鼠中骨骼肌衰老的缓解是否延伸至心脏——心脏是一个高度血管化、富含线粒体的器官，其功能同样随年龄增长而恶化 (44)。心脏 MRI 显示，TRM EP2 的缺失维持了年轻状态的左心室射出分数、室间隔壁厚以及左心室 (LV)/右心室 (RV) 比率，这与收缩功能的改善一致（图 2, K 和 L）。鉴于心脏的高能量需求，我们使用透射电子显微镜 (TEM) 检查了心肌细胞中的线粒体完整性。年长 WT 心脏中出现了更多电子密度较低（lucent）且嵴结构破坏的线粒体；相比之下，EP2 cKO 心脏显示出电子密度更高、与年轻心脏相似的线粒体（图 2, M 和 N，以及图 S4K）。我们还测量了心肌僵硬度，这种僵硬度在衰老过程中会增加，部分是由细胞外基质沉积（尤其是胶原蛋白）驱动的。三色染色显示，年长 WT 小鼠心室壁中存在胶原蛋白积累，而年长 EP2 cKO 小鼠中的积累量减少至接近年轻水平。胶原蛋白提取和纤维分离视图证实，年长 EP2 cKO 小鼠的纤维化减轻，且肌肉纤维完整性得以维持（图 2, O 和 P）。综上所述，这些发现表明 TRM EP2 的缺失限制了衰老心脏有害的结构和功能重构，且在 CX3CR1+ TRMs 中选择性靶向 EP2 可以广泛改善与年龄相关的认知、骨骼肌、脂肪分布和心脏功能的下降。
TRM EP2 缺失使衰老血浆蛋白质组保持在年轻状态
鉴于观察到 TRM 特异性 EP2 缺失带来的广泛多器官改善，我们试图确定这些变化的系统性介质。由于血液循环整合了跨组织免疫和代谢信号，我们使用基于串联质谱标签 (TMT) 的液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS)，对年轻和年长的 WT 及 EP2 cKO 小鼠进行了定量血浆蛋白质组分析（图 3A）。在去除高丰度血浆蛋白后，确信地定量了 138 种蛋白质（>2 个唯一肽段）。其中，71 种蛋白质随年龄增长而显著改变，且 59 种蛋白质在年长 EP2 cKO 小鼠中恢复到了年轻水平（图 3B）。主成分分析 (PCA) 显示，年长 WT 血浆与年长 EP2 cKO 组及年轻组之间有明显的区分（图 3C）。被救回蛋白质的通路富集分析识别出广泛的免疫重构，包括急性期反应、IL-12 信号传导、整合素 (integrin) 信号传导、IL-10 信号传导以及中性粒细胞脱颗粒（图 3, D 至 F）。
为了确定驱动这些与年龄相关的血浆变化的组织来源，我们利用组织特异性蛋白质组学特征进行了细胞类型富集分析。该分析显示，肝细胞、库普弗细胞（KCs）和胆管细胞是最富集的细胞来源（图 3G），这表明肝脏是血液中与衰老相关变化的主要贡献者。尽管肝脏在传统上被视为代谢中心，但它也是 TRM 最丰富的器官之一 (17)，起到过滤门静脉血和循环血的作用，同时维持肝脏及全身的免疫稳态 (45)。与此一致，衰老与血清中肝脏炎症和损伤生物标志物的升高相关，包括天门冬氨酸氨基转移酶 (AST)、丙氨酸氨基转移酶 (ALT)、$\gamma$-谷氨酰转移酶 (GGT)、碱性磷酸酶和 C-反应蛋白，而所有这些指标在年老且缺失 EP2 的 cKO 小鼠中均恢复到了接近年轻时的水平（图 3H）。这些发现支持了肝脏（且很可能是肝脏 TRMs）在驱动与年龄相关的全身性免疫变化中发挥核心作用，而这种变化在很大程度上可以通过缺失 TRM EP2 来防止。
图 1. TRM-选择性 EP2 缺失可恢复衰老过程中的线粒体与免疫稳态。数据为平均值 ± SEM。统计检验：(C) 和 (H 至 R) 采用双向方差分析 (ANOVA) 及 Tukey 事后检验；(D 和 E) 采用非配对双尾 t 检验。P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001, **P < 0.0001。检测对象为年轻 (yng) (6 to 8 个月) 和高龄 (23 to 25 个月) 的 C57BL/6J 雄性 Cx3cr1CreER (WT) 以及 Cx3cr1CreER;EP2lox/lox (EP2 cKO) 小鼠。(A) 组织驻留巨噬细胞 (MΦ) 的来源。TRMs 主要源自卵黄囊衍生的 EMPs，表达 CX3CR1hi，并在整个生命周期中自我更新。MDMs 在出生后源自 HSC 衍生的单核细胞，表达 CX3CR1low，并由血液循环不断补充。虚线箭头表示 MDMs 向类 TRM 细胞的组织依赖性转化。在驻留 MΦ 图表中，细胞大小近似于
相对丰度。LPM，大腹腔巨噬细胞；RPM，红髓巨噬细胞。(B) TRM-选择性 EP2 条件性敲除 (EP2 cKO) 小鼠的构建。两种基因型的小鼠在 4 到 6 个月龄时均给予他莫昔芬。分别在 6 到 8 个月和 23 到 25 个月时对青年和老年小鼠进行评估。i.p.，腹腔注射。(C) 肝脏、肺部和大脑中巨噬细胞池内 TRM 和 MDM 的平均比例。每组 n = 8 到 10 只小鼠。(D) 肝脏、肺部和大脑中 TRM 和 MDM 亚群的 CX3CR1 表达百分比。每个年龄组 n = 18 只小鼠（WT 和 cKO 合并）。(E) 肝脏、肺部和大脑中免疫细胞亚群的 EP2 表达百分比。小写字母 (a 和 b) 表示每个年龄组内野生型和 cKO 之间的显著差异。Neu，中性粒细胞；ILC，固有淋巴细胞；DAM，损伤相关巨噬细胞；BAM，边界相关巨噬细胞。每组 n = 8 到 10 只小鼠。(F) 肝脏、肺部和大脑中每百万个 CD45+ 细胞的平均免疫细胞百分比。细胞类型按指示的颜色编码。数据是对所有年龄和基因型组的平均值。每个器官 N = 36 只小鼠。(G) 肝脏、肺部和大脑中按免疫亚群划分的每百万个 CD45+ 细胞的平均 EP2+ 和 EP2− 细胞百分比。实心条，EP2+；阴影条，EP2−。淋巴细胞 (Lymph.) 包括 ILC、NK、CD4 T、CD8 T 和 B 细胞。数据是在每个基因型组内对青年和老年小鼠合并后的平均值。每种基因型 n = 18 只小鼠。(H) CD45+CD11b+ 细胞内腹腔 TRM 和 MDM 的百分比。PTM，腹腔 MΦ；每组 n = 6 到 12 只小鼠。(I) 至 (K) 腹腔 TRM 和 MDM 的线粒体特征：线粒体质量 (MitoGreen MFI) (I)，内膜电位 (ΔΨm; MitoRed MFI) (J)，以及产生超氧化物的 MΦ 百分比 (MitoSOX+) (K)。
MFI，平均荧光强度。每组 n = 6 到 12 只小鼠。(L 至 Q) 通过 Luminex 对青年和老年 WT 及 EP2 cKO 小鼠的血浆、肝脏、结肠、心脏、肾脏和海马体中显著调节的免疫因子 (*P < 0.05, 双因素方差分析) 进行无监督层次聚类。每个热图值代表两次技术重复的平均值。每组 n = 7 到 13 只小鼠。(R) 青年和老年 WT 及 EP2 cKO 小鼠的血浆内毒素。每组 n = 7 到 13 只小鼠。
TRM EP2 缺失可逆转衰老过程中胞葬器官中衰老中性粒细胞的累积 鉴于肝脏在塑造衰老免疫景观中的核心作用 (图 3)，我们对肝脏进行了单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq)，同时富集了 CD45+ 白细胞以及肝细胞和内皮细胞 (图 S5A)。均匀流形近似与投影 (UMAP) 聚类 (图 4A 和 图 S5, B 和 C) 显示，与其他三组相比，老年 WT 小鼠的中性粒细胞发生了显著偏移 (图 4B)。结合伪时间分析的子聚类鉴定出四种沿 Neu1 至 Neu4 轨迹排列的中性粒细胞状态，其中老年 WT 中性粒细胞偏向于 Neu2 和 Neu3 状态 (图 4, C 和 D)。Neu2 和 Neu3 在青年和老年 cKO 小鼠中几乎不存在，而在老年 WT 小鼠中分别扩增至中性粒细胞的 ~50 和 ~30% (图 4E)。
差异表达分析显示，Neu1 和 Neu4 携带急性免疫反应和组织相互作用程序，且不受 TRM EP2 缺失的影响。相比之下，Neu2 和 Neu3 的特征在年老的 WT 小鼠中达到峰值，并在年老的 EP2 cKO 小鼠中向年轻的表达水平回归（图 4F）。Neu2 富集了促炎警报素、周期蛋白依赖性激酶 (CDK) 抑制剂和抗凋亡因子，这与衰老相关分泌表型 (SASP) 和细胞周期停滞 (CCA) 程序一致；而 Neu3 则显示出 DNA 损伤反应 (DDR) 基因、促凋亡因子以及与中性粒细胞细胞外陷阱 (NET) 形成相关的颗粒蛋白基因的富集。综合来看，这些程序表明了一种衰老的中性粒细胞状态，包含 SASP、DDR、凋亡耐受和 CCA，尽管目前尚缺乏中性粒细胞衰老的共识框架，且现有的聚焦于 SASP 的检测组对小鼠免疫细胞的适用性有限 (46–48)。
尽管中性粒细胞被认为是终末分化的，但它们保留了细胞周期机制（CDK4/6、周期蛋白、层粘蛋白激酶），这些机制被重新用于非增殖功能，包括 NET 形成过程中的核膜分解 (CDK4/6)、脱颗粒 (CDK5) 以及凋亡时机的控制 (CDK7/9) (49–51)。由于现有的衰老框架可能并非为中性粒细胞设计（在中性粒细胞中，细胞周期组件被征用于非传统的效应作用），我们筛选了一个在 >20% 的中性粒细胞中检测到的 57 基因检测组，以进一步表征与 Neu2 和 Neu3 亚群相关的衰老和凋亡程序。该检测组被组织为与 MICSE 一致的类别（CCA、抗凋亡、DDR），并增加了促凋亡和 NET 形成的模块，以区分凋亡状态与衰老状态，并捕捉年老中性粒细胞的标志性特征（图 S5, D 至 I）。Neu2 在 CCA、SASP 和抗凋亡方面的得分最高，而 Neu3 则显示出最强的 DDR、NET 形成和促凋亡特征，其中年老 WT 在各类别中得分最高（图 4G）。综合衰老（CCA + SASP + 抗凋亡）和压力（DDR + NET 形成 + 促凋亡）得分将 Neu2 置于高衰老象限，而 Neu3 的一个子集形成了一个向高压力象限演进的过渡群体，这与衰老中性粒细胞逐渐获取压力并最终导致凋亡的过程一致（图 4H）。因此，Neu2 定义了衰老且耐凋亡的中性粒细胞，而 Neu3 则代表了向凋亡过渡的受压中性粒细胞。
中性粒细胞在循环中衰老迅速，在 8 到 12 小时内会获得 CXCR4hiCD62Llo 表型 (22, 52)，这使得骨髓、肝脏和脾脏中组织驻留巨噬细胞 (TRMs) 的清除作用对于免疫稳态至关重要 (图 4I)。在组织积聚后，衰老的中性粒细胞倾向于进行脱颗粒和 NET 形成，从而放大无菌性炎症 (53)。对 Cx3cr1CreER 小鼠肝脏的流式细胞术分析确认，尽管总中性粒细胞数量未改变，但衰老 WT 小鼠积聚了 CXCR4+ 和 annexin V+ 中性粒细胞，而这一表型在衰老 cKO 小鼠中得到了逆转 (图 4, J 和 K)。这些数据将转录组学的 Neu2（衰老）和 Neu3（促凋亡）状态与表面表型联系起来；此后，我们将 CXCR4hi 中性粒细胞称为衰老中性粒细胞。在衰老 EP2 cKO 小鼠中，血液中性粒细胞的穿出 (CXCR2+)、衰老 (CXCR4+, CD62L−)、脱颗粒 (CD63+) 和凋亡 (annexin V+) 标志物同样恢复到接近年轻状态的水平 (图 S6, A 和 B)。肝脏髓过氧化物酶 (MPO) 是中性粒细胞负担和 NET 形成的标志物 (53)，其在衰老 WT 小鼠中升高，而在衰老 EP2 cKO 小鼠中恢复到接近年轻状态的水平 (图 S6C)。这一表型在第二个遗传模型中得到了重复，即在 4 到 6 个月龄时使用他莫昔芬诱导的 Rosa26CreER 全身 EP2 缺失模型 (图 S6, D 和 E)。该遗传模型与 Cx3cr1CreER 模型相重叠，因为 EP2 主要在巨噬细胞中表达，在中性粒细胞中的基础表达极低，而在 TRMs 中表达最高 (图 S7A)。
肝脏和血浆中 CXCL1 和 CXCL2（驱动中性粒细胞招募的关键 CXCR2 配体）的丰度随年龄增长没有变化 (图 1, L 和 M)，这表明招募增加并非中性粒细胞积聚的原因。因此，我们研究了积聚是否反映了胞葬作用 (efferocytosis) 受损，即专业吞噬细胞吞噬衰老和凋亡细胞的过程。衰老的中性粒细胞会上调磷脂酰丝氨酸、annexin A1 和 CXCR4 以促进巨噬细胞的识别 (52, 54)，而胞葬作用通过三个步骤进行 (55)：(i) 识别，(ii) 配体-受体稳定化，以及 (iii) 吞噬 (图 4L)，随后是溶酶体消化 (56)。不同器官的 TRMs 在这些步骤中表达不同的配体-受体对 (57)。
我们通过流式细胞术检查了年轻和衰老 Rosa26CreER (WT) 以及 Rosa26CreER;ptger2lox/lox (EP2 全身 cKO) 小鼠肝脏、脾脏和骨髓中的胞葬作用，这三个组织负责清除高达 90% 处于周转中的中性粒细胞 (27–29) (图 4, M 到 P，以及图 S7, B 和 C)。在衰老 WT 肝脏中，作为主要胞葬细胞的 F4/80+ 库普弗细胞 (KCs) 显著减少；尽管总中性粒细胞数量未改变，但 CXCR4+ 衰老和 annexin V+ 凋亡中性粒细胞积聚，同时 KCs 上的 LFA-1 表达升高，这与清除受损和补偿性稳定一致。所有这些变化在衰老 EP2 cKO 小鼠中基本得到了逆转。
图 2. TRM EP2 缺失可防止与年龄相关的认知能力下降、肌肉减少症、肥胖以及心脏功能下降。除非另有说明，数据为平均值 ± 标准误 (SEM)，并使用双因素方差分析 (two-way ANOVA) 及 Tukey 事后检验进行分析：P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001, 以及 **P < 0.0001。研究对象为年轻 (yng; 6 至 8 个月) 和年老 (23 至 25 个月) 的 C57BL/6J 雄性 Cx3cr1CreER (WT) 和 Cx3cr1CreER;EP2lox/lox (EP2 cKO) 小鼠。(A) 空间记忆的 Barnes 迷宫评估。（左）代表性的第 4 天
习惯化（第 1 天）和训练（第 2 至 3 天）后的测试轨迹。逃避孔为绿色；密封孔为灰色。每组 n = 6 到 10 只小鼠。(B) 基于对象的片段记忆的物体识别 (NOR) 评估。（左）训练和测试阶段的示意图。（右）各组的物体偏好得分。配对 t 检验，训练（第 1 天）与测试（第 2 天）。每组 n = 6 到 10 只小鼠。(C) 肢体肌肉和腹部脂肪组织的 MRI。（左）冠状面和横截面中分别针对肌肉质量和脂肪组织的身体定位及扫描区域（粉色）。（右）来自匹配解剖平面的代表性图像，虚线和箭头分别突出显示肢体肌肉（上图）和脂肪组织（下图）。(D 和 E) 肢体肌肉体积 (D) 和脂肪组织体积 (E) 的 MRI 定量分析。每组 n = 4 只小鼠。(F) 使用小鼠衰弱指数（见方法）进行的衰弱评估，该指数评估八个类别，评分标准为 0 = 无，0.5 = 轻微，或 1 = 严重。每组 n = 6 到 10 只小鼠。(G) 每只小鼠 10 次试验的平均握力测量值；力以牛顿 (N) 为单位报告。每组 n = 6 到 10 只小鼠。(H) 小腿肌肉横截面的免疫荧光成像。大图显示合并通道；小图显示单个 4',6-二胺基-2-苯基吲哚 (DAPI)（细胞核，白色）、MHC IIa（肌纤维，绿色）和层粘蛋白 (Laminin)（基底膜，红色）。(I 和 J) 肌纤维面积 (I) 和细胞核定位 (J) 的定量分析；每个数据点代表每只动物三个视野 (FOVs) 的平均值。每组 n = 3 只小鼠。(K) 心脏 MRI 在冠状面（左）和横截面在舒张末期 (ED; 中) 和收缩末期 (ES; 右) 的视图。冠状面中的黄色平面和红色箭头指示在心室最宽处的横截面成像位置。黄色虚线勾勒出左心室 (LV) 和右心室 (RV)；蓝色条形指示 ED (T1) 和 ES (T2) 时的室间隔壁厚度 (T)。(L) 基于 (K) 的 LV 射血分数 (EF)、室间隔壁厚度和 LV/RV 比率的定量分析：LVEF = (ED 体积 – ES 体积)/ED 体积；壁增厚 = (T2–T1)/T1；ED 阶段的 LV/RV 体积比。每组 n = 4 到 6 只小鼠。(M) LV 心肌中心肌细胞的代表性 TEM 图像，位于各受试者相当的区域，在 4000× 放大倍数下获取。箭头指示线粒体。本面板中显示的 TEM 图像也呈现在图 S4K（第一列）中，其中与用于相关定量分析的额外处理和放大倍数一同显示。(N) 心脏 TEM 中线粒体特征的定量分析。平均线粒体灰度强度（AU，任意单位）反映了提取的线粒体在 0（暗）到 255（白）刻度上的亮度。异常透亮线粒体的比例（百分比）是在 1000× 放大倍数的图像中测得的，透亮度定义为灰度强度 >80 AU。每个数据点代表每只动物四个 FOVs 的平均值。每组 n = 4 只小鼠。(O) 心脏组织的代表性三色染色，用于评估胶原蛋白沉积和心肌细胞结构。切片沿各受试者相似区域的 LV 纵轴截取。图像在 2.5× 放大倍数下获取。三色染色的图像反卷积（左列）识别出胶原蛋白（蓝色；中列）和肌肉（红色；右列）。(P) 对 (O) 中三色染色的心脏组织成分进行定量分析。胶原蛋白阳性区域通过提取胶原蛋白的图像定量，非肌肉区域通过提取肌纤维的图像定量。每个数据点代表每只动物三个 FOVs 的平均值。每组 n = 4 只小鼠。
（图 4，M 和 N）。在脾脏中，EP2 在 TRM 中高度表达，但在中性粒细胞中表达极低（图 S7B），高龄 WT 小鼠表现出总中性粒细胞增加，且 CXCR4+ 衰老中性粒细胞和 annexin V+ 凋零中性粒细胞累积，同时脾脏 TRM 上的 LFA-1 水平升高，而这一切在高龄 EP2 cKO 小鼠中均得到恢复（图 4O）。骨髓呈现出相同的模式：CXCR4+ 衰老中性粒细胞累积以及 TRM 上的 LFA-1 升高，这两者在高龄 EP2 cKO 小鼠中均被逆转（图 4P）。与肝脏和脾脏一样，骨髓中的 EP2 表达主要局限于巨噬细胞（图 S7C）。Mer 酪氨酸激酶 (MerTK) 介导骨髓巨噬细胞对暴露磷脂酰丝氨酸细胞的吞噬 (58)，该蛋白在高龄 WT TRM 中升高，而在高龄 cKO 小鼠中恢复正常。在所有清除器官中，整合素表达的升高伴随着衰老中性粒细胞的累积，这表明是对慢性胞葬功能衰竭的一种补偿性反应。综上所述，衰老驱动了所有主要胞葬器官中衰老中性粒细胞的累积，并伴随稳定化受体的补偿性上调，而 TRM EP2 缺失可防止这两者发生。
TRM 特异性 EP2 缺失恢复胞葬功能并限制衰老中性粒细胞驱动的组织损伤 为了直接测试 TRM EP2 缺失是否能恢复胞葬能力，我们检查了年轻和高龄 Cx3cr1CreER 以及 Cx3cr1CreER;EP2lox/lox 小鼠的肝脏 KC 和脾脏红髓巨噬细胞 (RPM)，在后者的模型中，EP2 缺失主要局限于 TRM（图 1G）。TRM 与羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 (CFSE) 标记的目标细胞在体外共同孵育，并通过 4°C 孵育以区分黏附与摄取（图 S8）。KC 接受衰老中性粒细胞或地塞米松诱导的凋零胸腺细胞的挑战 (59)，而 RPM 则接受凋零 RBC (60) 或淋巴细胞 (61) 的挑战，所有基底的标记效率均 >95%（图 S8）。
来自这两个器官的高龄 WT TRM 对所有目标细胞的胞葬作用均显著降低，而 TRM EP2 缺失恢复了这一功能（图 5A）。这种缺陷在衰老中性粒细胞中最为明显（与年轻组相比降低约 10 倍，与 cKO 组相比降低约 6 倍），而凋零基底的降低幅度约为 2.5 倍。由于衰老细胞和凋零细胞共享依赖于磷脂酰丝氨酸的识别通路 (TIM4 和 MerTK) (62)，与年龄相关的识别缺陷可能广泛地导致了清除不足，这与报道的衰老过程中 MerTK 剪切 (63) 一致。然而，针对衰老中性粒细胞的选择性严重程度表明，在稳定化步骤中存在额外的失效，而胞葬器官中高龄 WT TRM 上整合素 LFA-1 的补偿性上调支持了这一观点（图 4，M 至 P）。
为了在原位研究与年龄相关的胞葬（efferocytic）缺陷，我们采用了 MACSima 多重免疫组化 (mIHC) (64)，对年轻和年老 Cx3cr1CreER 以及 EP2 cKO 小鼠肝脏中的库普弗细胞 (KCs)、中性粒细胞和脱颗粒标记物进行映射。KCs 通过 CD169 (Siglec-1) 进行鉴定，这是一种能高度特异性标记组织驻留巨噬细胞 (TRMs) 的唾液酸粘附蛋白 (65)；中性粒细胞则使用 Ly6G、衰老标记物 CXCR4 以及髓过氧化物酶 (MPO) 进行染色，后者是一种在脱颗粒和 NETosis 过程中水平升高的中性粒细胞颗粒酶，可促进氧化性组织损伤 (66)（图 5B）。年老 WT 肝脏显示 CD169+ KC 区域减少，同时 CXCR4+ 和 MPO+ 中性粒细胞负荷增加；在年老 EP2 cKO 小鼠中，这三项指标均恢复到接近年轻状态的水平（图 5, B 和 C）。CD169+ KCs 与 Ly6G+ 中性粒细胞的空间共定位（作为胞葬参与度的指标）在年老 WT 中有所减少，但在年老 EP2 cKO 小鼠中得到了恢复，同样得到恢复的还有升高的 CXCR4+Ly6G+ 中性粒细胞池（图 5, B 和 C）。MPO 的增加与增强的 NET 相关无菌性炎症一致 (66)。与 KCs 在门静脉周围富集的特征一致 (67)，使用巨噬细胞标记物 F4/80 的常规免疫组化 (IHC) 确认了各组的门静脉定位，且无区域性重新分布，而 Ly6G+ 中性粒细胞分布在门静脉区和中央肝区，无区域偏好（图 S9, A 和 B）。大面积常规 IHC 同样显示年老 WT 肝脏中 MPO 和弹性蛋白酶水平升高，而在年老 EP2 cKO 小鼠中得到了恢复（图 S9C）。
脾脏的平行常规 IHC 显示 Ly6G+ 中性粒细胞与溶酶体吞噬细胞标记物 CD68 的共定位减少，表明衰老中性粒细胞的降解受损。年老 WT 脾脏中 CD68+ 巨噬细胞区域也有所减少，这两项缺陷在年老 EP2 cKO 小鼠中均得到了恢复。年老 WT 脾脏积聚了总量及 CXCR4+ 衰老中性粒细胞，并显示 MPO 和弹性蛋白酶染色增加，表明存在中性粒细胞驱动的组织损伤，而这一切在年老 EP2 cKO 小鼠中均被阻止（图 S9, D 和 E）。这些发现表明，衰老过程中受损的清除能力延伸至整个胞葬器官，且由 TRM EP2 信号通路介导。
衰老细胞可以通过 SASP 介导的旁分泌信号对邻近细胞产生有害影响 (68)。为了研究衰老中性粒细胞积聚的旁分泌后果，我们使用 mIHC 检查了肝实质细胞。在年老 WT 肝脏中，肝细胞 (E-cadherin+) 上调了 CD54 (ICAM-1)，这是一种在炎症压力期间在肝细胞上诱导的粘附分子 (69)；窦内皮细胞 (CD31+) 显示 CD106 (VCAM-1) 升高，这是一种内皮激活标记物 (70)；而星状细胞 (CD206+)——肝脏纤连蛋白 (FN) 的主要来源 (71)——则增加了 FN 的沉积（图 5D）。
图 3. TRM EP2 缺失可防止血浆蛋白质组随年龄增加而产生的变化。除非另有说明，数据为平均值 ± SEM，并使用带有 Tukey 事后检验的双因素方差分析 (two-way ANOVA) 进行分析：P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001, 且 **P < 0.0001。研究对象为年轻 (yng; 6 至 8 个月) 和年老 (23 至 25 个月) 的 C57BL/6J 雄性 Cx3cr1CreER (WT) 和 Cx3cr1CreER;EP2lox/lox (EP2 cKO) 小鼠。(A) 基于 TMT 的血浆散弹枪蛋白质组学工作流程。在去除白蛋白、免疫球蛋白和转铁蛋白并进行随后的蛋白质消化后，使用 10 种同量异构 TMT 标签 (m/z 126 至 131) 对肽段进行标记，标签分配通过颜色编码以实现可视化，对应于用于蛋白质定量分析的 MS2 m/z 光谱上的报告离子位置。(B) 维恩图显示检测到的 138 种蛋白质（肽段数量 (Np) > 2）在蛋白质组之间的重叠。每组 n = 4 至 6 只小鼠。(C) 138 种蛋白质血浆蛋白质组的 PCA 分析。每个点代表一个生物样本的一个技术重复。每组 n = 4 至 6 只小鼠，每个样本三个技术重复。(D) 在年老 EP2 cKO 小鼠中恢复到年轻水平的血浆蛋白质的通路富集分析。柱状图长度表示每条通路的差异表达蛋白数量，红色和蓝色分别表示上调和下调的蛋白。顶部轴上的气泡位置表示通路的显著性 [−log(P-value)]。气泡大小代表该数据集中检测到的蛋白质与 Ingenuity Pathway Analysis (IPA) 中与该通路相关的所有蛋白质总数之比。(E) 年老 WT 与年老 EP2 cKO 小鼠之间差异表达的血浆蛋白。红点和蓝点代表达到显著性阈值 (FDR < 0.05, fold-change > 1.23) 的蛋白质。选定的注释蛋白根据蛋白质通路进行颜色编码（右侧）。(F) 通过 TRM EP2 cKO 恢复至年轻水平的代表性血浆蛋白的热图。蛋白质按通路分组，并根据右侧的功能类别进行颜色编码。数值代表每个样本三个技术重复的平均值。每组 n = 4 至 6 只小鼠。(G) 通过 TRM EP2 cKO 恢复至年轻水平的年龄相关血浆蛋白的细胞类型富集分析。柱状图长度表示映射的蛋白质数量；气泡位置反映 −log(P-value)；红色虚线标记 P-value = 0.1 阈值；蓝色柱表示显著富集，灰色表示不显著。(H) 在血清中测定的肝酶和生物标志物。AST，天门冬氨酸氨基转移酶；ALT，丙氨酸氨基转移酶；GGT，$\gamma$-谷氨酰转移酶；ALP，碱性磷酸酶；CRP，C-反应蛋白。每组 n = 6 至 8 只小鼠。
图 4. TRM EP2 缺失可减轻衰老中性粒细胞负担，并恢复年老胞葬器官的胞葬机制。研究对象为年轻 (yng; 6 至 8 个月) 和年老 (23 至 25 个月) 的雄性 Cx3cr1CreER (WT) 和 Cx3cr1CreER;EP2lox/lox (EP2 cKO) 小鼠 (A 至 K)。(M 至 P) 显示相同年龄组的 Rosa26CreER (WT) 和 Rosa26CreER;EP2lox/lox (EP2 cKO) 小鼠的数据。除 (G) (Wilcoxon 秩和检验) 外，数据均使用带有 Tukey 事后检验的双因素方差分析进行分析：P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001, **P < 0.0001。(A) 整合所有四组的肝脏 scRNA-seq UMAP 可视化图。主要细胞群体使用与相应簇相匹配的颜色编码标签进行注释。DCs，树突状细胞；plasmaC，浆细胞；endothelialC，内皮细胞；Kupffer 细胞，KCs。总计 n = 8 只小鼠。(B) 肝脏的 UMAP 可视化图
实验组的 scRNA-seq。箭头突出显示中性粒细胞集群。n = 每组 2 只小鼠。(C) 整合所有四个实验组的 Neu（中性粒细胞）伪时间轨迹。(D) 按实验组划分的中性粒细胞子集群（Neu1 至 4）的 UMAP 可视化，显示了子集群分布中依赖于条件的偏移。(E) 各实验组中，每个中性粒细胞子集群（Neu1 至 4）在总中性粒细胞中的平均百分比。(F) 中性粒细胞子集群（Neu1 至 4）以及年龄/基因型条件下最高差异表达基因的热图。比例尺表示 z-score 表达量。(G) 各中性粒细胞子集群（Neu1 至 4）和实验组中 CCA、SASP、抗凋亡、DDR、NETosis 和促凋亡基因类别的模块评分。每个数据点代表一个单细胞。y 轴代表每细胞在每个类别中的基因平均表达量，并经背景表达量调整。箱线图显示中位数（粗线）、四分位距（箱体）和须线（1.5× IQR）。显著性线用于比较子集群（长线）或同一子集群内的实验组（短线）。CCA，细胞周期停滞；SASP，衰老相关分泌表型；Apop，凋亡；DDR，DNA 损伤响应。(H) Neu2 和 Neu3 细胞的复合衰老（CCA + SASP + 抗凋亡）与压力（DDR + NETosis + 促凋亡）评分。箭头指示细胞状态转换轨迹。每个数据点代表一个单细胞。(I) 中性粒细胞生命周期示意图，阐明从骨髓成熟到循环、渗出至组织、激活以及被巨噬细胞清除的阶段。蓝色和红色箭头分别指示年轻和衰老中性粒细胞的迁移和命运。(J) 各实验组肝脏中性粒细胞 (Neu) 内 CXCR4（上）和 annexin V（下）表达的代表性流式细胞术图。n = 每组 8 到 10 只小鼠。(K) 对 (J) 中 CD11b+ 细胞内的总中性粒细胞百分比，以及中性粒细胞内 CXCR4+ 和 annexin V+ 百分比的量化。n = 每组 8 到 10。(L) 驻留巨噬细胞 (rMΦ) 对中性粒细胞 (Neu) 进行胞葬作用 (efferocytosis) 的三个步骤示意图：识别、稳定和吞噬。虚线框突出显示每一步的配体-受体相互作用，例如：胞葬细胞 TIM4–中性粒细胞 PtdSer（识别）、胞葬细胞整合素–中性粒细胞 ICAM-1/VCAM-1（稳定）以及胞葬细胞 FPR2–中性粒细胞 annexin A1（吞噬）。Sen，衰老的；Apop，凋亡的。(M) 流式细胞术策略及其代表性肝中性粒细胞和 KCs 图，显示细胞丰度、中性粒细胞凋亡和衰老，以及参与衰老中性粒细胞清除的配体-受体对的表达，对应于 (L) 中概述的胞葬阶段。每个标记的亲本群体指示在每行图的左上角。(N) 对 (M) 中中性粒细胞（左）和 KC（右）标记百分比的量化。中性粒细胞标记位于 Ly6G+ 细胞内；KC 标记位于 CD11b+ 细胞内。n = 每组 6 到 9。(O) 至 (P) 脾脏 (O) 和骨髓 (P) 中中性粒细胞和 TRM 标记百分比的量化。实验组注释（yng WT, yng cKO, aged WT, aged cKO）遵循 (N) 中所示的颜色图例。n = 每组 6 到 9 只小鼠。
E-cadherin 与 CD54、CD31 与 CD106 以及 CD206 与 FN 的共定位随年龄增加而显著增加，但在 aged EP2 cKO 小鼠中恢复到年轻水平（图 5, D 和 E）。空间分析显示，在 aged WT 小鼠中，受压实质细胞与 Ly6G+CXCR4+ 衰老中性粒细胞之间的距离缩短，而这在 aged EP2 cKO 小鼠中得到了正常化，支持了依赖于距离的旁分泌信号传导。综上所述，衰老过程中 EP2 介导的 TRM 胞葬作用受损促进了衰老中性粒细胞的积聚、NET 介导的组织损伤以及旁分泌炎症和纤维化压力，而所有这些情况均可通过删除 TRM EP2 来防止。
TRM EP2 缺失恢复衰老过程中的整合素激活与胞葬程序
鉴于在肝脏、脾脏和骨髓中观察到的胞葬功能受损（图 4 和 5），我们在单细胞分辨率下研究了 TRM 与中性粒细胞的相互作用。对年轻和衰老 WT 及 EP2 cKO 小鼠肝脏 scRNA-seq 的 CellChat 分析 (72) 确定整合素（integrins）是库普弗细胞（KCs）中的主导受体类，而相应的配体（例如 Icam1, Thbs1）在中性粒细胞中富集，形成了广泛的配体-受体网络（图 6A 和 fig. S10, A 和 B）。流式细胞术证实，各组织中衰老 TRMs 上的 LFA-1 (CD11a/CD18; Itgal/Itgb2) 水平升高（图 4），这表明 β2 整合素亚单位 (Itgb2) 的失调是与年龄相关的胞葬失败的共同特征，而 Itgb2 是所有主要白细胞整合素异二聚体的共有亚单位 (73)。
因此，我们研究了 β2 整合素在胞葬过程中是如何激活的。如图 6B 所示，激活过程分为四个阶段：(i) 静息状态（弯曲，失活）；(ii) 配体结合，此时 Rac1 和 RhoA 与 β2 尾部结合以启动细胞骨架重塑 (74)；(iii) 膜突起，此时 Skap1 促进膜延伸并使整合素转换为延伸-关闭状态；以及 (iv) 稳定化，此时 Tln2 和 Fermt3 诱导完全延伸的高亲和力构象，从而实现稳定的中性粒细胞结合 (74, 75)。尽管大多数整合素亚单位在衰老 KCs 中减少，但 Itgb2 却增加，这与激活受损情况下的补偿性上调一致。相比之下，所有五种关键的共激活因子 (Rac1, RhoA, Skap1, Tln2, Fermt3) 均随年龄增长而减少，但在衰老 EP2 cKO 小鼠中得到了恢复（图 6C），通路分析证实了衰老 WT KCs 中整合素激活受到抑制（图 6D）。
由于整合素的稳定化对于吞噬和下游清除是必需的，我们接着检查了吞噬后的程序 (fig. S10C)：立即早期基因 (Jun, Egr1) 启动转录响应；吞噬后调节因子 (Arg1, Il1rn) 协调抗炎信号；核受体 (Lxr, Pparg) 介导脂质降解；以及外排转运蛋白 (Abca1, Abcg1) 导出脂质内容物 (76–78)。所有这些效应因子在衰老 WT KCs 中均出现失调，激活因子下调而抑制因子升高，这一模式在衰老 EP2 cKO 小鼠中得到了反转 (fig. S10D)。通路分析确认，衰老 WT KCs 中的吞噬程序受到了广泛抑制（图 6E）。在 1227 个通过 EP2 缺失而挽救的年龄失调基因中 (fig. S10E)，胞葬相关通路（包括整合素信号传导、肝 X 受体 (LXR)/RXR 激活以及协调溶酶体表达与调节 (CLEAR) 网络信号传导）是最为恢复的程序 (fig. S10F)。此外，与年龄相关的免疫调节、稳态和应激适应的紊乱也得到了正常化 (fig. S10G)，从而支持高效清除所需的代谢需求。
上游转录因子 (TF) 分析揭示了胞葬相关 TFs 的协调调节（图 6F）。衰老与 JUNB、STAT3 和 RELA（促进吞噬清除的 TFs (79–85)）的抑制以及 CREB1（损害胞葬 (81, 85)）的诱导相关，这一模式在衰老 EP2 cKO 小鼠中得到了反转（图 6G）。综上所述，这些数据表明，EP2 信号通过损害转录控制、整合素激活和吞噬后清除，破坏了衰老 TRMs 中的胞葬功能，而这些缺陷可以通过 TRM 特异性 EP2 缺失而得到恢复。
药理学 EP2 拮抗作用恢复高龄小鼠的中性粒细胞清除
为了验证我们的遗传学发现，我们使用选择性 EP2 拮抗剂 PF-04418948 (PF) (86) 对 22 个月大的雄性小鼠进行了 2 个月的治疗（图 6H）。PF 使循环中的总中性粒细胞、CXCR4+ 衰老中性粒细胞和 CD62L− 高龄中性粒细胞的数量恢复到接近年轻状态的水平（图 6I 和图 S11A）。在肝脏中，PF 同样降低了总中性粒细胞和 CXCR4+ 中性粒细胞的数量，部分恢复了 KC 的丰度，并降低了 LFA-1+ KC 的比例，这表明与年龄相关的整合素稳定缺陷得到了部分逆转（图 6J 和图 S11, B 和 C）。中性粒细胞和 KC 上其他胞葬配体-受体对保持不变（图 S11C），这进一步证明 $\beta 2$ 整合素失调是主导的 EP2 依赖性缺陷。
PF 治疗还减少了脾脏和骨髓中与年龄相关的高龄衰老中性粒细胞积聚。在脾脏中，总 Ly6G+ 中性粒细胞和 annexin V+ 凋亡中性粒细胞随年龄增长而增加，并在 PF 治疗后显著降低，且 CXCR4+ 中性粒细胞呈现出向正常水平恢复的趋势（图 6K 和图 S11, D 和 F）。在骨髓中，PF 使 CXCR4+ 衰老中性粒细胞恢复正常，并挽救了与年龄相关的 VCAM-1+ 中性粒细胞丢失，这表明 EP2 抑制重新建立了骨髓生态位中正常的中性粒细胞滞留（图 6L 和图 S11, E 和 G）。肝脏以外的 LFA-1+ TRM 比例并未得到实质性恢复，表明整合素的正常化可能
图 5. TRM EP2 缺失可恢复衰老和凋亡细胞的清除，并减轻老年组织中由衰老中性粒细胞驱动的损伤和旁分泌压力。 研究对象为青年（yng；6 到 8 个月）和老年（23 到 25 个月）雄性 Cx3cr1CreER (WT) 和 Cx3cr1CreER;EP2lox/lox (EP2 cKO) 小鼠。数据为平均值 ± 标准误 (SEM)。(A) 采用双因素方差分析 (two-way ANOVA) 及 Tukey 事后检验进行分析；(C 和 E) 采用单因素方差分析 (one-way ANOVA) 及 Tukey 事后检验进行分析：P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001, **P < 0.0001。对于 (B) 至 (E)，共定位 (co-loc) 定义为信号重叠或检测到的信号中心之间距离 < 1 μm，且各组图像均使用相同的染色面板设置，采集自可比的解剖区域。(A) 体外胞葬作用分析。CFSE 标记的目标细胞被共同孵育
（共孵育）与肝脏或脾脏细胞制剂；CFSE 摄取通过 TRM（肝脏 KCs；脾脏 RPMs）进行门控。(左) 实验示意图；(中) 代表性流式图。(右) 定量分析。靶细胞：老年血中中性粒细胞 (Neu)、地塞米松诱导凋亡 (Dex-Apop) 的胸腺细胞 (Thy)、热处理凋亡的 RBC 或 Dex-Apop T/B 细胞。KC–Neu 和 KC–Thy 测定的代表性图（前两行）为图 S8A 完整对照系列中的 37°C 条件，其中包含匹配的无靶细胞对照和 4°C 阴性对照。RPM–RBC 和 RPM–T/B 测定的类似对照系列分别显示在图 S8B 中。Kupffer 细胞，KCs；红髓巨噬细胞，RPMs。每组 n = 8 到 10 只小鼠。(B) 肝脏切片的代表性 MACSima 多重免疫组化 (mIHC)，染色标记为 CD169 (KCs)、Ly6G (中性粒细胞)、CXCR4 (衰老) 和 MPO (脱颗粒/NETosis)。(顶行) 合并通道；(中行和底行) 上述合并图像的每个单独通道，分别显示。箭头指示老年 WT 中的 Ly6G 和 CXCR4 共定位。比例尺，20 μm。(C) 对 (B) 中成像数据的定量分析：标记阳性区域 (CD169, CXCR4, MPO) 和共定位频率 (CD169&Ly6G, CXCR4&Ly6G)。每个数据点代表每只动物三个 FOV 的平均值。FOV，视野。每组 n = 4 只小鼠。(D) 肝脏切片的代表性 MACSima mIHC，显示三种实质细胞群中的旁分泌应激标志物：肝细胞 (E-Cadherin/CD54)、窦状 endothelial 细胞 (CD31/CD106) 和星状细胞 (FN/CD206)，每种均与 Ly6G 和 CXCR4 共染色以标记衰老中性粒细胞。虚线框表示放大插图；顶部的插图显示 Ly6G (L) 和 CXCR4 (C) 通道；底部的插图显示单个实质标记对，由首字母标记，并与其在合并图像中对应的通道颜色匹配。黄色箭头突出显示受压实质细胞与 CXCR4+ 中性粒细胞的邻近性。比例尺，主图 30 μm，插图 15 μm。(E) 对 (D) 中旁分泌应激的定量分析。(顶) 实质细胞-应激标记对 (E-Cad&CD54, CD31&CD106, FN&CD206) 的共定位频率。(底) 每个受压实质标记对到 Ly6G+CXCR4+ 衰老中性粒细胞的平均空间距离。每个数据点代表每只动物三个 FOV 的平均值。每组 n = 4 只小鼠。
需要更长或更早的处理 (图 6, K 和 L)。脾脏和骨髓中中性粒细胞与 TRM 上的其他胞葬配体-受体对同样没有变化 (图 S11, F 和 G)。
为了直接评估 TRM 对中性粒细胞的胞葬作用，我们使用衰老血中中性粒细胞和新鲜富集的肝脏 KCs 进行了体外共培养实验，如 Fig. 5A 所示 (图 6M)。与溶媒对照组相比，经 PF 处理的老年小鼠 KCs 表现出显著增加的中性粒细胞摄取，使胞葬能力恢复到接近年轻状态 (图 6, M 和 N, 以及图 S11H)。总之，这些结果表明药理学 EP2 抑制可部分逆转与年龄相关的 TRM 功能障碍和衰老中性粒细胞累积，且在肝脏中的挽救效果最强。
人类衰老和疾病中的 TRM-中性粒细胞失调 我们接下来研究人类衰老和疾病中是否发生了类似的 TRM-中性粒细胞变化。对 Guilliams 人类肝细胞图谱 (67) 的 scRNA-seq 数据分析显示，与年轻受试者相比，老年健康肝脏的 TRM 比例降低且中性粒细胞群体扩大，而 MDMs 基本保持不变 (图 6, O 和 P)。在患病肝脏中也观察到了类似的模式，即 TRM 丢失和中性粒细胞扩大 (图 6P)。PTGER2 的表达在老年和患病人类肝脏的 TRM 中选择性增加，而在中性粒细胞和 MDMs 中的增加幅度较小 (图 6Q 和图 S12A)。
人类肝脏中性粒细胞也表现出与年龄和疾病相关的向衰老样状态的转变。我们使用了 SASP（衰老相关分泌表型）、抗凋亡和 DDR（DNA 损伤响应）基因集的同源基因集，这三个标志性类别在 scRNA-seq 数据中具有足够的表达量，可用于评估衰老特征（图 S12, B 至 D）。在老龄肝脏中，中性粒细胞从 Neu1+2 簇向 Neu3+4 簇转变（图 6R）。与 Neu1+2 中性粒细胞相比，Neu3+4 中性粒细胞显示出明显更高的 SASP ($P = 4.7 \times 10^{-7}$) 和抗凋亡 ($P = 7.2 \times 10^{-5}$) 模块评分，这与衰老样表型一致（图 6S）。CellChat 分析显示，老龄肝脏中 TRM-中性粒细胞的胞葬作用（efferocytic）相互作用减少，整合素（integrin）、半乳糖凝集素-9（galectin-9）、Annexin A1 和 NAMPT 信号传导丢失，并伴随 MHC-II 抗原呈递通路增加（图 6T 和表 S1）。这些变化表明，从耐受性中性粒细胞清除转向免疫刺激信号传导，这与之前的研究一致，即在年龄相关的炎症中，缺陷的胞葬作用会增强巨噬细胞 MHC-II 信号传导和 CD4+ T 细胞激活 (87)。
在患病肝脏中也观察到了类似的改变，其中中性粒细胞显示出更显著的衰老转录特征，从 Neu1+5 向 Neu2+3+4 群体转变（图 6U），且 SASP ($P = 5.7 \times 10^{-78}$)、抗凋亡 ($P = 9.8 \times 10^{-48}$) 和 DDR ($P = 1.5 \times 10^{-5}$) 评分升高（图 6V）。TRM-中性粒细胞之间的通讯在相互作用数量和强度上显示出类似的降低（图 6W 和表 S1）。使用 Tabula Sapiens 心脏图谱 (88) 对第二个器官（心脏）进行分析，同样揭示了与年龄相关的 TRM 丢失以及 TRM 中 PTGER2 的选择性上调，但并未出现中性粒细胞的扩张，这与心脏并非中性粒细胞的主要胞葬部位相一致（图 S12, E 至 G）。这些在人类中观察到的跨器官发现虽然是相关性的，但与我们在小鼠模型中观察到的关系一致。未来需要对人类样本进行研究，以直接测试老龄 TRM 是否对衰老中性粒细胞的胞葬能力降低，以及 EP2 拮抗是否能恢复这一功能。
作为一种补充的遗传学方法，我们在已发表的全基因组关联研究 (GWAS) 中检查了 EP2 或 PGE2 通路基因是否与人类长寿相关。在 6 项关于长寿和健康寿命的 GWAS 研究中 (89–93)，PTGER2 及相关的 PGE2 通路基因未显示出显著关联（图 S12H）。Timmers 2020 健康寿命 GWAS 的曼哈顿图显示，在 PTGER2 所在的 14 号染色体上没有显著位点（图 S12I）。最顶级的长寿位点映射至 APOE、LPA、CDKN2B-AS1、ATXN2 及其相关基因，这些基因位于包括脂质代谢、神经退行性病变、细胞周期与衰老、心血管功能、免疫功能、DNA 修复、胰岛素/IGF 信号传导和蛋白质稳态在内的通路中（图 S12, I 和 J）。值得注意的是，这些通路中的几个，特别是细胞周期与衰老以及免疫功能，与我们研究中确定的 TRM-中性粒细胞清除机制直接相关，这表明现有的 GWAS 可能尚未捕捉到所有贡献于这些生物过程的基因。与此一致，流行病学研究已广泛报道 PTGER2 与包括阿尔茨海默病、免疫功能紊乱和癌症在内的年龄相关疾病之间的关联 (94)。
讨论 我们认定 TRMs 是通过 PGE2- EP2 信号通路调节多器官衰老的中心调节因子。衰老 TRMs 中的 EP2 缺乏可恢复线粒体适应性，并减轻全身及器官层面的衰老表型，包括炎症、认知能力下降、肌肉减少症、衰弱、肥胖以及心肌纤维化。从机制上看，TRMs 通过依赖 EP2 的方式抑制对衰老中性粒细胞的胞葬作用（efferocytosis），从而驱动衰老。在衰老 TRMs 中，EP2 信号破坏了整合素激活和吞噬清除所需的转录程序，导致衰老中性粒细胞积累、持续脱颗粒、NETosis 以及无菌性炎症的传播。抑制 EP2 可维持 TRM 的胞葬能力并减轻中性粒细胞驱动的组织衰老。
衰老中性粒细胞（此处定义为包含 CCA、SASP 和抗凋亡等特征）代表了衰老过程中一种尚未被充分研究的中性粒细胞功能障碍状态。经典的衰老框架主要集中在增殖细胞上 (46, 48)；然而，中性粒细胞保留了细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK4/6, CDK5, 以及 CDK7/9），这些激酶被重新利用于 NETosis、脱颗粒和凋亡时序的调控 (49–51)。在衰老的中性粒细胞中，CDK 抑制剂表达的增加似乎限制了
图 6. EP2 损害了年老库普弗细胞 (KCs) 中的胞葬稳定化及吞噬后程序，而药理学抑制 EP2 可恢复年老小鼠中的中性粒细胞清除，且 TRM- 中性粒细胞的改变发生在年老及患病的人类器官中。(A 至 G) 来自年轻 (6 至 8 个月) 和年老 (23 至 25 个月) 雄性 Cx3cr1CreER (WT) 和 Cx3cr1CreER;EP2lox/lox (EP2 cKO) 小鼠的 scRNA-seq。(H 至 N) 接受载体 (veh) 或 PF- 04418948 (PF) 处理的年轻 (yng; 7 个月) 和年老 (24 个月) 雄性 C57BL/6J 小鼠。(O 至 W) 人类肝脏 scRNA-seq 数据 (Guilliams 等, PMID: 35021063)。数据为平均值 ± 标准误 (I) 至 (N) 使用单因素方差分析 (one-way ANOVA) 及 Tukey 事后检验进行分析；(O) 至 (W) 使用 Wilcoxon 秩和检验进行分析：P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001, **P < 0.0001。(A) 配体-整合素映射图谱位于
使用 CellChat 分析中性粒细胞和 KCs，并针对生物学相关表达和通信强度进行了过滤。(B) 胞葬作用 (efferocytosis) 期间整合素 (integrin) 激活阶段的示意图。整合素以 α/β 异二聚体形式发挥作用，从低亲和力（弯曲）状态转变为高亲和力（延伸，开放）状态。共激活因子 Rac1, RhoA, Skap1, Tln2 和 Fermt3 与 β- 亚基的细胞质尾部结合，以促进细胞骨架重塑、膜突起和整合素去弯曲。Neu，中性粒细胞。(C) KCs 中整合素及整合素激活基因的表达情况。表达值代表单细胞的每样本平均值。每个整合素激活因子旁的彩色点与 (B) 示意图中所用该因子的颜色对应。(D) KCs 中整合素及整合素激活通路富集分析。负值表示与老年 EP2 cKO 小鼠相比，老年 WT 小鼠中的富集度降低。P < 0.01, P < 0.001。(E) 由 TRM EP2 调节的 KC 下游吞噬通路富集分析。通路富集是根据与胞葬作用后稳定阶段相关的基因计算得出的。负富集分值表示与老年 EP2 cKO 相比，老年 WT 中的通路活性降低。P < 0.05; **P < 0.01。(F) 预测的调节整合素及胞葬相关吞噬程序基因的最主要转录因子 (TFs)。对 (C) 至 (E) 中的基因进行了联合分析。显著性以 –log10(P- value) 表示；红色虚线表示 P = 0.05。(G) 在老年 WT 和老年 EP2 cKO KCs 之间差异表达的 EP2 调节 TFs。柱状图方向反映表达变化；向左的柱体表示老年 WT 中 TF 表达降低且在老年 EP2 cKO 中恢复。柱体长度代表 log2 倍数变化。柱体颜色表示每个 TF 在胞葬作用中报道的作用：蓝色为激活因子，橙色为抑制因子。(H) 通过口服灌胃在年轻（5 个月）和老年（22 个月）雄性 C57BL/6J 小鼠中进行药理学 EP2 抑制的示意图。(I) 各治疗组血中中性粒细胞 (CD11b+Ly6G+) 标志物百分比的定量分析。n = 每组 6 只小鼠。(J) 各治疗组肝脏中性粒细胞 (CD11b+Ly6G+) 和 KC (CD11b+F4/80+) 标志物百分比的定量分析。n = 每组 6 只小鼠。(K) 至 (L) 脾脏 (K) 和骨髓 (L) 中中性粒细胞及 TRM 标志物百分比的定量分析。n = 每组 6 只小鼠。(M) 体外胞葬实验。用 CellTracker 红色标记的老年血液中性粒细胞与肝细胞制剂共同孵育；采集门设定在 KCs (CD11b+F4/80+)。显示了 CellTracker Red+ KCs 的代表性流式图以及 4°C 孵育对照。(N) 对 (M) 中 CellTracker Red+ KCs（左）、Ly6G+ KCs（中）以及 Ly6G+ KCs 内部 CellTracker Red+ 频率（右）的定量分析。Ly6G+ KCs 和 CellTracker Red+ Ly6G+ KCs 的代表性流式图见图 S11H。n = 每组 6 只小鼠。(O) 整合所有捐献者的人类肝脏髓系细胞 scRNA-seq 数据 (Guilliams et al., PMID: 35021063) 的 UMAP 图。该数据集用于 (O) 至 (W)。(P) 人类肝脏中的髓系细胞组成。(左) 健康肝脏（胆囊结石）中的年轻组（年龄 49, 53；n = 2 名捐献者）与老年组（年龄 73 至 75；n = 2 名捐献者）对比。(右) 健康组（胆囊结石；n = 4 名捐献者）与疾病组（n = 10 名捐献者；肝细胞癌、肝细胞腺瘤、伴有肝转移的结直肠癌、肝损伤、病理性肥胖）对比。相同的捐献者分组适用于 (Q) 至 (W)。(Q) 人类肝脏 TRMs 中的 PTGER2 表达情况。(上) 年轻组与老年组（健康捐献者）对比。(下) 健康组与疾病组对比。每个数据点代表一个
表达 PTGER2 的单细胞。(R) 健康捐赠者的中性粒细胞亚群分析。(左) 按年轻和年老分组的中性粒细胞亚群 (Neu1 到 4) 的 UMAP 图，带有伪时间轨迹（箭头）。(右) 按年龄组划分的中性粒细胞亚群组成。(S) 健康捐赠者中 Neu1+2（年轻富集）与 Neu3+4（年老富集）亚群的衰老模块评分（SASP、抗凋亡、DDR）对比。每个数据点代表一个单细胞。黑线表示中位数。(T) 年轻与年老健康捐赠者中 TRM-中性粒细胞胞葬相关信号传导的 CellChat 分析。(左上) 相互作用数量。(右上) 相互作用 (Int.) 强度。(底部) 差异最显著的信号通路之 Δ强度 (Young − Aged)；通路缩写、关键分子和胞葬作用见表 S1。(U) 至 (W) 与 (R) 至 (T) 相同，但对比的是健康与
疾病捐赠者。中性粒细胞亚群分析识别出五个亚群 (Neu1 到 5) (U)，衰老模块评分对比了 Neu1+5（健康富集）与 Neu2+3+4（疾病富集）(V)，以及健康与疾病 TRM-中性粒细胞通讯的 CellChat 分析 (W)。
这一功能储备，与非典型背景下的 CCA 程序一致。我们将这些转录组特征与表面 CXCR4 表达联系起来，从而能够通过流式细胞术进行前瞻性识别，并证明了从衰老到凋亡的转变 (Neu2 到 Neu3)，这解释了衰老组织中 CXCR4 和 annexin V 的共阳性。综上所述，这些发现扩展了当前的衰老相关免疫功能障碍模型，并表明针对这些功能障碍的中性粒细胞状态可能具有治疗意义。
衰老广泛地损害了 TRM 对多种细胞基质的胞葬作用，包括衰老的中性粒细胞以及凋亡的胸腺细胞、淋巴细胞和红细胞，表明 TRM 清除机制出现了普遍下降。然而，衰老中性粒细胞的受损程度尤为严重，这反映出除了共同的识别缺陷外，它们还需要额外的整合素介导的稳定性。这种“双击”脆弱性使衰老中性粒细胞成为一种特别具有致病性的基质，并表明针对其清除可能产生巨大的治疗益处。
当清除失败时，衰老的中性粒细胞会对周围的实质细胞产生旁分泌压力。在肝脏中，肝细胞上调了 ICAM-1，窦状内皮细胞增加了 VCAM-1，而星状细胞在与 CXCR4+ 中性粒细胞空间紧邻的区域沉积纤维连接蛋白。因此，胞葬功能障碍产生了一个局部炎症微环境，将功能障碍传播到免疫区室之外，在正反馈循环中将中性粒细胞积聚与组织衰老的炎症、血管和纤维化特征联系起来。
从机制上看，整合素介导的稳定性成为了主导的受损步骤。尽管 LFA-1 在所有三个胞葬器官中都出现了反向性上调，但关键构象激活剂 (Tln2, Fermt3, Skap1, Rac1, RhoA) 的转录抑制将整合素锁定在低亲和力状态。吞噬后的下游程序同样通过 EP2 驱动的 TF 失调而受到抑制，表现为促吞噬的 JUNB, STAT3 和 RELA 减少，以及抗吞噬的 CREB1 增强。因此，EP2 信号通过损害整合素激活和下游货物处理，成为胞葬作用的核心调节因子。
药理学 EP2 抑制证明了缺陷 TRM 胞葬作用的可逆性。PF-04418948 处理减轻了肝脏、脾脏和骨髓中的衰老中性粒细胞负担，并在离体实验中恢复了 KC 的胞葬作用。在肝脏中的恢复最为完全，这可能是由于通过门脉循环具有更好的药物可及性，而脾脏和骨髓可能需要更长或更早的抑制。
在年老且患病的人类肝脏中，TRM 的比例有所下降，PTGER2 的表达在 TRM 中选择性升高，中性粒细胞向类衰老转录状态转变，且 TRM 与中性粒细胞之间的通讯减少，这与我们在小鼠中的发现相平行。年老的人类心脏同样表现出 TRM 缺失和选择性 PTGER2 升高，表明在衰老过程中，不同器官的 TRM 生物学变化具有保守性。尽管 PTGER2 在长寿全基因组关联分析 (GWAS) 中未达到全基因组显著性水平，但它与年龄相关疾病、癌症和免疫功能障碍的关联强调了其转化相关性 (94)，并突显了当前 GWAS 在捕捉依赖于细胞状态的机制方面的局限性。这些人类研究结果虽然是相关性的，但将 TRM-EP2-胞葬作用轴定义为人类衰老中一个值得进一步功能性测试的候选机制。具体而言，未来的研究应评估衰老中性粒细胞的清除障碍是否也发生在人类 TRM 中，以及药理学 EP2 阻断是否能修复这一缺陷。
有几项局限性值得考虑。我们的流式细胞术分析采样了选定的配体-受体对，因此无法捕捉到所有的胞葬作用轴，包括肝脏中的 MerTK-Gas6 信号传导，后者可能在表面丰度未降低的情况下，通过蛋白水解切割而导致功能受损 (63)。人类单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 分析受到了高质量、具有统计效力的年龄分层数据集可用性有限的制约。
未来的研究应测试中断由中性粒细胞驱动的旁分泌压力是否能防止其他器官的实质损伤，以及 EP2 拮抗剂是否能与促衰老细胞清除 (senolytic) 或衰老形态改变 (senomorphic) 疗法产生协同作用。鉴于 TRM 在驱动全器官炎症和功能衰退中起到的巨大作用，恢复 TRM 的健康（例如通过药理学 EP2 抑制）可能会限制以下情况的发展：
与年龄相关的疾病，包括衰弱和肌肉减少症、心血管和肝脏疾病以及神经退行性疾病，其中 CXCR4+ 中性粒细胞负荷可作为一种潜在的药效学生物标志物。
方法摘要 方法的详细描述请参阅补充材料。补充材料和方法部分包括：小鼠模型和行为学评估（Barnes 迷宫、新物体识别）的描述；衰弱和握力评估；心脏成像和组织学（MRI、TEM、三色染色）；Luminex 细胞因子分析和基于 TMT 的血浆蛋白质组学；血清肝脏生物标志物测定；单细胞 RNA-seq 文库构建和小鼠肝脏的生物信息学分析；蛋白质印迹法（Western blot）；腹腔巨噬细胞分离和通过流式细胞术评估线粒体功能；用于巨噬细胞和中性粒细胞表征的多器官流式细胞术；体外胞噬测定（ex vivo efferocytosis assays）；肌肉、肝脏和脾脏组织的免疫组化；MACSima 多色免疫荧光成像和基于 QuPath 的定量分析；对已发表的人类肝脏和心脏 scRNA-seq 数据集的重新分析；基于 MAGMA 的人类长寿 GWAS 分析；以及统计学方法。
参考文献与注释
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致谢 我们感谢斯坦福共享 FACS 设施在流式细胞术采集期间提供的仪器支持和故障排除；感谢 J. Perrino 提供的 TEM 培训和协助；感谢诊断实验室提供的实验咨询；感谢 C. Wang 在 scRNA-seq 文库构建和仪器使用方面的指导；感谢 UCSF Chan Zuckerberg Biohub 基因组学平台的 A. Seng 针对 Illumina 测序提供的建议；感谢 J. Brook 建议在免疫细胞分析中加入肺组织；以及 P. Minhas, H. Ennerfelt 和 M. Xie 对原稿的批判性审阅。资金支持：本工作得到了 NIH 资助 1RF1AG080742, 1RF1AG070839, 和 P30 AG066515，美国心脏协会 19PABH1345800，斯坦福大学 Wu Tsai 神经科学研究所的 Phil and Penny Knight 脑韧性计划，以及 Arc 研究所 Ignite 奖（授予 K.I.A）；Glenn 医学研究基金会衰老研究博士后奖学金，2025 Glenn 医学研究基金会博士后奖学金续展奖，以及 Wu Tsai 神经科学研究所 NPIL 试点奖（授予 Y.J.T.）。K.I.A. 是 Chan Zuckerberg–
旧金山生物枢纽 (San Francisco Biohub) 研究员。O.S. 获得德国研究基金会 (Deutsche Forschungsgemeinschaft) (TRR332 项目 A2 & Z1, SO876/16- 1, CFU342 P1) 和 Else Kröner Fresenius 基金会 (2023_EKSE.212) 的资助。J.A.B. 由 HHMI Hanna Gray 奖学金资助。斯坦福共享 FACS 设施由 NIH 1S10OD026831-01, S10RR025518-01 以及帕克癌症免疫治疗研究所 (Parker Institute for Cancer Immunotherapy) 资助。细胞科学成像设施由 NIH 1S10OD028536 资助。吴蔡神经科学临床前成像实验室由 NIH S10OD025176 资助。MACSima 平台由明斯特 IZKF 的生物上下文 (Biology in Context, BIC) 核心设施和 DFG (项目 502158695) 资助。作者贡献：Y.J.T.、O.S.、S.J.P. 和 K.I.A. 设计了实验。除非另有说明，Y.J.T. 协调所有协作工作流程，执行所有实验、数据分析、数据解释并生成图表。T.E.C. 执行了 Barnes 迷宫、新物体识别、握力以及肌纤维染色实验并分析了数据；处理了 PF 处理小鼠的脾脏和骨髓样本用于流式细胞术；处理了 Cx3cr1CreER- EP2 小鼠的脾脏样本用于胞葬作用分析；并协助进行衰弱评分和 PF- 04418948 给药。F.Y. 处理了小鼠肝脏 scRNA-seq 数据，处理了人类肝脏和心脏 scRNA-seq 数据，生成了 Seurat 对象，并生成了图 4 A 至 D 以及图 S5 B 和 C。F.J.G.- M. 在 S.J.P. 的指导下处理了 TMT 质谱原始数据，执行了质量控制，并生成了分析矩阵。D.E.A. 和 V.V.D. 在 O.S. 的指导下执行了 MACSima 多重成像数据采集。Q.W. 维护并培育了 Cx3cr1CreER- EP2 和 Rosa26CreER- EP2 小鼠种群。A.B. 在 S.J.P. 的指导下协助 TMT 质谱样本制备并将样本加载到质谱仪上。J.K. 执行了小鼠 MRI 扫描和数据采集。J.A.B. 协助了小鼠肝脏 scRNA-seq 数据质量控制，并在六个长寿数据集上执行了人类 GWAS MAGMA 分析。
Y.J.T. 和 K.I.A. 构思并监督了该项目，设计了实验，解释了数据并撰写了论文。竞争利益：K.I.A. 是 Willow Neuroscience Inc. 的共同创始人。所有其他作者声明无竞争利益。数据、代码和材料可用性：支持本研究结果的数据可在主图、补充图和表中找到；额外的数据文件可在 Dryad (95) 获取；小鼠肝脏 scRNA-seq 数据已存入 Gene Expression Omnibus (GEO)，登录号为 GSE319489。已发表的人类肝脏 scRNA-seq 数据获取自 Guilliams 等人 [(67); GEO: GSE192742]。已发表的人类心脏 scRNA-seq 数据获取自 Tabula Sapiens 联盟 (88)。人类长寿 GWAS 汇总统计数据获取自相应的已发表研究 (89–93)。所有用于人类数据重新分析和 GWAS 分析的自定义 R 脚本均可在 Dryad (67) 获取。许可信息：版权所有 © 2026 作者，保留部分权利；独家被许可方为美国科学促进会 (AAAS)。不对原始美国政府作品主张权利。https://www.science.org/content/page/science- licenses- journal- article- reuse
补充材料 science.org/doi/10.1126/science.aea3075 材料与方法；图 S1 至 S12；表 S1；参考文献 (96–102)； MDAR 重现性检查表
10.1126/science.aea3075
2025 年 7 月 3 日提交；2026 年 5 月 11 日接受
性能权衡定义了哺乳动物中一种基础的牙齿二分法
Narimane Chatar1,2*, Melvin Vankelst3, Alejandro Pérez-Ramos2, Tahlia I. Pollock4,5, Davide Tamagnini6, Margot Michaud3,7,8, Levi Yoder Raskin9, Z. Jack Tseng1
牙齿定义了哺乳动物的进化，而冠群哺乳动物中许多适应性牙齿突破之一便是三尖臼齿（tribosphenic molar）：这是一种兼具剪切和破碎双重功能的牙齿，通常被认为是冠群哺乳动物的一项关键适应。然而，我们并不清楚这些对立功能之间的潜在权衡如何影响哺乳动物谱系的宏进化结果。在此，我们表明捕食性哺乳动物在其三尖肉齿（carnassial teeth）中演化出了二分化的性能，其中切割功能被限制在的一组狭窄的最佳表型中，而破碎功能则表现出冗余的解决方案。少于 1% 的捕食者演化出了最优化的剪切和破碎能力。三尖结构功能中的这种基础权衡促进了发散的宏进化特化，而非功能上的双重性。这些结果突显了关键创新如何驱动早期的进化成功，同时限制了随后的多样化。
牙齿是大多数脊椎动物与其食物之间的主要接口，使其成为理解生态适应和相互作用的核心 (1, 2)。它们在化石记录中具有极佳的保存状况，且与饮食以及食物处理的生物力学需求密切相关，长期以来使其成为研究哺乳动物进化的重要来源 (3, 4)。牙齿还记录了发育压力，并为洞察灭绝群落的进化动态提供了见解 (5, 6)。理解哺乳动物生态多样性的一个关键要素在于异型齿（heterodont dentition，即个体牙列中发育出不同的牙齿类型），这与大多数其他脊椎动物（尤其是鳄鱼或兽脚类恐龙等捕食者）的同型齿 (7, 8) 形成对比。尽管异型齿在非哺乳类合弓类动物中出现得更早 (9)，但冠群哺乳动物中三尖臼齿的出现标志着现代牙齿结构多样性辐射的开始，这种多样性是其他现存脊椎动物无法比拟的 (10)。在这种结构中，下臼齿的三角区（trigonid，用于切割）和跟区（talonid，用于破碎）与上原尖（protocone）协同工作，提供双功能咬合 (11, 12)（图 1）。这种结构的进化使得一次动作即可完成剪切和研磨，并为现代哺乳动物的牙齿和生态
1Functional Anatomy and Vertebrate Evolution Lab, Department of Integrative Biology University of California, Berkeley, Berkeley, CA, USA. 2Departamento de Ecología y Geología, Universidad de Málaga, Málaga, Spain. 3Evolution and Diversity Dynamics Lab, UR Geology, Université de Liège, Liège, Belgium. 4Palaeobiology Research Group, University of Bristol, Bristol, UK. 5School of Biological Sciences, Monash University, Monash, Australia. 6Department of Biology and Biotechnologies “Charles Darwin,” Sapienza University of Rome, Rome, Italy. 7Institut Polytechnique UniLaSalle, Université d’Artois, Mont- Saint- Aignan, France. 8Departement Formation et Recherché Sciences et Technologie, Université de Guyane, Cayenne, Guyane. 9Huelsenbeck Lab, Department of Integrative Biology University of California, Berkeley, Berkeley, CA, USA. *通讯作者。电子邮件：narimane. chatar@ berkeley. edu
多样性 (10)（图 1），这可能扩展了饮食和生态的适应能力，因此通常被认为是哺乳动物演化成功和多样化背后的关键适应（赋予演化优势的特征）。然而，这两个拮抗功能之间潜在权衡的演化意义和后果尚不明确。有利于切割的形态特征（高且尖的尖顶以及对齐的棱脊）最大限度地提高了剪切效率，但牺牲了用于研磨的高表面积和复杂性。相比之下，增强研磨能力的特征（宽且低的小臼齿盆，厚且钝的尖顶）往往会降低切割效率，并且在植食性中更为显著。这些相反的功能构成了兽类起源的基础，也构成了白垩纪末期大灭绝后冠群哺乳动物随后的爆发性辐射演化 (13, 14)。
在胎盘类哺乳动物中，多个谱系独立演化出了高度特化的牙齿，称为“食肉齿”，展示了针对以肉类为主的饮食的重复性解决方案 (15, 16)。虽然其中许多谱系现已灭绝，但现存的食肉目在生态和地理分布上仍然高度多样化。大约 300 个物种占据了从大型超食肉捕食者到小型植食动物的多种饮食生态位 (17, 18)，食肉动物共同拥有单对食肉齿，许多分类单元仍具有三尖齿状态，具有发达的用于研磨的后臼齿盆和用于切割的三尖齿部 (11, 19)。食肉动物的下食肉齿在现存哺乳动物中显示出最广泛的后臼齿盆形态范围 (16, 20, 21)。此外，它们极高的生态广度表明其具有演化灵活性，这可能与它们牙齿的潜在功能优化有关。超食肉类群倾向于表现出缩小的后臼齿盆或叶片状且增强的切割棱脊，而杂食动物则保留更宽、更强壮的后臼齿盆以处理多样化食物，植食动物则倾向于表现出最发达的后臼齿盆 (22)。这一总体模式出现在白垩纪末期灭绝之后，并一直延续至今。
在过去的 66 million 年里，多个胎盘类哺乳动物群体独立演化出了食肉齿。值得注意的是，鬣齿类 (Hyaenodonta) 和氧齿类 (Oxyaenodonta) 这两个历史上被称为“创齿类”的灭绝谱系，演化出了多对食肉齿，突显了与食肉目不同的替代演化方案 (11, 16)。这些发生在遥远捕食者谱系中的重复演化事件，强调了一种趋向于特化肉食的趋同形态的深层演化趋势。然而，尽管最初取得了成功，这些其他谱系最终消失了，这提出了一个更广泛的问题：三尖齿磨牙虽然开启了演化机遇，是否也将演化引导至一组有限的功能路径之中。为了评估这一演化情景，我们开发了一种方法，在灭绝物种和现存物种的功能景观框架下，将高密度三维 (3D) 几何形态测量数据与力学性能测试相结合。
食肉哺乳动物下臼齿的进化渠化
我们对 250 例猫形亚目（Feliformia，猫及其亲属）、犬形亚目（Caniformia，狗及其亲属）、“食肉目” (creodonts，包括已灭绝的食肉哺乳动物 Hyaenodonta 和 Oxyaenodonta) 以及早期分化的食肉类动物 (carnivoramorphans) 的下臼齿形状进行了定量分析。我们采用半自动方案，通过 2000 个 3D 点坐标（伪地标）对每颗牙齿进行了数字化处理（见补充文本和图 S1）。我们建立了一个形态空间（图 2），主要捕捉臼齿后分枝 (talonid) 发育的程度：较低的值对应于后分枝退化或缺失，较高值则表明后分枝发育更完整 (PC1)，代表了从专性食肉动物到杂食-草食物种的光谱（图 2A）。PC2 反映了牙冠的长宽比，范围从食虫动物的高而紧凑的牙齿，到专门食用硬质食物的动物的细长、低尖形态（图 2A）。形态空间中的密度等高线峰值突显了 2 种主要的重复出现且定义了主要特征的臼齿形态。
图 1. 牙齿在切割和/或粉碎方面的效率是由三尖齿结构 (tribosphenic architecture) 的两个原始区域——后臼齿盆 (talonid basin) 和三尖齿 (trigonid) 的发育所驱动的。(A) 我们数据集中的 PC1 值（捕捉后臼齿盆的发育情况）、粉碎效率和切割效率的演化，表明具有发育良好后臼齿的牙齿往往粉碎能力强于切割能力。(B) 现存分类群的子集及其饮食，将牙齿效率指标与观察到的饮食联系起来。
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脊椎动物组织
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竹笋和叶子
© Bryan Faust
昆虫、小型脊椎动物、卵、植物物质
© NatureTTL
硬壳无脊椎动物
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0.2
−0.2
0.1
−0.1
PC2 = 13.04%
0.0
B
猫型亚目 (Feliformia) 及干群 犬型亚目 (Caniformia)
图 2. 下下裂齿的形状变异。(A) 通过对 250 个标本进行主成分分析 (PCA) 获得的全局形态空间及密度等高线。(B) 每个演化支的形态空间（猫型亚目及其干群、犬型亚目、早期分化的食肉类形态动物及鬣狗类 Hyaenodonta）。(C) 简化图，突出了食肉哺乳动物下下裂齿中两种反复出现的形态：一种是跟齿减少或缺失的形态，对应于超肉食性分类群（剪切齿 secodont；图 S12）；另一种是跟齿发育更完整的形态，对应于饮食范围更广的分类群。
−0.2 0.0 0.2 PC1 = 52.37%
早期分化的食肉类形态动物及 鬣狗类 Hyaenodonta
D
B 粉碎景观
图 3. 每个功能的性能景观以及显示其在系统发育中分布的 3D 表型图。(A) 切割景观和 (B) 粉碎数据。 详细图注见图 S7；带十字的黑圈代表理论形状。(C) 系统发育中切割效率的分布，以及 (D) 系统发育中粉碎效率 在系统发育中的分布。3D 表面显示了 (E) 切割和 (F) 粉碎景观中的峰值与谷值。
与食物硬度（抵抗局部变形的能力，例如来自压痕或刮擦）相关的选择压力，而非韧性（吸收能量并在不发生断裂的情况下产生塑性变形的能力）(28)，这共同解释了我们观察到的多种高效粉碎的解决方案。相比之下，超肉食性物种受到严格限制：它们的双尖牙占据形态空间的狭小区域，即使在适度负载下也会出现灾难性失效。牙齿形状的微小结构改进可以显著影响性能：最佳切割与双尖形态一致，但粉碎效率各异，且可以通过细微的解剖学修改将其解耦（图 S12C）。我们发现，并非所有双尖形态在粉碎性能上都表现不佳。
在能够承受粉碎模拟的双尖牙中，一些具有肉食齿切迹（carnassial notch），即位于两个主尖（副尖和原尖，图 S12A）之间的一个钥匙孔形切迹。据假设，该特征有助于在压力和剪切负载期间分散应力 (32)，类似于圆锯中的切口。使用数字图像相关分析获得的非接触式面内应变测量证实，该切迹有助于在叶片上分散应变。相比之下，缺乏该切迹的分类单元在原尖-副尖界面附近显示出应力聚集，这是一个常见的失效区域，裂纹扩展由此开始（补充文本）。切割的形态功能解决方案依赖于精确的咬合对齐和高尖端穿透效率，这由尖端的长度和方向共同决定（图 S12, A 至 C）。这种配置将咬合压力集中在咬合平面一个很小的、高度局部化的区域（图 S12C），从而高效地切割软组织。
我们结合切割和粉碎指标的景观揭示了一个崎岖的适应景观，具有两条主要山脊（图 4A），表明存在能够在切割与粉碎性能之间实现最佳权衡的牙齿表型。仅有两种现存分类单元——斑鬣狗（Crocuta crocuta，综合切割指数为 0.75，综合粉碎指数为 0.65）和亚洲棕榈狸（Paradoxurus hermaphroditus，综合切割指数为 0.58，综合粉碎指数为 0.78）位于最优帕累托前沿（Pareto front），代表了我们数据集的 <1%（图 4B）。两者都没有同时在两种功能上接近理论值 1，这在机械上似乎是不可能的，特别是考虑到结构
F 表面更崎岖
效率 A 所有变量组合
图 4. 获得的切割/粉碎权衡性能表面。景观分别获得于 (A) 将所有五个变量（两个用于切割，三个用于粉碎）组合在一个单一景观中，以及 (B) 将给定方面的所有变量组合为一个，并估计这两个组合的切割和粉碎变量之间权衡时获得的帕累托景观。
猫亚目 (Feliformia) 与干类犬形亚目 (stem Caniformia) 早期分化的食肉类动物形态群 (carnivoramorphans) 与 鬣兽类 (Hyaenodonta)
三尖臼齿的限制。可能只有极少数物种实际上需要同时优化这两项功能，其中 C. crocuta 是一个显著的例外：一个既能碎骨又能食肉的物种 (33)。这与以下观点一致，即强烈的材料属性限制（较软与较硬的食物）限制了实现真正双重优化的空间。正如 Gould 和 Lewontin (33) 所批评的，功能分析倾向于关注复杂系统内部的零部件，有时将这些部件解释为适应性微调的直接产物。相反，表型源于适应性权衡与选择压力、材料限制导致的制造噪声，以及/或生长模式（参考 Seilacher 的形态动力学概念）之间的相互作用 (34)。大量分类群占据性能景观中次优区域的现象，可能反映了本研究测量范围之外的进化结构和历史偶然性的限制。这些模式也与近期的框架相呼应，该框架强调进化轨迹与生态进化驱动力之间在塑造适应性景观表型多样化过程中的相互作用 (35)。明显的牙齿次优化可能通过替代性功能策略来抵消，包括复杂的下颌运动 (36)、行为适应（如食物处理 [例如海獭 Enhydra lutris 对工具的使用 (37)]）或狩猎战术，以及竞争减少等生态因素。形态空间中无人占据的谷地对应于在两项功能中表现均较差的理论形状，这表明存在强的功能限制（图 1 至 3）。这些结果为在牙齿形态空间中存在“适应性谷地”的流行假设提供了直接的实验验证 (22)。然而，请注意，我们的研究重点是下前臼齿，如果将上齿列（尤其是 P4 和 M1，尤其是）的作用，或在具有多个肉齿化臼齿的分类群（如 Hyaenodon 属）中考虑不同的咬合点，可能会导致略有不同的景观。
切割效率比粉碎效率在系统发育上受限更严重
切割与粉碎的进化呈现出截然不同的系统发育模式。最早分化的分类群（高 PC1/高 PC2，对应于牙齿形态空间中最具三尖臼形状的区域）虽然并非顶尖表现者，但聚集在主要适应性脊线附近（图 4）。这些结果表明，肉齿形状的进化遵循沿两个主要功能轴的性能驱动轨迹：一个趋向于增强切割，另一个趋向于提高粉碎（图 S16）。切割适应性在结构和进化上似乎都受到了限制。实现高切割效率的分类群具有特化的双尖形态（图 1 至 3），并表现出强烈的系统发育信号。相比之下，粉碎能力显得更为灵活，出现在更广泛的牙齿形状中，且系统发育聚集度较低，这反映了后臼齿跟部（talonid）比三角部（trigonid）具有更大的可塑性 (31)。切割与粉碎之间的二分法得到了结果的支持，结果显示切割性状具有一致且强烈的系统发育信号 [K > 0.5, λ > 0.5, 根据 (38), 表 1]，而粉碎性状整体上的系统发育结构则弱得多（补充文本和表 1）。这些结果表明，切割能力在进化上更为保守，这与一个
表 1. 系统发育信号测试结果。
| 方面 | 性状 | Blomberg’s K | P- value | Pagel’s λ | P- value | 解释 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 切割 | 最大力 | 0.871 | 0.009 | 0.818 | 0.0006 | 高系统发育信号 |
| 最大长度 | 0.662 | 0.009 | 0.820 | 0.003 | 高系统发育信号 | |
| 综合切割 | 0.850 | 0.012 | 0.921 | 0.003 | 高系统发育信号 | |
| 粉碎 | 调整后峰值载荷 | 0.408 | 0.194 | 0.156 | 0.843 | 低系统发育信号 |
| 调整后至峰值载荷的距离 | 0.375 | 0.363 | 0.023 | 0.922 | 低系统发育信号 |
祖先切片功能需要精确的合拢对齐，且在演化树中表现出极小且局部集中的形态变异（图 S13 和 S14）。相比之下，研磨性能则表现出更高的演化速率变异，在饮食更坚硬或更多样化的谱系中重复演化（图 S15 至 S17）。这些观察结果进一步强调了前文所述的三尖臼齿双功能结构如何持续塑造不同谱系间的功能多样化模式。换言之，三尖臼蓝图提供了一个结构框架的边界条件，在此框架内，差异化的功能特化反复出现。尽管与祖先状态相比存在广泛的形态分化，但这种二分法仍然存在（图 1 和 2）。
功能多样性与演化成功。理解为什么某些谱系比其他谱系存续时间更长，仍然是演化生物学的一个核心问题。关注领域之一是对表现出趋同功能特征的类群进行比较，因为某些特征已被确定为灭绝风险的潜在相关因素 (39, 40)。尽管在多个胎盘类分支（例如，鬣齿兽类和氧齿兽类）中出现了切片特化牙齿的趋同演化，但如今只有食肉目存活，其演化成功的底层机制解释仍存在争议 (15, 19, 22, 29, 41)。有假设认为，在现生捕食者分支中观察到的较低特化的牙齿构成了一种演化优势 (16, 22, 29)。与这一论点一致，有观点认为食肉目的成功可能与某些谱系保留了更多泛化特征有关，例如 the genets（Viverridae）、獴类（Herpestidae）或犬类及其亲缘类群（Caniformia）(11)。相比之下，之前的研究表明，在某些以牺牲研磨牙形态为代价而强调剪切的灭绝类群中，极肉食性可能起到了宏演化棘轮的作用；一旦研磨用的后臼齿跟部（talonid）丢失，可逆性可能会受到限制，从而可能导致这些谱系的长期演化存续能力降低 (41)。泛化类群预计在多个功能方面维持中等性能，而不是在其中某一方面达到最大化，从而可能在帕累托框架（Pareto framework）中实现优化的权衡。然而，我们的发现并未明确支持这一假设。值得注意的是，位于帕累托前沿的两个物种并不代表典型的饮食泛化者。亚洲棕榈灵猫 (P. hermaphroditus) 是一种相对特化的食果动物（图 4），在保持中等切片能力的同时，表现出极高的研磨性能值。由于其行为隐秘，关于其在野外饮食的详细定量数据仍然稀缺，但现有证据表明其强烈依赖肉质水果 (42)。在这种情况下，发达的跟部可能在通过研磨从水果中提取营养方面同样高效。同样，鬣狗的牙齿尽管具有高度特化的极肉食性裂齿，但在切割软组织和研磨硬组织方面都表现得异常出色。综合来看，这些发现表明，在切片和研磨之间实现高性能的折中，并非简单的保留原始特征的问题。相反，最优的形态功能解决方案似乎仅在极少数类群中选择性地实现。一个真正的机械最优解（同时在两种功能上都表现卓越）是
在结构上难以实现，至少在考虑下前臼齿时是如此。这种局限性可能既反映了饮食压力（很少有物种在两种功能上都需要最大效率），也反映了更深层的架构约束。三尖臼齿分为截断区和研磨区（图 1），这可能在本质上限制了集成优化的潜力，引导哺乳动物牙齿进化沿着发散的路径演变，而非使之向单一的多功能峰值收敛。
因此，源自三尖臼的裂齿在形态功能上的进化遵循两条基本且互斥的路径：切削（约束较多）与研磨（较为灵活）。虽然某些谱系利用研磨的灵活性来扩大饮食范围，但其他谱系可能会以牺牲进化可逆性为代价来优化切削。理论和实验研究均表明，哺乳动物牙齿是在一组狭小的物理和发育可能性 (28, 43) 中演化的，几何和材料约束决定了形态适应功能的方式。理想化模型仅确定了少数几种机械上最优的牙齿架构，例如三尖臼和裂齿形态 (28)；而其他方面的研究，如微观结构分析，则显示了诸如釉质柱交叉和自愈合簇等特征如何在这些约束下增强耐用性 (44)。进化模型显示，多尖牙和模块化臼齿的出现代表了一种分散压力并减轻竞争性断裂模式的策略 (45)。这一模式在将机械折衷与哺乳动物饮食多样化联系起来的形态测量学研究中也得到了体现 (46)。在这种情况下，三尖臼蓝图既是一项赋能创新，也是一种结构约束：一个允许两套牙齿性能但难以超越的进化设计空间。这种哺乳动物特有牙齿的双重性可以通过以下观察结果来调和：权衡并非改变的障碍，而是创新的驱动力 (47)。最初的三尖臼架构具有两个在结构上截然不同且在功能上专业化的区域，这可能引入了内在的结构约束 (sensu 34)，从而导致了观察到的权衡。这些结果突显了关键创新如何在推动进化成功的同时，限制随后的多样化。
参考文献与注释
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致谢 我们感谢策展人、馆藏管理员及工作人员，他们的帮助和支持对于收集本研究所需的所有扫描件至关重要。特别是，我们要感谢：V. Fischer (ULiège, Liège, Belgium), O. Pauwels, A. Folie and T. Smith (RBINS, Brussels, Belgium), E. Gilissen (RMCA, Tervuren, Belgium), G. Véron and G. Billet (MNHN, Paris, France), D. Kalthoff and T. Mörs (NRM, Stockholm, Sweden), B. Kear (PMU, Uppsala, Sweden), E. Amson (SMNS, Stuttgart, Germany), S. Fraile and J. Morales (MNCN, Madrid, Spain), R. Pappa and P. Brewer (NHMUK, London, UK), P. Holroyd (UCMP, Berkeley, CA, USA), C. J. Conroy (MVZ, Berkeley, CA, USA), S.A. McLeod and X. Wang (NHMLA, Los Angeles, CA, USA), D. Berthet and F. Vigouroux (Musée des confluences, Lyon, France), B. Roussel (Musée de Valence, Valence, France), L. Costeur (NMBS, Basel, Switzerland), D. Brinkman
and V. R. Rhue (YPM, New Haven, CT, USA), J. Meng, J. Galkin and R. O’Leary (AMNH, New York, NY, USA), 以及最后的 N. Pyenson, A. Millhouse, and M. Miller (NMNH, Washington, DC, USA)。对于向我们提供额外扫描件的行为，我们要感谢所有在各类平台上提供扫描件的机构和个人，具体包括怀俄明大学、菲尔德自然历史博物馆、佛罗里达大学、爱达荷自然历史博物馆、巴塞罗那自然科学博物馆、加州大学洛杉矶分校、Blaire Van Valkenburgh、Denis Geraads，以及 MorphoSource、Sketchfab 和 Digimorph 背后的所有工作人员。我们还感谢所有分享我们在图表中使用的 PhyloPic 剪影的同事：T. M. Keesey, L. Ancillotto, A. Farke。
资助：本研究得到了以下支持：比利时美国教育基金会 (BAEF) 奖学金（授予 N.C.）；欧盟玛丽·居里行动 (MSCA) 2024 年博士后奖学金 (HORIZON- MSCA- 2024- PF- 01) 资助协议 101207039 https://doi.org/10.3030/101207039 （授予 N.C.）；美国国家科学基金会资助 NSF DBI- 2128146 （授予 N.C. 和 Z.J.T.）；科学研究基金 F.R.S.–FNRS 资助 FRIA FC 63999 （授予 M.V.）；Labex BCDiv 10- LABX- 0003 和 Fyssen 基金会（授予 M.M.）；ED 227 “自然与人类科学：进化与生态”博士学校（授予 M.M.）；意大利大学与研究部 PNRR，任务 4 组件 2，“从研究到企业”，投资 1.4，项目 CN00000033 （授予 D.T.）；约翰·邓普顿基金会资助 (JTF 62574)（授予 E. J. Rayfield 和 P.C.J. Donoghue 以在撰写本文期间聘请 T.I.P.）（本文表达的观点仅代表作者，不一定反映 约翰·邓普顿基金会的观点）（授予 T.I.P.）；利弗休姆信托基金授予的利弗休姆早期职业研究员奖学金 (ECF- 2025- 468) （授予 T.I.P.）。
作者贡献：概念化：N.C., M.V., and Z.J.T.; 方法论：N.C., M.V., A.P.R., T.I.P., Z.J.T.; 调查：N.C., M.V., A.P.R., Z.J.T.; 正式分析：N.C. L.Y.R.; 软件：N.C. L.Y.R.; 可视化：N.C.; 资金获取：N.C. Z.J.T.; 项目管理：N.C. Z.J.T.; 监督：N.C. Z.J.T.; 撰写——初稿：N.C., M.V., Z.J.T.; 撰写——审校与编辑：N.C., M.V., A.P.R., T.I.P., DT, M.M., L.Y.R., Z.J.T.
竞争利益：作者声明不存在竞争利益。
数据、代码和材料可用性：所有数据均可在正文或补充材料中获得。本研究中描述的所有化石标本均已编目并存放于各
机构，更多详情请参阅补充材料中的“材料来源”部分：可在 Data S1 中找到所使用标本的完整列表及其元数据（包括标本编号和机构）。许可信息：版权所有 © 2026 作者，保留部分权利；独家许可方为美国科学促进会。不对美国政府原始作品主张权利。https://www.science.org/content/ page/science- licenses- journal- article- reuse
补充材料 science.org/doi/10.1126/science.aee3453 材料与方法；补充文本；图 S1 至 S17；表 S1 至 S4； 参考文献 (48–95)；视频 S1 至 S8；数据 S1 至 S4
用于下一代互连线的韦尔半金属 NbAs 纳米线的表面主导传输
Yeryun Cheon1, Mehrdad T. Kiani2†, Yi- Hsin Tu3, Sushant Kumar4, Nghiep Khoan Duong1, Jiyoung Kim5, Lingcheng Kong5, Quynh P. Sam2, Han Wang2, Satya K. Kushwaha6, Nicholas Ng6, Seng Huat Lee7, Sam Kielar5, Chen Li5, Amelia Schaeffer8, Jack D. Coyle2, Dimitrios Koumoulis9, Saif Siddique2, Zhiqiang Mao7, Gangtae Jin10, Zhiting Tian5, Ravishankar Sundararaman11, Hsin Lin12, Gengchiau Liang3, Ching- Tzu Chen13, Judy J. Cha2*
对更小型化且更节能的电子设备的持续需求，使得在尺寸减小时具有更低电阻率的替代互连材料成为必要。我们报道了通过热机械纳米模塑合成的单晶且直径可控（低至 40 纳米）的韦尔半金属砷化铌 (NbAs) 纳米线。NbAs 纳米线的电阻率随直径的减小而降低，直径为 40 纳米的纳米线在室温下表现出 10.5 ± 1.9 微欧·厘米的电阻率，比其体相对应物低约 70%。计算结果将这种电阻率的降低归因于在有限温度下具有长载流子寿命的表面主导导电。对纳米线和体相晶体的进一步表征显示出高击穿电流密度、稳定性和热导率。这些特性突显了 NbAs 纳米线作为下一代互连线的潜力，有望突破当前基于铜的互连线的局限性。
随着现代集成电路 (IC) 中电子元件的持续小型化，目前的铜 (Cu) 基互连线正达到其物理极限 (1–4)。在低于电子平均自由程的极小尺寸下，由于表面和晶界的电子散射，Cu 的电阻率大幅增加。当前窄互连线的高电阻引入了不可忽视的电阻-电容信号延迟，并提高了动态功耗，限制了 IC 芯片的整体计算性能 (3, 4)。因此，在先进技术节点中解决这些挑战，需要寻找在尺寸减小时电阻率低于当前 Cu 互连线的替代导电材料。
尽管最近的研究集中在单质金属上，例如钴 (Co) 和钌 (Ru)，由于其电子平均自由程较短，在 10 纳米以下区间表现出的电阻率尺寸效应较不明显 (3, 4)，但拓扑半金属已成为一个具有前景的候选材料 (5–8)。拓扑半金属具有拓扑保护的导电表面态，据预测，即使在较大尺寸下，这些状态也会对总电导率产生显著贡献 (9)。在具有大表面积-体积比的小特征尺寸下，表面
1美国纽约州伊萨卡，康奈尔大学物理系。2美国纽约州伊萨卡，康奈尔大学材料科学与工程系。3台湾新竹，国立阳明交通大学产学创新学院。4美国纽约州奥尔巴尼，IBM 研究院。5美国纽约州伊萨卡，康奈尔大学西布利机械与航空航天工程学院。6美国马里兰州巴尔的摩，约翰斯·霍普金斯大学界面材料加速实现、分析与发现平台 (PARADIM)。7美国宾夕法尼亚州大学公园，宾夕法尼亚州立大学物理系。8美国纽约州伊萨卡，康奈尔大学应用与工程物理学院。9美国纽约州伊萨卡，康奈尔大学材料研究中心。10韩国城南，嘉泉大学电子工程系。11美国纽约州特洛伊，伦斯勒理工学院材料科学与工程系。12台湾台北，中央研究院物理研究所。13美国纽约州约克顿高地，IBM 托马斯·J·沃森研究中心。*通讯作者。电子邮件：jc476@cornell.edu †现地址：美国佛罗里达州塔拉哈西，佛罗里达州立大学材料科学与工程系。
对电导的贡献可能占据主导地位，且某些拓扑半金属即使在室温下，其电阻率也会随着尺寸的缩小而降低 (10–12)。关于韦尔半金属 (Weyl semimetals) 和多倍费米子半金属的理论研究确实证明，在纳米尺度上存在显著的表面态电导贡献 (5, 9, 13, 14)。尽管有这些令人鼓舞的理论预测和少数薄膜研究 (15–17)，但仍明显缺乏实验证据来确认此类材料系统在与实际互连应用相关的尺寸下具有更优越的电阻率缩放特性。
砷化铌 (NbAs) 是一种 I 型韦尔半金属，自 2015 年实验发现以来 (18) 已被广泛研究。虽然已经应用了一些自下而上和自上而下的方法来合成 NbAs 纳米结构，但它们在可实现尺寸或晶体质量方面受到限制。例如，据报道通过化学气相沉积 (CVD) 生长的 NbAs 纳米带厚度约为 200 nm，且这些纳米带的电电阻率比块体晶体降低了一个数量级，证明了表面电子的高迁移率 (11)。然而，CVD 合成缺乏对形貌和尺寸的精细控制；纳米带的截面积被限制在 ~105 nm2，这远大于先进节点互连所需的面积。虽然已通过分子束外延在砷化镓衬底上生长了 NbAs 薄膜，但这些薄膜具有纳米级晶粒的织构 (15)。作为一种自上而下的方法，聚焦离子束 (FIB) 铣削可以产生尺寸可控的 NbAs 微纳结构，但由于 Nb 和 As 之间的表面结合能差异很大，Ga 离子束会在其表面留下 Nb 残留物 (19)。
在这项工作中，我们利用热机械纳米模塑法 (TMNM) 成功合成了直径小至 40 nm 的单晶 NbAs 纳米线。TMNM 是一种近期开发的制备方法，通过多孔模具中的晶格和界面扩散，可以从多晶体块原料中获得单晶纳米线 (20–23)。对这些 NbAs 纳米线的电输运测量显示出理想的电阻率缩放：对于 40-nm-直径的纳米线，室温电阻率 (10.5 ± 1.9 microhm·cm) 比体相单晶低约 70%，且与先进节点中的铜 (Cu) 互连相当 (24)。低温下的磁输运测量在 NbAs 纳米线中显示出明显的 Shubnikov–de Haas (SdH) 振荡，表明其具有较高的载流子迁移率。第一原理计算和 SdH 振荡分析表明，NbAs 纳米线的化学势偏移可忽略不计，从而排除了体相载流子密度变化是导致观测到的室温电阻率降低的原因，进而表明拓扑表面态具有显著贡献。此外，电子-声子电阻率缩放的模拟表明，表面态的寿命必须比体相态的寿命高出大约两个数量级，才能解释观测到的电阻率降低。最后，我们报道了 NbAs 的击穿电流密度、空气敏感性和热导率，以展示 NbAs 如何在未来的互连应用中优于其他候选材料。
NbAs 中电输运与电阻率缩放的理论预测 图 1A 显示了 NbAs 的晶体结构，它属于过渡金属单 the pnictide (TmPn) 家族 (Tm = Ta/Nb; Pn = P/As)，空间群为 I41md (No. 109) (18)。该 TmPn 家族缺乏反演对称性，从而使其能够承载韦尔费米子 (Weyl fermions)。我们
c
a b
-1
×1020
1.0
0.2
E F D
Electron (电子) Hole (空穴)
Carrier density (cm–3) (载流子密度 (cm–3))
0.5
-0.5
100 50 0 -50 -100 400 200 0 -200 -400
0.4
0.0
0 10
E – EF (meV)
E – EF (meV)
As
图 1. 韦尔半金属 NbAs 的理论计算。(A) NbAs 的晶体结构。(B) 具有有限自旋-轨道耦合的 NbAs 计算电子能带结构。(C) NbAs 三维布里渊区 (BZ) 中韦尔节点的示意图及其在 (001) 表面 BZ 上的投影。红色和蓝色表示节点的相反手征，而青色表示 BZ 中的高对称点。费米弧（浅绿色）连接电荷相反的投影韦尔节点。(D) 300 K 时电子（红色）和空穴（蓝色）载流子密度随化学势的变化函数。(E) 300 K 时计算的体相电子-声子电阻率随化学势的变化。(F) 模拟的室温电阻率 ρ/ρ0（其中 ρ0 为体相电阻率）随临界尺寸 (CD) 的变化函数，对应的表面-体相状态寿命比 τs/τb = 1, 10, 和 100（分别为红色、蓝色和绿色曲线）。此处，τs 和 τb 分别表示表面状态和体相状态的寿命。对于薄膜，CD 指厚度；对于纳米线，CD 指直径。空心圆圈是 16 至 56 个原子层 (AL) 薄膜中计算得到的 ρ 值，增量为 8 AL。虚线是通过将公式 S5 拟合到每个薄膜数据集而得出的，实线是纳米线的近似电阻率缩放。
τs/τb = 1
对 NbAs 的电子能带结构、声子能带结构和电子-声子耦合进行了第一原理计算（见材料与方法）。图 1B 展示了具有有限自旋-轨道耦合的 NbAs 计算电子能带结构。NbAs 具有 12 对韦尔节点（费米能级附近离散的线性能带交叉），且具有拓扑费米弧表面态，将表面布里渊区 (BZ) 中两个电荷相反的韦尔节点投影连接起来。
1.2
图 1C 示意性地展示了这些韦尔节点在三维 BZ 中的分布，以及在 (001) 表面投影二维 BZ 中的拓扑保护费米弧 (18, 25)。对 NbAs 薄片的费米面计算表明，表面态在低至 ~2 nm 时仍保持不受干扰（图 S1 和 S2），这表明在亚 10-nm 尺寸下应能保持表面态传输。理论预测，大量的韦尔节点和表面态产生了相对较高的表面态密度 (DOS)，导致在尺寸减小时，表面对总电导有显著贡献 (13)。我们计算了不同薄片厚度的体相-表面 DOS 比，结果显示即使在 NbAs 的 40 nm 厚度下，表面态的贡献依然显著（见补充文本、图 S3 以及表 S1 至 S3）。
图 1D 显示了 300 K 时计算的体相载流子密度随化学势的变化函数。红色和蓝色曲线分别代表电子和空穴的贡献，突显了 NbAs 的半金属特性，这意味着电子和空穴载流子在费米能级处几乎完美地相互补偿。图 1E 显示了 300 K 时体相电子-声子电阻率
Energy (eV) (能量 (eV))
XY Σ Σ' Г Г N P Z Y' Z
T = 300 K T = 300 K
Resistivity (µΩ∙cm) (电阻率 (µΩ∙cm))
20 30 40 0
如何随化学势变化。零掺杂附近较高的电阻率主要源于较低的体相载流子密度。需要注意的是，虽然载流子掺杂（例如由空位引起）可以降低 NbAs 的体相电子-声子电阻率，但化学势必须移动 ~200 meV 才能使电阻率降低 ≳75%。
图 1F 绘制了 NbAs 薄膜在室温下的电阻率缩放情况，以及 NbAs 纳米线的估计值，其函数为有效表面态与体态寿命比 ($\tau_s/\tau_b$)（详见补充文本和图 S4）。红色、蓝色和绿色轨迹分别对应 $\tau_s/\tau_b = 1, 10, 100$。空心圆圈表示在 16-原子层 (AL) 至 56- AL 薄膜中计算出的 $\rho$ 值，增量为 8 ALs；在 NbAs 中，沿着 [001] 方向的一个晶胞厚度为 8- AL。假设体态和表面态并行导电，我们使用单个拟合参数 $\alpha$ 对每个计算出的 $\rho$ 数据集（对应于固定的 $\tau_s/\tau_b$）进行拟合，$\alpha$ 表示表面电导与体电导率的比率 (13)（见补充文本中的等式 S5），并将薄膜电阻率外推至约 40 nm 的临界尺寸（图 1F，虚线）。随后，我们通过将 $\alpha$ 值翻倍，以考虑除顶面和底面之外的侧壁表面电导贡献，从而估计相应的纳米线电阻率缩放（图 1F，实线）。由于表面对总导电的贡献增加，结果显示样本电阻率随尺寸减小而降低。这种降低的程度随 $\tau_s/\tau_b$ 比率的增加而增加，因为 $\tau_s/\tau_b$ 比率越高，每个表面态的贡献就越大。对于一个直径约为 40- nm 的 NbAs 纳米线，相较于体电阻率降低 $\gtrsim 75\%$ 意味着 $\tau_s/\tau_b \sim 100$（图 1F，绿色实线）。
$\tau_s/\tau_b = 10$
$\tau_s/\tau_b = 100$
0.8
0.6
临界尺寸 (nm)
多晶 块体原料
通过 TMNM 合成 NbAs 纳米线 我们通过放电等离子体烧结制备了 NbAs 的多晶块体原料（见材料与方法）。X 射线衍射确认了块体原料中占主导的 NbAs 相，且其电子背散射衍射图显示了微米级晶域（图 S5）。利用这些多晶块体原料，我们使用 TMNM 合成了单晶 NbAs 纳米线（图 2A），其中目标材料的块体原料在高温下被压入多孔模具中。纳米线通过晶粒重新定向，沿具有能量优势的表面在特定方向上生长，从而能够从多晶块体原料中制备出单晶纳米线 (23, 26)。我们在 700°C 和 200 MPa 下进行 TMNM 持续 3 小时，使用的是孔径为 40 或 80 nm 的阳极氧化铝 (AAO) 模具。使用不同孔径的模具来控制纳米线的形貌和尺寸。在用 40 nm 孔径的 AAO 模具蚀刻后，对 NbAs 纳米线进行的扫描电子显微镜 (SEM) 成像（图 2B；另见材料与方法）确认其线径均匀，约为 40 nm。这些纳米线通过在异丙醇中超声处理从块体原料中释放，得到的典型线长为 2 至 3 μm。
T = 700 °C
单晶 纳米线
NbAs 纳米线的高角环形暗场扫描透射电子显微镜 (HAADF-STEM) 的低倍和高倍图像（分别见图 2, C 和 D；更多 NbAs 纳米线见图 S6）显示，纳米线为单晶，没有明显的缺陷，如堆垛层错或位错。表面约 3 nm 的薄氧化层（图 S7A）与之前关于 NbAs 薄膜的报道一致 (15)。利用 STEM 图像及其快速傅里叶变换 (FFT) 进行的晶体学分析表明，NbAs 纳米线的生长主要沿 [100] 晶向，尽管也观察到了 [101] 生长方向（图 S6, E 和 F）。
为了进行比较，我们还利用选区电子衍射 (SAED) 图谱和电子透明薄片提取物的原子分辨率 HAADF-STEM 图像，对通过化学气相传输法生长的单晶进行了表征（分别见图 2, E 和 F；不同晶向见图 S8）。纳米线的晶格常数为 a = 3.48 Å 和 c = 11.73 Å，这与我们的单晶（a = 3.45 Å 和 c = 11.51 Å）以及之前的研究一致 (18)。图 2G 比较了纳米线和单晶的归一化能量色散 X 射线光谱 (EDX) 数据。Nb 和 As 的相对峰强表明，纳米线的 Nb 与 As 比例接近 1:1，具有约 0.1 原子百分比 (at %) 的 As 空位（表 S4）。在成型温度 >700°C 时，由于砷容易挥发，我们观察到了缺 As 相，如铌氧化物或亚稳态 Nb7As4。
A AAO 模具
图 2. NbAs 纳米线的热机械纳米模塑 (TMNM) 及结构表征。(A) TMNM 过程的示意图。(B) 仍附着在块体原料上的 NbAs 纳米线的 SEM 图像。(C) NbAs 纳米线的低倍 HAADF-STEM 图像。(D) (C) 中红框区域的原子分辨率 HAADF-STEM 图像。插图显示了相应的 FFT，标出了 [100] 生长方向。(E) NbAs 块体单晶提取物的 SAED 图谱。插图为该单晶的光学照片（黑色比例尺：1 mm）。(F) 与 (E) 中相同的提取物的原子分辨率 HAADF-STEM 图像。(G) 纳米线（红色）和块体单晶（蓝色）的归一化 STEM-EDX 光谱。a.u.，任意单位。
P = 200 MPa
1 nm [100]
NbAs 纳米线的电输运性质及表面导电证据
我们利用标准电子束曝光技术（见材料与方法）制备了四端器件，以对 NbAs 纳米线进行电输运测量。纳米线被分散在 $\text{SiN}_x/\text{Si}$ 基底上，并使用稀氢氟酸 ($\text{HF}$) 处理，以去除薄氧化层和任何残留的模具材料（使用 $\text{SiN}_x/\text{Si}$ 基底是因为它们在 $\text{HF}$ 中的刻蚀速率较慢）。图 3，A 和 B 分别显示了一个代表性 NbAs 纳米线器件的示意图和 SEM 图像。不同沟道长度的两端电测量（图 3C）显示在低施加电压下具有线性电流-电压 ($\text{I-V}$) 特性，表明器件具有定义良好的欧姆接触。两根直径为 40- nm 的 NbAs 纳米线和两块体单晶的温度依赖性电阻率均表现出金属行为（图 3D）。在 300 K 时，四端纳米线器件显示的电阻率 ($\sim 8.1$ 和 $\sim 12.7$ 微欧$\cdot\text{cm}$) 低于体材料 ($\gtrsim 49$ 微欧$\cdot\text{cm}$)。此外，测得的纳米线表现出较弱的温度依赖性，与单晶相比，其低残余电阻比 ($\text{RRRs}$) 较低 ($\sim 1.8$ 和 $\sim 1.6$ 对比 $\sim 10$ 和 $\sim 5.6$)。
纳米线较小的电子-声子电阻率与体单晶形成对比，这无法通过掺杂引起的体电阻率降低来解释。通过掺杂实现 $\sim 70\%$ 的电阻率降低需要将化学势改变 $\pm 200\text{ meV}$。
[[IMG_XXXX]] （图表内容： Nanowire 纳米线 Bulk 体 As L Nb L Intensity (a.u.) 强度 (a.u.) As K As K Nb K Nb K 10 12 14 16 18 20 1 2 Energy (keV) 能量 (keV)）
B
G
J (MA cm–2)
-5
-10
1 2 3 4 0
d = 40 nm
图 3. NbAs 纳米线的电学特性以及用于互连应用的额外材料表征。(A) 四端 NbAs 纳米线器件的示意图。(B) 四端 NbAs 纳米线器件的代表性 SEM 图像（比例尺：1 μm）。(C) 不同沟道长度 (Lch) 的两端 I-V 曲线。(D) 体相单晶（黑色和灰色）与直径为 40- nm 的纳米线（红色和橙色）随温度变化的四端电比电阻率。(E) 多晶体相原料（蓝色三角形）、体相单晶 [黑色菱形；实心符号来自本研究，空心符号来自之前的研究 (11, 29, 30)] 以及纳米线（红色星号代表直径约为 40 nm，浅红色星号代表直径 >50 nm）的室温电阻率。(F) 六个直径约为 40 nm 的不同两端纳米线器件的电流密度与施加电压的关系。插图显示了一个失效器件的代表性 SEM 图像（比例尺：100 nm）。(G) 各种材料的热导率，包括本研究中的 NbAs（其中 sc 和 pc 分别表示单晶和多晶）、传统金属 (Cu, Ru, 和 Co) (40)、Cu/TaN 多层堆栈 (47) 以及其他代表性的拓扑半金属 [NbP (41), MoP (42), TaAs (43), WTe2 (44), CoSi (45), 和 Cd3As2 (46)]。(H) 直径为 40- nm 的 NbAs 纳米线（红点）和厚度为 40- nm 的 Cu 薄膜（黑点）的归一化电阻变化 (ΔR/R0) 与空气暴露时间的关系。(I) 传统金属纳米线和 NbAs 纳米线的室温电阻率随直径的变化函数。Cu（黑色）、Ru（蓝色）和 Co（绿色）的拟合曲线来自先前报道的实验数据 (24, 48, 49)，而 NbAs 纳米线则以红色星号绘制。
E
d = 40 nm
多晶 (Polycrystalline)
单晶 (Single crystal)
Lch
50 nm
~40 nm
I
NbAs
MoP
NbP
TaAs
Cu/TaN
WTe2
Cd3As2
CoSi
Cu
Ru
Co
Ru
H
Co
R/R0 (%)
Cu
块体 (Bulk)
(图 1E)，鉴于模制 NbAs 纳米线的化学计量比接近 1:1 (图 2G)，这种情况不太可能发生。我们的密度泛函理论 (DFT) 计算表明，0.78 at % 的 As 空位仅使费米能级移动了 ~20 meV (图 S9 和 S10)。如下文所述，对样品的量子振荡测量显示，纳米线与块体单晶之间的化学势差很小，进一步排除了块体载流子掺杂是导致纳米线电阻率降低的原因。因此，NbAs 纳米线的低电阻率必然源于表面态传导的贡献。
通常，低 RRR（剩余电阻比）是由低质量晶体中的杂质或紊乱引起的。然而，纳米线的剩余电电阻率仍然较低，且在 2 K 时与我们的块体单晶相当 (~5 microhm·cm)，因此其原因可能是拓扑表面态中较弱的电子-声子耦合。事实上，先前对拓扑绝缘体 $\text{Bi}_2\text{Se}_3$ 和 $\text{Bi}_2\text{Te}_3$ 采用第一原理计算和角分辨光电子能谱的研究已揭示了较弱的表面态电子-声子耦合 (27, 28)。
图 3E 显示了模制纳米线、多晶块体原料以及 NbAs 块体单晶的室温电阻率。我们测得的块体晶体电阻率值与先前报道的数值高度一致 (11, 29, 30)。块体晶体的霍尔测量显示，室温载流子浓度和迁移率与之前的研究一致 (29, 30)（详见补充文本和图 S11）。在室温下，我们的 NbAs 纳米线表现出比块体单晶更低的电阻率。特别是，直径为 ~40 nm 的纳米线平均电阻率为 10.5 ± 1.9 microhm·cm，比最好的块体单晶低 ~70%，比生长这些纳米线所用的多晶块体原料低一个数量级。
我们将多晶块体原料比块体单晶高得多的电阻率归因于晶界散射。此外，通过将实验测得的纳米线与块体电阻率之比 (~0.25 至 ~0.33) 与理论结果 (图 1F) 进行比较，我们估计平均表面载流子寿命比块体载流子寿命长约两个数量级（见补充文本），这与温度依赖性电阻率中表现出的弱电子-声子耦合一致。基于这一估计的寿命比，我们预计室温下表面载流子的迁移率将比块体载流子高两个数量级，尽管这还需要进一步的实验验证。
IDS (µA)
300 nm 350 nm 420 nm
1 2 3 4 0 -1 -2 -3 -4
VDS (mV)
面内 (in-plane)
(W m–1 K–1)
c-轴 (c-axis)
NbAs NW Cu 薄膜 (Cu film)
1 10 100 800 1400 1600
VDS (V)
曝光时间 (h)
块体 1 (Bulk 1)
块体 2 (Bulk 2) 纳米线 1 (Nanowire 1) 纳米线 2 (Nanowire 2) (40 nm)
电阻率 (µΩ∙cm)
电阻率 (µΩ∙cm)
电阻率 (µΩ∙cm)
0 50 100 150 200 250 300
T (K)
NbAs (sc)
NbAs (pc)
纳米线 (Nanowire) 块体 (Bulk)
20 40 60 80 0
直径 (nm)
我们注意到，用于电阻率计算的导线直径取自 AAO 模具的标称孔径或低倍率 SEM 图像。实际的导线直径小于这些标称值。例如，先前一项关于纳米模塑 Mo4P3 的研究表明，实际导线直径可能比标称模具直径小 15 到 20% (31)。因此，此处报告的电阻率值代表一个上限，在现实中可能会低约 35%。
其他材料特性以及与当前互连技术的比较 对于互连应用，其他材料特性（如击穿电流密度、热导率以及抗氧化和抗电迁移能力）与低电阻率同样重要。为了研究 NbAs 纳米线的击穿电流密度，我们制备了直径为 40 nm 的两端 NbAs 纳米线器件，并逐渐增加施加电压直到器件失效。测得的击穿电流密度为 46.3 ± 20.3 MA cm–2，这是 6 个器件的平均值（图 3F）。该数值与 Cu 纳米线的击穿电流密度（~100 MA cm–2）(32, 33) 以及先前报道的其他具有高击穿电流密度的纳米结构（如三硒化钽 (TaSe3) 纳米线和二碲化钨 (WTe2) 纳米带）相当（表 S5）(34–37)。图 3F 的插图显示了一个失效器件的 SEM 图像。值得注意的是，击穿位置不在阴极侧，而是出现在随机位置，这表明器件击穿可能是焦耳加热的结果，而非电迁移诱导的空洞形成 (38, 39)。
我们通过使用激光诱导瞬态热光栅法测量 NbAs 块体单晶和多晶的热导率来表征散热性能。我们在室温下获得了面内热扩散率，并利用测得的比热将其转换为热导率（参见材料与方法）。单晶和多晶的面内热导率分别为 109.68 ± 1.28 和 51.74 ± 5.57 W m–1 K–1（详见补充文本和图 S12）。对于单晶 NbAs，面内热导率相当各向同性（图 S13）。由于我们的 NbAs 纳米线主要沿 [100] 方向生长，该面内热导率提供了最相关的块体参考。为了完整起见，我们还使用频域热反射法测量了沿 [001] 方向的跨面热导率，得到的值为 23.30 ± 1.60 W m–1 K–1（参见补充文本，图 S14 和表 S6）。
单晶 NbAs 的面内热导率与 Ru 和 Co 等常规金属相当 (40)，且高于或相当于其他拓扑半金属 (图 3G；详见表 S7) (41–46)。尽管大块 Cu 表现出比 NbAs 更高的热导率 (401 W m–1 K–1) (40)，但 Cu 互连需要氮化钽 (TaN) 等阻挡层，这降低了有效热导率。例如，Cu/TaN (10 nm/3.5 nm) 多层堆栈的有效热导率仅为 12.8 W m–1 K–1 (47)。由于相对于光束尺寸样本体积较小，我们无法测量 NbAs 纳米线的热导率。然而，其高电导率表明，在尺寸减小时，热导率和传热能力可能不会显著下降。对于互连堆栈的整体散热，还必须考虑周围低 k 介电层的热导率。这些介电层通常表现出的热导率为 <~1 W m–1 K–1 (表 S8)，远低于互连金属。在这种情况下，NbAs 的热导率足够高，且不是互连尺寸缩减的限制因素。
为了测试空气稳定性，我们监测了 NbAs 纳米线器件在暴露于环境空气后的电阻率 (图 3H)。NbAs 纳米线的电阻率在暴露于空气 1 天后增加了 ~100% 并达到平台期，这表明纳米线表面形成了自钝化氧化层。我们将溅射在蓝宝石衬底上的 40 nm 厚 Cu 薄膜作为参考，在相同条件下进行了测试。虽然它比我们的 NbAs 纳米线表现出更好的稳定性，但此类薄膜暴露的表面积比纳米线少，从而减轻了空气暴露的影响。
为了在稳定性方面与 Cu 进行更直接的比较，我们在真空中测量了我们的 NbAs 纳米线和 Cu 纳米线在高达 100°C 时的电阻率，发现 NbAs 纳米线表现出比 Cu 纳米线更低的电阻温度系数 (图 S15)。为了进一步研究 NbAs 的表面氧化，我们对在环境空气或氩气 (Ar) 环境中在高达 450°C 温度下退火的大块 NbAs 晶体进行了 X 射线光电子能谱测量。在 Ar 环境下，我们观察到在高达 200°C 时表面氧化可忽略不计，而环境空气中在 >100°C 时开始出现逐渐的表面氧化 (详见图 S16)。这些结果表明，NbAs 在受控环境下、处于后端工艺 (backend-of-line) 兼容的高温时具有高稳定性，并且在实际应用中需要封装。纳米线和大块晶体表面氧化的 STEM 表征见图 S7。
图 3I 显示了 NbAs 纳米线与领先的互连替代金属纳米线（包括最新的 Cu（带有 Co/TaN 衬层/阻挡层的大马赛克线）、Ru 和 Co (24, 48, 49)）的室温电阻率随尺寸缩放的情况。与这些电阻率随尺寸减小而增加的常规金属相反，NbAs 表现出相反的趋势。在 40 nm 尺寸下，NbAs 纳米线表现出比 Ru 和 Co 更低的电阻率。尽管直径为 40 nm 的 NbAs 纳米线尚未超越最先进的 Cu 互连技术，但我们预计 NbAs 的优势将在 10 nm 以下区间变得更加显著，因为此时表面对电导的贡献将超过体相贡献 (13)。
NbAs 纳米线的量子振荡与化学势估计
我们在 2 K 温度下对 NbAs 的块体单晶和纳米线进行了磁输运测量，并对比了它们的垂直磁电阻 (MR)（图 4, A 和 B）。在 2 K 时，当磁场沿晶体学 c 轴方向施加时，块体晶体表现出高达 ~13,000% 的大磁电阻（在 9 T 时）。相比之下，纳米线在 9 T 时的磁电阻则低得多，最高约为 ~2.5%。由于禁锢效应和散射效应，这种降低的 MR 响应在纳米线和薄膜中十分常见 (50, 51)。我们将纳米线 MR 降低的原因归结为块体载体的表面散射增强，这抑制了它们对块体晶体中所观察到的巨磁电阻的贡献，同时还受到了表面主导输运的影响。在 NbAs 中，块体载体在 2 K 时的平均自由程为几个微米 (29)，这使得它们在直径约 40- nm 的纳米线中极易受到表面散射的影响。
尽管 MR 较低，但 NbAs 纳米线仍显示出与块体晶体中观察到的类似的 SdH 振荡。电阻率的振荡分量是通过减去多项式背景获得的，并作为 1/B 的函数绘制在图 4C 中。通过对这些减去背景后的电阻率进行快速傅里叶变换 (FFT)，每个样本都被识别出两个主振荡频率：块体晶体为 13.8 和 24.2 T，纳米线为 8.8 和 29.4 T（图 4, D 和 E）。这些 SdH 振荡频率与之前关于 NbAs 块体晶体的报告一致 (29, 52, 53)。对应于表面态的频率范围比我们的实验数据至少高出一个数量级 (11)。因此，测得的 SdH 振荡起源于块体费米面。与表面态相关的 SdH 振荡缺失可归因于巨大的回旋半径（超过了纳米线直径），以及由纳米线圆形截面引起的厚度变化所导致的韦尔轨道 (Weyl orbits) 破坏性干涉。
I+
I V+
I-
V-
MR (%)
B (T)
E
Fα
Fα
Fβ
Fβ
Fα + Fβ
F (T)
图 4. NbAs 纳米线与体晶的磁传输特性。(A 和 B) 在 2 K 下测得的 (A) 体单晶和 (B) 纳米线器件的垂直 MR。(C) 电阻率的振荡分量，通过从 (A) 和 (B) 所示的数据中减去多项式背景获得。(D 和 E) (D) 体晶和 (E) 纳米线振荡的 FFT，标记了两个频率 (Fα 和 Fβ)。Fα + Fβ 表示 Fα 和 Fβ 的更高谐波频率。(F) 体态电子（红色）和空穴（蓝色）口袋的 SdH 振荡频率随化学势的变化计算值。标注了实验值以供对比。实黑线表示体单晶的 SdH 振荡频率；虚黑线表示纳米线的 SdH 振荡频率。
纳米线
B (T)
F
F (T)
F (T)
图 4F 显示了当磁场沿 c 轴方向时，计算出的 SdH 振荡频率随化学势的变化函数（见补充文本）。这些频率源自计算的体能带结构中电子和空穴口袋的极值横截面积。我们还计算了 SdH 振荡频率随磁场与 c 轴倾斜角度的变化函数（图 S17F），结果表明，在所有方向上，SdH 振荡频率均随倾斜角度的增加而增加。
1.0
0.5
通过将计算结果与实验数据进行对比，我们发现，体单晶的化学势位于未掺杂费米能级之上 ~10 ± 5 meV，而纳米线器件的化学势则位于其之上 ~17 ± 6 meV（假设磁场平行于 c 轴）。我们将估计的空穴和电子化学势值的偏差归因于磁场与样品 c 轴之间的对准偏差、DFT 优化晶格参数与实际值的差异，以及 DFT 计算的内在局限性（详见补充文本中的详细解释）。
-10
基于上述分析，即使考虑到场方向的不确定性，纳米线与体晶之间的化学势差也很小。我们早期的分析（图 1E）表明，若要仅通过体传导来解释 ~70% 的电阻率降低，则需要 ~200 meV 的费米能级偏移。此外，尽管每根纳米线的费米能级可能有所不同，但所有测得的 NbAs 纳米线与体材料相比，均表现出显著降低的室温电阻率。结合上述量子振荡分析，我们证明，在我们的纳米线样品中，仅体电阻率的变化所导致的电阻率降低可以忽略不计。因此，我们纳米线的低室温电阻率必须主要源自费米弧表面态，其散射寿命比体态更长（图 1F）。我们注意到，纳米线器件在暴露于空气 2 个月后，SdH 振荡依然可见，这突显了 NbAs 卓越的稳定性。
0.2
-0.2
B A
体相 (Bulk) 纳米线 (Nanowire)
体相 (Bulk) 纳米线 (Nanowire)
MR (×104 %)
T = 2 K T = 2 K
0 3 9 6 -9 -3 -6
0 3 9 6 -9 -3 -6
FFT 幅度 (a.u.)
FFT 幅度 (a.u.)
0 50 100 150
0.1
-0.1
0 50 100 150 0 10 20 -20 -10 0
纳米尺度。由于这些量子振荡源于费米面附近准粒子的相干运动，因此对缺陷高度敏感，它们的持续存在进一步验证了我们 NbAs 纳米线所保持的晶体质量。
NbAs 与其他具有潜力的互连拓扑半金属的基准比较 图 5A 比较了 NbAs 纳米线与其他纳米线几何结构中具有潜力的拓扑半金属 [单硅化钴 (CoSi)、磷化钼 (MoP)、磷化钨 (WP)、砷化镉 (Cd3As2)、二磷化钼 (MoP2) 以及二砷化钽 (TaAs2)] 的室温电阻率 (10, 42, 54–58)。在低于 100-nm 的尺寸下，NbAs 纳米线在已报道的拓扑半金属纳米线中表现出最低的室温电阻率。为了评估表面态对电导的贡献，我们还比较了经由各自体相电阻率缩放后的纳米线电阻率，定义为 ρ(nanowire)/ρ(bulk) (图 5B)。NbAs 和多重费米子半金属 CoSi 纳米线在尺寸减小时表现出由表面主导的电导。在图 5 A 和 B 中，我们仅关注纳米线的实验结果，不包括其他几何结构。通常，即使晶体质量相似，薄膜的电阻率往往低于纳米线，而我们的工作目标是形态呈现纳米线几何结构的极小尺寸互连线。
在图 5 C 和 D 中，我们总结了拓扑半金属薄膜 [NbAs、磷化铌 (NbP)、砷化钽 (TaAs)、CoSi 以及硫化钴锡 (Co3Sn2S2)] (12, 15, 16, 59, 60)、薄片以及纳米带 [NbAs, WTe2, 五碲化锆 (ZrTe5), 铋铂化物 (PtBi2) 以及硫化锡钽 (SnTaS2)] (11, 61–64) 的室温电阻率缩放情况。在所示的纳米结构中，外延 Nb 种子层上的非晶 NbP 薄膜和 SnTaS2 薄片显示出随尺寸减小而电阻率降低的理想趋势。
0.1 0.2 0.3 0.4
1/B (T–1)
电子带 空穴带
E – EF (meV)
实验体相 (Exp. Bulk) 实验纳米线 (Exp. NW)
A
纳米线 (Nanowire)
纳米线 (Nanowire)
MoP
Cu
MoP2
MoP
TaAs2
CoSi
TaAs2
Cu
C
WTe2
ZrTe5
WTe2
TaAs
ZrTe5
TaAs
NbP
SnTaS2
NbP
SnTaS2
图 5. 将 NbAs 纳米线与其他具有潜力的拓扑半金属纳米结构进行基准对比。(A) NbAs 纳米线及各种拓扑半金属纳米线 [CoSi (10), MoP (42), WP (54), Cd3As2 (55, 56), MoP2 (57), 以及 TaAs2 (58)] 的室温电阻率随直径（横截面积）的变化关系。为了与当前的互连技术进行比较，图中还绘制了带有 Co/TaN 衬层/阻挡层的 Cu 大马士革线的电阻率 (24)。(B) 来自 (A) 的室温电阻率，由其各自的体相值进行缩放，定义为 ρ(纳米线)/ρ(体相)。(C) 各种拓扑半金属薄膜以及薄片或纳米带的室温电阻率随厚度的变化关系。薄膜 [NbAs (15), NbP (12), TaAs (16), CoSi (59), 以及 Co3Sn2S2 (60)] 和薄片或纳米带 [NbAs (11), WTe2 (61), ZrTe5 (62), PtBi2 (63), 以及 SnTaS2 (64)] 分别以空心符号和半实心符号绘制。(D) 来自 (C) 的室温电阻率，由其各自的体相值进行缩放，定义为 ρ(纳米结构)/ρ(体相)。
0.1
0.1
NbAs 纳米带
厚度 (12, 64)。我们 NbAs 纳米线的电阻率高于此前报道的 CVD 生长、厚度约为 200 nm 的 NbAs 纳米带约 3 microhm·cm 的值（图 5, C 和 D）(11)。这种差异可能源于样品几何形状的不同（纳米线与纳米带）。与 CVD 生长的纳米带相比，纳米线中承载拓扑保护费米弧的 (001) 表面比例较小。
对于实际的互连应用，我们进一步将 NbAs 纳米线的线电阻与工业界对 Cu 和 Ru 线的预测进行了比较，假设采用了当前的衬层/阻挡层 (fig. S18) (24)。横截面积为 1250 至 1400 nm2 的 NbAs 纳米线预计将表现出与 Ru 线相似的线电阻，但高于 Cu 线。NbAs 纳米线在横截面积减小时，线电阻的增加幅度较小，表明其具有更优越的缩放行为。基于这一趋势，我们预计 NbAs 在横截面积小于 ~400 至 500 nm2 时能够优于当前的 Cu 大马士革线，这对应于 2 和 3 nm 技术节点。这种有利的缩放特性应该会持续到 ~100 至 200 nm2，
Cd3As2 Cd3As2
电阻率 (µΩ∙cm) 电阻率 (µΩ∙cm)
CoSi MoP2
NbAs (本工作)
NbAs (本工作)
1000 100 10 1000
100 10 1
100 10 1
直径 (nm) 直径 (nm)
Co3Sn2S2 Co3Sn2S2
CoSi CoSi
PtBi2 PtBi2
NbAs 纳米带 Cu
NbAs NW (本工作) NbAs NW (本工作)
薄膜 薄片/纳米带
薄膜 薄片/纳米带
厚度 (nm)
厚度 (nm)
T = 300 K T = 300 K
WP WP
Cu T = 300 K T = 300 K
NbAs 薄膜 NbAs 薄膜
对应于 7 至 8 nm 的线宽，且宽高比约为 1:3，这是工业界预测的后单质金属互连的目标尺寸。
我们强调，线电阻（line resistance）作为实际互连应用的关键指标，仅能在纳米线几何结构中进行考量。受控合成直径小于 100 nm 的高质量纳米线通常具有挑战性。在目前的工作中，通过使用 TMNM 方法实现了这一目标，该方法可制备直径小至 40 nm 且长宽比超过 100 的单晶纳米线。对于二元化合物，使用传统的化学气相沉积 (CVD) 或气-液-固生长法很难获得如此小直径的纳米线。高质量 NbAs 纳米线的成功合成，从而实现了可靠的传输测量，并评估了它们在技术相关尺寸下用于互连应用的可行性。因此，我们的工作证明了即使在存在表面氧化和粗糙度的情况下，拓扑半金属的物理特性也可以在纳米线中实现，而这代表了最新技术节点的线性尺寸和实际条件。
结论 自拓扑材料首次被实验发现以来，已近二十年，这为研究其基本特性提供了许多开创性的见解。然而，这些材料的实际应用仍然难以实现。正如本文通过韦尔半金属 NbAs 纳米线所证明的，低电阻的下一代互连线可能是此类应用的首批实现方案之一。然而，为了充分利用这一潜力，有必要进行进一步的研究，包括对更小直径纳米线进行更深入的传输研究，以及建立能够解释纳米线几何结构中拓扑表面态电子-声子相互作用的精细理论框架。此外，必须探索针对较小尺寸 NbAs 的晶圆级合成和可扩展制造方案，以实现片上集成。两种工业可行方案是减法刻蚀和镶嵌工艺 (3, 65, 66)。尽管如此，我们的结果标志着在弥合基础发现与实际应用之间差距方面迈出了关键的一步，最终实现了人们长期期待的拓扑半金属的承诺。
参考文献与注释
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致谢：第一原理电子传输计算在伦斯塞勒理工学院的计算创新中心完成。本项工作使用了康奈尔材料研究中心共享仪器设施。资金支持：纳米线合成部分由 Gordon and Betty Moore 基金会的 EPiQS 计划资助，资助编号 GBMF9062.01。电子传输测量由半导体研究公司 (Semiconductor Research Corporation) JUMP 2.0 SUPREME 支持。S.Ku. 和 R.S. 感谢半导体研究公司在任务号 2966.002 下提供的资助。H.L. 感谢台湾国家科学技术委员会 (NSTC) 在资助编号 NSTC 114-2112-M-001-055-MY3 下提供的支持。Y.C. 由 ILJU 研究员奖学金支持。Q.P.S. 由美国国家科学基金会 (NSF) GRFP 在资助编号 2139899 下支持。Thermo- Fisher Helios G4
UX FIB 和 Kraken STEM 的采集得到了美国国家科学基金会 (NSF) 的支持 (DMR- 2039380)。器件制备部分在康奈尔纳米规模设施 (Cornell NanoScale Facility) 完成，该设施是国家纳米技术协调基础设施 (NNCI) 的成员，由美国国家科学基金会 (NSF) 支持 (拨款 NNCI- 2025233)。热传输测量得到了 SRC JUMP 2.0 SUPREME 种子基金、SRC JUMP 2.0 CHIMES 以及 DARPA YFA (D23AP00159- 00) 的支持。单晶生长支持由美国国家科学基金会 (NSF) 通过宾州州立大学二维晶体联盟-材料创新平台 (Penn State 2D Crystal Consortium- Materials Innovation Platform, 2DCC- MIP) 提供，协议编号为 NSF DMR- 2039351。体相原料制备使用了界面材料加速实现、分析与发现平台 (PARADIM) 的合成设施，该平台由美国国家科学基金会 (NSF) 根据合作协议 no. DMR- 2039380 提供支持。G.L. 和 Y.- H.T. 得到了国家科学技术委员会 (NSTC) 的支持，拨款编号为 NSTC 112- 2112- M- A49 - 047 - MY3。
作者贡献：Y.C. 合成了 NbAs 纳米线，制备了器件，并进行了电学和磁传输测量。Y.- H.T., S.Ku., R.S., H.L., G.L., 和 C.- T.C. 进行了理论分析。M.T.K. 为 STEM 表征准备了单晶的转移切片 (lift-outs)。M.T.K., N.K.D., Q.P.S., 和 S.S. 进行了 STEM 表征。J.K., L.K., S.Ki., C.L., A.S., 和 Z.T. 进行了热导率测量和建模。M.T.K., G.J., S.K.K., 和 N.N. 合成了体相原料。S.H.L. 和 Z.M. 提供了 NbAs 单晶。H.W., J.D.C., 和 G.J. 协助进行器件制备和电传输测量。Y.C. 和 D.K. 进行了热容测量。J.J.C. 监督了该项目。Y.C., Y.- H.T., S.Ku., C.- T.C., 和 J.J.C. 撰写了原稿，并得到了所有作者的建议。所有作者审阅并批准了原稿的最终版本。
竞争利益：作者声明没有竞争利益。
数据、代码和材料可用性：所有数据以及评估本文结论所需的材料合成的所有细节均见于正文或补充材料。
许可信息：版权所有 © 2026 作者，保留部分权利；独家许可方为美国科学促进会 (AAAS)。不对原始美国政府作品主张权利。https://www.science.org/about/science- licenses- journal- article- reuse
补充材料 science.org/doi/10.1126/science.adx3027 材料与方法；补充文本；图 S1 至 S18；表 S1 至 S8； 参考文献 (67–95)
10.1126/science.adx3027
2025年3月7日提交；2026年3月30日重新提交；2026年5月21日接受
原子尺度下几何驱动的可逆 固-液相变
Wenjun Cui1,2,3,4†, Cheng Qian5†, Weixiao Lin1,3, Zefan Xue1,3, Zhencui Ge6, Wen Zhao6, Gustaaf Van Tendeloo1,3,7, Jinsong Wu1,3, Feng Ding5, Xiahan Sang1,2,3, Zhengyi Fu1,2
在几何受限纳米团簇中对液-固相变的原子级分辨率观察，为异相成核机制提供了基础见解。在这项工作中，我们利用原位透射电子显微镜，在可调的纳米级间隙中直接控制并观察单个临界尺寸的铋纳米团簇，驱动其经历一个从准无定形纳米盘 $\rightarrow$ 晶体纳米线 $\rightarrow$ 液体纳米滴的可逆循环。团簇的长宽比（而非其体积）是主导这些相变的初级描述符，由内在表面各向异性与界面能量之间的相互作用决定。受限状态还产生了织构，迫使纳米线采用一种在非受限纳米颗粒中不存在的优先 [2110] 取向。这些结果为几何驱动的相选择和取向选择提供了机制基础，从而能够通过工程化受限来合理设计纳米材料。
在纳米尺度上实现对液-固相变的确定性控制是材料科学中的一项基础追求 (1–4)。经典成核理论 (CNT) 将此过程模拟为体相吉布斯自由能的降低与创建固-液界面所产生的能量代价之间的竞争 (5–8)。然而，这种经典观点不足以解释自然界和技术中许多在几何受限条件下发生的关键过程 (9–14)。在从生物矿化到纳米材料合成 (6, 15) 的受限系统中，初生的固相与周围表面直接相互作用，从根本上改变了成核的能量格局。这种改变已被证明能够稳定特定的固相，倾向于某些多晶型，并产生织构 (11, 16–18)。然而，理解具有各向异性表面能的几何受限临界核的动态结构演化仍然难以实现。
直接观察和操控临界尺寸团簇的行为一直是一个长期的实验挑战。第一个障碍源于难以分离和稳定一个纳米级团簇以进行持续观察，因为核在自由能势垒的顶端是一个热力学不稳定的过渡态（图 1A） (6, 19)。第二个挑战涉及施加有意义的几何受限，这需要以纳米级精度操纵表面，以动态控制受限空间 (20, 21)。最后一个要求是在一个允许捕获结构演化的环境中集成这种机械控制，特别是通过原子分辨率的直接实时观察，捕捉无定形、液体和晶体状态之间的转变 (22–25)。
1中国，武汉，武汉理工大学，材料合成与加工先进技术国家重点实验室。 2中国，襄阳，武汉理工大学襄阳示范区，湖北龙钟实验室。 3中国，武汉，武汉理工大学，纳米结构研究中心。 4中国，合肥，安徽大学，物理科学与信息技术研究院，光电信息采集与防护技术实验室。 5中国，苏州，苏州实验室。 6中国，青岛，中国石油大学（华东），材料科学与工程学院。 7比利时，安特卫普，安特卫普大学，材料科学电子显微镜中心 (EMAT)。 *通讯作者。电子邮件：dingf@ szlab. ac. cn (F.D.); xhsang@ whut. edu. cn (X.S.) †这些作者对这项工作贡献均等。
在本研究中，通过原位透射电子显微镜 (TEM)，我们利用施加电压在钨 (W) 针尖上产生一个铋 (Bi) 亚临界团簇，并通过机械操纵针尖精确控制其限制状态，随后观察到其在准非晶纳米盘、晶体纳米线 (NW) 和液体纳米液滴 (ND) 之间的可逆相变。这种限制作用强烈稳定了 [2110] 取向 NW 的形成，其各向异性的侧表面能低于液相，从而基本上消除了经典的液-固相变能垒。NW 的长宽比自然成为主要的相描述符，反映了各向异性表面自由能与来自限制作用的界面自由能之间的竞争。这项工作实现了对亚临界核中几何控制的固-液相变的直接、实时且原子级分辨率的可视化，证明了限制几何形状和表面各向异性在决定纳米尺度下的相稳定性及晶体学取向方面的决定性作用。
可操纵临界尺寸核的受控产生 实验是在透射电子显微镜内部使用配备有压电控制 (26–28) 的 Mn 涂层 W 针尖的原位偏置样品杆（PicoFemto TEM-STM, Zeptools Co.）进行的（图 1B 及图 S1 至 S3）。我们使用聚焦离子束地暴露 $\text{Bi}_2\text{Te}_3$ 样品的 (0110) 表面，这一策略性制备使范德华 (vdW) 间隙与表面垂直，从而作为 $\text{Bi}$ 阳离子扩散的自然通道（图 1B，黑色箭头）(2, 29–31)。在建立接触并施加 3- V 偏压后，$\text{Bi}$ 阳离子沿这些 vdW 间隙向针尖-样品界面迁移，导致界面处出现局部的 $\text{Bi}$ 积累（图 1, B 和 C），这一点已通过能量色散 X 射线光谱法（图 S4）确认。积累的 $\text{Bi}$ 形成一个纯净的晶体层，在 $\text{Bi}_2\text{Te}_3$ 基底上外延生长，采用菱方结构（空间群 R3m），其取向关系为 $\text{Bi}_2\text{Te}_3\text{- [2110]} \parallel \text{Bi- [2110]}$ 且 $\text{Bi}_2\text{Te}_3\text{- (0001)} \parallel \text{Bi- (0001)}$（图 1C）(32)。W 针尖上的 Mn 涂层形成了一个 $\text{MnO}$ 表面层，该层起到了扩散屏障的作用，防止 $\text{Bi}$ 与针尖形成合金（图 S2）。
随着 $\text{Bi}$ 层在界面上继续生长，施加的电压驱动多余的 $\text{Bi}$ 在 $\text{MnO}$ 表面横向扩散，形成孤立的纳米级团簇（图 1D，绿色箭头，以及图 S5 至 S7）。这些团簇最初以液体 $\text{Bi}$ $\text{NDs}$ 的形式出现，在高分辨率 TEM (HRTEM) 图像中表现出特征性的球形形貌，并且其快速傅里叶变换 (FFT) 谱图呈弥散状，缺乏清晰的衍射斑点（图 1D，底图）(33–35)。当达到约 3 到 4 nm 的临界半径时，它们在 $\text{MnO}$ 表面凝固成具有刻面的晶体纳米颗粒 (NPs)（图 1E，视频 S1，以及图 S8 和 S9）。这一体积依赖性转变的标志是出现了与 [0110] 带轴相对应的清晰晶格条纹和 FFT 衍射斑点，这与经典成核理论 (CNT) 一致 (3)。由于尺寸依赖的熔点 ($\text{T}_m$) 降低与局部电子束加热的共同作用，成核发生在远低于 $\text{Bi}$ 体相熔点 (544 K) 的温度下 (36)。这种电压驱动的原位生长提供了一种可靠的机制，可以直接在可移动的针尖上产生并分离单个临界尺寸的 $\text{Bi}$ 团簇，为随后的几何限制实验奠定了基础。
几何约束下 Bi 纳米簇的可逆相变
为了施加几何约束，我们驱动携带 Bi ND 的 W 针尖向相对的无定形 C 基底方向移动，将 ND 捕捉在可调的纳米级间隙中（图 S6 和 S10）。接触后，受限的 ND 立即转化为一个轴向长度（l；等同于其厚度）为 1.5 nm、直径（d）为 5.5 nm 的 Bi 纳米圆盘，
图 1. 受限 Bi 纳米团簇中可逆相变的原位 TEM 观察。(A) CNT 示意图，其中总吉布斯自由能 ($\Delta G$) 的变化是负体积项 ($\Delta G_V$) 和正表面项 ($\Delta G_S$) 之和。必须克服临界半径 ($r^$) 和能垒 ($G^$) 才能实现凝固。(B) 实验装置示意图。一个压电控制的、涂有 Mn 的 W 针尖接触 $\text{Bi}_2\text{Te}_3$ 晶体的 (0110) 表面。施加的电压驱动 Bi 离子沿 vdW 间隙向针尖迁移（黑色箭头）。(插图) 该装置的低倍率扫描透射电子显微镜 (STEM) 图像。比例尺 500 nm。(C) 界面原子分辨率高角环形暗场 (HAADF) STEM 图像，显示 Bi 层在 $\text{Bi}_2\text{Te}_3$ 上的外延生长。(D) 35 s 时 Mn 涂层 W 针尖表面的 Bi 液体 NDs 的 HRTEM 图像（上）。97 s 时的放大 ND 及其对应的 FFT（下）表明其处于液体状态。(E) 在 $\text{MnO}$ 表面形成的具有 [0110] 取向的晶体 Bi NP 的 HRTEM 图像（上）和相应的 FFT 图谱（下）。(F) 时间序列 HRTEM 图像（上）和相应的 FFT 图谱（下），显示 Bi 纳米团簇从准无定形纳米盘到晶体 NW 的转变，其标志是最初的弥散弧线演变为锐利的衍射斑点。阴影区域突出了有序的原子桥和链。(G) 时间序列 HRTEM 图像（上）和 FFT 图谱（下），证明了晶体 Bi NW 与液体 Bi ND 之间的可逆转变。晶体 NW 逐渐伸长 (188.5 s $\rightarrow$ 294 s)，直到达到临界长宽比，脱离并转化为液体 ND (312 s)。将 ND 推回并与基底接触，会诱导其立即重新凝固为晶体 NW (361 s)。标注了关键的晶体学取向以及 (2110) 平面相对于基底的夹角。
以及长宽比 ($l/d$) 为 0.27。相应的 FFT（图 1F，143 s 以及视频 S2）表明该纳米盘总体上是无序的（弥散环），但在压缩方向上保持有序（两条白色弧线）。因此，我们将此鉴定为由几何挫折动力学陷获的准无定形状态，类似于受限的双层无定形冰 (37)。在极窄的受限条件下，巨大的界面区域和原子级表面粗糙度迫使两个界面上的 Bi 原子重新排列为结构兼容的
非晶层。这种结构适应性最大限度地减少了如果采用刚性晶格将会产生的巨大的弹性应变和界面能损失（参见补充文本及图 S11 和 S12）。在这种情况下，非晶化是部分发生的，这由在实空间（阴影区域）中观察到的、跨越 C 基底与针尖之间间隙的狭窄有序链和桥证明。
)
$\delta G_S$
(1)
将针尖从 C 基底撤回会增加 Bi 纳米团簇的长宽比 ($l/d$)。最初，纳米团簇保持准非晶状态，沿压缩方向具有强衍射弧（图 S11 和 S12）。随着撤回的继续 ($t = 168.5$ s；图 1F)，部分结晶开始出现，表现为左上区域出现了明显的晶格条纹。相应的 FFT 证实了这种相共存，在缩短的衍射弧旁边显示出尖锐的衍射斑点 [索引至纯 Bi 的 (1210) 晶面]。在 $t = 172.5$ s 时，进一步撤回到 $l/d$ 比率为 0.41，触发了团簇完全转化为单晶纳米线 (NW)。定量的径向和方位角强度分布验证了这种完全结晶，证实离散的衍射斑点已完全取代了 FFT 图案中最初的弥散弧（图 S11 和 S12）。
随着 $l/d$ 进一步增加，纳米团簇仍几乎垂直地锚定在两个基底上，保持单晶 Bi NW 形貌，可容纳 >50% 的伸长（从 $\sim 3.2$ 到 $\sim 4.9$ nm；图 1G, 188.5 到 294 s）。与此同时，纳米线经历了动态的晶体学重定向，频繁地采取 $[0111]$（图 1G, 188.5 s）、$[0001]$ (240 s) 和 $[0221]$ (294 s) 带轴。晶体状态一直持续到达到临界长宽比 $l/d_{s \to l} \approx 1.5$（视频 S2, 310.5 s）。在这个阈值，纳米线从 C 表面脱离，并自发转化为具有球冠形貌的液体纳米滴 (ND)（图 1G, 312 s），以最小化总表面能。这一转变由相应 FFT 中无特征的弥散对比度所证实。
$\delta d = 0$
$(l/d)^* = -\gamma_S$
2 (2)
值得注意的是，这一过程是可逆的。重新定位针尖使纳米滴重新与 C 表面接触，会诱导其瞬时重新凝固为晶体纳米线 (361 s)。这条新形成的纳米线可以再次被伸长，直到它重新熔化为液体纳米滴 (471 s)。整个序列重复了高达 11 次（图 S13 至 S16），这表明几何限制可用于通过其准非晶、晶体和液体状态来控制临界尺寸晶核的相。在平行限制下，在一定范围的剂量率 (3433 到 11300 $\text{e}^-/\text{Å}^2\text{s}$) 和施加偏压 (0 到 $-5$ V) 下重复了类似实验（图 S17 至 S26）。在这个开放的驱动系统中，电子束充当热背景，施加的偏压调节 Bi 质量源（图 S27 至 S31），而可移动的针尖实现了精确的机械操纵，为隔离和研究限制几何形状对相变的影响提供了平台。
长宽比作为相稳定性的决定因素
通过对电影 S2 和 S3 中测得的准非晶纳米盘 (nanodiscs) 和晶体纳米线 (NWs) 的几何参数 ($l$ 和 $d$) 进行分析，揭示了长宽比 ($l/d$) 与相状态之间的相关性（图 2A）。晶体 NWs（紫色正方形）在 $0.4 < l/d < 1.5$ 的范围内保持稳定。当被压缩至 $l/d < 0.4$ 时，NW 会转变为准非晶状态（灰色圆圈）；而当拉伸至 $l/d \approx 1.5$ 以上时，则会熔化为液体 ND（绿色圆圈）。这一观察结果与 CNT 显著不同，在 CNT 中，体积是决定液-固转变的唯一参数（图 S32 至 S40 及表 S1）。为了建立这些转变的热力学模型，我们首先通过比较 NW 的实验强度分布图（显示出从边缘到中心平滑的对比度衰减，图 2B）与各种截面的 HRTEM 模拟图（图 2C），确定了受限纳米簇维持圆柱形几何结构。只有圆形模型与实验数据相匹配，而正方形和菱形模型的衰减率则过于剧烈或过于缓慢。这一发现同时适用于准非晶态和晶体态（图 2D 和图 S41），证实了由最小化侧表面积的热力学必然性所驱动的圆柱形状。
利用确认的圆柱几何形状来计算纳米簇体积 ($V$)，我们将图 2A 的数据重新绘制为 $V$ 与 $l/d$ 的相图（图 2E）。非晶-固体（灰色线）和固体-液体（绿色线）相界是垂直的，这表明它们主要取决于 $l/d$，而没有明显的体积依赖性。这与在 $\text{MnO}$ 基底上非受限的 $\text{Bi}$ 簇异质成核（图 2F 和图 S8）形成对比，后者显然是由体积驱动的，并且在临界尺寸（$30$ 至 $60\text{ nm}^3$）附近具有液-固共存区。在这一共存范围内，相选择对微小的热力学或动力学波动高度敏感，使得结果难以预测 ($5, 19, 35, 36, 38$)。在几何受限条件下，这种不可预测的体积依赖区被抑制。系统转而分解为由 $l/d$ 清晰区分的截然不同的相（图 2E），从而将 $l/d$ 确立为主要描述符。对多个独立纳米簇进行的广泛统计分析确认，在我们的限定实验条件（剂量率，$3433$ 至 $11,300\text{ e}^-/\text{Å}^2\text{s}$；偏压，$0$ 至 $-5\text{ V}$）下，这些由 $l/d$ 定义的相界在宽广且动态的体积范围（$20$ 至 $120\text{ nm}^3$）内具有高度的可重复性（图 S17 至 S26, S42, 和 S43）。值得注意的是，尽管由于局部微结构和剂量率的变化产生了温度不确定性，但 $l/d$ 边界仍然保持稳定（图 S42）。
为了提供热力学基础，我们对受限 $\text{Bi NW}$ 的总表面-界面自由能 $G_S$ 进行建模。对于体积 $V$ 固定的圆柱体，$G_S$ 由侧面的 $\text{Bi}$ 表面能 ($\gamma_{S,\text{lat}}$) 与创建 $\text{Bi/MnO}$ 和 $\text{Bi/C}$ 界面所需的能量惩罚（图 S44）之间的相互作用决定：
$G_S = A_S\gamma_{S,\text{lat}} + A_I$
这里，$A_I = 1/4\pi d^2$ 代表每个圆形端盖界面（$\text{Bi/MnO}$ 和 $\text{Bi/C}$）的面积，而 $A_S = \pi dl$ 是侧表面积。通过应用 Young 方程，总有效界面能项可以用接触角代替，简化为 $-\gamma_S(\cos\theta_1 + \cos\theta_2)$，其中 $\theta_1$ 和 $\theta_2$ 分别为 $\text{Bi/MnO}$ 和 $\text{Bi/C}$ 界面的接触角，$\gamma_S$ 是 $\text{Bi}$ 的平均固体表面能。通过在恒定体积下对直径最小化 $G_S$
$(\cos\theta_1 + \cos\theta_2)$
我们推导出了最小化 NW 自由能的最佳长宽比 $(l/d)^*$ 的表达式：
这一推导揭示了 $(l/d)^*$ 受两个竞争分量的支配，这一机制与 CNT 不同（图 S32 至 S40）。第一个因素 $\gamma_S / \gamma_{S,\text{lat}}$ 代表了内在的表面能各向异性。因为
侧面具有极低能量，该比率 >1，作为纳米线 (NW) 的稳定力。第二个因素，$\frac{-\cos\theta_1 + \cos\theta_2}{2}$，代表了与限制界面接触的外部影响，这导致随着脱润湿行为增强 ($\theta_1$ 或 $\theta_2 > 90^\circ$)，$(l/d)^$ 随之增加。因此，$(l/d)^$ 是由内在表面各向异性和限制界面的有效润湿状态共同决定的。该方程表明，如果 $\text{MnO}$ 和无定形 $\text{C}$ 表面结构在重复循环中保持稳定，则相边界应保持稳定。情况通常如此（图 S45），尽管长时间接触可能会留下痕迹性的残留 $\text{Bi}$，从而改变局部润湿行为并干扰进一步的可逆相变（图 S46 和 S47）。此外，由于这些表面和
$[(\gamma_{\text{Bi}/\text{MnO}} - \gamma_{\text{MnO}}) + (\gamma_{\text{Bi}/\text{C}} - \gamma_{\text{C}})]$
图 2. 长径比 (l/d) 是几何限域下相稳定性的决定因素。(A) 纳米团簇 l/d 在循环相变期间的时间演化，揭示了从非晶态到晶态 (l/d ≈ 0.4，粉色虚线) 以及从晶态到液态 (l/d ≈ 1.5，绿色虚线) 转变的陡峭阈值。(插图) TEM 图像显示了循环中关键节点的团簇状态。(B) 穿过晶体纳米线 (NW) 的实验强度线分布图。比例尺，2 nm。a.u.，任意单位。(C) 将 (B) 中的实验分布图与圆形、正方形和菱形截面纳米线的模拟分布图进行对比。(D) 单根纳米线 (左) 强度线分布图的时间演化 (x 轴) 以及圆形截面模拟强度分布图 (右)。(E) 受限纳米团簇的相状态随体积 (V) 和 l/d 的函数关系。灰色和绿色垂直线分别表示非晶固体和固体-液体相界。(F) 为了对比，在 MnO 基底上成核的非限域 Bi 团簇的体积-半径关系。这种依赖于体积的液-固转变发生在临界半径 ~3 nm 处。(G) 一个受限、恒定体积纳米团簇 (V = 70 nm3) 的总自由能 (G) 随 l/d 变化的热力学模型。当 (l/d)* = 0.75 时，晶体纳米线的能量达到最小。
由于界面自由能通常表现出较弱的温度依赖性 (39)，该方程有助于解释为什么相界在面对温度不确定性时依然保持稳健。
如示意性的自由能景观图 (G 随 l/d 变化) 所示 (图 2G)，伸长 [l/d > (l/d)] 会增加侧表面能的惩罚，最终触发向纳米点 (ND) 的固-液转变。相反，压缩 [l/d < (l/d)] 会使界面能占主导地位并诱导准非晶转变，这与我们的原位观察结果一致。
在模拟相图中统一熔化行为 随后，我们使用机器学习力场-分子动力学 (MLFF-MD) 模拟来构建相图，详细阐述相稳定性随 l/d 和温度变化的函数关系。这是通过在各种固定的 l/d 比例下系统地加热受限 Bi 纳米团簇，并记录它们在各种界面（石墨烯、非晶碳和 MnO；图 3 及图 S48 至 S56）之间的相变温度来实现的。我们使用一个被限制在两层石墨烯之间的 56.5-nm3 纳米团簇代表性模型来阐明这一行为，因为这种理想化且对称的限域能够产生清晰的势能曲线，从而界定每一次相变。
对于一个高度压缩的纳米团簇 (l/d = 0.33；图 3A 和视频 S4)，其加热后的势能演化 (图 3C) 揭示了一个明显的两阶段转变：从晶态 (300 K) 到液态 (>510 K)。在 ~410 K 时，能量曲线显示出一个小而尖锐的峰值，标志着表面非晶化在我们将定义为 Tsa 的温度下开始。我们将此定义为非晶化而非熔化，因为能量增加很小，对应于团簇边缘原子 (黑色箭头) 结构失序形成类固态非晶壳层，而核心仍保持晶态。这种核壳结构一直持续到 510 K，此时势能显示出第二次且幅度大得多的跳跃。这标志着核心的完全熔化
图 3. MLFF-MD 模拟中铋（Bi）纳米团簇随长宽比变化的相变行为。(A) 受限在石墨烯片之间且长宽比低 (l/d = 0.33) 的纳米团簇 (V = 56.5 nm3) 的模拟原子快照，显示了加热过程中的两阶段熔化过程。表面非晶化始于 Tsa ≈ 410 K (黑色箭头)，随后在 Tcm ≈ 510 K 时发生核心熔化。(B) 同体积且长宽比高 (l/d = 1.68) 的纳米团簇快照，其在 Tm ≈ 440 K 时直接经历单阶段转变成为液滴。(C) 不同长宽比纳米团簇的势能与温度曲线。能量的剧烈跳跃定义了转变温度 (Tsa, Tcm 或 Tm)。(D) 固定体积 (V = 56.5 nm3) 的模拟相图，绘制了转变温度随长宽比变化的曲线。该图揭示了三个截然不同的区域：稳定晶相、中间表面非晶相和液相。晶相在 l/d ≈ 1 时显示出最大的热稳定性。黑色箭头展示了实验中的等温路径，其中增加长宽比促使纳米团簇从准非晶态转变为晶态，最后转变为液态。(插图) 不同 l/d 比例纳米团簇的代表性图像。比例尺，2 nm。
在温度 Tcm 时，整个纳米团簇突然转变为完全无序的液体。因此，在低 l/d 比例下，狭窄的限制在能量上倾向于一种稳定的、混合的非晶-晶体构型，这在物理上对应于实验观察到的准非晶态。
这种两阶段的液化路径在较高长宽比 (l/d > 0.7) 时被单阶段过程取代。例如，l/d = 1.68 的铋纳米线（Bi NW，见图 3B 和视频 S5）经历了快速的统一熔化。在 420 K 表面开始无序后不久，整个核心在 440 K 时变为液体，导致纳米团簇从一个表面脱离并形成液滴。这种表面非晶化与核心熔化事件有效地合并为单一转变，并由势能曲线 (图 3C) 所证实。对于 l/d > 0.7 的纳米团簇，这些曲线仅表现出一次剧烈的跳跃，定义了一个统一的熔化温度 Tm。我们认为，随着纳米线变得更细，一旦表面非晶化开始，它就缺乏维持稳定晶体核心所需的横向体积。
将转变温度（l/d < 0.7 时的 Tsa 和 Tcm，以及 l/d > 0.7 时的 Tm）绘制为长宽比的函数，得到了一个计算相图 (图 3D)，该图被分为三个区域：晶体纳米线 (NW)、液体纳米点 (ND) 和准非晶纳米盘。固态不稳定性（Tsa 和 Tm 曲线）的起始点呈现抛物线趋势，在最佳 l/d ≈ 1 处达到峰值。这一最佳比例的存在代表了热力学上最稳定的晶体状态，与自由能模型 (图 2G) 吻合良好。针对不同团簇体积 (56.5 和 84.8 nm3) 及各种表面的额外相图证实了
图 4. 约束诱导的 Bi NWs 晶体学织构。(A) 时间序列 HRTEM 图像，对比了未约束的 Bi NP（顶行）与约束的 Bi NW（底行）的动态取向。NP 自由翻滚，而 NW 保持其 (2110) 平面（虚线）与衬底近乎平行。(B 和 C) 量化 (2110) 平面相对于衬底的角度偏差 (δ) 的直方图。未约束的 NP (B) 呈现宽泛的随机分布，而约束的 NW (C) 在 0° 附近显示出尖锐的峰值，证实了强烈的优先取向。(D 和 E) 观察到的晶带轴及其对应频率沿 [2110] 极方向观察的立体投影图。每个数据点的大小与观察到对应晶带轴的帧数成正比。未约束 NP (D) 的晶带轴散布在投影图上，表明其在进行 3D 翻滚。对于约束的 NW (E)，所有观察到的晶带轴都位于同一个大圆上，证明其运动被限制在围绕一个固定 [2110] 轴的旋转。(F) 计算的各种 Bi 晶体学平面的表面能 (γs)。(G) 具有不同生长方向的 Bi NWs 原子模型：[0001]（左）、[2110]（中）和 [0221]（右）。暴露的表面平面用不同颜色突出显示。（插图）使用伪立方晶格的原子排列。
约束诱导的晶体学织构 直接原位 TEM 观察揭示了约束 NWs 和未约束 NPs 的快速晶体学重取向，晶带轴之间的频繁转换在数秒内发生（图 4A 和视频 S1 至 S3）。为了揭示约束对取向选择的影响，我们统计分析了经常观察到的 (2110) 晶体学平面（使用 FFT 定位）相对于衬底（定义见图 4A 及图 S57 和 S58）的角度偏差 (δ)。对于未约束的 NP，这些平面显示出宽泛的角度分布，其中仅 13% (94 帧中的 12 帧) 表现出 δ < 10° (图 4B)。相反，对于约束的 NW，(2110) 平面出现在所有可索引的帧中，并优先平行于衬底界面，其中 77% (62 帧中的 48 帧) 显示 δ < 10° (图 4C)。
固相在优化的 l/d 比下达到最大稳定状态（图 S49 至 S56）。如水平黑箭头所示，等温条件下长宽比的增加驱动纳米团簇依次经历从无定形到固态再到液态的边界演变，定性地解释了观察到的约束诱导相变。此外，MD 模拟显示，对于润湿行为显著不匹配的界面 [例如，石墨烯与 MnO(100) 表面配对]，纳米团簇可能会产生不对称润湿。然而，在实验中，这种不对称性很少被观察到。由于实验中的 MnO 和无定形 C 表面表现出相似的去润湿行为，因此缺乏足够的驱动力来克服暴露新的高能侧面以破坏能量最小化圆柱形状的动力学势垒。
为了可视化纳米线（NW）中这种由禁锢诱导的取向，我们将可观测带轴的频率绘制在以 [2110] 极点为中心的立体投影图上（图 4，D 和 E，以及表 S2）。对于未禁锢的纳米颗粒（NP），带轴随机分散，表明其处于自由的三维（3D）翻滚状态（图 4D）。相比之下，一个扩展数据集（279 帧）中所有观察到的 NW 带轴，包括 [0221]、[0111]、[0111]、[0110] 和 [0001]，均排布在垂直于 [2110] 中心极点的单一大圆上（图 4E）。这种分布表明，禁锢将 NW 复杂的翻滚运动限制在了围绕固定 [2110] 生长轴的简单自旋中。这种优先的纵向取向与报道的铋（Bi）NW 生长方向一致（表 S3）。此外，连续旋转迁移率的观察，结合 NW 能够通过横向滑动来缓解剪切力（图 S59），直接证明了这种垂直对齐并非由机械力强加。
相反，观察到的对 [2110] 生长方向的偏好是由侧表面能 ($\gamma_{S,lat}$) 的最小化驱动的，这一点已通过密度泛函理论（DFT）量化（图 4F 和表 S4）(40, 41)。我们的计算确定 (0001)、(0112) 和 (0111) 为铋（Bi）的最低能表面。如原子模型所示（图 4G），沿 [2110] 方向生长的 NW 自然地将这些稳定晶面作为其主要的侧表面。为了确认此配置的稳定性，我们对在铋（Bi）伪立方（pc）晶格中沿其他低指数方向 [0001] 和 [0221] 生长的 NW 进行了建模（图 4G）(42)。在这两种情况下，几何结构都迫使高能晶面暴露，例如 [0001] 取向的 (2110) 和 (0110) 晶面，以及 [0221] 取向的 (2110)、(1012) 和 (0114) 晶面。因此，计算出的 [2110] 生长方向的面积加权平均表面能 (0.26 J/m²) 明显低于 [0001] (0.47 J/m²) 和 [0221] (0.33 J/m²)。此 $\gamma_{S,lat} = 0.26 \text{ J/m}^2$ 低于液态铋 [0.378 J/m² (43)]，这从根本上将经典的表面能惩罚反转为热力学驱动力（图 S32 至 S40）。这种反转有效地消除了成核势垒，并驱动了在禁锢 NW 中观察到的强 [2110] 晶体织构的选择。
因此，取向稳定性的差异反映了能量景观的根本转变。未禁锢的 NP 通过采用由许多小晶面组成的近半球形形状来最小化其能量 (9, 33)。这种结构平均化使得重新取向的能量惩罚可以忽略不计，允许颗粒在热涨落的驱动下自由翻滚。相反，禁锢的 NW 是一个高度各向异性的多面体，其稳定性由构成其大侧表面的少数特定低能平面决定。[2110] 侧晶面的低表面能将 NW 陷在一个深且高度稳定的热力学势阱中。任何向替代取向的旋转都需要克服一个远超可用热能的陡峭势垒，从而抑制了横向旋转自由度。这些结果提供了直接的原子级分辨率证据，证明禁锢通过将几何约束与内在表面各向异性相结合而诱导了织构。
在这项研究中，我们超越了异相成核过程中表面能与体能之间的经典竞争，证明了表面自由能各向异性和界面能量重塑了能量景观。对于几何受限的铋（Bi）纳米团簇，这种相互作用决定了其相稳定性、形状和晶体学取向，从而确立了长宽比（而非体积）作为主要的相描述符。由于表面能各向异性是大多数晶体固体的固有特性，我们假设该机制可以扩展到铋以外的材料，并可用于利用几何受限来实现先进材料的理性设计。
致谢 资金支持：本研究主要由中国教育部基础与交叉学科突破行动计划 (JYB2025XDXM408)、中国国家自然科学基金 (52272235, 12474020, 52503284, 以及 52573254)、国家科技重大专项 (2026ZD062500)、广东省基础和应用基础研究基金 (2024A1515010965)、新一代人工智能——国家科技重大专项 (2025ZD0121802)、中国国家重点研发计划 (2021YFA0715700 以及 2025YFE0200800)、苏州实验室研究项目 (SK- 1502- 2024- 055) 以及中国博士后科学基金 (2025M78003 以及 2025M781003) 提供支持。作者贡献：概念化：X.S., J.W.; 方法论：X.S., F.D., W.C., C.Q.; 验证：X.S., F.D., W.C., C.Q.; 形式分析：X.S., W.C., C.Q.; 调查：W.C., C.Q., W.L., Z.X., Z.G., W.Z.; 资源：X.S., F.D., J.W., G.V.T., Z.F.; 数据整理：W.C., C.Q.; 论文初稿撰写：W.C., C.Q.; 论文审阅与编辑：X.S., F.D., J.W., G.V.T., Z.F.; 可视化：W.C., C.Q.; 监督：X.S., F.D., G.V.T., J.W.; 项目管理：X.S., F.D., J.W., Z.F.; 资金获取：X.S., F.D., J.W., Z.F.。利益冲突：作者声明不存在竞争性利益。数据、代码及材料可用性：所有数据均可在正文或补充材料中获取。许可信息：版权所有 © 2026 作者，保留部分权利；独家许可方为美国科学促进会 (AAAS)。不对美国政府原始作品主张权利。https://www.science.org/about/science-licenses-journal-article-reuse
补充材料 science.org/doi/10.1126/science.aed6019 材料与方法；补充正文；图 S1 至 S60；表 S1 至 S8；参考文献 (44–66)；视频 S1 至 S5
10.1126/science.aed6019
2025年11月3日提交；2026年6月3日接收
环境条件下可扩展钙钛矿光伏的 时空均匀晶化
Binlou Gao1†, Yang Zhong1†, Xiao Luo1, Jiacheng He1, Junxi Guo1, Xueying Wang1, Yikun Liu1, Licheng Tan1, Yiwang Chen1,2,3
钙钛矿太阳能电池 (PSCs) 的商业化可能需要能够在环境条件下实现均匀钙钛矿薄膜的可扩展沉积。然而，在长时间涂布过程中，亚稳态钙钛矿的空间异质性降解会导致不均匀性。在此，我们展示了通过一种相位锁定策略实现 $\alpha$- 相 $\text{FAPbI}_3$（其中 FA 为甲脒）的时空均匀晶化，该策略在大幅面打印过程中建立了一个动态演进的、具有缓冲水分作用的晶间网络。该方法防止了由环境湿度引起的过早降解，消除了方向性不均匀性。刮涂 PSCs 实现了 26.7% 的能量转换效率 (PCE；认证值为 26.1%)，而刚性和柔性的 100 平方厘米模块分别达到了 21.5 和 19.5%。形态均匀性的提高减轻了局部降解并抑制了自放大老化路径。封装器件在环境空气中 85°C 最大功率点跟踪 1500 小时后，仍保留了 90% 以上的初始 PCE。
实验室规模的钙钛矿太阳能电池 (PSCs) 通常在惰性气氛下通过前驱体旋涂制备，已实现 >27% 的认证能量转换效率 (PCEs) (1–3)。然而，旋涂法在本质上与高通量、工厂规模的制造不兼容，因为离心力会产生薄膜不均匀性，且惰性气氛增加了工艺复杂性和成本 (4)。
打印方法受益于高材料利用率和低成本工艺，能够生产大面积钙钛矿太阳能模块 (PSMs) (5, 6)。然而，对于打印工艺而言，沉积时间随衬底面积增加而增加，使得未退火的钙钛矿中间体处于亚稳态 (7)。具体而言，水分子与有机阳离子形成氢键，诱导局部晶格应变，并降低向光电失活的黄色 $\delta\text{-FAPbI}_3$ 相（其中 FA 为甲脒）转变的能垒 (8)。这种不稳定性触发了空间异质性降解，即在整个沉积过程完成之前，最初涂布的钙钛矿就已经开始分解。
为了解决这种不均匀性，一种高湿度工艺被用于形成完整的 $\delta$ 相以提高均匀性，随后通过热转换变为具有理想光学带隙和高热稳定性的光电活性黑色 $\alpha\text{-FAPbI}_3$ (8) (9–11)。然而，这种方法损害了微观结构的完整性，因为随后的固相转变会诱导异质成核和应变累积 (12)。另一种方法是，直接进行 $\alpha$ 相晶化
1 南昌大学 化学与化学工程学院/江西省重点实验室 (FEC) 薄膜能源化学，中国 南昌。 2 教育部 能源材料与化学氟硅重点实验室，江西师范大学，中国 南昌。 3 赣南师范大学 化学与材料科学学院，中国 赣州。 * 通信作者。电子邮件：ywchen@ ncu. edu. cn (Y.C.); tanlicheng@ ncu. edu. cn (L.T.) † 这些作者对这项工作贡献均等。
尽管许多结晶调节策略能够实现直接的 $\alpha$ 相打印 (13–17)，但它们主要解决的是热力学稳定性问题，使得 $\alpha$ 相在较长的工艺窗口期内容易受到水分影响。因此，这种预降解在退火后表现为空间异质性，导致串联子电池之间出现电流失配，并降低钙钛矿太阳能模块 (PSMs) 的性能 (18)。不均匀钙钛矿薄膜中的局部降解会触发一种自放大老化过程，其中缺陷热点加速分解，并将失效传播至整个模块。
在此，我们通过一种相锁定策略实现了 $\alpha$ 相钙钛矿在时空上的均匀结晶。该策略通过协调结晶过程与动态演变的防潮晶界网络的形成，确保了在环境可扩展打印过程中 $\alpha$ 相的稳定形成。此方法有效地防止了早期沉积的钙钛矿发生过早降解，保证了时空均匀性。刮涂钙钛矿太阳能电池 (PSCs) (0.08 cm2) 实现了 26.7% 的能量转换效率 (PCE) (认证值为 26.1%)，而刚性及柔性模块 (100 cm2；有效光照面积 78.96 cm2) 分别实现了 21.5% 和 19.5% 的 PCE。该策略还表现出与碳电极的极佳兼容性，并在一个无碳基空穴传输层的模块 (100 cm2) 中实现了 16.0% 的 PCE。此外，封装后的模块在 85°C 和 85% 相对湿度 (RH) 或 ISOS-D-3 湿热测试下经过 2300 小时后，仍保留了 >90% 的初始性能，证明了通过增强形貌均匀性以抑制缺陷传播引起的局部降解，从而实现了具有工业相关意义的操作稳定性。
环境空气下可扩展刮涂过程中 $\alpha$ 相钙钛矿的稳定化 我们采用了一种可扩展的 $\alpha$ 相制备刮涂法，首先沉积 $\text{PbI}_2$ 溶液，随后沉积 FAI 溶液，最后进行热退火 (图 S1 和注 S1)。然而，$\text{PbI}_2$ 薄膜中二甲基亚砜的水合作用导致中间配合物向钙钛矿的转换不完全，并加速了在潮湿空气中向 $\delta$ 相的转变 (4, 19)。为了减轻水合作用，我们在 $\text{PbI}_2$ 前驱体溶液中添加了 3- 脲基丙基三甲氧基硅烷 (TMPU) (图 1A)。在退火过程中，TMPU 的同时交联及其与钙钛矿中间体的相互作用形成了一个动态演变的晶界网络，阻挡了水分入侵 (图 S2 至 S9 以及注 S2 和 S3)。
对 RH 值在 15% 至 75% 范围内的沉积过程分析表明，这种相锁定策略通过抑制水合作用并降低 $\alpha\text{-FAPbI}_3$ 的形成能垒，促进了 $\alpha$ 相的直接形成和稳定 (图 1B 和图 S10)。退火后一致的 (100) 取向 $\alpha$ 相衍射图谱证实了晶体质量的提升 (晶粒更大且空隙减少) (图 1C 和图 S11)。对照组未退火薄膜在较高 RH 下逐渐显示出更多的 $\delta$ 相形成 (2$\theta$ = 11.7°)，而在 RH 高于 60% 时则完全形成 $\delta$ 相 (图 S12 和 S13)。我们还研究了疏水性三甲氧基硅烷和功能化脲作为对比。我们发现，TMPU 的优势不仅在于结合了防潮和结晶调节，而是源于共价硅氧烷网络与末端脲介导的动态氢键的结合，从而实现了 $\alpha$ 相锁定 (图 S14 和 S15，注 S4，以及表 S1)。
在给定的刮涂速度下，工艺窗口（总时间）取决于 FAI 溶液沉积时间、转移时间以及退火时间 (7) (图 S16 和 S17)。在 45% RH 下，对照组钙钛矿薄膜在 30 s 内表现出 α-相消失且 δ-相持续存在，而目标组对应样本则在 60 s 内形成了 α-相 (图 1D)。这种基于 TMPU 的相锁定策略实现了均匀稳定的 α-FAPbI3 钙钛矿薄膜 (100 cm2) (图 1E 和视频 S2)。
图 1. $\alpha$- 相钙钛矿在环境空气可扩展刮涂期间的稳定化。1. (A) 常规策略（左）与我们的相锁定策略（右）的示意图，后者在刮涂过程中实现了 $\alpha$- 相的稳定化和形貌均匀性。(B 和 C) 在不同 RH 下制备的退火对照组和目标钙钛矿的 XRD 图谱 (B) 和 SEM 图像 (C)。(D) 在约 45% RH 的工艺窗口期间，对照组和目标钙钛矿薄膜的半原位 XRD 图谱。(E) FAI 溶液在对照组和目标 $\text{PbI}_2$ 薄膜（10 $\times$ 13 $\text{cm}^2$）上的刮涂工艺。照片捕捉于视频 S2 中。
扩大规模期间的时空均匀结晶动力学
工艺窗口在基板上有所不同，从经历完整刮刀遍历时间 (10 s) 的前沿到基本上为零的后沿（图 S13）。这种与位置相关的处理时间由于初始形成的 $\alpha$- 相的不稳定性，直接损害了薄膜的均匀性（图 S18、S19 及注 S5）。我们使用原位紫外-可见 (UV-vis) 吸收光谱来监测整个薄膜的结晶动力学（图 2A）。目标钙钛矿薄膜在整个工艺窗口内，在波长 >550 nm 处表现出稳定的吸收，表明 $\alpha$- 相具有出色的稳定性 (20)。在退火期间，所有位置的吸收
(
n)
图 2. 刮涂过程中时空均匀的结晶动力学。2. (A) 不同位置随时间演变的原位 UV-vis 吸收光谱。(B 和 C) 对照组 (B) 和目标 (C) 钙钛矿在退火过程中 690 nm 处吸光度的随时间演变。(D) 从 Avrami 模型中提取的不同钙钛矿薄膜的结晶速率常数 (K)。(E) 将 10 cm $\times$ 10 cm 钙钛矿薄膜分为 16 个区域的示意图。(F 和 G) 通过扩展工艺窗口 (40 s) 制备的 10 cm $\times$ 10 cm 钙钛矿薄膜中，对照组 (F) 和目标 (G) 器件分段的 PCE 映射图。
为了放大结晶速率的区域差异，我们应用 Avrami 模型分析了 690 nm 处 UV 吸收的演变 (21)（图 2, B 和 C）。该模型描述为：
$Y(t) = 1 - e^{-K(t-t_0)^n}$
其中 $Y(t)$ 是时间 $t$ 时结晶相的转化分数，$t_0$ 是钙钛矿信号出现的时间起点。结晶速率常数 $K$ 反映了钙钛矿晶体的生长速度，而 Avrami 指数 $n$ 则反映了有效 1
成核-生长模式，包括来自成核行为和生长维度的贡献。K 值从前沿的 0.048 s⁻¹，到中点的 0.026 s⁻¹，并进一步下降到后沿附近的 0.008 s⁻¹（图 2D，图 S20，以及表 S2）。这种显著的梯度源于在退火过程中，由于退火前不同的工艺窗口导致相变启动出现位置依赖性的延迟。对于相锁、稳定的 α-相钙钛矿，对应位置的结晶速率在统计上变得不可区分（0.005, 0.004, 和 0.003 s⁻¹），从而实现了高度的空间均匀性 (22)。
工业规模的制备要求随着衬底面积的增加而延长沉积时间 (23, 24)。通过将未处理薄膜的工艺窗口额外延长 40 s（这已超过了操作限制，图 1D），我们观察到 PCE 沿涂覆方向逐渐下降（图 2, E 到 G，以及图 S21 和 S22），这反映了钙钛矿的降解。相比之下，使用相锁策略制备的器件在不同的工艺窗口中保持了更窄且更高的 PCE 分布。光学显微镜确认了薄膜整体均匀的光学特性（图 S23），而对 16 个选定区域的扫描电子显微镜 (SEM) 和 X 射线衍射 (XRD) 分析显示，平均晶粒尺寸增加了 149%，且离散度降低（标准差 SD = 0.077，而对照组为 0.112）（图 S24 至 S26 以及表 S3），同时抑制了残留的 PbI₂（峰强度比：0.060），并增强了 α-FAPbI₃ 的晶体学对齐 (13, 25)（图 S27 和表 S4）。
器件光伏性能与可重复性 钙钛矿太阳能电池 (PSCs) 的性能取决于八面体 [PbI₆]⁴⁻ 框架的结构完整性。在高质量的钙钛矿晶体中，Pb-I 键的长度和角度变化极小，从而降低了结构缺陷密度。采用相锁策略，通过刮涂制备的 10 cm by 10 cm 钙钛矿薄膜比对照薄膜更均匀，并显示出更强的光致发光 (PL) 强度（图 3A），表明陷阱态密度降低，陷阱态密度谱 (26)（图 S28A）也证实了这一点。在 Arrhenius 图中对深能级瞬态谱 (DLTS) 峰值进行线性拟合，得到了陷阱深度（有效能级）（图 3B 和注释 S6）(27, 28)。对照器件具有一个 0.376 eV 的浅陷阱 D1，以及两个更深的 p 型陷阱态：D2 为 0.421 eV 和 D3 为 0.582 eV（位于价带顶之上），而目标器件仅表现出一个 0.225 eV 的单一 p 型浅陷阱。对照组的捕获截面分别为 2.09 × 10⁻¹⁵ cm² (D1)、4.82 × 10⁻¹⁵ (D2) 和 1.08 × 10⁻¹² cm² (D3)，而目标组 D1 的捕获截面为 1.53 × 10⁻¹⁹ cm²。对照器件中较深的 D2 和 D3 陷阱导致了环境可扩展工艺引起的降解。对照器件中的 D1, D2 和 D3 陷阱的缺陷密度分别达到 8.35 × 10¹⁶, 2.07 × 10¹⁴, 和 4.03 × 10¹⁵ cm⁻³，而目标器件仅显示出 1.07 × 10¹¹ cm⁻³（图 3E）。
在暗电流密度-电压 (J–V) 特性中降低的漏电流以及目标器件中近理想的行为表明，非辐射复合得到了缓解 (29)。光依赖的开路电压 (VOC) 斜率从 1.73 降低至 1.26 kBT/q（其中 kB 是玻尔兹曼常数，T 是开尔文温度，q 是基本电荷），且短路电流密度 (JSC) 的线性度从 0.995 提高到 0.985（图 S28, B 至 D，以及注 S7）。时间分辨光致发光 (PL) 揭示了延长的载流子寿命 (1022 至 13234 ns)，且瞬态光电压/瞬态光电流衰减显示出增强的复合寿命和加速的提取动力学 (30, 31)（图 S28, E 至 G，以及表 S5）。电化学阻抗谱和 Mott-Schottky 测量进一步证实了复合电阻的降低和内置电场 (Vbi) 的增强 (25, 32)（图 S28, H 和 I）。
制备了刮涂单电池和组件（冠军器件的光伏特性见图 S29A，分布特性见图 S29, B 至 E，以及表 S6 和 S7）。对于小面积器件 (≤0.08 cm2)，冠军目标电池实现了 26.7% 的 PCE（图 3F，图 S30，以及表 S8），认证值为 26.10%（图 S31）。该器件还展示了 26.57% 的稳定功率输出，并且在积分电流密度与外部量子效率测量之间表现出极佳的一致性（图 S32）。当规模扩大至 1.01 cm2 时，钙钛矿太阳能电池 (PSCs) 维持了 24.5% 的冠军 PCE（图 S33），与 0.08-cm2 器件相比，效率损失较低。
此外，相锁策略确保了大面积范围内均匀的钙钛矿形貌，从而减轻了单个电池之间会损害 PSM 性能的电流失配 (18)。我们制备了 25-cm2（有效面积 16.8 cm2）和 100-cm2（有效面积 79.0 cm2）的刚性组件，其冠军 PCE 值分别为 23.2 和 21.5%（图 3G，图 S34 至 S36A，以及表 S8）。一个柔性 PSM 在 100 cm2 下实现了 19.5% 的 PCE，在 10,000 次弯曲循环后保持率达 91.29%（图 S36B 和 S37 以及表 S8）。此外，该策略与碳电极表现出极佳的兼容性，在 100-cm2 的无碳基空穴传输层组件中实现了 16.04% 的 PCE（图 3H，图 S36C 和 S38，以及表 S8）。这些结果与其他两步可扩展钙钛矿光伏器件（图 3I 和表 S9）以及在 PCE 方面与一步法策略（图 S39 和表 S10）相比均具有优势。
改进后组件的平均单节 VOC 贡献为 1.168 V（图 3, J 和 K，以及表 S11），与小面积刮涂 PSCs (0.08 cm2) 获得的 1.20 V 密切匹配，表明在扩大规模过程中电压损失极小。值得注意的是，该组件实现了 201 mA 的高 JSC，反映了所有子电池中均匀的电流提取。相比之下，薄膜均匀性较差的对照组组件随着子电池数量的增加，出现了显著的电压损失。
在不同的高相对湿度 (RH) 环境条件下制备可重复的 PSCs 是其商业化的前提 (33)。此处，对于传统的两步法工艺，随着 RH 从 20 增加到 60%，平均 PCE 在 1.01-cm2 电池中下降了 >51%，在 16.8-cm2 组件中下降了 >63%，且性能分布范围扩大（图 S40 和表 S12）。由于 α-相形成受到抑制，在 75% RH 时出现了完全的性能失效（图 1B）。相锁策略使得器件在 15 至 75% RH 之间保持一致的性能：在高达 75% RH 时，维持了 20.15% 的 PCE (1.01-cm2 电池) 和 18.1% 的 PCE (16.8-cm2 组件)。
均匀性对大面积钙钛矿薄膜稳定性的影响
在实际应用中，环境温度的变化会诱导钙钛矿中严重的离子迁移和相变，而热膨胀不匹配则会产生循环热机械应力，最终导致晶格降解和器件性能恶化 (34)。退火后，TMPU 形成了晶间网络（图 S41），提高了在湿热条件下的固有稳定性（图 S42 至 S44），并抑制了离子迁移 (35–37)（图 S45）。此外，XRD 分析显示，对照组薄膜出现了渐进式分解，其特征是 12.6° 处的 PbI2 衍射增加，同时 13.9° 处的钙钛矿信号减弱（图 4A）。相比之下，目标钙钛矿薄膜在 35 次热循环（–40° 至 85°C）后表现出卓越的结构稳定性，并保持了 $\alpha$-相结晶度，相降解极小（图 4B，图 S46 以及注 S8）。
封装器件的 PCE 遵循类似的趋势。五台对照器件在 –40° 至 85°C 之间循环 550 次后，平均保持了初始性能的 72.2%。相比之下，在热循环测试下的目标器件保持了 97.3% 的初始 PCE，并超过了 IEC 61215 标准中关于 200 次循环后下降幅度不超过 5% 的要求（图 S47, A 至 C，以及表 S13）。光学图像进一步揭示了对照组钙钛矿薄膜沿涂覆方向存在明显的降解梯度，其中初始涂覆区域的降解
图 3. 钙钛矿器件的光伏性能。(A) 10 cm $\times$ 10 cm 钙钛矿薄膜的 PL 映射图像。(B) 阿伦尼乌斯图 (Arrhenius plots) 用于识别对照组和目标器件中的陷阱。数据点是通过使用离散拉普拉斯变换计算 DLTS 信号中包含的内部瞬态而获得的。(C) 相应的缺陷捕获截面，代表能级捕获电子的概率。(D) 通过拟合 DLTS 光谱获得的陷阱密度。(E) 带隙内深能级陷阱的示意图。峰的位置和高度分别对应于 D1、D2 和 D3 陷阱的深度和密度。$E_C$ 表示导带最小值，$E_V$ 表示价带最大值。(F) 最佳小面积 PSCs (0.08 cm2) 的 J–V 曲线。(G 和 H) 最佳刚性、柔性组件 (G) 和碳基组件 (H) (79.0 cm2) 的 J–V 曲线。(I) 本工作与近期代表性报告 (表 S8) 中使用两步可扩展沉积方法的刚性器件 PCE 随面积变化的对比。(J 和 K) 对照组 (J) 和目标组 (K) 组件不同子电池的 J–V 特性。
图 4. 大面积钙钛矿薄膜和组件的稳定性。(A 和 B) 对照组 (A) 和目标组 (B) 钙钛矿在热循环（–40° 至 85°C）期间的 XRD 图谱。 (C) 大面积钙钛矿薄膜中整体老化（monolithic aging）与分段老化（segmented aging）的示意图。(D 和 E) 封装器件 (1.01 cm2) 在遵循 ISOS- L- 2 (85°C, 环境空气) 协议的 1-sun 最大功率点跟踪下的相应 PL 映射图 (D) 和 PCE 演变图 (E)。(F) 封装 PSM 的湿热稳定性 (85°C/85% RH, 黑暗) 以及近期代表性报告 (表 S15)。数据点代表平均值 ± 标准差 (n = 5; 本研究)。
比随后涂覆的区域衰减更快 (图 S47D)。这种异质性源于该印刷技术固有的工艺窗口。具体而言，早期涂覆区域较长的工艺窗口导致在退火后产生了更高的缺陷密度和较低的晶体质量 (在图 S24 至 S27 中得到证明)，从而创建了优先降解路径。关键在于，含有 PbI2 积累的降解区域起到了催化中心的作用，将分解扩散至相邻区域，最终在不均匀的薄膜中建立了一种自催化老化机制 (38–41)。
为了验证这一假设，我们对刮涂钙钛矿薄膜采用了两种老化协议：整体老化（完整钙钛矿薄膜接受连续老化）和分段老化（钙钛矿薄膜在老化前被预先分割成隔离区域，见图 4C）。通过在三个代表性位置（早期涂覆、中心涂覆和晚期涂覆，分别对应图 4C 中的位置 1, 5, 和 9）的 PL 映射来追踪老化进程，结果揭示了两种协议之间截然不同的降解路径 (图 4D)。在 60°C 的整体老化下，对照组薄膜在所有监测位置均表现出快速的 PL 强度猝灭，峰值强度在 38 天内下降了 >40% (图 S48 和 S49)。值得注意的是，沿着涂覆方向观察到降解速率存在差异，位置 1 的降解速度比位置 9 快 1.47 倍。在 60°C 的分段老化下，尽管整体 PL 强度的下降程度相似，但位置 5 和 9 的降解速度比相应的整体老化样本慢。这种空间异质性源于刮涂过程中位置 1 较长的工艺窗口，导致晶体质量较差且 PbI2 残留更多。这些富含 PbI2 的区域充当了催化位点，促进了钙钛矿的分解并加速了离子迁移。
相应的 PCE 评估确认了这些趋势 (图 S50)。在整体老化下，对照组器件表现出严重的随位置变化的降解，位置 1, 5, 和 9 的 PCE 保持率分别仅为 34.46, 42.3, 和 50.44%。这种位置依赖性在分段老化下依然存在，相同位置的保持率分别为 36.1, 50.9, 和 64.8%。相比之下，相位锁定 (phase-locked) 薄膜在两种老化协议的所有区域中均保持了 >84% 的初始 PL 强度，且具有一致的降解动力学 (图 S48 和
为了验证我们方法的实际功效，设备在 ISOS- L- 2 协议下进行了评估。目标设备表现出同样极高的稳定性，在 1500 小时的最大功率点追踪后，仍保留了 >90% 的初始 PCE (42)（图 4E 和图 S51）。此外，我们将 n- i- p 设备置于 ISOS- D- 3 工业标准湿热测试（85°C 和 85% RH）中。目标电池展现了卓越的运行稳定性，在 2000 小时的连续老化后，仍保留了 90.73% 的初始效率（图 S52 以及表 S14 和 S15）。为了通过抑制来自传输层和 Ag 电极的离子迁移进一步增强稳定性 (43–45)，我们对相应的无空穴传输层碳电极组件进行了封装。封装后的组件在 2300 小时的老化后保留了 90.05% 的初始效率（图 4F，图 S53 和表 S16）。这些结果证实了我们的相锁策略在苛刻条件下稳定钙钛矿光电器件的有效性，代表了从实验室规模设备向工业可行组件迈出的关键一步。
讨论 我们通过一种由相锁策略实现的常温可扩展制备工艺，证明了时空均匀的 $\alpha$-相钙钛矿结晶。该方法将结晶动力学与环境鲁棒性及大面积均匀性直接联系起来。通过同时抑制水合驱动的相变并建立动态晶间网络，我们的方法有效地防止了早期沉积钙钛矿的过早降解，同时消除了大面积衬底 (100 cm2) 上的方向性不均匀性。因此，这种两步可扩展工艺产生了具有高 PCE 的钙钛矿太阳能电池 (PSCs) 和组件，并具有出色的运行稳定性。这一突破为推动钙钛矿光伏向商业可行、高性能应用的发展建立了一条可靠的路径。
参考文献与注释
National Laboratory of the Rockies, “Best research-cell efficiency chart” (NREL, 2026);
L. Lang et al., Adv. Energy Mater. 15, 2405423 (2025).
资金资助：本研究得到了中国国家自然科学基金的资助（L.T. 项目号 52373186，Y.C. 项目号 52527804）。作者贡献：B.G.、Y.Z. 和 L.T. 构思了研究方案。B.G. 设计了实验协议，制备了器件并进行了相关表征。X.L. 进行了钙钛矿薄膜的原位表征。Y.Z.、J.H.、J.G. 和 Y.L. 对钙钛矿太阳能电池 (PSCs) 和钙钛矿选择性膜 (PSMs) 的优化提供了有益建议。X.L. 和 J.H. 表征了钙钛矿器件的各项光电性能。X.W. 进行了稳定性表征和应用演示实验。L.T. 和 Y.C. 监督了整个项目。B.G. 和 Y.Z. 起草了原始手稿。L.T. 和 Y.C. 完成了手稿定稿。所有作者讨论了结果并参与了手稿的撰写。竞争利益：B.G.、Y.Z.、J.G.、L.T. 和 Y.C. 是由南昌大学提交的与本工作相关专利申请的发明人。其余作者声明不存在竞争利益。数据、代码和材料可用性：评估本研究结论所需的所有数据均可在正文或补充材料中获取。原始数据和关键定量分析可见于 Zenodo (46)。许可信息：版权所有 © 2026 作者，保留部分权利；独家许可方为美国科学促进会 (AAAS)。不对美国政府的原始作品主张权利。https://www.science.org/about/science-licenses-journal-article-reuse
science.org/doi/10.1126/science.aef1969 材料与方法；注释 S1 至 S8；图 S1 至 S53；表 S1 至 S16；参考文献 (47–88)；视频 S1 和 S2
10.1126/science.aef1969
2026 年 1 月 6 日提交；2026 年 6 月 2 日接收
具有量子态操纵功能的鲁棒单电子存储器
刘春森1†, 项雨桐1†, 王冲1, 周鹏1,2
信息存储的终极目标是单电子存储器。量子力学预言，通过将单个电子限制在极小空间内，可以实现两个可区分的量子态。然而，缩小此类器件的规模反而会放大边缘电容效应，这阻碍了单电子存储器的实验观察。我们报道了一种基于共面漏极-沟道-源极结构的二维单电子存储器件，该结构抑制了边缘电容，在单个电子改变后表现出 0.5 伏的非易失性阈值电压偏移。关于编程电压，两种有趣的量子行为也得到了验证。此外，我们预测并观察到一种独特的量子存储效应：量子态被状态密度剪刀（density of states scissors）截断。
电子存储构成了现代电子系统中信息存储的基础 (1)，其原理是对电子进行精确的空间控制。电子存储的终极目标是实现单电子存储器，这只能在极小器件中实现 (2, 3)。主流的半导体非易失性电子存储器采用在电介质中插入存储层 (SL) 的晶体管结构，即闪存 (4)，其存储的电子表示为 Q = Cox × ΔVth，其中 Cox 是 SL 与栅极之间的电容，ΔVth 是由存储电子引起的阈值电压偏移 (5)。单电子存储器的底层机制可以用量子力学来解释 (6, 7)：因为 Q 是基本电荷 (e) 的整数倍 (8)，ΔVth 也应该是相邻量子态之间最小 ΔVth 值（记作 ΔVth quantum）的整数倍。根据上述理论，ΔVth quantum 的值为 ±V* = ±e/Cox，符号表示单个电子是从 SL 中移除（负号）还是移入（正号）。然而，对于大尺寸器件，巨大的电容导致 ΔVth quantum 极小，只能观察到连续状态 (9, 10)。当尺寸较小时，电容降低到与基本电荷相当的数量级，ΔVth quantum 的值可以有效增加，从而表现出量子化的 ΔVth。虽然单电子存储器的物理图景在理论上很清晰，但实验上实现稳定、可区分的量子存储仍然具有挑战性。
单电子存储器的基础物理是通过小型化来降低电容。20 世纪后期，许多研究旨在实现这一目标，例如使用硅纳米晶体或量子点作为 SL (11–14)。这些纳米材料为观察单电子存储提供了技术途径。随着纳米级多晶硅点的引入，一项重大进展得以实现，能够在室温下观察到 55 mV 的微小 ΔVth quantum (15)。然而，为了避免由硅沟道厚度引起的大栅极-沟道边缘电容影响，使用了超薄隧穿层 (1 nm)，导致保持时间仅为 5 秒。因此，栅极-沟道边缘电容仍然
1复旦大学微电子学院集成芯片与系统国家重点实验室、芯片与系统前沿研究院，中国上海。2绍兴实验室，中国浙江。*通讯作者。电子邮件：chunsen_liu@fudan.edu.cn (C.L.); pengzhou@fudan.edu.cn (P.Z.) †这些作者对这项工作贡献相等。
这是一个单电子存储器的限制，降低了 $\Delta V_{th}$ 量子值，使得量子态变得不可区分且不稳定。根据量子力学中的海森堡不确定性原理，当空间或时间被压缩到极小尺度时，物质的能量和动量开始产生显著波动 (16, 17)，增强了量子行为的可观测性。由于具有原子级的厚度，二维 (2D) 材料在厚度方向上天然地提供了极限空间维度限制 (18, 19)，为探索量子现象提供了一个极具前景的平台。
在本研究中，我们基于共面漏极-沟道-源极 (DCS) 结构，通过自对齐栅极-存储层 (SL)-沟道和边缘接触，研制了一种 2D 单电子存储器件，从而抑制了边缘电容。该器件在室温下（热能约为 0.0259 eV）表现出 0.5 V 的非易失性 $\Delta V_{th}$ 量子值。此外，它还展现出两种与宏观存储行为完全不同的有趣量子行为：(i) 达到每个状态所需的最小编程电压是量子化的，相邻状态之间的间隔为 $\pm V_{th}^*$；(ii) $\Delta V_{th}$ 与编程电压脉冲宽度无关。此外，我们开发了一种状态密度剪刀 (DOS-scissors) 理论，预测了量子态的消失，随后在自对齐双狄拉克结构中通过实验进行了验证。据我们所知，这是一种此前从未报道过的量子存储效应。
结果与讨论 单电子存储理论与边缘电容效应 此处讨论单电子移除的一个示例。在理想的单电子存储器件中（图 1A），当向栅极施加负编程栅源电压 ($V_{GS}$)，且源极和漏极接地时，电子可以通过 Fowler-Nordheim (FN) 隧穿机制 (5, 20) 从存储层 (SL) 中被移除。该配置包含栅极-存储层电容 ($C_{ox}$) 和存储层-沟道电容 ($C_{tunnel}$)，且任何两个端子（栅极、漏极、源极和沟道）之间不存在边缘电容。具体而言，当编程 $V_{GS}$ 降低至 $-V_{GS0}$ 时，第一个电子的移除导致 $\Delta V_{th}$ 值降低 $V^$，其由 $e/C_{ox}$ 决定。随着编程 $V_{GS}$ 变得更负，$\Delta V_{th}$ 保持不变，直到编程电压达到 $-(V_{GS0} + V^)$，此时下一个电子被移除，导致 $\Delta V_{th}$ 进一步降低 $V^$。在此过程中，$\Delta V_{th}$ 值是 $-V^$ 的整数倍，且达到每个状态所需的最小编程电压以 $-V^*$ 为步长量子化。补充材料 (SM) 中提供了详细分析。当施加不同的编程 $V_{GS}$ 幅度时，单电子存储器在 $\Delta V_{th}$ 上表现出阶梯状变化。
单电子存储的物理过程如图 1B 所示。随着编程 $V_{GS}$ 的降低，存储层电势 ($V_{SL}$) 以 $\frac{C_{ox}}{C_{ox} + C_{tunnel}}$ [栅极耦合比 (GCR)] 的斜率线性降低。一旦编程 $V_{GS}$ 和 $V_{SL}$ 达到足够负的电压（分别记为 $-V_{GS0}$ 和 $-V_{SL0}$）以触发第一次 FN 隧穿，电子的移除会导致 $V_{SL}$ 产生 $e/C_{\Sigma}$ 的骤跳，其中 $C_{\Sigma}$ 为总电容 ($C_{ox} + C_{tunnel}$)。如果较小的 $C_{\Sigma}$ 接近 $e$ 的量级，$V_{SL}$ 的大幅增加将显著降低隧穿层内的电场强度，从而阻止下一个电子的移除，这被称为库仑阻塞 (21)。只有当编程 $V_{GS}$ 进一步降低至 $-(V_{GS0} + V^*)$ 且 $V_{SL}$ 回到 $-V_{SL0}$ 时，电场强度才再次达到 FN 隧穿的阈值，触发下一个电子的移除（图 S1）。因此，$V_{SL}$ 随编程 $V_{GS}$ 的变化而呈现出锯齿状变化。
为了研究实验实现量子存储的潜在限制，我们分析了一种采用体相沟道材料的单电子存储模型（图 1C）。在这种结构中，由于体相沟道的厚度，栅极与沟道侧壁之间不可避免地存在边缘电容（Cfrg）。因此，绝对
图 1. 单电子存储理论与边缘电容效应。(A) 单电子存储器件中 $\Delta V_{\text{th}}$ 与编程 $V_{\text{GS}}$ 幅度的关系。(插图) 该器件的示意图，显示了栅极与 SL 之间 (Cox) 以及 SL 与沟道之间 (Ctunnel) 的电容。任何两个端子（栅极、漏极、源极和沟道）之间均不存在边缘电容。(B) 存储层电势 ($V_{\text{SL}}$) 与编程 $V_{\text{GS}}$ 幅度的关系。红色箭头表示当 $V_{\text{SL}}$ 达到从 SL 中移除一个电子所需的临界电压时，$V_{\text{SL}}$ 出现骤增（增加值为 $e/C_{\Sigma}$，其中 $C_{\Sigma} = C_{\text{ox}} + C_{\text{tunnel}}$）。橙色线表示从 SL 中移除一个电子所需的临界电压。(插图) 分别从 SL 中移除一个、两个和三个电子的情况（从右至左）。(C) 硅基单电子存储器件的示意图。栅极与沟道之间的边缘电容 ($C_{\text{frg}}$) 导致 $\Delta V_{\text{th}}$ 量子值远小于 $V^$。(D) $\Delta V_{\text{th}}$ 量子值与 $V^$ 的比率随 SL 面积的变化关系。随着器件面积缩小，边缘电容效应增强。减小沟道厚度 ($\text{t}{\text{h}}$) 可使 $\Delta V{\text{th}}$ 量子值更接近 $V^*$，从而抑制边缘电容效应。黑色虚线表示 $C_{\text{frg}} = 0$ 时的比率。
$\Delta V_{\text{th}}$ 量子值由下式给出： $e/(C_{\text{ox}} + C_{\text{tunnel}}) = e/C_{\Sigma}$ (2)。这一结果清楚地表明，引入 $C_{\text{frg}}$ 会使 $\Delta V_{\text{th}}$ 量子值降低到远小于 $V_{\text{th}}^*$ 的程度。通常，缩小 SL 面积可能会导致更大的 $\Delta V_{\text{th}}$ 量子值（图 S2）。然而，我们的研究结果表明，随着器件面积的缩小，边缘电容效应也同步增强（图 1D）。因此，仅靠减小器件面积不足以实现较大的 $\Delta V_{\text{th}}$ 量子值，而本质的沟道厚度 ($\text{t}_{\text{h}}$) 才是隐藏且决定性的因素。具体模拟参数详见 SM。因此，厚度通常低于 1 nm 的二维材料成为研究单电子存储的合适候选对象。
基于共面 DCS 结构的二维单电子存储器件 考虑到区分量子存储的测量需求，二维半导体在极小空间内通常易受边缘散射影响 (22)，而具有高载流子迁移率的石墨烯则表现出更稳定的传输。我们证明，沟道宽度为 20 nm 的石墨烯晶体管可产生平滑的转移曲线，并保持约 $\pm 0.05$ V 的低 $\Delta V_{\text{th}}$ 噪声（图 S3A），为区分量子存储测量提供了所需的稳定性。其他二维半导体器件（如 $\text{MoS}_2$ 晶体管）在沟道宽度减小至 50 nm 以下时，转移曲线的波动更大（图 S3B），这一趋势与之前的报告一致 (23, 24)。因此，我们利用石墨烯沟道而非二维半导体制造了一个二维单电子存储器件。我们器件的示意结构设计如图 2A 所示。我们采用了共面 DCS 设计，以消除栅极、漏极、源极和沟道之间的任何寄生电容。在这种共面 DCS 结构中，沟道区域与栅极区域自对齐，其余的石墨烯区域被定义为同一平面上的二维漏极/源极区域。为了避免引入金属接触侧壁，
漏极/源极电极是通过位于远离二维（2D）通道区域的边缘接触实现的。由于自对准栅极-存储层（SL）-通道结构以及二维漏极/源极设计，$C_{frg}$ 的影响被降低到仅约 2.4%，使其可以忽略不计（图 S4）。为了进一步提高存储窗口的稳定性，应对存储堆栈进行精心设计。六方氮化硼 (hBN) 已被证明是一种良好的封装材料 (25)，且其低介电常数也可以促进 FN 隧穿 (26)。因此，我们采用了底部 hBN 封装以提高超小尺寸下电子传输的稳定性，并使用顶部 hBN 作为隧穿层。$\text{Al}_2\text{O}_3$ 被用作阻挡层，而 $\text{Al}_2\text{O}_3$ 与顶部 hBN 之间的界面则充当 SL。具体的器件制备工艺和表征详见图 S5 和 S6。透射电子显微镜图像证实了我们的器件设计，并显示出异质结构中原子级平整的界面。
单电子移除的能带图如图 2B 所示。当施加负编程栅极电压 $V_{\text{GS,prog}}$ 时，该电压分布在阻挡层、隧穿层和石墨烯通道上，导致分别产生 $V_{\text{ox}}$、$V_{\text{tunnel}}$ 和 $V_{\text{ch}}$ 的电压降；$\mu_{\text{ini}}$ 为石墨烯的初始化学势。平带条件见图 S7。在图 2C 和 D 中，我们阐述了该二维单电子存储器件在室温下的量子行为。每次编程过程均从原始状态开始，在负编程栅极电压下，电子从 SL 中被移除，此时漏极和源极接地（图 2C）。由于我们设计的 SL 面积约为 400 $\text{nm}^2$ 且 $C_{\text{ox}}$ 约为 0.32 aF（图 S8B），预计移除一个电子将产生 –0.5 V (–$V^*$) 的存储窗口，这支撑了在室温下的稳健量子观测。随着编程 $V_{\text{GS}}$ 以 –0.1 V 为步长从 –28.6 V 降低到 –30 V，在 –28.8 至 –29.2 V、–29.3 至 –29.7 V 以及 –29.8 至 –30 V 的编程 $V_{\text{GS}}$ 范围内，分别移除了一个、两个和三个电子，导致 $\Delta V_{\text{th}}$ 值分别约为 –0.5、–1 和 –1.5 V。$\Delta V_{\text{th}}$ 与...之间的关系
图 2. 室温 2D 单电子存储器件。(A) 基于共面 DCS 结构的 2D 单电子存储器件示意图。透射电子显微镜图像显示了自对准栅极-SL-沟道结构和边缘接触。标尺，5 nm。栅极长度约为 20 nm，顶层 hBN、石墨烯和底层 hBN 的厚度分别为 5 nm、双层和 11 nm。(B) 2D 单电子存储器件中移除电子的能带图。左侧和右侧的石墨烯分别代表初始状态和施加栅极电压 (VGS,prog) 后的状态。石墨烯内的红色区域表示电子占据态，隧穿层的绿色区域表示电场达到 FN 隧穿阈值的地方。Vch, Vtunnel 和 Vox 分别是跨越沟道、隧穿层和阻挡层的电压降；μini 是石墨烯的初始化学势。(C) 在 2D 单电子存储器件中施加不同编程 VGS 幅度前后的转移曲线。器件在室温 (RT) 下，在漏极和源极接地的情况下，使用 30-ns 的编程脉冲宽度从其原始状态（黑色虚线）进行编程。(D) ΔVth 随编程 VGS 幅度的变化曲线，包括 (左) 从 SL 中移除单电子 [提取自 (C)] 和 (右) 单电子移动进入 SL。不同颜色的球体表示不同的 ΔVth 量子数 (Nth)，虚线表示每个量子态的平均 ΔVth 值。该器件在 RT 下测量，并使用 30-ns 脉冲宽度进行编程。
B
不同编程 VGS 幅度的结果如图 2D 所示。为了标记每个量子态，我们将 ΔVth 量子数 (Nth) 定义为 ΔVth 量子的整数倍，其计算方式为：
$\frac{V_{th,prog} - V_{th,ref}}{V^*}$
其中 Vth,prog 是编程量子态的 Vth，Vth,ref 是参考态的 Vth。我们发现，在移除单电子时，ΔVth 量子的值约为 –0.5 V (–V)，且相邻状态之间最小编程电压的间隔呈现相同的值，这证明了 Cfrg 在该结构中受到了抑制。此外，我们还观察到在单电子移动进入 SL 后，ΔVth 出现了 0.5 V (V) 的量子化，显示出类似的量子行为（图 2D，右）。为了证实这些发现的鲁棒性，我们还证明了我们的 2D 单电子存储器的可重复性（图 S9 至 S12）。对于大尺寸存储器件 (SL 面积 = 2 μm²)，ΔVth 在不同编程电压下显示出连续变化（图 S13）。
另一个有趣的量子现象如图 3A 所示。当编程 VGS 幅度被设定为移除零个、一个或两个电子时 [分别对应 Nth (0), Nth (–1), Nth (–2)]，在室温下，当编程脉冲宽度在 20 到 90 ns 之间变化时，ΔVth 值几乎保持不变。脉冲宽度由示波器测量的半高全宽定义（图 S14）。这证明了自限制编程的量子现象，即 ΔVth 不依赖于编程脉冲宽度。这与大尺寸闪存中 ΔVth 与编程脉冲宽度之间的正相关关系不同 (27, 28)。如图 3B 所示，我们确认了 2D 单电子存储器件的非易失性数据保留能力。量子态的稳定性在室温下进行了评估。在不同的时间间隔测量转移曲线，并提取 ΔVth 以证明该器件即使在 5000 s 之后仍保持稳定（图 S15, C 至 F）。
随后，我们对比了各种室温单电子存储器件中 $\Delta V_{\text{th quantum}}$ 的绝对值（图 3B），其中包括工业产品 (29, 30)、使用量子点的学术研究 (13) 以及使用纳米级多晶硅 (15, 31) 作为存储层 (SL) 的器件。我们的二维单电子存储器件展现出 0.5 V 的巨大 $\Delta V_{\text{th quantum}}$，为量子态的鲁棒观察提供了支持。
修订石墨烯沟道器件的单电子存储理论 现有的单电子存储理论是基于传统的半导体沟道。然而，众所周知，石墨烯具有线性能带色散且在狄拉克点处状态密度 (DOS) 为零，这使得石墨烯在特定条件下无法接收或提供电子。因此，必须修订单电子存储理论以预测新兴现象。根据之前的研究，石墨烯沟道的电容 ($C_{\text{ch}}$) 可以估算为
B 图 3. 2D 单电子存储器件的鲁棒性与非挥发性。(A) 2D 单电子存储器件中 $\Delta V_{th}$ 与编程 $V_{GS}$ 持续时间的关系。通过 $-28.6$、$-29$ 和 $-29.5$ V 的编程 $V_{GS}$ 分别实现了三种量子状态，分别对应 $N_{th} (0)$、$N_{th} (-1)$ 和 $N_{th} (-2)$。(B) 2D 单电子存储器件中不同量子状态的 $\Delta V_{th}$ 与保留时间的关系。器件分别由 $-28.6$、$-29$、$-29.5$ 和 $-30$ V 的 $V_{GS}$ 编程，脉冲持续时间为 30 ns。彩色虚线表示数据的 10 年线性外推。(C) 不同报道的室温单电子存储器件中 $\Delta V_{th}$ 量子值的比较。分为三个区域：美光 (29) 和三星 (30) 的工业产品（蓝色区域）；使用纳米材料作为存储层 (SL) 的单电子存储器件，如量子点 (13) 和硅纳米晶体 (15, 31)（绿色区域）；以及本研究的 2D 单电子存储器件（红色区域）。
)2]
)2]
(2)
$C_{ch} = k_{ch}\mu$ (32)；石墨烯通道的电荷 ($Q_{ch}$) 由下式给出： $Q_{ch} = 1$
$2k_{ch}\mu^2$，由其状态密度 (DOS) 决定，其中 $\mu$ 为化学势（费米能级与狄拉克点之间的电势差），
$k_{ch} = \frac{2e^3S}{2}$，S 为石墨烯通道面积，$\hbar$ 为普朗克常数 $h$
$\pi(\hbar v_F)$
除以 $2\pi$，且 $v_F$ 为费米速度 (33)。我们的实验结果验证了石墨烯的线性电容特性。由于状态密度 (DOS) 较大，少层石墨烯表现出更大的 $k_{ch}$，为 $0.33$ F/(V·m$^2$)，而单层石墨烯的 $k_{ch}$ 为 $0.23$ F/(V·m$^2$)（图 S17）。这种线性电容为构建我们修正的单电子存储理论以及预测独特的量子存储行为提供了基础。基于上述信息，我们开始建立理论模型来描述石墨烯通道器件中的单电子存储行为。特别重要的是，施加的 $V_{GS,prog}$ 如何调节 $V_{ch}$ 和 $V_{tunnel}$。门电压在通道上的分压比例越高，石墨烯层对单电子存储动力学的影响就越大。$V_{tunnel}$ 是决定是否发生 FN 隧穿的关键因素。
此处以单电子移除为例进行描述。根据门-通道平行板电容器的电荷守恒原理，正极板上电荷的任何增加或减少必须在负极板上由相等的电荷变化来镜像反映。考虑到我们的实验数据，移除第一个电子所需的编程电压为 $-28.8$ V，此时石墨烯通道呈强 p 型。因此，我们可以得出 $V_{ch}$、$V_{tunnel}$ 和 $V_{ox}$ 之间的关系。详细的解析推导可见于补充材料 (SM)。同时，穿过绝缘层的电压分布由串联电容模型决定。结合上述关系，我们可以得到：
$V_{GS,prog} = V_{ch} - V_{ch,fb} - \frac{(C_{tunnel} + C_{ox})k_{ch}}{2C_{tunnel}C_{ox}} [(\mu_{ini} - V_{ch}$
$[(μ_{ini} - V_{ch}$
$)2 + (\mu_{ini} - V_{ch,fb}$
$)2 + (\mu_{ini} - V_{ch,fb}$
$V_{tunnel} = V_{tunnel,fb} - \frac{k_{ch}}{2C_{tunnel}}$
其中 $V_{tunnel,fb}$ 和 $V_{ch,fb}$ 分别是由于在 $V_{GS,prog} = 0$ V 时功函数差异而产生的隧穿层和石墨烯通道的内置电势。根据公式 1 和 2，可以获得一个定量结果来描述所施加的 $V_{GS,prog}$ 如何调制 $V_{ch}$ 和 $V_{tunnel}$。考虑到石墨烯从 n 型到 p 型的转变需要费米能级穿过狄拉克点，当费米能级接近狄拉克点时，石墨烯电容变得很小。它达到一个有限的最小值，从而导致一个电容饱和区（ $| \mu | \leq | \mu_{saturation} |$ ），其中 $\mu_{saturation}$ 是石墨烯电容达到最小值时的化学势。我们的实验结果显示，单层石墨烯的 $\mu_{saturation} = \pm 0.09$ V，少层石墨烯为 $\pm 0.07$ V（图 S17D），这与之前的工作 (34) 一致。在考虑石墨烯电容饱和效应后，我们得到了 $V_{GS,prog}$、$V_{ch}$ 和 $V_{tunnel}$ 之间的最终定量关系（图 S18 至 S20）。我们的计算结果表明，当石墨烯通道呈强 p 型且远离电容饱和区时，其电容大大超过了 $C_{ox}$ 和 $C_{tunnel}$。在这种条件下，编程电压的增量（ $| V_{GS,prog} | - | V_{GS0} |$ ）根据 GCR 线形分布在 $C_{ox}$ 和 $C_{tunnel}$ 之间。因此，在第一个电子移除之前，石墨烯通道消耗了大约 –0.47 V 的编程电压。进一步降低编程电压使得石墨烯通道电容的影响可以忽略不计，从而导致实验结果与现有的单电子理论一致。
DOS-剪刀理论发展与异常量子存储观察 在上述实验中，我们使用石墨烯作为通道，但没有观察到明显的量子存储行为，因为较大的负编程电压使石墨烯通道强 p 掺杂，使其费米能级远离狄拉克
e
图 4. 由双狄拉克结构设计实现的量子态消失。(A) (上) 器件示意图，以及 (下) 双狄拉克结构在不同编程 $V_{GS}$ 幅度下的能带图。从左到右，编程 $V_{GS}$ 分别为 $-V_{GSn}$（电子移除前）、$-V_{GSn}$（电子移除后）、$-(V_{GSn} + V^)$ 和 $-(V_{GSn} + 2V^)$。在能带图中，石墨烯内部的红色区域表示电子占据态，隧穿层的绿色区域表示电场达到 FN 隧穿阈值的地方。各层的厚度为示意性绘制，旨在突出 SL-石墨烯能带的变化。(B) 双狄拉克结构中 $\Delta V_{th}$ 与编程 $V_{GS}$ 幅度的关系。蓝色和红色球体分别表示电子的移除和添加过程。蓝色和红色阴影区域表示反常量子行为：两个量子态 $N_{th}$ (–6) 和 $N_{th}$ (–8) 之间最小编程电压的间隔约为 $\pm 2V^*$ ($\pm 0.6$ V)，正负号表示单个电子是被移入（正）还是移出（负）SL-石墨烯。虚线表示每个量子态的平均 $\Delta V_{th}$ 值。该器件在 10 K 下进行测量，并使用 30- ns 脉冲宽度进行编程。
(
$E_g$
)
(3)
点。然而，当石墨烯被用于 SL 时，SL-石墨烯经历的栅极可控性较弱。因此，SL-石墨烯的费米能级可以被调制到接近狄拉克点，此时态密度 (DOS) 趋近于零。此外，考虑到量子局域效应，在超小石墨烯 (35) 中会开启一个有限的带隙 ($E_g$)，从而有效地拓宽了零-DOS 区域。这一零-DOS 区域有可能触发独特的量子存储现象。
基于上述见解，我们开发了一种 DOS-剪刀理论，以进一步操纵量子态并探索一种独特的量子存储效应。以双狄拉克结构作为代表模型，我们保留了如图 2A 所示的相同阻挡层、隧穿层、封装层和沟道，但引入了石墨烯作为 SL。与仅有石墨烯沟道的模型不同，SL-石墨烯引入了额外的分压效应。为了准确描述器件物理，我们的目标是获得 $V_{tunnel}$ 与 $V_{GS,prog}$ 之间的关系。以单个电子移除为例，详细的解析推导见补充材料 (SM)。在第一个电子从 SL-石墨烯中移除之前，我们可以得出 $V_{GS,prog}$、$V_{ch}$ 和 $V_{tunnel}$ 之间的定量关系（图 S22）。随着编程 $V_{GS}$ 持续降低，电子的顺序移除驱动 SL-石墨烯的费米能级稳定下降。一旦费米能级进入零-DOS 区域，SL-石墨烯将无法再为 FN 隧穿提供可用电子。为了跨越这个零-DOS 区域并触发下一个电子移除，基于电容分压关系，所需的编程电压增量可估算为：
$\Delta V_{GS,prog} = -$
$+ C_{SL}$
其中 $C_{SL}$ 表示零-DOS 区域内 SL-石墨烯的饱和电容。这种现象代表了源自 DOS-剪刀的反常量子存储效应。
为了更清晰地提供关于异常区域的物理直觉，我们绘制了相应的能带图（图 4A）。当施加 –VGSn 的编程电压时，第 (n + 1) 个电子通过 FN 隧穿被移除。此时，如前所述，沟道变为 p 型，而由于电压在不同层之间分布，SL-石墨烯呈弱 n 型。在第 (n + 1) 个电子被移除后，VSL 增加，导致隧穿层内的电场减弱，从而抑制了下一个电子的移除，这就是所谓的库仑阻塞（Coulomb blockade）。当编程电压降低到 –(VGSn + V) 时，具有高 DOS 的 SL 材料（如金属）通常允许下一个电子的移除，因为 VSL 回到了 FN 隧穿的临界电压。然而，对于作为 SL 的石墨烯，费米能级位于零 DOS 区域内。由于缺乏可用的电子态，SL-石墨烯无法为隧穿提供电子，从而阻止了第 (n + 2) 个电子的移除。因此，需要额外的编程电压（例如 –2V）将费米能级移出该零 DOS 区域，以触发随后的隧穿。当编程电压达到 –(VGSn + 2V) 时，–2V 的电压增量被分为两种效应：将 SL-石墨烯的费米能级移出零 DOS 区域，以及增强隧穿电场，这将
1+ CSL Ctunnel
Cox
导致了第 (n + 2) 个电子的移除。因此，零 DOS 区域裁剪掉了一个本应在特定电压 –(VGSn + V) 处出现的量子态。两个量子态 Nth [–(n + 1)] 和 Nth [–(n + 2)] 之间的最小编程电压间隔变为 –2V。这一扩宽的间隔旨在战略性地揭示对单个量子态的精确操纵。详细的计算过程见 SM。
在我们的 DOS-剪刀理论指导下，我们实验验证了这种异常的量子存储行为。双 Dirac 结构是通过自对准刻蚀工艺实现的，该工艺在宽度方向上同时定义了沟道和 SL 区域。为了证明该理论能够实现对单个量子态的高精度控制，根据公式 3，我们设计了一个宽度约为 20 nm 的 SL-石墨烯。诱导带隙确保了 ΔVGS,prog 与 –2V 紧密对齐，从而允许在 –(VGSn + V) 的编程电压下对量子态进行精确裁剪。具体的器件制备工艺和表征详见图 S23 和 S24。在 10 K 温度下，设计为 V* = 0.3 V 的双 Dirac 器件的 ΔVth 与编程 VGS 幅度之间的关系如图 4B 所示。随着编程 VGS 从 –27.6 V 降低
至 –29.1 V（对应于第一到第六个电子的依次移除），相邻量子态之间的最小编程电压间隔和 ΔVth 值均在 –V 左右（图 S25），这与传统的单电子存储行为一致。然而，当 SL-石墨烯的费米能级进入零 DOS 区域时，出现了异常行为。实验上，当编程 VGS 降低到 –29.4 V 时，SL-石墨烯的零 DOS 区域阻止了可用于隧穿的电子供应，从而抑制了电子的移除。结果，通常在编程 VGS 为 –29.4 V 时出现的 Nth (–7) 量子态消失了。下一次电子移除仅在编程 VGS 达到 –29.7 V 时发生。此时，SL-石墨烯的费米能级跨越了零 DOS 区域，恢复了可隧穿电子的供应。这种转变导致 Nth (–6) 和 Nth (–8) 量子态之间的编程电压步进扩大至 –2V (–0.6 V)，表明额外的 –0.6 V 电压足以驱动费米能级跨越零 DOS 区域并促进进一步的隧穿。根据我们的理论模型 (3)，SL-石墨烯相应的带隙约为 0.03 eV，这与此前报道的 20-nm 宽石墨烯的实验值 (35, 36) 紧密一致。SL-石墨烯的带隙通过温度依赖的输运测量进一步验证（图 S26）。实验观察与我们理论预测之间的高度一致凸显了 DOS-剪刀理论的可靠性。在该异常区域之外，相邻量子态之间的最小编程电压间隔和 ΔVth 值
恢复到 –V*。相反，将单电子移入 SL-石墨烯的过程也表现出类似的异常量子存储行为，其中 Nth (–7) 量子态同样消失（图 4B，右侧）。我们进行了一系列对照实验以进一步确认该机制的鲁棒性（图 S27 和 S28）。
通过将二维材料的极限厚度限制与共平面双栅极（DCS）结构相结合以抑制边缘电容，在室温下实现了非挥发且可区分的单电子存储器，并观察到了两种有趣的量子行为。此外，我们建立了态密度（DOS）剪切理论来预测一种独特的量子存储效应。这一预测通过实验得到了验证，实验证明我们的理论和技术框架能够支持对单个量子状态的精确操纵。我们的发现为探索新兴量子现象铺平了道路，表明集成多种半导体[此处文本截断]
致谢 资金支持：本研究得到了中国国家重点研发计划 (2024YFA1208400)、中国国家自然科学基金 (62322405, 62525401, U25D8010, 以及 62374042)、上海市基础研究试点计划-复旦大学 21TQ1400100 (21TQ011)、通过 XPLORER PRIZE 资助的新 Cornerstone 科学基金、青年教师科研创新能力支持项目以及教育部创新平台青年科学家项目的支持。部分样品制备在复旦纳米加工实验室完成。作者贡献：C.L. 和 P.Z. 构思了该想法；C.L. 构建了理论，Y.X. 提供了有价值的投入；C.L. 和 Y.X. 设计并进行了实验；C.W. 在模拟方面提供了有价值的投入；C.L. 和 Y.X. 共同撰写了原稿；所有作者均参与了原稿的讨论和修订。竞争利益：作者声明不存在竞争利益。数据、代码和材料可用性：评估本文结论所需的所有数据均在正文或补充材料 (SM) 中提供。所有支撑图表的数据可在 Figshare (37) 中找到。许可信息：版权所有 © 2026 作者，保留部分权利；独家被许可人美国科学促进会。不对原始美国政府作品提出主张。https://www.science.org/about/science-licenses-journal-article-reuse
补充材料 science.org/doi/10.1126/science.aeg6638 材料与方法；补充文本；图 S1 至 S28；表 S1 至 S3；参考文献 (38–47)
2026 年 2 月 23 日提交；2026 年 5 月 29 日接受
阿拉尔海的干涸重塑了 中亚的人为碳 库存
Rafael Marcé1*, Daniel Diaz- de- Quijano2,3†‡§, Sofía Rodríguez- Gómez4†, Enrique Moreno- Ostos4, Makhambet Mukhtar5, Björn Wissel6, Zoraida Quiñones- Rivera6, Carolina Olid7, Santiago Giralt8, Joan Pere Casas- Ruiz9, Georgiy Kirillin10, Daniel Mercado- Bettín1, Valentí Rodellas11, Jordi Ibáñez- Insa8, Núria Catalán1
湖泊在其沉积物中储存大量碳，有助于气候调节。然而，湖泊干涸后这些碳的去向仍不明确。我们采用空间-时间替代法，结合沉积物芯样、二氧化碳通量测量和遥感技术，量化了全球最大干涸湖泊——阿拉尔海的有机碳损失。自 1960 年以来，裸露的湖床沉积物已释放 204 ± 53 兆克碳 (Tg C)，而植被生长的抵消作用不足 1%。将这些排放量纳入计算后，改变了区域碳预算，使阿拉尔海流域从一个假定的土地利用变化碳汇转变为净排放源。重新注水填充该海域可防止额外的 165 ± 13 Tg C 释放，这将使生态恢复不仅成为一项生态和人道主义的紧迫任务，同时也是一个缓解气候变化的机会。
由于碳储量在地球各分区之间的重新分布对大气碳水平和气候变化具有深远影响，这已成为当代碳生物地球化学的核心焦点。湖泊和内海调节从陆地到海洋的碳转移 (1, 2)，排放二氧化碳 (CO2) 和甲烷 (CH4) (3, 4)，并将有机碳和无机碳（分别简写为 OC 和 IC）埋藏在沉积物中，使其能够持续数千年 (5–8)，从而使其成为重要的全球碳汇 (9)。然而，由于引水、筑坝和气候变化，湖泊面积正在发生变化 (10)。自 2001 年以来，全球新形成的湖泊和水库面积增加了约 48,000 km2 (11)，增强了其沉积物中的 OC 埋藏 (9, 12)。与此同时，在干旱和半干旱的内流盆地中发生了大规模的湖泊萎缩 (10, 13)。自 2001 年以来，约 96,000 km2 的湖面干涸 (11)，使大面积的沉积物暴露于大气之中。由于许多湖泊经历了剧烈的干涸，近期研究表明，当沉积物干涸时，储存在湖泊沉积物中的 OC 会矿化为 CO2 (14–17)，这意味着干涸可能会将此前埋藏的碳重新释放回大气中。然而，尽管存在这种长期 OC 埋藏被反转的可能性，湖泊干涸对沉积碳储量及其大气释放的整体影响仍不清楚 (18)。
阿拉尔海（哈萨克斯坦/乌兹别克斯坦）曾是世界第四大内陆水体，在 20 世纪 60 年代初开始萎缩，这主要是由于其两条主要支流被引作灌溉所致 (19, 20)。这引发了 20 世纪最严重的全球环境和社会危机之一 (21)。灌溉的扩张
1西班牙国家研究委员会 (CSIC) 高级研究中心 (CEAB)，西班牙布拉内斯。 2加泰罗尼亚水资源研究中心 (ICRA)，西班牙吉罗纳。 3西伯利亚联邦大学 (SFU)，俄罗斯克拉斯诺亚尔斯克。 4马拉加大学；生态系，海洋与湖沼生态学组，西班牙马拉加。 5非政府组织 Aral Tenizi，哈萨克斯坦阿拉尔斯克。 6克洛德·贝尔纳-里昂第一大学，UMR 5023 LEHNA，法国维勒尔班。 7巴塞罗那大学 (UB) 地质模型研究所，地球与海洋动力学系，地球科学学院，西班牙巴塞罗那。 8巴塞罗那地球科学中心 (GEO3BCN)，CSIC，西班牙巴塞罗那。 9地中海高级研究中心 (IMEDEA- UIB- CSIC)，西班牙埃斯波尔莱斯。 10莱布尼茨淡水生态与内陆渔业研究所 (IGB)，德国柏林。 11巴塞罗那自治大学 (UAB) 物理系，西班牙贝拉特拉。 *通讯作者。 电子邮件：rmarce@ ceab. csic. es †这些作者对本工作贡献均等。 ‡现地址：巴塞罗那大学 (UB) 进化生物学、生态学与环境科学系，西班牙巴塞罗那。 §水生生态研究组，生物科学系，维克大学-加泰罗尼亚中央大学，西班牙维克。
导致了阿拉尔海流域大规模的人为土地利用/土地覆盖变化 (LULCC)，自 1960 年代以来，约 40,000 km2 的干地被转化为灌溉农业 (22)。与此同时，阿拉尔海海岸线的后退使约 60,000 km2 的前湖底暴露于大气中 (23)，约占全球干涸湖泊沉积物面积的 50% (11)。由于其规模前所未有，阿拉尔海为评估大规模湖泊干涸如何影响沉积碳储量以及如何重塑 LULCC 产生的区域碳通量提供了前所未有的机遇。
在本研究中，我们利用 2022 年野外考察期间收集的数据，量化了 1960 年至 2022 年间因阿拉尔海湖底沉积物暴露而导致的碳储量变化。采用以空间换时间的采样设计，我们量化了在湖泊从水域向陆地转换过程中影响沉积碳储量的四个过程：(i) 暴露沉积物中 OC 的原位降解，(ii) 风蚀及异地 OC 降解，(iii) 沉积碳埋藏的停止，以及 (iv) 殖民干涸湖底的植被所带来的 OC 累积 (24)。随后，我们评估了纳入这些碳通量如何重塑阿拉尔海流域 LULCC 的净碳交换估算值，并探讨了重新注水减轻排放的潜力。
沿干涸时间序列的环境梯度 我们沿着三条约 120 km 的样带调查了 14 个样点，这些样带的选取旨在捕捉具有代表性的平坦地形（平均坡度 0.21%）并避开主要河流输入（图 1A 和图 S1）。每条样带包含 4 到 5 个沿干涸时间序列布置的样点，即一系列在不同时间暴露的区域；我们利用这一点来重建干涸约 50 年期间的碳动态，时间跨度从 1970 年代起就干涸的区域到直到 2020 年仍处于淹没状态的中心盆地（图 1B）。这种以空间替代时间的采样设计的潜在逻辑在材料与方法中有所描述 (24)。在过去的五十年里，湖泊退缩产生了强烈的环境梯度（图 1，C 至 E）。地表沉积物的电导率和含水量在原湖中心附近达到峰值，并向暴露时间最长的区域递减（图 1F）。湖中心近期的干涸产生了高盐环境 (25)，并伴有卤化物和硫酸盐矿物的沉淀（图 1G）。沉积柱揭示了三种主要的岩相：(i) 分选良好、浅褐色的砂层，局部含有生物碎屑，表明为浅水沉积；(ii) 青色至绿色的粘土和粉质粘土，代表近海碎屑堆积；以及 (iii) 在干涸晚期形成的薄白色岩盐及其他硫酸盐结壳。这些岩相在垂直方向上交替出现，反映了过去湖泊水位的波动（图 S2 和 S3），且结壳相仅出现在 1990 年代之后干涸的区域。暴露的沉积物已发育为排水不良的盐渍土，如 solonchaks 和 takyrs (26)。
在未被盐壳胶结的细粒、未固结硅质碎屑沉积物中，我们发现了明显的风蚀证据（图 1D 和图 S4）。这一点得到了过量 210Pb 存量的支持 (24)，结果显示时间序列中段样点的风蚀率较高，而近期暴露区的风蚀率较低（图 1B），这与遥感分析一致 (27)。风蚀率范围为 0 至 8.0 mm yr−1，平均值为 2.6 ± 2.2 mm yr−1（平均值 ± 标准差，N = 14 个样点），与先前通过沙尘捕捉器和气溶胶建模得出的长期估计值相符 (28, 29)。
灌木植被沿时间序列的分布情况不一，特别是在 1960 年代至 1980 年代之间暴露的区域，其中部分区域已实施造林 (30)。来自全球生态系统动态调查 (GEDI) 的地上生物量估算结果显示
图 1. 阿拉尔海干涸时间序列沿线的采样设计和环境梯度。(A) 阿拉尔海地图，显示随时间推移的海岸线退缩（蓝色渐变）以及干床地上植物生物量的同步累积（绿色渐变）。方框指示了样线和采样点的位置。星号和菱形标记了淹没区域 (33, 34)，小正方形标记了从文献中汇总的干床位置 (32)。(B) 三条样线（细直线）上的采样点（圆圈）。海岸线随时间推移的退缩由蓝色线条表示（1960, 灰色线条除外）。圆圈的红色深浅与估计的风蚀率（毫米/年）成正比。白色区域代表 1960 年高于水位的陆地。细十字线代表无法到达的采样点（S11 点）。背景是 2022 年 9 月 4 日的修正反射率 MODIS/Terra 图像。(C 至 E) 沿干涸时间序列的景观演变。请注意从长期暴露的干床中的植物 (E)，到样线中间部分的沙质沉积物 (D)，再到近期暴露沉积物中的高盐盐壳 (C) 的过渡。(F) 沿干涸时间序列表面沉积物（顶部 10 cm）的沉积物浆液电导率（毫西门子/厘米）和含水量（百分比）。(G) 沿干涸时间序列沉积物核心中矿物质的平均百分比组成，通过 X 射线衍射测量。仅显示了最丰富的七种矿物。在 (F) 和 (G) 中，x 轴同时描绘了采样位置以及自干涸以来的相应年份。线条和阴影表示时间序列上每个点所有可用样本（核心深度和/或采样点）的平均值和标准差。
遥感产品 (31) 与我们的无人机摄影测量估计结果一致（幂回归斜率 = 1.1, 决定系数 R2 = 0.62, P = 0.037, N = 7 个站点；图 S5），并显示 55% 的阿拉尔海干床缺乏可检测到的植被（图 1A）。在有植被的地方，地上生物量较低，平均为 0.029 ± 0.087 kg C m−2（在 1 km2 分辨率下 N = 24,725 个像素）。
干涸导致有机碳储量损失 我们从每个站点采集一个 23 至 55 cm 的核心来估计 OC 和 IC 储量（有关采样站点尺度结果代表性的分析，请参见补充文本），并计算了直到 2022 年前 205 至 255 年的层次的累积碳质量 (24)。OC 储量急剧下降（图 2A），从近期干涸站点的 3.0 kg C m−2 以上下降到干涸 30 年以上站点的 ~0.50 kg C m−2。我们将这种减少解释为沿时间序列的 OC 损失，这与在干涸的北极浅湖中观察到的类似模式一致 (14)。OC 的下降遵循指数衰减（图 2A），与阿拉尔海其他干床区域的数值相匹配 (32)（图 1A 和 2A）。干涸开始前预期的 OC 储量（指数拟合的截距，4.0 ± 0.44 kg C m−2，图 2A）与从淹没区域回收的核心所计算的 OC 储量一致 (33, 34)（图 1A 和 2A）。相比之下，IC 储量在不同样线之间没有显著变化 (P = 0.051；图 S6)。我们还记录到干湖床中存在中等但广泛的 CO2 排放 (0.131 ± 0.136 kg
图 2. 沿阿拉尔海干涸时间序列的沉积物 OC 储量下降情况。(A) 沉积物 OC 储量随干涸年数和采样位置（圆圈）的变化函数，以及指数拟合曲线（虚线）和自助法（bootstrapped） 95% 置信区间（阴影区域）。文献 (33, 34) 中关于淹没条件的 OC 参考值用星号和菱形表示，而来自文献 (32) 的干涸湖床 OC 储量用方块表示（图 1A）。文献来源的值未包含在模型拟合中。(B) 沉积物 OC（深色箱线图）与根据 Keeling 图估计的干涸湖床 $\text{CO}_2$ 排放量（浅色箱线图）的碳同位素组成 ($\delta^{13}\text{C}$，千分比) 对比。数据对应于第一个时间序列（站点 S1 至 S5）。由于各组样本量不同，我们使用 Wilcoxon 符号秩检验来评估中心趋势的差异。
图 3. 阿拉尔海干涸湖床中的有机碳损失。(A) 1960 到 2022 年期间，利用聚合指数模型（图 2A）估计的 OC 损失，与实际损失过程（原位降解、风蚀）和反事实损失过程（丧失的埋藏）累积的瀑布图对比。对于原位降解的贡献，我们采用了基于 OC 储量或干涸湖床 $\text{CO}_2$ 排放量的估计值。条纹区域表示自助法不确定性 ($\pm 1 \text{ SD}$)，柱状图顶部的数值为平均值。(B) 1960 到 2022 年期间，原位降解（使用 OC 储量计算）、风蚀和丧失的埋藏对总 OC 损失的年相对贡献率。(C) 与 (B) 相同，但针对原位降解和风蚀具有遗留效应的时期 (2023 到 2085)（即，不考虑 2022 年之后出现的新干涸区域）。(B) 和 (C) 中的线条和灰色区域分别代表这三个过程年贡献总和（总 OC 损失，每单位年太克碳）的中位数和 95% 置信区间。
CO2- C m−2 year−1, N = 109 次通量测量），使用土壤箱和便携式气体分析仪进行测量 (24)。同时，我们利用 Keeling 曲线实验表征了 S1 至 S5 站点干床 CO2 排放的 δ13C（−22.5 ± 1.8‰, N = 8 个 Keeling 曲线），这与沉积 OC 的稳定同位素组成相匹配（−22.4 ± 1.7‰, N = 150 个沉积物样本）(图 2B)。这些数值在统计上没有显著差异 (Wilcoxon's W = 576, P = 0.85)，表明 CO2 排放源自沉积 OC 的原位矿化。在所有采样地点均未检测到 CH4 排放 (24)。
阿拉尔海干床的有机碳损失 OC 储量的减少反映了三个过程：(i) 原位 OC 降解，(ii) 风蚀及随后的异地降解，以及 (iii) 干涸后丧失的沉积 OC 埋藏。后者代表了一种反事实的埋藏通量：即如果干涸没有中断沉积物累积，本应被埋藏的 OC。我们通过在空间和时间上对干旱条件下 OC 储量的指数衰减进行积分（图 2A），估算了 1960 到 2022 年整个阿拉尔海干床的累计 OC 损失（关于图 2A 结果向整个干床可推广性的分析，请参阅补充文本）。我们利用历史湖泊退缩数据来绘制干涸时间线并相应地应用衰减函数，不确定性通过自助重采样（bootstrap resampling）和蒙特卡罗传播进行量化 (24)。将 2022 年预测的剩余 OC 储量与模型截距（代表若未发生干涸时的 OC 基准线）进行比较，得出累计损失为 204 ± 53 Tg C (图 3A)。
为了确定实际损失过程和反事实损失过程对观察到的累计 OC 损失的贡献，我们独立估算了 (24)：(i) 原位 OC 降解，通过对自 1960 年以来未受埋藏或风蚀影响的核心深层剖面计算的 OC 储量进行指数衰减拟合 (图 S7)；(ii) 风蚀，通过将基于 210Pb 的侵蚀率与随时间变化的沉积 OC 含量下降模型相结合；以及 (iii) 丧失的 OC 埋藏，使用基于文献的平均 OC 埋藏率（20 ± 16 g C m−2 yr−1, N = 61 个估算值），并假设其在空间和时间上保持不变。这些结果分别为 101 ± 41 Tg C（原位降解），28 ± 9 Tg C（风蚀），以及 41 ± 4 Tg C（丧失的埋藏），总计 167 ± 33 Tg C，与累计估算值 [204 ± 53 Tg C；差异的 95% 置信区间 (CI)：−71 至 200 Tg C] 在统计上没有显著差异 (图 3A)。
图 4. 阿拉尔海干床 OC 损失对阿拉尔海盆地 LULCC 驱动的碳平衡的影响，以及与阿拉尔海恢复相关的潜在碳信用。(A) 瀑布图显示，在纳入暴露的阿拉尔海干床实际 OC 损失（原位降解和风蚀）后，阿拉尔海盆地与灌溉农业扩张相关的 LULCC 净碳排放（1975 到 2019 年） (22) 如何发生变化。农业扩张影响包括预计到 2067 年的遗留效应。干床 OC 损失分别显示为 1975 到 2019 年以及预计到 2082 年的遗留效应。箭头表示变化方向。条形图标签显示平均值；自助法不确定性 (±1 SD) 由条纹区域表示。(B) 估算的淡水注入量增加对阿拉尔海覆盖水域面积的影响与由此产生的可交易碳储量的关系（上方插图），以及增加注入量的盆地投资成本与由此产生的可交易碳储量之间的关系（下方插图）。除投资成本（未提供不确定性）外，部分误差线被符号遮挡。插图中的符号颜色与地图中的颜色对应。
一个关于原位有机碳（OC）降解的独立估算值是通过原位 $\text{CO}_2$ 通量得出的，该通量被建模为季节性沉积物温度的函数，并在空间和时间上进行了积分 (24)。这得出的损失量为 $119 \pm 17 \text{ Tg C}$，与基于储量的估算值 $101 \pm 41 \text{ Tg C}$ 一致（差异的 95% 置信区间：$-71$ 至 $89 \text{ Tg C}$）。这种一致性以及汇总估算与特定过程估算之间的收敛，增强了我们方法的稳健性，并支持了这样一种解释，即干涸后的 OC 损失主要由原位降解主导。
随着可降解 OC 的枯竭，OC 衰减的非线性轨迹已将实际损失的比例从 1960 年代的约 80% 降低到 2020 年代的约 70%（图 3B）。由于预计干床将不再进一步扩张，2085 年之后预计仅存在反事实损失（失去的埋藏量）（图 3C）。
植被生长带来的碳累积与损失相比可以忽略不计 我们将 GEDI 衍生的地上生物量（图 1A）转换为地上碳 (24)，整个干床共计 $0.72 \pm 0.13 \text{ Tg C}$。这反映了自 1960 年以来植被的净积累，仅占原位降解和风蚀导致的实际 OC 损失 ($128 \pm 40 \text{ Tg C}$) 的 0.56%。如果将地下生物量 (24) 纳入计算，总生物量累积将增加到 $1.36 \pm 0.91 \text{ Tg C}$，但这仍然仅占总实际 OC 损失的 1.1%。因此，植被对碳的影响可以忽略不计
预算。尽管最近的绿化计划 (30) 可能有助于减轻中亚地区与沙尘暴相关的健康和经济影响 (35)，但它们在碳抵消方面的潜力极小。植被可以局部减少风蚀 (36)，从而间接影响有机碳 (OC) 的损失；然而，植被覆盖区仍是尘埃热点 (37)，这让人对其在大尺度上的有效性产生质疑。此外，1990年代后干涸区域的高盐分限制了植物在中心干涸湖床的进一步殖民 (38, 39)。
对中亚地区人为碳清单的影响 评估中亚地区土地利用与土地覆盖变化 (LULCC) 碳排放的研究主要集中在干地与灌溉农田之间的转换。一个簿记模型估计，自 1975 年以来，在干地向灌溉地转换的驱动下，阿拉尔海盆地的累积碳汇为 −89 ± 35 Tg C (22)。该估计考虑了截至 2019 年的 LULCC 影响，以及预计将持续到 2067. 年的遗留效应。我们通过考虑与阿拉尔海干涸相关的 OC 损失 (24) 重新审视了这一评估，纳入了促成与大气之间实际垂直碳交换的进程（即原位降解和风蚀），这与 LULCC 评估惯例一致。将 1975 年至 2019 年间原位 OC 降解和风蚀的影响 (94 ± 32 Tg C) 计算在内后，LULCC 平衡值移至接近零 (4.7 ± 47.4 Tg C)（图 4A）。若将与实际 OC 损失过程相关且将持续至 2082 年的遗留效应 (134 ± 34 Tg C) 纳入其中，净 LULCC 平衡则转变为 45 ± 49 Tg C 的碳源（图 4A）。
我们将阿拉尔海的 OC 损失与整个中亚地区其他与 LULCC 相关的碳通量进行了比较 (40)。1960 年至 2022 年间，阿拉尔海暴露湖床的实际 OC 损失为 167 ± 42 Tg C（遗留效应预计将持续到 2085 年）。与此同时，一项最近的研究报告称，在长期干旱条件下，1979 年至 2011 年间中亚地区的土壤 OC 储量增加了 130 Tg C，而同期植被生物量减少了 570 Tg C，后者同样归因于干旱 (41)。值得注意的是，这些变化发生在面积几乎比阿拉尔海干涸湖床大 100 倍的区域。因此，阿拉尔海的干涸不仅反转了阿拉尔海盆地的 LULCC 预算，使其从净碳汇变为碳源，而且对整个中亚地区的碳动态具有更广泛的影响。
将干涸湖泊的碳通量纳入国家清单报告 由人类活动驱动的湖泊干涸可能会显著影响区域人为碳清单，特别是在湖泊退缩的干旱和半干旱地区，例如大盐湖和萨尔顿海（美国）、乌尔米亚湖（伊朗）、查德湖（查德）、波波湖（玻利维亚）、奇基塔湖（阿根廷）和鲁夸湖（坦桑尼亚） (13)。尤其令人关注的是里海，作为地球上最大的内陆水体，预计到本世纪末将缩减约 23% (~90,000 km2) (42)，这一过程在其东北部的哈萨克斯坦海岸已经可以观察到 (43)。
湖泊干涸通常与盆地层级的土地利用与土地覆盖变化（LULCC）相关，例如从未管理土地转变为灌溉用地，对此已有碳核算指南。然而，目前尚无指南探讨水体转变为干地所产生的碳排放。将干涸湖泊纳入国家清单报告，对于全面且公平地评估人为温室气体（GHG）排放至关重要。将干涸湖泊整合到国家清单的“土地利用、土地利用变化与林业”部门面临三个挑战：首先，由于数据不足，盐湖和盐渍土（在干涸地区常见）被排除在当前的 IPCC 指南之外 (44)。其次，尚不清楚干涸湖泊如何适应“管理土地代理”机制——这是 IPCC 的一项操作性假设，即定义为管理土地上的所有温室气体通量均为人为产生的，因此必须纳入国家清单。这引发了一些问题，例如，干涸过程中部分淹没区域的温室气体通量是否应归因于人为管理。第三，湖泊表面经常随季节和年际波动 (11)，这增加了识别永久性土地利用变化的难度。我们在补充文本中详细探讨了这些问题，并为将干涸湖泊纳入国家清单提供了建议。值得注意的是，未来的方法可以利用现有的关于排水泥炭地的指南 (45)，因为两者面临类似的挑战。
利用沉积碳库的脆弱性来支持阿拉尔海的恢复 解决阿拉尔海灾难的努力长期以来吸引了国际关注 (21)，大多数干预措施集中在社会经济适应上，例如在干涸的湖床进行植树造林以减少沙尘暴 (30) 以及推广替代生计 (46)。尽管这些策略很重要，但它们并未解决湖泊水位剧烈下降的问题。然而，扭转干涸状况将需要对跨界流域的水资源管理进行重大且政治敏感的变革 (47)。但令人鼓舞的是，成功的跨界水治理模型正在全球范围内出现 (48)。
我们的研究结果表明，恢复阿拉尔海的水文状况不仅是生态和人道主义的迫切要求，而且是一个气候缓解的机遇。我们估计，在 2023 年至 2085 年之间，有 38.6 ± 4.7 Tg 的有机碳 (OC) 易受原位降解和风蚀的影响（图 3C）。在 100 年的碳核算周期下，我们还估计由于丧失埋藏机会而导致 125 ± 13 Tg C 的反事实损失。重新蓄水将停止有机碳的进一步降解并恢复沉积碳埋藏，从而有可能防止 165 ± 13 Tg C 的额外排放；假设有机碳库发生好氧降解，这相当于 604 ± 48 Mt CO2。参照 IPCC 湿地补充指南 (44)，由于硫酸盐对产甲烷作用的抑制效果，我们假设重新蓄水的盐渍湿地产生的 CH4 排放量可忽略不计（见补充文本）。
这种减缓潜力可以在自愿碳市场 (VCM) 中产生大量的碳信用额，有可能使当前全球未退休信用的总量（~700 Mt CO2）翻倍 (49)。旨在增加阿拉尔海入水量的灌溉效率项目可以可靠地将避免的排放和恢复的汇量主张为可交易的信用额。尽管如此大规模信用额池的市场价值尚不确定，但鉴于其可衡量、可验证的影响以及显著的社会共益，这些抵消额很可能被认定为高质量 (50, 51)。使用 2024 年 VCM 中林业和土地利用项目的价格范围（每吨二氧化碳当量 $6.03 至 $29.72）(52)，阿拉尔海碳信用的市场价值估计在 $3.6 ± 0.29 billion 至 $18 ± 1.4 billion 美元之间。投入 9.7 billion 美元 (2024 USD) 来改善中亚农业的水资源管理、输水和农场灌溉效率，可使淡水入流量增加 28 km3 yr−1 (53, 54)。由于这些增量源于减少当前的水量损失而非重新分配灌溉取水量，这种水平的入流量可以在不对区域农业生产产生不利影响的情况下，恢复该湖泊 1960 年面积的 ~50% (55)，从而产生 323 ± 25 Mt CO2 的信用额（图 4B）。然而，随着恢复进程的推进，进一步改善水资源管理、输水和灌溉效率的成本呈指数级增长（图 S8），导致碳信用额的边际回报下降（图 4B），使得仅通过碳抵消实现完全恢复变得不太可能。尽管如此，碳信用额可以在恢复过程中发挥催化作用，特别是当其与跨界水权交易等机制互补时 (56)。
我们承认估值中固有的巨大不确定性，以及任何恢复工作都将面临的重大技术、社会、经济和政治挑战（补充文本）。然而，对阿拉尔海干涸湖床中可交易碳储量的估值可能提供一个强大的激励机制，将恢复工作从一项区域负担转变为一个全球支持的气候减缓机遇。
中国新疆省。它包括阿拉尔海盆地，且面积大四倍。 41. C. Li et al., Glob. Change Biol. 21, 1951–1967 (2015). 42. R. Samant, M. Prange, Commun. Earth Environ. 4, 357 (2023). 43. R. Court et al., Commun. Earth Environ. 6, 261 (2025). 44. T. Hiraishi et al., Eds., 2013 Supplement to the 2006 IPCC Guidelines for National
Greenhouse Gas Inventories: Wetlands (IPCC, 2014).
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Pathways for Adaptation and Resilience (United Nations ESCAP IDD, 2022). 47. K. D. White, Journal of Eurasian Studies 4, 18–33 (2013). 48. United Nations Economic Commission for Europe, “The water convention: 30 years of
impact and achievements on the ground.” (UNECE, 2022). 49. World Bank, State and Trends of Carbon Pricing 2024 (World Bank, 2024). 50. B. S. Probst et al., Nat. Commun. 15, 9562 (2024). 51. J. Lou, N. Hultman, A. Patwardhan, Y. L. Qiu, Commun. Earth Environ. 3, 137 (2022). 52. Forest Trends’ Ecosystem Marketplace, State of the Voluntary Carbon Market 2025
(Forest Trends Association, 2025); https://www.ecosystemmarketplace.com/ publications/2025- state- of- the- voluntary- carbon- market- sovcm/. 53. M. Bekchanov, C. Ringler, A. Bhaduri, M. Jeuland, Water Resour. Econ. 13, 30–45
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Aral Sea Basin,” thesis, Bonn University, Bonn, Germany (2014). 55. X. Wang et al., Earths Futur. 11, e2023EF003657 (2023). 56. M. Bekchanov, C. Ringler, A. Bhaduri, Land Degrad. Dev. 29, 952–961 (2018). 57. R. Marcé, Drying of the Aral Sea reshapes the anthropogenic carbon inventory of Central
Asia, Zenodo (2025); https://doi.org/10.5281/zenodo.16809289.
致谢 我们感谢 Z. Tairova, A. Makhambetzhanov, O. Ospanov, M. Sayanov, K. Pazylbekov, I. Tairov, T. Abdikerov, M. Konysov, Y. Aldamzharov, 和 L. Carrau 在野外工作中提供的帮助。来自非政府组织 Aral Tenizi 的 A. Baimahanova 为此次考察的物流和成功做出了决定性贡献。我们感谢 J. M. Bruach, S. Sammartino, A. Freixa, C. Gutiérrez, S. Martínez, F. Ikane, E. Bisbal, L. Cojoc, P. Giménez, C. Estop- Aragonés, 和 K.- H. Knorr 在实验室工作或计算方面提供的帮助，以及马拉加大学应用物理 II 系提供的硬件和软件支持。与 B. Obrador 和 D. von Schiller 的讨论极大地促进了指导本研究的假设和方法的制定。纪念我们尊敬的同事和朋友 Jordi Garcia Orellana，他在考察开始前几周不幸逝世。他以极大的热情投入到这项工作中，全球同行将深切缅怀他。资金支持：本工作得到了西班牙国家研究局 (Spanish Agencia Estatal de Investigación) 的支持（资助号 PID2024- 161534NB- C31/AEI/10.13039/501100011033 授予 R.M., D.M.- B., 和 G.K.；PID2024- 161534NB- C32/AEI/10.13039/501100011033 授予 E.M.- O. 和 S.R.-G；以及 PID2023-148093NB-I00/MCIU/AEI/10.13059/501100011033/FEDER,UE 授予 C.O.）。S.R.- G. 受益于西班牙科学、创新与大学部 (Spanish Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades) 的资助 (FPU22/01818)。J.P.C.- R. 受益于由巴利阿里群岛政府资助的 Vicenç Mut 奖学金 (参考号 PD- 057- 2023)。作者贡献：概念化：R.M., E.M.-O., D.M.- B., N.C；方法论：R.M., D.D.- d.- Q., S.R.- G., E.M.- O., M.M., B.W., Z.Q.- R., C.O., S.G., D.M.- B., V.R., N.C.; 调查：R.M., D.D.- d.-Q., S.R.- G., E.M.-O., M.M., B.W., Z.Q.- R., C.O.,
S.G., J.P.C.- R., G.K., N.C.; 正式分析：R.M., D.D.- d.-Q., S.R.- G., B.W., Z.Q.- R., C.O., S.G., J.P.C.- R., D.M.- B., V.R., J.I.- I., N.C.; 可视化：R.M., Z.Q.- R., J.P.C.- R., N.C.; 资源：R.M., E.M.-O., M.M., B.W., Z.Q.- R., S.G., G.K., V.R.; 资金获取：R.M., E.M.-O., D.M.- B., N.C., G.K.; 项目管理：R.M., E.M.-O., D.M.-B.; 监督：R.M., E.M.-O., N.C.; 论文起草：R.M., Z.Q.R., N.C.; 论文审阅与编辑：R.M., D.D.- d.- Q., S.R.- G., E.M.-O., M.M., B.W., Z.Q.- R., C.O., S.G., J.P.C.- R., G.K., D.M.- B., V.R., J.I.- I., N.C. 利益冲突：作者声明不存在竞争性利益。数据、代码和材料可用性：评估本文结论所需的所有数据均已在文中和/或补充材料中给出。原始数据和处理代码可在 Zenodo (57) 获取。本研究未产生新材料。许可信息：版权所有 © 2026 作者，保留部分权利；独家许可方为美国科学促进会 (AAAS)。不对美国政府原始作品主张权利。https://www.science.org/about/science- licenses- journal- article- reuse
补充材料 science.org/doi/10.1126/science.aeb2344 材料与方法；补充文本；图 S1 至 S17；参考文献 (58–108)
10.1126/science.aeb2344
提交于 2025 年 8 月 13 日；接收于 2026 年 5 月 27 日
CA3 锥体神经元树突沿线的并行独立电压计算
Asako Noguchi1,2†, Satoshi Terada1,2†, George N. Zakka2, Cliodhna O’Toole2, Luke Reynolds2, Michelle Ann Land3, Balázs J. Rózsa4,5,6, François St- Pierre3,7,8, Attila Losonczy1,2,9*
树突计算有助于皮层回路的信息处理。海马体 CA3 在导航中起核心作用，但 CA3 锥体神经元的树突在体内如何处理信息在很大程度上仍不清楚。通过在小鼠进行虚拟现实引导导航期间，对 CA3 锥体神经元的树突和胞体进行电压成像，我们发现树突分枝包含多个独立的计算单元，这些单元可以根据行为条件动态地与胞体活动耦合或解离。树突活动通过与胞体输出的条件耦合，塑造了空间、奖励和上下文的亚细胞表征。此外，空间共同调谐的树突在尖波涟漪（sharp-wave ripples）期间保持其协调性。这些发现表明，过去、现在和未来的表征共存于 CA3 锥体神经元的树突分枝中，共同塑造了与行为相关的神经编码。
越来越多的实验和理论工作表明，锥体神经元的树突可以通过与轴突-胞体区室的灵活耦合，独立或共同地处理信息 (1–7)。在海马体的 CA3 区域，锥体神经元 (CA3PNs) 通过空间、奖励和上下文相关的活动 (8–10)，以及通过与尖波涟漪 (SWR) 相关的在线活动模式的再激活 (11, 12)，在空间导航和记忆中发挥关键作用。然而，在行为动物进行在线探索和离线记忆巩固期间，使用电压成像测量 CA3PNs 在体内的树突整合特性一直难以实现。大多数关于树突整合的研究是在切片制备中进行的，其解剖和生理条件与体内不同 (13–17)。体内研究主要依赖于钙指标 (18–20)，这些指标既缺乏捕捉亚毫秒树突信号的时间分辨率，也缺乏解析亚阈值动力学的灵敏度。此外，单深度树突电压成像 (21, 22) 限制了对胞体-树突膜沿线多个部位膜电位 (Vm) 的获取，从而限制了对信号起始和传播的了解。为了填补这些主要空白，我们利用超快、运动稳定、三维 (3D) 声光显微镜和优化的基因编码电压指示剂，在 CA3PNs 胞体-树突膜表面的多个位点进行了双光子电压成像。
CA3 锥体神经元树突的体内电压成像 为了实现对树突树中感兴趣区域 (ROIs) 的运动稳定扫描，我们利用了实时运动校正 (RTMC)
1Peter O’Donnell Jr. 脑研究所，德克萨斯大学西南医学中心，达拉斯，TX，美国。2Mortimer B. Zuckerman 心智、大脑与行为研究所，神经科学系，哥伦比亚大学，纽约，NY，美国。3神经科学系，贝勒医学院，休斯顿，TX，美国。4BrainVisionCenter，布达佩斯，匈牙利。5三维功能网络与树突成像实验室，实验医学研究所，布达佩斯，匈牙利。6 信息技术与仿生学部，帕兹马纽·彼得大学，布达佩斯，匈牙利。 7生物化学与分子药理学系，贝勒医学院；休斯顿，TX，美国。8电子与计算机工程系，莱斯大学，休斯顿，TX，美国。9神经科学系，德克萨斯大学西南医学中心，达拉斯，TX，美国。*通讯作者。电子邮件：asako. noguchi@ utsouthwestern. edu (A.N.); st3166@ columbia. edu (S.T.); attila. losonczy@ utsouthwestern. edu (A.L.) †这些作者对本工作贡献均等。
(23)。CA3 锥体神经元 (CA3PNs) 被低密度标记了一种病毒表达的绿色电压指示剂 JEDI3sub (24)，以及 tdTomato（用于 RTMC 的静态参考）（图 1A 和图 S1）。一个胞体和多个树突感兴趣区域 (ROI) 的成像频率超过 1 kHz (图 1B 和图 S2)。记录结果显示出截然不同的 Vm 信号模式，在操作上被分类为快速尖峰 (fast spikes) 和慢速亚阈值动力学 (slow subthreshold dynamics) (17, 23, 25–27) (图 1C 以及图 S3 和 S4)（见材料与方法)。快速尖峰推测对应于胞体动作电位和树突钠尖峰 (17, 28)。逆传动作电位 (bAPs) 被定义为在胞体尖峰发生后 1 ms 内发生的快速树突事件，且表现出预期的幅度衰减，以及随与胞体路径距离增加而增加的延迟 (22, 23) (图 S5)。为了研究空间导航期间的胞体-树突电压动力学，我们使用了一个虚拟现实系统 (29, 30) (图 1D)。我们记录了 20 个 CA3 位置细胞的 Vm 动力学，同时监测每个细胞的胞体及最多 14 个树突 ROI 的 Vm (每细胞 5 到 14 个 ROI) (图 1E)。生理基准表明电压成像具有稳定性和可靠性 (图 S6)。
CA3 位置细胞中的胞体-树突耦合 我们首先分析了整个树突树的空间调谐及其协调性。树突通常表现出与胞体相似的空间调谐，表明胞体-树突动力学高度耦合 (图 1, F 和 G) (20)。然而，这种耦合表现出显著的空间梯度。每个树突 ROI 与其父级胞体之间的调谐曲线 (TC) 相似性随树突分枝路径距离的增加而降低 (图 S7A)。在排除与 bAP 相关的树突事件后，这一梯度仍然存在，表明其并非完全归因于 bAPs。此外，去除在胞体动作电位 (APs) 之前出现的树突快速尖峰降低了相关性 (图 S7, B 至 D)，这表明 AP 之前的树突尖峰有助于形成依赖于路径距离的胞体-树突协调。在行为时间尺度上，在动物进入胞体位置场 (PF) 之前，树突尖峰率会增加 (图 S8, A 和 B)，而 PF 之后则没有观察到类似的增加 (图 S8C)。这些结果表明，位置细胞中的胞体-树突耦合在空间上是有组织的，并且与胞体 PF 放电前的时间非对称性树突活动相关。
接下来，我们探讨了这种空间组织是否延伸至阈下活动（图 1G 及材料与方法）。利用随机森林回归器，我们将每圈 somatic PF 建模为定义空间间隔内先前 dendritic TC 及其路径距离的函数（图 1H 和图 S9）。阈下和阈上树突特征均能稳健地预测随后的 somatic PF 动态（图 1，H 和 I，以及图 S10）。我们使用 SHapley Additive exPlana-tions [SHAP (31)] 分析来量化每个特征的边际贡献，结果显示预测影响力随路径距离呈非线性衰减（图 1I）。树突阈下特征与 SHAP 值呈现 U 形关系（图 S10B），这表明存在不同的树突功能亚型，它们要么增强，要么抑制 somatic PF 的幅度。通过 Ward 法聚类和均匀流形近似与投影 (UMAP) 识别出一些树突群体，其贡献仅在特定空间间隔内强正相关，而在其他地方则较弱或呈负相关（图 1J 和图 S11）。将预测影响力峰值所在的间隔定义为“IN”间隔，将影响力最小的间隔定义为“OUT”间隔（图 1K），结果显示树突特征在“IN”区域内与 SHAP 值正相关，在区域外则呈负相关（图 1L）。这些结果表明，时间上脱节的树突活动可以通过在定义的感受野内进行选择性调节以及在其他地方进行抑制，来预测随后的 somatic 触发。
I
L
D
J
1 0
虚拟现实 (virtual reality)
G
亚阈值 (Subthreshold)
F
快速脉冲 (Fast spike) 亚阈值 (Subthreshold)
K
-30%
∆F/F (Z)
ER (Z) 4 0 ∆F/F (Z) 3 0 胞体 (soma)
胞体 (soma)
胞体 (soma)
圈数 # (Lap #)
圈数 # (Lap #)
圈数 # (Lap#)
圈数 # (Lap#)
圈数 # (Lap#)
圈数 # (Lap#)
2 0
2 0
2 0
2 0
基底 (basal)
基底 (basal)
基底 (basal)
顶端 (apical)
顶端 (apical)
顶端 (apical)
顶端 (apical)
簇状 (tuft)
簇状 (tuft)
0.2
-0.2
0.2
0.1
0.2
0.2
0.1
0.2
0.2
-0.1
300 0 200 100
300 0 200 100
位置 (cm) (Position (cm))
位置 (cm) (Position (cm))
0.4
1 2
预测的胞体 PF (Predicted Somatic PF)
-0.4
重要性 (Importance)
胞体 PF (somatic PF)
OUT+
0.4
0.4
图 1. 海马 CA3 锥体神经元位置细胞的树突电压成像。(A) 视野示例图，显示 CA3 锥体神经元中的参考指标（红色，tdTomato）和功能指标（绿色，JEDI3sub）。白线表示示例 ROI。(B) 3D 线扫描和实时运动校正示意图。(C)（左）来自胞体和每个树突区域的代表性轨迹，以及检测到的快速脉冲。（右）胞体爆发事件的示例轨迹及其相应的时频谱。黑色刻度线表示检测到的脉冲，虚线表示亚阈值动力学。(D) 固定水奖励（上）的空间导航任务示意图，以及集成双光子显微镜和虚拟现实系统的结构。(E) 位置细胞的胞体和顶端树突 ROI 的代表性轨迹（上）以及动物在轨道上的位置（下）。(F)（左）每圈顶端树突 ROI 的脉冲时间（上）以及相对于位置场 (PF) 峰值的相应事件率（下）。（右）每圈顶端树突 ROI 亚阈值动力学的热图（上），以及相应的蓝色轨迹和黑色平均轨迹（下）。(G) 胞体、基底、顶端和簇状树突 ROI 的亚阈值动力学（左）和脉冲率（右）热图，这些 ROI 是从一个位置细胞中同步记录的，并作为动物位置的函数表示。白色箭头表示与胞体 PF 分离的树突空间调谐。(H)（左）基于随机森林 (RF) 的预测，利用先前的树突调谐曲线 (TC) 预测胞体 PF 强度。（右上）通过决定系数 (R2) 分数量化的预测准确度 (R2 = 0.873, n = 2816 个事件，来自 12 只小鼠的 20 个细胞)。（右下）RF 回归器中使用的树突特征的相对重要性。(I) SHapley Additive exPlanations (SHAP) 图阐明了特征值及其对预测胞体 PF 强度的影响。面板显示了由亚阈值动力学（左）或快速脉冲活动（右）推导出的与胞体距离如何预测胞体 PF。实线代表捕捉非线性趋势的高阶多项式拟合。(J) 树突功能亚型的代表性示例。标记颜色与每个亚型相对应。AUC，曲线下面积。(K) 示意图展示了树突亚型 [来自 (J)，顶部] 对模型预测的影响。(L) 跨树突功能亚型的 SHAP 依赖图 [OUT: 皮尔逊相关系数 (R) = −0.4, P < 0.0001; IN: R = 0.71, P < 0.0001)。
10s
∆F/F (Z) 在位置: 0.92
55µm
70µm
156µm
0 -100 -200
距离胞体 PF 峰值的位置 (cm) (Position (cm) from peak of somatic PF (sub))
~-60cm
~-85cm
~-100cm
~-130cm
~-155cm
~-155cm ~-130cm ~-100cm ~-85cm ~-60cm
SHAP 值 (SHAP value)
SHAP 值 (SHAP value)
SHAP 值 (SHAP value)
SHAP 值 (SHAP value)
R=-0.27
树突 TC 亚型 (Dendritic TC subtypes)
-0.5 0.5 0
5 0
5 0
5 0
R=0.53
时间 (1s) (time (1s))
1s
胞体 (soma) 基底 (basal) 顶端 (apical) 簇状 (tuft) 树突 (Dendrites)
亚阈值 (Subthreshold) 快速脉冲 (Fast spike) 在位置: 0.92
2 ∆F/F (Z)
顶端 (apical) 顶端 (apical)
事件率 (Hz) (Event Rate (Hz))
-6 -4 0 2 -2 4
-6 -4 0 2 -2 4
距离胞体 PF 峰值的时间 (s) (Time (s) from peak of somatic PF) 距离胞体 PF 峰值的时间 (s) (Time (s) from peak of somatic PF)
由树突 TC 预测 (Predicted by Dendritic TC)
(AUC / PF 宽度)
0 3
0.3
AUC (树突) (AUC (dendrite))
距离胞体的距离 (Distance from Soma)
* *
*
* *
*
* *
*
*
R=0.015
R=-0.23
R=0.58
R=0.73
2.5 0
R=0.59
R=0.51
R=0.12
R=0.19
树突 TC 的 Z-score AUC (Z-scored AUC of dendritic TC)
频率 (Hz) (Frequency (Hz))
0.6 R= -0.77 R= 0.66
距离胞体的距离 (µm) (Distance from Soma (µm)) 距离胞体的距离 (µm) (Distance from Soma (µm)) 100 0 300 200 400 100 0 300 200 400
dend-TC IN
IN OUT
IN OUT
R= -0.4 R= 0.71
0 2 4 -2 10 5 0 树突 TC 的 Z-score AUC (Z-scored AUC of dendritic TC)
<40Hz
小波幅值 (Wavelet Amp)
H
I
C
对毫秒时间尺度下亚阈值动力学的事件级分析揭示了树突活动与胞体活动之间结构性的时间关系。局部树突事件的可能性随与胞体路径距离的增加而增加（图 2, A 和 B）。相比之下，对共激活树突事件的分析揭示了树突-胞体潜伏期中结构性的时间关系，其中树突先行事件（负潜伏期）随路径距离增加而减少，而树突随行事件（正潜伏期）随路径距离增加而增加（图 2, C 至 E）。这些模式伴随着独特的波形特征，定义了功能性的
-2
共激活 (Co-active)
F
树突 (dend)
树突 (Dend)
树突 (Dend)
D
G
A B
* 1.0
局部 d-事件 (Local d-event) 1.0
1.0
-10
胞体 (soma) 树突 (dendrite)
100ms
0.0
0.0
1 ∆F/F (Z)
1 ∆F/F (Z)
1 ∆F/F (Z)
* *
*
2 10
*
*
*
*
*
R=0.30
滞后量 | (ms)
滞后量 (ms)
0.2
0.2
400 300 200 100 0
0.02
0.2
0.1
0.2
400 300 200 100 0
400 300 200 100 0
0.1
0.2
0.2
0.1
-0.2
400 300 200 100 0
-200
距离胞体(µm)
距离胞体(µm)
距离胞体(µm)
距离胞体(µm)
R=-0.27 E
时间优先级
0.4
0.4
0.4
指数
R=0.37
解码
比例
基底
顶端
簇状
平方误差
MSE
0.5
跟随者
跟随者
驱动者
驱动者
J
同步
驱动者
跟随者
R=0.31
同步
胞体事件
R=-0.20
驱动者
跟随者
图 2. 与胞体位置场相关的胞体-树突亚阈值协调。 (A) 由局部树突亚阈值事件（d-事件）的开始触发的周事件时间直方图（PETHs）。 (B) （左）每个区域的局部树突电压事件比例（n = 20 个细胞，χ2 检验，P < 0.05）。（右）局部树突事件比例作为其源树突与胞体之间距离的函数（R = 0.37, P < 0.05）。灰色阴影区域表示 95% 置信区间。标记形状和颜色对应于树突区域（基底：绿色正方形；顶端：天蓝色叉号；簇状：紫色倒三角形）。 (C) 由共激活树突电压事件的开始触发的 PETHs。 (D) 树突事件与胞体事件之间绝对（左）和带符号的延迟作为距离母胞体距离的函数（绝对延迟：R = 0.30, P < 0.05；正延迟：R = 0.31, P < 0.05；负延迟：R = −0.20, P < 0.05）。实线表示局部加权散点平滑拟合（左）和三阶多项式拟合（右）。 (E) 时间优先级指数，定义为 (Npreceding − Nfollowing) / (Npreceding + Nfollowing)，作为距离母胞体距离的函数（R = −0.27, P < 0.05）。 (F) 共激活树突电压事件的功能亚型的平均波形。虚线表示胞体事件的开始。 (G) 驱动者和跟随者树突事件以及共时发生胞体事件的所有 PETHs。 (H) 同一细胞内胞体事件幅度与由驱动者（左，R = 0.58, P < 0.05）或跟随者（右，R = 0.22, P < 0.05）树突事件预测的幅度之间的相关性示例。 (I) （左）胞体事件幅度与解码幅度之间的平方误差比较（蓝色：驱动者；粉色：跟随者；t 检验，P < 0.05）。每个树突的平均平方误差（MSEs）比较（t 检验，P < 0.05）。 (J) 共激活树突事件相对于胞体 PF 开始时间的发生时间分布（顶部：同步；中部：驱动者；底部：跟随者）。实线表示直方图的核密度估计，与上述热图对应。
0.8
0.8
局部 共激活
0.6
0.6
驱动 D-事件
亚型 基于滞后量
50ms
30 20 10
事件 # 事件 # 事件 #
-20 -30 -40
11900
前导 跟随
树突事件类别。特别是，一部分树突事件表现为在胞体激活之前的递增去极化（“驱动者”事件），而其他事件则以较慢的动力学跟随胞体活动（“跟随者”事件）（图 2, F 和 G）。与跟随者事件相比，驱动者事件能更强地解释逐个事件的胞体活动（图 2, H 和 I），这表明胞体激活之前的树突去极化对胞体放电有重大贡献。在行为时间尺度上，驱动者事件在进入胞体 PF 之前增加，而跟随者事件在 PF 之后显示出剧增。
局部 d-事件比例
跟随者 D-事件
跟随者 D-事件
-0.5 2 ∆F/F (Z) 驱动者 D-事件
-100 0 200 100 距离胞体事件开始的时间 (ms)
驱动者 胞体 跟随者 胞体
2 R=0.58 R=0.22
2.5 -2.5 0 -2
2.5 -2.5 0
胞体幅度 (原始)
1.5 1e-5
1e-5
(零滞后)
概率密度
6 4 0 -4 -2 2 距离胞体 PF 开始的时间 (s)
0.06
0.04
发作 (图 2J)。总之，亚阈值动力学展现出时间上不对称的空间组织，这构成了体细胞 PF 出现及逐次试验表征的基础。
A
C
G
H
I
奖励移位期间的体质树突重组 接下来，我们研究了在同一环境内奖励移位以及在全局上下文切换期间的亚细胞电压动力学。在奖励移位后 (图 3A)，体细胞场迅速重组，而一部分树突即使在其亲本体细胞已经重新映射后，仍保留了原始的空间调谐 (图 3B)。我们通过比较树突中“熟悉”（移位前）和“新颖”（移位后）TC 的比例来量化这种重组。
奖励移位
熟悉
全局上下文切换
树突
RZ1 RZ2
重新定位
0 3 m
E F
体细胞 树突
体细胞树突
*
*
*
*
Familiar-TC ratio (熟悉TC比率)
1.0
1.0
-1.0 *
-10
-10
0.5
-0.5
0.5
-5
-5
0 soma (胞体) tuft 1 (簇状树突 1)
0 3 Position (m) (位置 (m))
0 3 Position (m) (位置 (m))
0 3 Position (m) (位置 (m))
0.2
apical 1 (顶端树突 1)
Novel TC (新TC)
0.4
0.2
= 0.53
∆Lap# of remapping (重映射的圈数差)
-0.4
-0.8
= 0.39
∆Lap# of remapping (重映射的圈数差)
∆Lap# of remapping (重映射的圈数差)
图 3. 位置场重映射期间的胞体-树突脱耦。 (A) （上）在奖励易位中，奖励区域被移动到熟悉情境中的另一个固定位置。（下）奖励易位前后的平均速度曲线。(B) 奖励易位前后，一个位置细胞的胞体和顶端树突感兴趣区域 (apical 1) 的快速脉冲率热图，由虚线指示。(C) （左）(B)中所示细胞在奖励易位前（熟悉）和后（新）的胞体调谐曲线 (TCs)。（右）在奖励易位前后，各区域中显示出与熟悉或新 TC 具有高相似度的圈数比例 [费舍尔精确检验，胞体：比值比 (OD) = 0.073, P = 1.2 × 10−3; apical1: OD = 0.463, P = 0.45; apical2: OD = 0.063, P = 2.0 × 10−4; apical3: OD = 0.26, P = 0.094; tuft1: OD = 0.13, P = 0.017]。 (D)
具有熟悉 TC 的圈数比例，由新旧 TC 圈数之和归一化（Familiar- TC ratio）。 t = 21.1, 24.6, P = 6.9 × 10−18, 2.5 × 10−48, n = 14, 60 分别为胞体和树突的 ROI，Student's t 检验（另见图 S12F）。 (E) 奖励易位前后的 Familiar- TC ratio 变化 [ΔFamiliar- TC ratio (后-前)]。 P = 0.021, t = −2.4, Student's t 检验。(F) ΔFamiliar- TC ratio (后-前) 随距离胞体路径距离的变化曲线。相关系数的 t 检验（双侧）， R = 0.39, P = 6.7 × 10−4, n = 74 个 ROI，来自 10 只小鼠的 14 个细胞。(G) 树突 ROI 开始重映射的圈数相对于同源胞体计算（ΔLap# of remapping initiation），并绘制为路径距离的函数。相关系数的 t 检验（双侧）， R = 0.53, P =
1.3 × 10−6, n = 74 个 ROI，来自 10 只小鼠的 14 个细胞。(H) 全局情境切换后胞体和簇状树突 ROI (tuft 1) 的发放率热图。白色箭头指示每个 ROI 开始形成位置场 (PFs) 的圈数。(I) 树突 ROI 开始形成 PFs 的圈数，相对于同源胞体计算（ΔLap# of remapping initiation）。 t = −6.7, P = 2.7 × 10−8, n = 45 个 ROI，来自 8 只小鼠的 10 个细胞，与零值对比的一样本 t 检验。(J) ΔLap# of remapping initiation 随路径距离的变化曲线。 R = −0.42, P = 1.5 × 10−3, n = 55 个 ROI，来自 8 只小鼠的 10 个细胞，相关系数的 t 检验（双侧）。在 (F)、(G) 和 (J) 中，橙色、绿色、蓝色和紫色分别表示胞体、基底树突、顶端树突和簇状树突。
B soma (胞体) Lap (圈数)
Familiar TC (熟悉TC) 0.4
Event rate (Hz) (事件率 (Hz))
Event rate (Hz) (事件率 (Hz))
0 1 2 3
∆Familiar-TC ratio (aft-bef) (∆熟悉-TC比率 (后-前))
∆Familiar-TC ratio (aft-bef) (∆熟悉-TC比率 (后-前))
0 100 200 300 Path distance (um) (路径距离 (um))
initiation (rel. soma) (启动 (相对于胞体))
initiation (rel. soma) (启动 (相对于胞体))
initiation (rel. soma) (启动 (相对于胞体))
奖励易位前后圈数之间 (图 3C, 左)。 胞体显示出具有熟悉 TC 的圈数比例下降，以及具有新 TC 的圈数比例增加，证实了胞体重映射。相比之下，树突表现出更异质的动态；虽然一些树突与胞体并行重映射，但另一些则维持了熟悉 TC (图 3C, 右)。在所有 ROI 中，胞体和树突中具有熟悉 TC 的圈数比例均有所下降 (图 3D)。然而，这种下降在胞体处更为显著 (图 3E)，表明树突对其空间表征的重组程度较低或比胞体更缓慢。我们进一步发现，远端树突比近端树突更强地保留了其原始调谐，熟悉 TC 随距离亲本胞体的路径距离而减少。
n.s. (无显著性) n.s. (无显著性)
= -0.42 J
0 100 200 路径距离 (um)
胞体（图 3F）。重映射的时间进展遵循离心梯度，在胞体和近端树突中发生的时间早于远端树突（图 3G 和图 S12）。在去除与 bAP 相关的树突事件后，这种关系依然存在，表明距离依赖性并非完全由 bAP 相关效应驱动（图 S13, A 和 D）。排除 AP 前和/或后树突尖峰进一步增加了熟悉调谐的保留率（图 S13E），支持了部分树突自主性的观点。此外，这种距离依赖性模式在奖励转移前调谐与胞体不同的树突中也被观察到（图 S13F），表明空间梯度重组并不局限于与胞体功能耦合的树突。这些结果表明，奖励转移诱导了胞体与其树突之间的瞬时脱节，其特征是胞体 PF 的快速重组，而树突表征保持相对稳定，随后树突逐渐向胞体进行离心重新对齐。
熟悉 新颖
新环境下协调的胞体-树突空间调谐演变 与奖励转移相反，在小鼠暴露于新环境下发生的大规模重映射过程中，胞体及其树突内的 PF 在相似的时间进程中形成（29, 30）（图 3H）。为了确定新空间调谐首次出现的时间和位置，我们将初始周次（initial lap）定义为首次出现与稳定的胞体新 PF 高度相似的树突 TC。大多数成像的树突比胞体更早地表达新 TC（图 3I），且这种时间领先在树突分枝上呈空间组织分布，远端树突表现出新 TC 的时间早于近端部分（图 3J）。这些结果表明，PF 重映射首先在远端树突中出现，并向近端树突和胞体方向向心推进。这些结果证明，奖励转移和新环境暴露会诱发出具有不同时间与空间协调机制的截然不同的亚细胞重映射模式。
与重映射相关的树突亚阈值协调 接下来，我们研究了重映射过程中亚阈值水平上的胞体-树突协调。利用非负矩阵分解 (NMF)，我们
将单个 lap 的空间调谐亚阈值动力学分解为基准调谐模式的组合（图 S14 及材料与方法）。我们首先利用这种潜在嵌入将躯体 PF 重映射过程分为四个功能时期：“熟悉期 (Familiar)”、“之前期 (Before)”、“期间 (During)”和“重映射期 (Remapped)”，每个时期由躯体调谐模式的独特加载属性定义（图 4A 和图 S14, A 至 C）。为了评估沿树突分叉的重映射动力学空间分布，我们随后追踪了在这些时期中熟悉调谐曲线和新调谐曲线的幅度，并将其绘制为与躯体路径距离的函数。在奖励位置转移后，新的空间调谐在“之前期”优先出现在近端树突中，早于躯体重映射的开始。这种空间偏好在奖励切换之前的“熟悉期”就已经存在，表明未来的躯体调谐特征预先存在于树突亚阈值动力学中。相比之下，在语境切换后，新调谐在“之前期”出现在远端树突中（图 4, B 和 C，以及图 S15）。这些初始的空间不对称随后伴随着额外树突区室的征集，导致随着学习的进行，调谐在空间上变得更加均匀。在树突中观察到的空间梯度与相应行为条件下超阈值调谐的演变一致，并进一步揭示了在躯体表征重组之前且能预测该重组的预测性特征。
接下来我们询问单个树突是经历类似的转换，还是表现出截然不同的、区室特异性的时间动力学。我们发现，与由新 PF 的同步上调和熟悉 PF 的下调所代表的躯体重映射并行，树突的熟悉和新 TC 表现出独特的时间演变（图 4D）。通过对这一联合进展进行层次聚类，我们识别出三种主要模式（图 4E）。值得注意的是，具有独立调谐的树突优先表现出新空间表征的早期上调，这表明这些区室可能会启动重映射。
最后，我们研究了树突如何快速产生新的空间调谐。一个基于 NMF 衍生潜在嵌入训练的 k-最近邻解码器（图 4, F 和 G，以及图 S16）重现了近端树突在奖励转移期间的主导作用，并进一步揭示了树突活动在行为改变之前偶尔能预测未来的躯体调谐状态（图 4, H 和 I）。具体而言，当解码器无法匹配当前躯体状态时，树突活动表现出未来 PF 表征的增加，进一步表明即将到来的躯体调谐特征已经存在于树突子群中。这些发现揭示了树突亚阈值活动中的一种潜在组织方式，其中未来的躯体表征已经嵌入在持续的信号中，并以依赖语境的方式与躯体活动保持一致。
尖波-波纹（SWRs）期间的分室化树突动力学
先前的研究表明，在 SWRs 期间，位置细胞和非位置细胞具有截然不同的活动动力学 (32–34)。为了确定这种区别是否延伸至 CA3 的树突动力学，我们将躯体-树突电压成像与对侧 CA1 的局部场电位记录相结合（图 S17A）(35, 36)。在 SWRs 期间，位置细胞表现出比非位置细胞更高的躯体放电率和树突快速脉冲率（图 S17B）(33, 34)，尤其是在基底和顶端分室中。此外，位置细胞在 SWRs 期间表现出更高比例的活跃树突分支（图 S17C）(18)，表明树突招募更为广泛 (37)。接下来，我们检查了相对于 SWR 峰值，不同树突区域脉冲的时间结构。基底和顶端树突的脉冲时间比其他区域早，且相对于 SWR 峰值更早（图 S18A），且近端 ROI 的脉冲早于远端 ROI（图 S18B），这与靶向近端树突并促使 SWR 生成的循环输入一致 (38–40)。为了表征 SWRs 期间的亚阈值电压动力学，主成分分析和层次聚类识别出三类事件：去极化事件、超极化事件和非调制事件（图 S17, D 和 E）。近端树突波形比远端树突波形更接近躯体波形（图 S19A），这与近端分室中更强的躯体-树突耦合一致。去极化事件在位置细胞的基底和顶端树突中发生频率更高，而与非位置细胞相比，位置细胞在各树突区域的超极化事件发生频率较低（图 S17F），表明 SWRs 期间树突去极化增强且抑制降低。为了进一步评估突触输入的贡献，我们分析了缺乏同步躯体去极化的 SWRs。在这种条件下，位置细胞的树突仍表现出比非位置细胞更大的去极化和更多的去极化事件（图 S19, B 至 D），表明这既有树突兴奋性提升的贡献，也有输入端不同的兴奋-抑制平衡的影响。最后，我们探讨了空间导航期间的树突动力学是否能预测 SWRs 期间的协调性。在导航期间具有高度相关空间调谐的树突 ROI 对，在 SWRs 期间表现出比弱相关对更相似的脉冲计数动力学和亚阈值活动（图 S17, G 至 I），表明空间共调谐的树突在随后的 SWRs 中保留了协调的动力学。
讨论
我们对哺乳动物皮层锥体神经元的树突功能进行了深入分析，通过对行为动物亚细胞分室的双光子电压成像进行了评估。结果为单个 CA3PNs 中亚细胞表征的体内动力学提供了新见解（图 S20）。我们提供了体内证据，证明不同的树突计算支持目标导向的导航和上下文表征。独立于躯体的树突活动使得空间、奖励和上下文的亚细胞表征能够形成并维持，且与躯体输出呈条件性耦合。这种机制可能使树突不仅能表征在线（当前）的环境特征和任务变量，还能保留（过去）近期奖励位置的记忆，或在全局环境上下文中领先于（未来）躯体输出的重映射。
在超阈值水平上，胞体-树突耦合（somatodendritic coupling）会根据行为需求灵活地重新配置，从而在单个 CA3 锥体神经元（CA3PNs）内部产生截然不同的重组基元。在奖励转移范式中，重组遵循离心模式，这可能为在保留广泛空间上下文的同时快速更新显著的局部信息提供了一种高效策略。相比之下，在全局上下文切换期间，重组表现出由树突驱动的向心模式，其中远端树突在胞体重新映射之前就表达了新的表征。综合而言，这些观察结果表明，胞体-树突耦合的程度和重组的方向性均受到行为上下文的动态调节，揭示了一种灵活的单神经元机制，支持空间表征的快速更新和从头形成。与这种灵活的组织一致，在空间导航期间观察到的树突活动模式在随后的尖波-涟漪（SWRs）期间得以维持。这些活跃且协作的树突动态可能支持记忆的重新激活以及位置细胞活动模式的巩固。
除了超阈值电压动态之外，我们对亚阈值膜电位（Vm）的分析揭示了另一层将局部活动与胞体输出联系起来的树突计算。在胞体 PF（主发放）之前出现的树突亚阈值动态可以预测胞体空间调谐在每次试验中的变异性，这表明树突活动编码了塑造随后胞体输出的潜在结构。此外，我们发现了一种独特的胞体-树突协调模式，在这种模式中，树突去极化在毫秒时间尺度上早于胞体激活，并且在集体作用下，可以在行为时间尺度上驱动胞体 PF 活动。
3.0
B C
G
Soma (胞体)
soma (胞体)
soma (胞体)
Soma (胞体)
Soma (胞体)
Soma (胞体)
Soma (胞体)
Soma (胞体)
Lap # (圈数 #) 20 soma (胞体) basal (基底)
2.0
2.0
Lap # (圈数 #)
Lap # (圈数 #)
Familiar (熟悉) During (期间) Remapped (重新映射)
Remapped (重新映射)
Remapped (重新映射)
Familiar (熟悉)
Familiar (熟悉)
During (期间)
During (期间)
Remapped (重新映射)
Remapped (重新映射)
Familiar (熟悉)
Familiar (熟悉)
During (期间)
During (期间)
Remapped (重新映射)
Remapped (重新映射)
Familiar (熟悉)
During (期间)
Familiar (熟悉)
During (期间)
Familiar (熟悉)
Remapped (重新映射)
Familiar (熟悉)
Remapped (重新映射)
Familiar (熟悉)
Remapped (重新映射)
Lap # (圈数 #) 20 Lap # (圈数 #) 20 Lap # (圈数 #) 20 tuft (簇) apical (顶端)
Before (之前)
Before (之前)
Before (之前)
Before (之前)
Before (之前)
Before (之前)
Before (之前)
Before (之前)
Position (m) (位置 (米))
0 3 Position (m) (位置 (米))
0.3
-0.3
F
Familiar TC (熟悉 TC)
Familiar TC (熟悉 TC) Upregulation of (上调)
Familiar TC (熟悉 TC)
Novel TC (新颖 TC)
Novel TC (新颖 TC)
Novel (新颖)
Magnitude of TC (z-scored W) (TC 幅值 (z-score W))
Magnitude of TC (z-scored W) (TC 幅值 (z-score W))
dend (树突)
dend (树突)
-1
-1
1.0
1.0
-1
-1
-1.0
-1.0
1.0
*
*
*
E Pattern 1 (模式 1) Pattern 2 (模式 2) Pattern 3 (模式 3) *
Change from Familiar (与熟悉状态相比的变化)
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
-0.2
0.2
0.1
-0.1
Before (之前) -During (期间)
Before (之前) -During (期间)
Before (之前) -During (期间)
0.8
0.8
0.6
0.6
0.6
0.4
0.4
0.4
Global context Switch (全局上下文切换)
0.8
0.8
0.8
0.6
0.6
0.6
0.4
0.4
0.4
Reward translocation (奖励易位)
Reward translocation (奖励易位)
Correct (正确)
Failed (失败)
Correct (正确)
Failed (失败)
Reward translocation (奖励易位)
I
* 0.6
0.4
奖励移位 (Reward translocation)
0.25
0.8
0.4
比例 (Fraction)
0.6
0.4
之后 (After)
奖励移位 (Reward translocation)
0.25
0.0
w / iso-TC
wo / iso-TC
之前 (Before) 之后 (After)
之前 (Before) 之后 (After)
图 4. 与不同行为范式中胞体重映射相关的树突中分区特异性亚阈值协调。(A) 奖励移位（左）启动的胞体位置场 (PF) 重映射过程中，树突及其亲本胞体的亚阈值活动热图。从热图中提取的代表性胞体调谐曲线 (TC)（右）。重映射时期分为：“熟悉期 (Familiar)”（基线圈数）；“之前 (Before)”（奖励移位或情境切换后，胞体 PF 形成前）；“期间 (During)”（PF 形成后，但在稳定前）；以及“重映射后 (Remapped)”（新 PF 稳定后）（见材料与方法和图 S13）。(B) 在每个重映射时期中，与胞体中新稳定曲线相同的树突 TC 幅度 (W) 随距胞体距离的变化函数（上图：奖励移位；下图：全局情境切换）。实线代表线性回归拟合及 95% 置信区间（奖励移位：熟悉期，R = −0.25, P = 0.03；之前，R = −0.23, P = 0.044；期间，R = −0.12, P = 0.314；重映射后，R = −0.07, P = 0.562。全局情境切换：熟悉期，R = 0.02, P = 0.907；之前，R = 0.37, P = 0.002；期间，R = −0.12, P = 0.344；重映射后，R = −0.05, P = 0.682）。虚线表示熟悉期期间幅度的平均值。标记形状对应于树突区域（基底：正方形；顶端：十字形；簇状：倒三角形）。(C)（左）按每个区域分类的 (B) 的箱线图（红色：胞体；绿色：基底；天蓝色：顶端；紫色：簇状树突）。（右）熟悉环境期间被识别为 PF 的 TC 幅度的箱线图。其随距胞体距离变化的散点图见图 S14。(D) 重映射过程中，按每个树突转换分类的新型 TC 和熟悉 TC 幅度的箱线图。(E)（左）在奖励移位中识别的树突重映射模式（见材料与方法）。黄色和紫色分别表示新型和熟悉 TC。（右）在熟悉虚拟现实环境中，具有局部 TC (w / iso- TC, 42 个树突 ROI) 和不具有局部 TC (wo / iso- TC, 29 个树突 ROI) 的树突之间重映射模式的比例 ($\chi^2$ 检验; $\chi^2(1, 71) = 13.64, P < 0.0001$)。(F) 用于 k-最近邻 (kNN) 解码的胞体和树突 TC 的基于 NMF 的潜嵌入，采用 UMAP 进行 3D 可视化。颜色标尺表示圈数进度，从蓝色（早期圈数）到红色（晚期圈数）。(G) 每个区域的 kNN 解码器性能随圈数变化的图表。(H) 新型或熟悉 TC 幅度的比较，包括树突 TC [熟悉环境期间的正确与失败预测 (pred.)] 和胞体 TC（重映射前与后）。统计分析使用方差分析进行 (熟悉 TC: F(3,2175) = 94.97, P = 9.28 \times 10^{-58}, 新型 TC: F(3, 2175) = 148.23, P = 1.66 \times 10^{-87})。(I) (H) 中所有分类 TC 的平均波形。
熟悉期 (Familiar) 之前 (Before) 期间 (During) 重映射后 (Remapped)
新型 TC 幅度 (W) (Magnitude of Novel TC (W))
新型 TC 幅度 (W) (Magnitude of Novel TC (W))
r = -0.25 r = -0.23 r = -0.12 r = -0.07
2 $\Delta$F/F (Z)
200 0 400
r = 0.02 r = 0.37 r = 0.12 r = -0.05
1 0 2 3
200 0 400 200 0 400 200 0 400
距胞体距离 ($\mu$m) (Distance from soma ($\mu$m)) 200 0 400 200 0 400 200 0 400 200 0 400
下调 (Downregulation of)
1 圈数 # (Lap #)
早期 (early) 晚期 (late)
潜变量 1 (Latent 1)
潜变量 2 (Latent 2)
TC 幅度 (W) (Magnitude of TC (W))
TC 幅度 (W) (Magnitude of TC (W))
45% 36% 19%
5% 45% 50%
10 20 30 40 0
顶端 (Apical) 6
10 20 30 40 0 10 20 30 40 0
熟悉 TC (Familiar TC) 新型 TC (Novel TC)
熟悉 TC (Familiar TC) 新型 TC (Novel TC)
树突 (Dend) (失败) (Failed) 树突 (Dend) (正确) (Correct)
树突 (Dend) (失败) (Failed) 树突 (Dend) (正确) (Correct)
TC 幅度 (W) (Magnitude of TC (W)) TC 幅度 (W) (Magnitude of TC (W))
基底 (Basal) 2
10 20 30 40 0 奖励移位 (Reward translocation)
顶端 (Apical) 8
0.75
0.75
0.50
0.50
归一化幅度 (norm. amplitude)
距 PF 峰值位置 (cm) (Position (cm) from peak of PF) -50 0 50 -50 0 50
胞体 (soma) 基底 (basal) 顶端 (apica) 簇状 (tuft)
树突 (Dend) (预测失败) (Failed pred.)
Dend （正确预测值）
Soma Dend
在群体水平上，海马体的空间地图是由位置细胞（place cells）结构化、序列化集群的协调活动而产生的。因此，单个位置细胞的体质树突活动动力学应在这一网络级组织框架内进行最佳解读。我们推测，我们观察到的树突活动具有位置特异性且在时间上脱节的预测能力（图 1, G 至 L），可能反映了网络级序列在树突内的整合。事实上，在细胞水平上，单个树突已被证明能接收组织化且序列化的突触输入 (41)。这种整合可以提供关于动物当前位置的指导性信号，随后演变为随后的体细胞 PF。这一视角可以将群体水平的细胞集群与局部树突处理（突触集群）联系起来，表明单个 PF 并非孤立的单元，而是环境一个更大的序列表征的协调组件。
在响应环境变化进行重组时，树突亚阈值模式可预测随后的体细胞重映射。在奖励位置转移期间，未来空间调谐的特征在环境变化之前就已经存在于树突亚阈值动力学中。由于在奖励转移过程中环境结构被部分保留，预先存在的树突表征可以与输入信号相互作用以塑造重组，使输入通路的平衡向体细胞和近端树突输入倾斜，而非远端由内嗅皮层驱动的输入。总的来说，这些发现表明，树突亚阈值活动构成了一个多时间尺度的底质，它整合了过去、当前和前瞻性的表征，动态地组织这些信号以塑造体细胞输出，同时保持灵活性。尽管树突电信号与体细胞输出之间动态分离和耦合的潜在机制仍有待确定，但生物物理机制 (42) 和亚细胞域特异性的 $\gamma$-氨基丁酸 (GABAergic) 释放抑制可能在调节体质树突峰值耦合和重映射中发挥作用 (43–47)。
这些观察结果为长期以来关于树突作为条件独立处理单元的假设提供了有力证据 (2, 48, 49)。本研究揭示的多样化体质树突动力学通过实现并行输入处理和信号整合，增强了 CA3 锥体神经元 (CA3PNs) 的计算能力。尽管树突事件的具体生物物理性质仍需通过未来的研究来确定，但本研究为树突自主性提供了经验支持，并强调了其在单神经元灵活特征选择中的作用。我们的结果进一步将亚阈值动力学定位为记忆形成过程中动态神经表征的底质，揭示了一个塑造神经计算的高维组织层。这一原理可能会延伸到海马体和锥体神经元之外，为理解一般的神经计算提供一个更广泛的框架。
参考文献与注释
S. Kim, S. J. Guzman, H. Hu, P. Jonas, 《自然神经科学》(Nat. Neurosci.) 15, 600–606 (2012).
S. V. Rolotti, H. Blockus, F. T. Sparks, J. B. Priestley, A. Losonczy, 《神经元》(Neuron) 110, 977–991.e4 (2022).
致谢 我们感谢 F. Polleux, B. Y. Rao, T. Mihaila 和 A. Shah 对手稿早期版本的评论。共聚焦成像得到了 Zuckerman 研究所细胞成像平台的支持。资助：本工作得到了人类前沿科学计划 (HFSP) 奖学金 LT0003/2024- L (DOI: 10.52044/HFSP.LT00032024- L.pc. gr.194283) 以及日本学术振兴会 (JSPS) 海外研究员奖学金对 A.N. 的资助；得到了脑与行为研究基金会对 S.T. 的资助；得到了美国国家精神卫生研究所 R01MH124047 和 R01MH124867、美国国家老龄化研究所 RF1AG080818、美国国家神经疾病和中风研究所 (NINDS) 脑计划 U01NS115530，NINDS R01NS121106，NINDS R01NS131728 以及 NINDS 脑计划 R01NS133381 对 A.L. 的资助；得到了 Klingenstein-Simons 神经科学奖学金、McNair 医学基金会、Welch 基金会 grant Q- 2016- 20190330, NIH R01EB027145, U01NS113294, U01NS118288, U01NS133971 和 R01NS136027 对 F.S.- P. 的资助；以及得到了 2025- 3.1.1- ED- 2025- 027, 2025- 1.3.3- NEURO- 2025- 01, NKKP Excellence 153978, 2025- 3.1.1- ED- 2026, 2020- 2.1.1- ED- 2021- 00190, 2020- 1.1.3- IPARJOG- 2023- 00477, 2020- 2.1.1- ED- 2022- 00208, 2021- 1.1.4- GYORSÍTÓSÁV- 2022- 064, 2022- 2.1.1- NL- 2022- 00012, 2022- 1.1.1- KK- 2022- 05 Demján Sándor, 2024/1+1/2598, 2020- 1.1.5- GYORSÍTÓSÁV- 2021- 04, 以及 GINOP_PLUSZ- 2.1.1- 21- 2022- 0143 对 B.J.R. 的资助。作者贡献：概念化：A.N., S.T., A.L.；数据整理：A.N., S.T.；形式分析：A.N., S.T.；资金获取：A.N., S.T., F.S.- P., B.J.R., A.L.；调查：A.N., S.T., A.L.；方法论：A.N., G.N.Z., S.T., C.O’T., L.R., M.A.L., B.J.R., F.S.- P., A.L.；项目管理：B.J.R., F.S.- P., A.L.；资源：F.S.- P., M.A.L., A.L.；软件：A.N., S.T.；监督：B.J.R., F.S.- P., A.L.；验证：A.N., S.T.；可视化：A.N., S.T.；初稿撰写：A.N., S.T., A.L.；审阅与编辑：所有作者。竞争利益：F.S.- P. 持有一项关于电压传感器设计的美国专利，涵盖了本研究中使用的电压指示剂 JEDI3sub (专利号 US9606100 B2, “用于测量膜电位和成像高频神经元电活动的荧光蛋白电压传感器”)。F.S.- P. 因电压传感器开发和应用的一般方面工作获得了 Flagship Pioneering 的咨询费；这些活动与此处报告的特定研究无关。B.J.R. 是 Femtonics 的创始人及其科学顾问委员会成员。数据、代码和材料可用性：本研究包含的数据集在发表后可通过 Dryad (50) 获取。许可信息：版权所有 © 2026 作者，保留部分权利；独家许可方为美国科学促进会。不对美国政府原始作品主张权利。https://www.science. org/about/science- licenses- journal- article- reuse
补充材料 science.org/doi/10.1126/science.aeh9302 材料与方法；图 S1 至 S20；MDAR 可重复性清单
基于结构与进化的 极小 RNA引导核酸酶的设计
Petr Skopintsev1,2†, Isabel Esain- Garcia1,2†, Evan C. DeTurk1,2†‡, Peter H. Yoon1,3, Zehan Zhou1,3, Trevor Weiss4, Maris Kamalu4, Ajit Chamraj1,3, Kenneth J. Loi1,2, Conner J. Langeberg1,2, Ron S. Boger1,2,5, Hunter Nisonoff6, Hannah M. Karp1,7, Lin-Xing Chen8§, Honglue Shi1,2, Kamakshi Vohra1,2¶, Jillian F. Banfield1,8,9, Jamie H. D. Cate1,2,3,5,10, Steven E. Jacobsen4,11, Jennifer A. Doudna1,2,3,5,10,12,13,14,15*
设计不受进化限制的 RNA-guided nucleases（RNA引导核酸酶）可以扩展可编程的基因组编辑能力。然而，产生具有强健酶特性的多样化多域蛋白质仍然具有挑战性。在这里，我们采用了一种蛋白质设计策略，将结构引导的反向折叠模型与基于进化的残基约束相结合，以产生 TnpB（一种极小的类 CRISPR-Cas12 核酸酶）的活性且具有差异性的变体，称之为 SynTnpBs。对人工智能生成的变体进行高通量筛选，得到了在细菌、植物和人类细胞中保留或超过野生型活性的编辑器。通过冷冻电子显微镜对最具差异性的变体进行结构测定，揭示了在不同构象中 RNA-DNA 界面上具有稳定作用的接触，证明了该方法的设计潜力。总之，这些结果确立了一种创建非天然 RNA-guided nucleases 以及构象活性核酸结合剂的策略，扩大了可设计的蛋白质空间。
CRISPR-Cas 系统通过实现可编程的、序列特异性的 DNA 和 RNA 靶向，彻底改变了基因组编辑，为精确的遗传和表观遗传扰动奠定了基础 (1–7)。蛋白质设计具有扩展这些能力的潜力，可以通过创建在自然界中未观察到的具有特定功能和特性（包括序列和结构）的 RNA-guided nucleases 来实现。
然而，此类设计尤其具有挑战性，因为这些核酸酶是多域核酸结合剂，其活性依赖于由不同构象状态协调完成的 RNA 和 DNA 识别、激活及切割 (8–11)。基于序列的生物语言模型 (LMs) 通过在进化数据上进行训练并推断序列-功能关系，可以产生 RNA-guided nucleases，但即使在广泛的后验过滤后，它们产生的活性核酸酶通常仍与训练所用的参考序列高度相似 (12, 13)。结构引导的理性设计方法提供了一种鲁棒的策略，用以采样高度差异化的蛋白质序列，以及自然界中不存在的结构，甚至延伸至从头设计 (14–19)。尽管这种方法在产生动态开关和 DNA 结合剂方面取得了成功 (20–22)，但复杂酶的设计，例如
1加州大学伯克利分校创新基因组研究所，伯克利，CA，美国。 2加州定量生物科学研究所 (QB3)，加州大学伯克利分校，伯克利，CA，美国。 3加州大学伯克利分校分子与细胞生物学系，伯克利，CA，美国。 4加州大学洛杉矶分校分子、细胞与发育生物学系，洛杉矶，CA，美国。 5加州大学伯克利分校生物物理研究生组，伯克利，CA，CA，美国。 6加州大学伯克利分校计算生物学中心，伯克利，CA，美国。 7加州大学伯克利分校化学系，伯克利，CA，美国。 8加州大学伯克利分校地球与行星科学系，伯克利，CA，美国。 9莫纳什大学生物医学发现研究所微生物学系，克莱顿，维多利亚，澳大利亚。 10分子生物物理学
以及综合生物成像部门，劳伦斯伯克利国家实验室，美国加利福尼亚州伯克利。11霍华德·休斯医学研究所 (HHMI)，加州大学洛杉矶分校，美国加利福尼亚州洛杉矶。12霍华德·休斯医学研究所，加州大学伯克利分校，美国加利福尼亚州伯克利。13李嘉诚基因组工程中心，加州大学伯克利分校，美国加利福尼亚州伯克利。14格拉斯顿数据科学与生物技术研究所，美国加利福尼亚州旧金山。15格拉斯顿-UCSF基因组免疫学研究所，美国加利福尼亚州旧金山。*通讯作者。电子邮件：doudna@ berkeley. edu †这些作者对本工作做出了同等贡献。‡现地址：剑桥大学历史与科学哲学系，英国剑桥。§现地址：中国科学技术大学环境学院，国家先进环境技术重点实验室，中国合肥。¶现地址：耶鲁大学生物化学、定量生物学、生物物理学和结构生物学方向，美国康涅狄格州纽黑文。
我们认为，反向蛋白质折叠模型 (17–19) 这种以结构为条件的方案，结合进化信息，可以在保留功能的同时产生高度多样化的蛋白质。为了测试这种设计策略的潜力，我们选择了 TnpB，这是一个多样化的转座子编码小蛋白家族，是 CRISPR-Cas12 核酸酶的祖先，这些核酸酶在所有生命领域中介导 RNA 引导的 DNA 切割、转录调节和基因组定点（23–29）。这些特性使得 TnpB 成为探索非自然进化产生的 RNA 引导核酸酶的极具前景的支架。
使用 ESM-IF1 进行 TnpB 的进化与结构条件反向折叠 我们首先通过计算机模拟评估了 ESM 反向折叠 (ESM-IF1) 模型 (18) 是否能够重新设计极简的 RNA 引导核酸酶 ISDra2 TnpB，以创建具有非自然序列的功能酶。ESM-IF1 生成的序列准确地重现了由 AlphaFold2 (30) 预测的输入折叠（图 1A 和图 S1A），保留了 RuvC 结构域中的 DED 催化三联体（图 1B 和图 S1B），并捕捉到了在天然同源物中发现的氨基酸变异（图 S1, C 和 D）(18)。相比之下，LigandMPNN (19, 31) 虽然重现了 TnpB 折叠，但在所有模型生成温度下都未能维持催化三联体。
系统发育分析显示，ESM-IF1 序列处于一个与天然 TnpB 不同的分支中（图 1C），与该分支基部的 ISDra2 TnpB 仅有 50 到 60% 的一致性（图 S1, E 和 F）。该模型在 DNA-RNA 界面产生了化学保守的替换（图 1B）。然而，它还在 K76、F77 和 T123 残基处引入了非同义突变，已知这些残基介导对转座子相关基序 (TAM) 序列的核碱基特异性识别 (32)；TAM 是一种短 DNA 基序，类似于 CRISPR-Cas9 (1) 的前间隔序列临近基序 (PAM)，用于启动 TnpB 的激活。同样，与野生型 (WT) ISDra2 TnpB 不同的残基替换发生在蛋白质及其引导 RNA（对于 TnpB 而言为 reRNA）的界面上。这表明 ESM-IF1 捕捉到了 TnpB 的折叠和催化 DED 基序，并部分恢复了核酸结合残基，但在缺乏同源 RNA-DNA 环境的情况下，错误分配了一些接触位置。
因此，我们探索了目标条件化（targeted conditioning），以强化功能性的蛋白质-RNA 和蛋白质-DNA 接触。通常，反向折叠模型会固定在实验解析的结合配体定义半径内的残基 (33)。然而，对于 TnpB，49- kDa 的 RNA-DNA 异质双链通过一个巨大的界面与 46- kDa 的蛋白质结合，这需要固定许多残基，从而给重新设计留下的空间很小。此外，对于像 RNA引导核酸酶这样的动态蛋白质，现有的冷冻电子显微镜 (cryo-EM) 结构 (32, 34) 可能会遗漏瞬时的蛋白质-DNA/RNA 接触，这可能导致无法固定所有对功能至关重要的残基。
为了解决这一问题，我们开发了一种用于反向折叠的掩码策略（masking strategy），该策略引入了来自进化数据的功能关键残基。源自物理学中 Potts 模型的两两进化耦合（Pairwise evolutionary couplings）一直以来在推断残基接触、指导蛋白质结构预测、预测蛋白质-蛋白质接触以及评估突变效应 (35–38) 方面发挥着基础性作用。之前的生物信息学研究表明，DNA 和 RNA 结合残基可以通过以下方式识别：
i
i
i
ESM-IF1
ESM-IF
DNA
C D
ISDra2
图 1. 利用 ESM 逆折叠 (ESM-IF1) 模型的 RNA引导核酸酶 TnpB 设计策略。(A) ESM-IF1 生成的序列通过 AlphaFold2 (30) 能够一致地折叠成 ISDra2 TnpB 结构。(B) ESM-IF 返回的 RuvC 催化残基与野生型 (WT) 相似，而那些与核酸结合的残基在 WT 和 ESM-IF 序列之间存在差异。(C) 进化分析显示，ESM-IF1 生成的序列聚集在一个独特的演化支中，反映出与天然 TnpB 的显著差异。自举支持率 (bootstrap support) ≥90% 的节点用灰色点标记。(D) 为了在生成的序列中保留 ISDra2 TnpB 特有的核酸结合残基，ESM-IF 模型的条件设定基于 WT 残基，且其位置保守性 $C_i$ 或与配体核酸的共进化耦合强度 $\sigma_i$ 需高于选定的阈值。通过提高 $(C_i, \sigma_i)$ 阈值，与 WT ISDra2 TnpB 的差异逐渐增大，最终产生完全不受约束的序列。随后计算选定参数下的共识序列并测试其活性。
共识 (Consensus)
天然 TnpBs
结构 (Structure)
进化 (Evolution)
ESM 逆 折叠 (Inverse Folding)
生成的序列
共识 (Consensus)
位置保守性 $C_i$
WT
测试 (Test)
$C_i$
耦合强度
位置保守性或进化耦合 (39, 40)。因此，我们从天然 TnpB 的多序列比对中导出了 TnpB 残基 $i$ 的位置保守性 $C_i$ 值，并从 Potts 模型 (GREMLIN) (37) 中导出了耦合信号 $\sigma_i$；该模型基于从基因组数据库中挖掘的配对 TnpB–RNA 或 TnpB–DNA 序列进行训练（见材料与方法以及图 S2）。超过给定 $C_i, \sigma_i$ 阈值 $C_0, \sigma_0$ 的残基在 ISDra2 TnpB 中被固定为其 WT 身份，从而产生用于条件化 ESM-IF1 生成的序列掩码。通过改变阈值 $C_0, \sigma_0$，可以有效地调节输入模型的结构信息与进化信息之间的平衡（图 1D）。我们进一步发现，生成序列的共识平均值比单个序列具有较低的模型困惑度 (perplexity)，这表明其折叠兼容性更好，且可能具有更高的活性概率（图 S3）。
输入 (Input)
高通量细菌筛选鉴定出活性变体 我们的设计目标是通过实验确定哪些 $(C_0, \sigma_0)$ 组合能产生具有活性的核酸酶，同时尽量减少固定残基的数量，从而最大限度地扩大采样序列空间并探索合成 TnpB 的多样性。为了最大化活性蛋白的生成率，我们测试了在每个 $C_0$ 或双重 $(C_0, \sigma_0)$ 条件下，由 10,000 次 ESM-IF1
WT 残基 AI 生成残基 DNA RNA
AF2 模型
WT TnpB
生成次数导出的共识序列。为了筛选生成的 TnpB 变体的活性，我们采用了细菌测定法，其中细胞恢复率与 TnpB 介导的携带 ccdB 毒素基因质粒的切割成正比 (41)（图 2, A 至 C）。
通过点铺板法测试在一系列保守性 ($C_i$) 阈值 ($C_0$) 和模型温度 (T) 下生成的全长蛋白，我们观察到在 $C_0 = 0.25$ 和 0.35 时的三个变体表现出活性，其生存水平为 $10^3$ 至 $10^4$ 菌落形成单位 (CFU)/μg，尽管低于 WT ($C_0 = 0.0$) 的 $10^6$ CFU/μg（图 2D）。我们假设，由于 TnpB 是多域蛋白，不同的叶片 (lobes) 可能无法耐受同等的突变深度，或者无法达到相似的生成成功率。因此，我们实施了一种分域策略，将生成的 DNA 结合域和 RNA 结合域（分别称为 REC 和 NUC）分别进行实验测试。
受此前应用于 CRISPR-Cas9 工程 (42) 的领域交换策略启发，我们将人工智能 (AI) 生成的 lobe 与其野生型 (WT) 对应部分融合，以便对其进行单独评估（图 2, E 和 F）。支持我们的假设，这些 lobe 对序列分歧表现出不同的耐受性。在 $C_0 = 0.25$ 时，仅有一种 AI 生成的 REC-lobe 变体在与 WT 融合时具有功能。
Output 模型
Conditioned on the mask 基于掩码
WT residues mask WT 残基掩码 ($C_i$
阈值)
Protein residue i 蛋白质残基 $i$ RNA
Steering ( ) thresholds 引导 ( ) 阈值
Sampling sequence space 采样序列空间
B
DNA REC 结构域 (REC lobe)
E F
G
图 2. 基于位置保守性 (Ci) 和耦合强度 (σi) 阈值筛选 AI 生成的 SynTnpB 变体。(A) TnpB 的分叶设计（以 8EXA 模型描绘）允许对 REC 和 NUC 结构域进行组合测试。表达 TnpB 变体的质粒通过电穿孔导入携带阿拉伯糖诱导毒素 (pBAD-ccdB) 的大肠杆菌细胞中。活性变体切割毒素质粒，使其能够在选择性琼脂培养基上存活。(B) 通过点样法 (spot plating)（上图）或结合高通量测序的混合细菌筛选（下图）评估活性。方程项表示初始转化库 (P0)、选择平板 (S) 和非选择平板 (R) 中每个生成的变体表达质粒的丰度。A 表示转化和生长偏差，F 表示与毒素质粒切割相关的选择适应度。(C) 两个实验重复中生成变体的 Log10 富集度。数据经过归一化处理，使得参考 WT ISDra2 TnpB 的富集度 = 1。富集度与 WT 相似性的关系见图 S4。(D) 在两种 ESM-IF1 采样温度下，跨 Ci 阈值生成的全长变体的活性。柱状图显示三个重复的平均值 ± 标准差 (SD)。(E 和 F) 分别测试 REC (E) 和 NUC (F) 结构域及其对应 WT 的切割活性。(G) 基于 (Ci, σi) 阈值组装的 REC 和 NUC 结构域中，顶端变体（在 (C) 中测试了 1980 个）的回收情况。(H 和 I) 热图显示 AI 生成的 REC (H) 和 NUC (I) 结构域在 (Ci, σi) 阈值上的富集情况，是对所有融合组合的平均值。
I
WT
0 0
TnpB 活性测量
reRNA NUC 结构域
101 102 103 104 105 106 107 108
10-1
10-2
10-3
结合测序的高通量读出
重复 2 富集度 F
10-3 10-2 10-1 100 101
重复 1 富集度 F
v9
v4
v2
v8
v6
我们接下来评估了代表性SynTnpB变体（v1至v9）的基因组编辑活性，这些变体涵盖了高活性以及 77 到 91% 的序列多样性，并在人类胚胎肾 293T (HEK293T) 细胞中，利用生物学重复进行了内源性蓝色荧光蛋白 (BFP) 基因敲除分析（图 3A 和图 S7），同时将 WT ISDra2 作为对照。WT 酶的平均编辑率为 28%。变体 v2 至 v4 以及 v6 至 v8 显示出与 WT 相当的数值。
v3
v7
v5
图 3. AI 生成的 TnpB 在 HEK293T 细胞中的基因组编辑。(A) 将编码变体蛋白和相应引导 reRNA 的质粒共转染至 HEK293T 细胞中。 编辑效率通过以下方式评估：(B) 通过流式细胞术测量的 BFP 基因敲除，或 (C) 对内源性位点 (RUNX1, NIBAN1, EMX1, AGBL1) 插入缺失 (indels) 的 NGS 定量。统计显著性使用双尾 Welch's t 检验确定。数据以平均值 ± 标准差 (n = 3) 表示。ns，不显著；P 值：ns > 0.05, P ≤ 0.05, P ≤ 0.01, P ≤ 0.001, **P ≤ 0.0001。 UTC：未转染对照；NTG：非靶向引导。
范围在 23 到 32% 之间。值得注意的是，v1 和 v5 的编辑效率相对于 WT 增幅最高，数值分别为 46% (P < 0.001) 和 50% (P < 0.001) (图 3B)。这些结果证实了活性且多样化的变体被成功生成。
接下来，为了评估可编程性和编辑潜力，我们靶向了内源性人类和植物基因组位点。在 HEK293T 细胞中，AI 生成的 TnpB 靶向了之前研究过的四个内源性基因 RUNX1, NIBAN1, EMX1 和 AGBL1 (23, 43)，并通过二代测序 (NGS) 计算插入和缺失 (indels) 的百分比。虽然大多数变体表现出与 WT 类似的活性，但 v1 和 v5 在所有测试位点中再次成为最活跃的变体。变体 v1 对 EMX1, AGBL1, NIBAN1 和 RUNX1 的编辑率分别为 26, 26, 28 和 21%，而 v5 为 21, 20, 24 和 35%，相比之下，WT 为 7, 18, 25 和 30% (图 3C)。值得注意的是，在 EMX1 位点，v1 和 v5 相较于 WT 分别显示出 3.8 倍和 3.1 倍的增长 (v1 P < 0.0001, v5 P < 0.01)。在 AI 设计的变体与 WT ISDra2 TnpB 之间未观察到编辑窗口的显著差异 (图 S8)。
我们随后使用全基因组 Tn5 标记切分分析 (材料与方法) 评估了 AI 设计变体的特异性。变体 v1 表现出与 WT 相当的特异性，而 v5 和 v7 具有更多可检测的脱靶位点。所有变体均保留了经典的 TTGAT TAM 偏好 (图 S9 和 S10)。在 HEK293T 和大肠杆菌 (Escherichia coli) 中的蛋白质印迹 (Western blot) 分析表明，不同变体之间的表达差异与编辑活性不相关 (图 S11A)。使用体外切割分析的生物化学表征显示，v7 保留了强大的靶链切割活性，尽管其动力学相对于 WT 有适度降低 (图 S11B)。基于圆二色性的热变性分析显示，v7 表现出与 WT 相当的热稳定性，其熔解温度为 51.2°C (图 S12) (32)。
由于其体积微小，TnpB 非常适合通过病毒载体递送进行植物基因组编辑 (44)。因此，我们通过靶向 AtPDS3 基因的四个不同位点，在拟南芥原生质体细胞中测试了选定的九个变体。与 HEK293T 的结果一致，v1 在几乎所有测试靶点上的表现均优于 ISDra2 (图 S13 和 表 S1)。
构象动态为 SynTnpB 活性提供了机制见解
在我们的细胞实验中，高度发散的变体 v7 表现出最高的绝对编辑效率（RUNX1 为 44%；图 3C）。该变体与野生型 (WT) 的序列一致性为 77%（不包括对活性可有可无且保持固定的无结构 C 端；REC 叶为 83%，NUC 叶为 72%）。与我们的设计目标一致，v7 中约四分之一的残基是由进化条件约束的 ESM-IF1 模型生成的，共计 85 个位置。其中许多残基与掩蔽的 WT 残基一起排列在核酸界面上，且包含保守性和非保守性替换（图 S14）。这些结果促使我们研究 AI 引入的替换如何促进 SynTnpB 切割机制的结构基础。为了研究这些残基如何在 AI 生成的蛋白 v7 中促进功能，我们利用冷冻电镜 (cryo-EM) 确定了其三元复合物结构，捕捉到了分辨率为 2.8- Å 的 TAM 结合状态和 R-loop 形成状态（图 4 和图 S15）。
对于这两种状态，在 NUC 叶中，RNA-蛋白质界面表现出由 AI 引入的残基 K224R、Q227R、T228R 和 K245R 所促进的正电势累积（图 4, A 和 B）。RNA 进一步被掩蔽的 WT 残基 R232、R238 和 K241 稳定，这些残基与共进化的 RNA 核碱基相互作用。K256Q 和 R270K 处此前未报道的额外接触点排列在 RNA 假结区域。值得注意的是，我们的冷冻电镜分析解析了一个此前在 TnpB 中未见报道的 TAM 结合构象中间态。在这种状态下，蛋白质和 RNA 的构象与 ISDra2 TnpB 的二元复合物 [8BF8，见 (34)] 非常相似，但该复合物还结合了 DNA，其中包含在指南 reRNA-靶标 DNA 异源双链种子区域形成的一个单核苷酸对。虽然由于与 TAM 基序的强共进化而保留了大多数 WT 蛋白质-DNA 接触点，但生成的 N4R 替换与保守的“磷酸锁”残基 K84 (45) 一起稳定了异源双链种子对（图 4C）。与 ISDra2 结构中 reRNA Stem2 为无序状态 (34) 不同，在 v7 中 Stem 2 是有结构的且与 REC 叶结合。
D
DNA:RNA 异质双链种子已形成
图 4. AI 生成的变体 v7 的冷冻电子显微镜 (Cryo-EM) 结构揭示了 RNA-DNA 界面残基和保守的构象运动。(A) TAM 结合状态（异质双链种子已形成）和 (D) R-loop 状态（完全异质双链）在 2.8- Å 分辨率下的 Cryo-EM 重构图。(B) 在 NUC 叶中，引入的残基（珊瑚色）与引导 reRNA 形成接触。(C) 磷酸锁残基 K84 稳定了第一个 DNA 与 RNA 间隔区的碱基配对；推测的接触点 H4R 和 T88R 出现在异质双链种子附近。(E) REC 和 NUC 叶均显示出 AI 生成的与 RNA:DNA 异质双链的额外接触。(F) 保守的构象运动包括由 AI 生成的残基 (L289R- L293R, 和 Y214F–L219E) 介导的盖域 (lid-domain) 稳定化和桥螺旋 (bridge-helix) 弯曲。配色方案：AI 生成残基，红色；固定 WT 残基，灰色；RNA，橙色；DNA，青色。
我们的 R-loop 形成状态与此前报道的 ISDra2 TnpB 三元复合物 [ (34) 中的 8EXA] 非常相似，异质双链沿 RNA 间隔区的第 1 到 12 个核苷酸完全形成（图 4D）。REC 叶将 AI 生成的 T88R, K102E, R108K, R113K, 和 R160K 残基定位在与异质双链接触的位置。此外，覆盖在底物结合裂隙上的盖域通过非天然的 D283K, R286M, R289H, 和 L293R 接触在异质双链上构建了结构（图 4, E 和 F）。值得注意的是，一个主要由 ESM-IF1 生成的残基 Y214F, Y215L, R216K, S217K, 和 L219E 组成的螺旋片段保留了先前观察到的有利于异质双链形成的弯曲运动（图 4F）(34)。结构引导的反向诱变支持这些 AI 引入残基中的很大一部分具有功能性贡献（图 S16）。最后，NUC 叶已完全结构化，并在 RuvC 催化口袋中结合了单链 DNA 底物，该口袋仍由 WT 酶中的残基所排列。
综合来看，这些结构和反向诱变表明，AI 生成的残基引入了静电和氢键网络，可能在不同的蛋白质构象状态中稳定了 RNA-DNA 界面。该蛋白质中大部分由 AI 生成的片段保留了天然的螺旋弯曲，这与蛋白质的构象转变一致。最后，我们的设计方法使我们能够捕捉到一个此前未观察到的 TAM 结合状态，该状态在 WT 中可能不受青睐，但在 AI 生成的变体中则存在。
讨论 TnpB 家族酶作为 CRISPR-Cas12 的祖先，是一种紧凑的 RNA引导核酸酶，由于它们将可编程的 DNA 靶向能力和多种天然功能耦合到一个极简的架构中，因此成为蛋白质设计的极具吸引力的目标。然而，此类系统的设计一直受到限制，因为基于序列的生物 LMs 产生的蛋白质仍与天然序列接近，而理性设计则需要对构象机制进行明确的编程。
与那些生成的蛋白质保留了与天然同源物 >99% 认同度的野生型 (WT) DNA 结合域的语言模型 (LMs) 不同（图 S17）(12, 13)，我们的结构和进化引导设计方法创建了与 DNA 和 RNA 相互作用的叶片 (lobes)，其 AI 生成的接触点与自然界中最接近的对应物的认同度分别为 83% 和 72%。分拆设计方法进一步揭示了对序列变化的非对称耐受性：DNA 识别 REC 叶片对替换的敏感度显著高于 RNA 结合催化 NUC 叶片。我们将这种敏感性归因于 TAM 搜索和识别中精细调节的生物物理要求以及更严格的进化约束 (46)，这与 REC 和 NUC 叶片需要分别进行优化的需求一致。这种模块化设计原则可推广至其他多结构域蛋白质。我们的掩码策略不依赖于先前的实验结构，而是基于进化信息。它在保留关键接触点的同时，允许接触网络的出现。
这些相互作用在酶的状态之间创建了构象特异性的 RNA-DNA 相互作用，正如我们对 AI 生成的 RNA 引导核酸酶冷冻电镜 (cryo-EM) 结构的首个洞察所支持的那样。
为了支持我们的设计策略结果，最近的深度突变扫描和定向进化研究发现，我们 AI 生成的 N4R、Q227R 及其他替代位点增强了 ISDra2 TnpB 的活性（图 S16）(47, 48)。此外，虽然最近的 AI 引导工程研究使用了逆折叠模型通过单点突变来增强天然蛋白 (49, 50)，但我们的独特策略将系统发育保守性与蛋白质-RNA/DNA 共进化相结合，从而能够设计高度发散的非天然蛋白质。
DNA-RNA 接触残基的独特组合及其与 TnpB 构象运动的对齐方式，提出了这样一种可能性：ESM-IF1 可能会推断出与折叠和系统发育相关的蛋白质序列约束，从而产生与核酸结合相兼容的构象状态和残基排列，即便在训练过程中缺乏明确的核酸信息。通过我们方法中的进化约束进行细化，这种能力为其他多状态蛋白质或核酸结合剂的结构引导设计奠定了基础，前提是它们及其同源 DNA 和 RNA 序列在基因组数据库中得到了多样且均匀的代表 (51–53)。此外，有观点认为蛋白质是以构象集的形式发挥功能和进化的，而非单一的静态结构 (54)。在这种背景下，我们观察到的先前未解析的 TAM 结合状态，可能代表了相对于野生型 (WT) TnpB 的一个独特动力学中间体，并为分离和研究 RNA 引导核酸酶在自然界及其他环境下可能采样到的瞬时构象提供了先例。通过一个由进化和结构引导的模型，我们为设计 RNA 引导系统和灵活的核酸结合剂建立了基础，我们愿景通过生成生物学 (55) 将其功能扩展到自然序列约束之外，并向从头设计 (de novo design) 迈进，从而扩大可设计的蛋白质空间。
参考文献与注释
2022.04.10.487779 [Preprint] (2022). https://doi.org/10.1101/2022.04.10.487779. 19. J. Dauparas et al., Science 378, 49–56 (2022). 20. A. B. Guo et al., Science 388, eadr7094 (2025). 21. C. J. Glasscock et al., Nat. Struct. Mol. Biol. 32, 2252–2261 (2025). 22. F. Praetorius et al., Science 381, 754–760 (2023). 23. T. Karvelis et al., Nature 599, 692–696 (2021). 24. S. N. Takeda et al., Mol. Cell 81, 558–570.e3 (2021). 25. M. Schmitz, I. Querques, S. Oberli, C. Chanez, M. Jinek, Cell 185, 4999–5010.e17 (2022). 26. T. Wiegand et al., Nature 631, 439–448 (2024). 27. P. H. Yoon et al., Nucleic Acids Res. 51, 12414–12427 (2023). 28. M. Saito et al., Nature 620, 660–668 (2023). 29. E. Ma et al., Nucleic Acids Res. 53, gkaf649 (2025). 30. J. Jumper et al., Nature 596, 583–589 (2021). 31. J. Dauparas et al., Nat. Methods 22, 717–723 (2025). 32. R. Nakagawa et al., Nature 616, 390–397 (2023). 33. K. H. Sumida et al., J. Am. Chem. Soc. 146, 2054–2061 (2024). 34. G. Sasnauskas et al., Nature 616, 384–389 (2023). 35. D. S. Marks et al., PLOS ONE 6, e28766 (2011).
致谢 我们感谢 Doudna 实验室和创新基因组研究所 (Innovative Genomics Institute) 的成员提供的富有成效的讨论，以及加州大学旧金山分校 (UCSF) 为满足我们的计算需求而提供的高性能计算集群 Wynton 的访问权限。感谢 UCSF 低温电镜 (CryoEM) 核心设施的 D. Bulkley 和 G. Gilbert 在三元复合物筛选方面提供的支持；感谢 QB3-Berkeley 的 Cal-Cryo 设施的 D. Toso, K. Sharma, J. Remis, P. Tobias 在数据采集方面提供的支持；感谢加州大学伯克利分校 (UC Berkeley) DNA 测序设施提供的 Sanger 测序和 Oxford Nanopore 测序；感谢 QB3 Genomics 和 IGI 测序核心设施提供的 NGS 测序；感谢劳伦斯伯克利国家实验室的 C. Citek 和加州大学伯克利分校 Marqusee 实验室的 E. Gerbe 对圆二色光谱实验的支持；感谢 Cate 实验室的 Y. Koga 对蛋白质印迹 (Western blotting) 实验的支持；感谢 C. Hsu 和 D. Savage 对初稿提供的反馈；感谢 S. Chitrananda 提供的
关于 Potts 模型的讨论；L. E. Valentin-Alvarado 关于系统发育学的讨论；B. W. Thornton 关于库载体设计的讨论；K. Chen 和 K. Wasko 提供 BFP HEK293T 细胞系；K. Zhou 和 J. Ye 为 Doudna 实验室提供的宝贵技术和组织支持；以及 K. Lucas 在管理实验室运营和研究活动方面的领导与协调。图 2A 和 3A 中的示意图由 BioRender.com 创建。资金支持：这项工作得到了美国国家科学基金会 (NSF) 植物基因组研究计划资助 (2334027) 对 S.E.J.、J.A.D. 和 J.F.B. 的支持。J.A.D. 和 S.E.J. 是霍华德·休斯医学研究所 (HHMI) 的研究员。P.S. 由瑞士国家科学基金会流动奖学金 (P500PB_214418) 支持。H.S. 由美国国家卫生研究院的 K99 奖项 (K99GM160778) 支持。A.C. 作为 HHMI 的夏季研究员获得支持。作者贡献：概念化和方法学：P.S.、J.A.D.。计算设计：P.S.、H.N.。生物信息学：P.S.、I.E.-G.、C.J.L.、L.-X.C.、P.H.Y.。克隆和细菌测定：E.C.D.、P.S.、I.E.-G.、A.C.、P.H.Y.、K.J.L.、H.S.、K.V.。HEK293T 实验：I.E.-G.、P.S.、P.H.Y.、E.C.D.、H.M.K.。数据分析：P.S.、I.E.-G.、E.C.D.、R.S.B.。植物编辑和分析：T.W.、M.K.、S.E.J.。蛋白质纯化：Z.Z.、P.S.。冷冻电子显微镜：P.S.、I.E.-G.。写作——初稿：P.S.、I.E.-G.、E.C.D.、J.A.D.，所有作者均有贡献。利益冲突：P.S.、S.E.J.、J.A.D.、I.E.-G. 和 E.C.D. 已提交一项涵盖本工作相关方面的专利。加州大学校董会拥有作者作为发明人的技术待审专利。S.E.J. 是 Inari Agriculture 的联合创始人兼顾问，以及 Terrana Biosciences、Invaio Sciences、Sail Biomedicines 和 Zymo Research 的顾问。J.F.B. 是 Metagenomi 的联合创始人。J.A.D. 是 Aurora Therapeutics、Azalea Therapeutics、Caribou Biosciences、Editas Medicine、Evercrisp、Scribe Therapeutics、Intellia Therapeutics 和 Mammoth Biosciences 的联合创始人。J.A.D. 是 BEVC Management、Caribou Biosciences、Evercrisp、Intellia Therapeutics、Isomorphic Labs、Scribe Therapeutics、Mammoth Biosciences、The Column Group 和 Inari 的科学顾问委员会成员。J.A.D. 是 Aditum Bio 和 Aurora Therapeutics 的顾问。J.A.D. 是 Sixth Street 的首席科学顾问，并且是 Johnson & Johnson、Altos 和 Tempus 的董事。数据、代码和材料可用性：TAM 结合态和 R-loop 形成态的冷冻电镜状态模型已存入蛋白质数据库 (Protein Data Bank)，访问编号为 pdb_00009YYG 和 pdb_00009YYH。冷冻电镜图谱可在电子显微镜数据库 (Electron Microscopy Data Bank) 中获取，访问编号为 EMD- 73644 和 EMD- 73645。本研究中生成的合成寡核苷酸序列在数据 S2 中提供，构建体可根据合理请求提供。ccdB 测定、HEK293T 扩增子测序、全基因组 Tn5 脱靶分析和原生质体扩增子测序的测序数据已存入序列读取存档 (Sequence Read Archive)，BioProject 编号为 PRJNA1454204。与本研究相关的代码和数据可在 https://github.com/pyskop/SynTnpBs 获取，并存档于 Zenodo (56)。许可信息：版权所有 © 2026 作者，保留部分权利；独家被许可人为美国科学促进会 (AAAS)。不对原始美国政府作品主张权利。https://www.science.org/about/science-licenses-journal-article-reuse。本文受 HHMI 的出版物开放获取政策约束。HHMI 实验室负责人此前在其研究文章中向公众授予了非排他的 CC BY 4.0 许可，并向 HHMI 授予了可转许可的许可。根据这些许可，本文的作者接受稿 (AAM) 在发表后可立即根据 CC BY 4.0 许可免费提供。
补充材料 science.org/doi/10.1126/science.aed6123 材料与方法；图 S1 至 S18；表 S1 至 S3；参考文献 (57–70)； MDAR 可重复性清单
冷放射性分子的制备与光谱学
Chandler J. Conn1†, Phelan Yu1†, Madison I. Howard1, Yuxi Yang1, Chaoqun Zhang2‡, Arian Jadbabaie1§, Aikaterini Gorou1¶, Alyssa N. Gaiser3,4, Timothy C. Steimle1, Lan Cheng2, Nicholas R. Hutzler1*
具有重放射性原子核的分子有望对基础核物理和粒子物理表现出极高的灵敏度。然而，这些原子核的供应量有限，这给其在精密测量中的应用带来了挑战。在这里，我们通过结合痕量放射性靶标制备方案、低温缓冲气体中的光驱动化学以及低背景光谱检测方法，在台式装置中演示了单羟基镭、单氘代羟基镭和单氟化镭分子（226RaOH, 226RaOD, 和 226RaF）的气相合成、深冷冷却和高分辨率激光光谱分析。这些分子在实验室坐标系中被冷却，创造了与目前许多分子精密测量和量子信息实验相同的起始条件。该方法可轻松应用于多种物种，并为奇异原子核的分子量子传感建立了关键能力。
研究人员寻求将放射性原子和分子用于研究广泛的物理领域，包括核结构、基本对称性和恒星过程 (1)。然而，由于可用性有限以及相关的安全风险，放射性分子尤其是一个相对未被探索的领域。近期，人们对含有重八极变形（“梨形”）原子核的分子产生了浓厚兴趣，与球形原子核相比，这类原子核能将源于“新物理”的核对称性破缺灵敏度提高三个数量级以上 (1–3)。结合分子相对于原子的灵敏度约千倍的增强 (4)，这些物种成为了探测基础核性质和标准模型之外 (BSM) 物理的极其灵敏的探针。
在可能的八极变形候选者中，含镭分子极具吸引力，这是由于镭具有较大且相对明确的八极形状变形 (5, 6)，其通过核希夫矩 (nuclear Schiff moment) 对基础对称性破缺具有巨大的分子灵敏度 (2, 7–9)，以及能够创建光学可控、激光可冷分子的独特能力 (9–12)。通过将现代量子工具与含重变形核分子所提供的对 BSM 物理的巨大灵敏度增强相结合，人们可以探测远超太电子伏特 (TeV) 能标的领域，从而对尖端对撞机和精密测量的能力进行补充和延伸 (1, 13)。
对于精密原子和分子实验，实现高度的运动和内部量子态控制是一个必不可少的先决条件，因为它能够实现较长的询问时间以及相干的，
1加州理工学院物理、数学和天文学部，帕萨迪纳，加利福尼亚州，美国。 2约翰斯·霍普金斯大学化学系，巴尔的摩，马里兰州，美国。 3密西根州立大学化学系，东兰辛，密歇根州，美国。 4密西根州立大学稀有同位素束流设施，东兰辛，密歇根州，美国。 *通讯作者。 电子邮件：cconn@ caltech. edu (C.J.C.); phelanyu@ caltech. edu (P.Y.); hutzler@ caltech. edu (N.R.H.) †这些作者对这项工作有同等贡献。 ‡现地址：耶鲁大学化学系，纽黑文，康涅狄格州，美国。 §现地址：麻省理工学院物理系，剑桥，马萨诸塞州，美国。 ¶现地址：加州大学伯克利分校化学系，伯克利，加利福尼亚州，美国。
量子态分辨的制备、操纵和读取。近期的方法在这一方向上取得了进展，涉及含镭分子，包括使用加速放射性同位素束的 RaF 光谱学研究 (3, 14–16) 以及捕获含镭的多原子分子离子 (17)，两者的目标均是为了对基本对称性进行精密测量 (10, 18)。
在此，我们报告了在台式装置中，在 $\sim$4 K 温度下产生、冷却以及对镭-226 单氢氧化物、单氘氧化物和单氟化物分子 ($\text{}^{226}\text{RaOH}$, $\text{}^{226}\text{RaOD}$ 和 $\text{}^{226}\text{RaF}$) 进行高分辨率激光光谱分析的情况。通过使用制备的镭靶材进行脉冲激光烧蚀、低温缓冲气体冷却 (19)、状态选择性化学反应的共振光学驱动 (20) 以及高灵敏度低背景检测方法，我们创建并研究了低温且低速 (<30 m/s) 的样本。这些物种的结构适用于激光冷却和光学捕获，以实现长相干时间和高保真度的量子态控制与读取 (9–12, 21, 22)。此外，多原子物种具有相反宇称的近简并态，能够实现用于精密测量 (23–26) 和量子信息 (27) 的高级方案。这项工作展示了一条将精密分子科学工具——特别是在 BSM 搜索 (4, 28, 29) 和量子信息 (30, 31) 领域——应用于短寿命放射性系统的路径。更广泛地说，在大学（或更大规模）环境中使放射性分子可用于台式实验，能够实现在基础物理学中的广泛应用 (1)。
除了在利用分子进行精密测量时面临的常规困难 (4) 之外，限制获取放射性分子的主要挑战是材料数量少，通常少于几个微克。另一个复合挑战是这些超重分子的理论不确定性很大；其电子能级可以被预测 (32)，但具有 $\sim$10-THz 的不确定性，这比低温下单个量子态 $\sim$100-MHz 的线宽大多个数量级。综合来看，这些挑战意味着分子产生和测量策略必须高效。通过使用一组具有分级线宽且宽可调的连续波 (CW) 和脉冲染料激光器，我们证明了对于此前未观察到的放射性分子，在先验未知光学跃迁的情况下，可进行范围超过 10 THz 的高效材料光谱搜索。随后，通过逐步降低激光线宽直至单纵模 ($\Delta\nu \le 500 \text{ kHz}$) 的激光激发，使我们能够直接分辨分子振动能带上单个低能 (N $\le$ 9) 旋转跃迁，其线宽为 $\sim$100-MHz 的多普勒限制线宽，分辨率为数兆赫兹。在放射化学靶材制备、低温源设计、化学产生、光谱方法和检测手段方面的这些进展，可很容易地扩展到广泛的短寿命放射性同位素和复杂的分子结构中。
放射性分子的产生与检测 冷气相放射性原子和分子是在一个体积约为 48 $\text{cm}^3$ 的铜质低温缓冲气体池内产生的，该气体池由商用闭路低温冷却机维持在 4 和 7 K 之间的基准温度。低温池的几何结构和光路如图 1 所示。首先，通过对固体靶材进行激光烧蚀使原子和分子前驱体汽化。接下来，通过镭原子与试剂之间由光学驱动的化学反应形成分子。最后，由可调谐激光器引起的激光诱导荧光被光电探测器收集，以测量分子光谱。这些步骤在下文中详细描述。
在细胞内，原子和分子前体被聚焦的、纳秒级 532 nm Nd:YAG（钇铝石榴石）激光器烧蚀，根据目标的不同，每脉冲提供 5 to 20 mJ 的能量。分子的产生是通过对放射性同位素和配体物种的独立目标进行烧 ablation 实现的，这允许通过原位切换目标来进行物种选择性生产。含有 10 to 50 μCi (0.37 to 1.85 MBq, 44 to 221 nmol) 镭的放射性同位素目标
A
C
B
图 1. 实验装置。(A) 低温恒温器的剖面渲染图，未显示气体或电信号馈通。整个系统高度不足 1. 米，实验装置可安置在光学平台上。(B) 分子产生并进行光谱研究的铜池细节。脉冲消融激光将靶板上的试剂汽化，汽化后的试剂填充在池内，并与冷氦缓冲气体达到热平衡。探测激光沿正交轴发射。一个与消融轴平行但偏移 4 cm 的集光透镜将激光诱导荧光准直，以便由低温恒温器外部的光电倍增管检测。该电池采用真空密封，以减轻放射性同位素污染向更大的低温恒温器扩散。示例靶板显示了金箔上的滴铸镭靶，周围环绕着各种试剂和用于测试的 Yb 金属。(C) 在针对 $\tilde{C}^2\Sigma^+-\tilde{X}^2\Sigma^+$ 能带系统进行消融后记录的 RaOH 分子的共振激光诱导荧光。随时间变化的轨迹描绘了同时记录的固定频率“归一化”激光激发（蓝色，顶部）、扫描“光谱”激光激发（橙色，中间）以及来自消融和等离子体背景的非共振散射（黑色，底部）。插图为放大图，描绘了 2. 个周期的幅度调制荧光数据，短脉冲归一化探测（蓝色）与较长的连续波 (CW) 光谱探测（橙色）交替出现。进一步讨论请参见图 S5。
图 2. 低温气体中通过共振光驱动化学产生分子的过程。(A) Ra 与水反应的能级图。基态 $^1S_0$ 无法反应生成 RaOH，但激发态 $^3P_1$ 可以，因此我们使用强 714- nm 激光激发原子。(B) RaOH 产量的增强与 $^3P_1$ 激光偏离共振频率的关系。(C) 单次激发荧光轨迹，证明了 RaOD 的共振产生。当 Ra $^3P_1$ 激光非共振（“off”）时，我们观察到少量 RaOD 产生；在共振（“on”）激光存在时，产量有所增强。我们在消融脉冲后约 3 ms 打开快门，以区分在消融羽流中产生的分子与通过共振化学产生的分子。在对新的滴铸靶点进行首次消融激发后，我们估计总共产生了约 $\sim 10^{10}$ 个分子 [关于数量估算的细节见 (37)]。
氯化物 ($\text{RaCl}_2$) 或硝酸盐 [$\text{Ra}(\text{NO}_3)_2$] 盐是通过将弱酸性水盐溶液手动移液（“滴铸”）到加热的金表面上在实验室内部制备的。溶液中溶解了少量的木糖醇，以提高蒸发后消融靶的一致性和附着力。试剂“共靶”是由含氟化物、氢氧化物或氘氧化物粉末经液压压制而成的固体颗粒。通过将消融激光引导至特定的共靶即可产生不同的分子，单个电池内可以有许多（10 个或更多）共靶（图 1B），具有相当大的化学多样性，仅受靶板可用空间的限制。
在消融之后，气相原子和分子产物通过与预充的氦缓冲气体碰撞，迅速冷却至低温。这意味着许多可能形成目标分子的化学反应在能量上变得不可行，从而抑制了分子的产生（图 2A）。为了克服这一点，使用 1.5 W 的、运行在接近饱和分布状态的连续波 (CW) 激光，将镭原子从 $^1\text{S}_0$ 基态激发到 $^3\text{P}_1$ 亚稳态 [$\lambda = 714$ nm, $\tau \approx 422$ ns (33)]。$^3\text{P}_1$–$^1\text{S}_0$ 跃迁是自旋禁阻的，但由于极强的自旋-轨道耦合，它获得了跃迁强度。在 $^3\text{P}_1$ 状态下，Ra 原子具有足够的内能来克服额外的反应能垒（如图 2A 所示），从而使分子数量增加了约 10 到 30 倍（图 2, B 和 C）。该反应的共振行为提供了一个强有力的系统性检查，证明即使在存在大量化学污染或光谱拥挤的情况下，这些分子仍含有镭 (34)。该方法可用于增强 RaOH、RaOD 和 RaF 的产生，以及 BaOH 和 BaF（后者在本项目装置中用作测试和校准物种）。
通过在 483 nm 处的强 $^1\text{P}_1$ – $^1\text{S}_0$ 谱线上的共振光学吸收来测量电池内部的 Ra 原子密度 [$\tau \sim 6$ ns (35)]。每次消融脉冲约产生 $10^{10}$ 到 $10^{12}$ 个冷 Ra 原子。根据沉积量和沉积程序的不同，每个镭靶材在耗尽前可提供约 $0.5 \times 10^4$ 到 $2 \times 10^4$ 次射击（图 S1）。
分子产物通过脉冲激光和连续波激光的激光诱导荧光进行检测。低温电池组件中的集成透镜收集来自电池孔中间焦平面的光，通过低噪声光电倍增管 (PMT) 模块进行实时读取。这种检测面临若干挑战：受限的几何结构导致来自各种激光器的光散射相当严重
D
E
表面；非共振散射发生在由消融产生的气相团簇和大分子上；而由消融产生的各种原子和分子的亚稳激发态会发射宽带荧光。我们使用低反射率表面涂层处理该电池，并在与任何激发激光不同的波长下检测荧光，以便利用光学滤波器阻挡散射的激光。通过扫描激光频率以直接观察共振行为，可以将共振散射与非共振散射区分开来。宽带背景荧光则通过使用幅度调制激光（通常在 50- 至 100- kHz 范围内）结合锁相检测，与激光诱导荧光信号区分开。
B A
C
锁相检测方法还提供了一个有用的工具，可以用一种节省材料的方式来对原子和分子产量的单次脉冲波动进行归一化。通过在每个分子脉冲内时间交替地使用两束激光（图 1C），其中一束频率可变用于测量光谱，另一束频率固定在已知的分子共振点用于信号归一化，我们可以监测分子产量以降低噪声，而无需对多次消融脉冲进行平均。该方法还验证了任何光谱信号的缺失并非仅仅是因为目标点耗尽导致消融分子产量低而产生的结果。
RaOH, RaOD, 和 RaF 的激光光谱 RaOH 和 RaOD 的激光光谱专注于 $\tilde{C}^2\Sigma^+ - \tilde{X}^2\Sigma^+$ 电子跃迁，这大约对应于价层金属局域电子的单 $\text{p}\sigma \leftarrow \text{s}\sigma$ 激发 (23, 36)。探测激光激发 $\tilde{C}^2\Sigma^+(000) \leftarrow \tilde{X}^2\Sigma^+$，并检测来自衰减
$\tilde{C}^2\Sigma^+ - \tilde{X}^2\Sigma^+$ 起始能带和 RaF $C^2\Sigma^+(v' = 0) - X^2\Sigma^+(v'' = 1)$ 系统的荧光。每个点代表一次单次消融脉冲。(A 和 B) RaF（紫色）和 RaOH（蓝色）的脉冲染料激光荧光光谱，未进行归一化，分辨率约为 2.5 GHz，由激光线宽决定。(C) 从 (D) 的高分辨率数据中放大显示的一个自旋-旋转双峰，展示了带有 Voigt 拟合的谱线形状。(D) RaOH 的连续波 (CW) 染料激光荧光光谱，线宽约为 100- MHz，由多普勒温度和辐射展宽决定。(E) RaOD 的连续波 (CW) 染料激光荧光光谱。表 S1 包含 RaF 的测量谱线中心列表，表 S2 包含 RaOH 和 RaOD 的完整谱线列表及与预测值的对比。
图 3. RaOH 和 RaOD $\tilde{C}$ 的激光诱导荧光光谱
$\tilde{C}^2\Sigma^+(000) \to \tilde{X}^2\Sigma^+(\nu_1\nu_2\nu_3)$ 被检测到。这里 $(\nu_1\nu_2\nu_3)$ 标记了 (Ra–O 伸缩, Ra–O–H 弯曲, O–H 伸缩) 振动模式中的量子数 (24)，且到每个状态的相对衰减速率由 Franck-Condon 因子的量级决定 (22)。由于这些分子被预测为可以用激光冷却，因此电子和振动自由度在很大程度上是解耦的，主导衰减是回到底层 (000) (32)；然而，由于该衰减波长与强探测激光相同，它被光学滤波，因此仅检测到向激发振动状态 $\nu_1 = 1$ 和 $\nu_2 = 2$ 的衰减。
为了在理论不确定性较大且材料有限的情况下高效地寻找并探索光谱，光谱采集分阶段进行，且分辨率逐渐提高。针对 RaOH $\tilde{C}$ 态的初始宽带连续波 (CW) 勘测光谱由先前的相对论耦合簇电子结构计算 (32) 指导，该计算指出在 15,750 $\text{cm}^{-1}$ 附近存在量级约为 100 $\text{cm}^{-1}$ 的搜索窗口。我们设计了一种高效的搜索策略，利用单个 10-$\mu\text{Ci}$ 放射性同位素靶扫描整个理论不确定性范围。我们使用了一台光谱带宽较宽 ($\Delta\nu \sim 30\text{ GHz}, \sim 1.\text{ cm}^{-1}$) 的可调谐连续波激光器来扫描激光诱导荧光，这使得在短短几个小时内并通过几百次消融脉冲即可覆盖这一广大区域。通过使用连续波激光器，我们利用了分子脉冲完整的几毫秒持续时间。根据这次初始勘测数据，在 15,740 $\text{cm}^{-1}$ 处定位到了一个荧光过剩区域（图 S6），我们初步将其归属为 $\tilde{C}^2\Sigma^+ \leftarrow \tilde{X}^2\Sigma^+$ 起始能级系统。
随后，我们在范围逐渐缩小的区域内进行了分辨率不断提高的扫描。中等分辨率 ($\Delta\nu \sim 2.5\text{ GHz}$) 的脉冲染料激光激发显示出一个紧密聚集的带头，以及孤立的，
如图 3B 所示，翼部出现了旋转分辨渐进序列。脉冲染料激光器的运行重复率为 50- kHz，在分子脉冲长度范围内提供了约 1000 次荧光脉冲。对于高度对角线的 $\Sigma^+ - \Sigma^+$ 能带而言，这种典型的簇状带头外观是不寻常的，这归因于 $\tilde{C}^2\Sigma^+$ 态巨大的负激发态自旋-旋转常数，它将旋转 $R_1$ 和 $P_2$ 支渐进序列推向了能带原点。这可能是由于与 $\tilde{A}^2\Pi$ 电子流形中 $|\Omega| = 1/2$ 分量之间存在较大的自旋-轨道耦合（$A_{SO} \sim 1500 \text{ cm}^{-1}$）所致，预计后者位于 $\tilde{C}^2\Sigma^+$ 流形下方约 2000 $\text{ cm}^{-1}$ 处 (32) [详见 (37)]。最后，利用单纵模 ($\Delta\nu \sim 0.5 \text{ MHz}$) 可调谐连续波 (CW) 染料激光器对单条谱线进行了高分辨率分辨，由于多普勒展宽和自然展宽，其半高全宽约为 100 MHz，从而能够将谱线中心确定到大约 0 兆赫兹级别，如图 3D 和图 S7 所示。
$\tilde{C} \ 2\Sigma^+(000)$ $\tilde{X}$
$\tilde{C} \ 2\Sigma^+(000)$
$2\Sigma^+(000)$
$2\Sigma^+(000)$
针对氘代同位素 $\text{RaOD}$ 进行了类似的光谱搜索，在 $\text{RaOH}$ 主原点特征的红移约 9 $\text{ cm}^{-1}$ 处定位到一个能带，这与振动同位素位移的电子结构预测基本一致。两个能带的特征均显示出对（非）氘代共靶消融以及向 $\text{Ra } 3\text{P}_1$ 态共振泵浦的明显依赖性，表明这是光学驱动的化学产物（见图 2C 和图 S7d）。将 $\text{H} \rightarrow \text{D}$（甚至 $\text{H} \rightarrow \text{T}$）替换应会降低弯曲振动能量，从而增加对称性降低的“科学态”的自发寿命 (24, 38)。
通过窄带 CW 激光激发，分别记录了 $\text{RaOH}$ 和氘代 $\text{RaOD}$ 的 $\tilde{C}^2\Sigma^+ - \tilde{X}^2\Sigma^+$ 系统中 27 条和 32 条低 $N$ 谱线。此处 $N$ 为分子的角动量，不包括电子或核自旋。通过 Voigt 廓线拟合确定的谱线中心列表见表 S2。自旋-旋转相互作用引起的劈裂在所有谱线中均得到了分辨，直至最低的 $N = 1$ 旋转态。预计来自质子和氘子自旋的超精细耦合在 $\sim 1 \text{ MHz}$ 量级，低于目前的谱线宽度，因此无法分辨。与在 $\text{BaOH}$ 的第一个激发 $2\Sigma^+$ 态中观察到的严重扰动相反 (39, 40)，$\text{RaOH/D}$ 中进入 $\tilde{C}^2\Sigma^+$ 流形的低 $N$ 渐进序列似乎基本未受扰动。然而，如 (37) 中讨论的，某些特征的强度和激发态自旋-旋转常数表明 $\tilde{C}^2\Sigma^+$ 态与相邻状态之间存在自旋-轨道诱导的混合。
完整的 $\text{RaOH/D}$ 高分辨率谱线列表被拟合到一个包含旋转 ($B_0$) 和自旋-旋转 ($\gamma$) 的五参数分子精细结构哈密顿量模型中，其算符形式可写为：
其中双撇号和单撇号以及下标 $\text{g}$、$\text{e}$ 分别代表基态和激发态，$T_0$ 是激发态原点。哈密顿量的角动量矩阵元写在 (37) 中。
$\tilde{X}^2\Sigma^+$ 和 $\tilde{C}^2\Sigma^+$ 态的旋转常数和氘代同位素位移与 (32) 中计算的键长和转动惯量非常一致。提取的完整分子参数集及与从头算理论的对比列在表 1 中。基态自旋-旋转常数的观测值与计算值之间达到了良好的一致，而激发态数值的大小则存在差异。这表明相邻电子态对激发流形产生了额外的扰动影响，这种情况在类似系统中已有观察 (39, 40)，但目前的电子结构计算未能捕捉到其影响。
$\hat{H}_g = B''_0 \hat{N}^2 + \gamma''_g \hat{N}_g \cdot \hat{S}_g$
$\hat{H}_e = T_0 + B'_0 \hat{N}^2 + \gamma'_e \hat{N}_e \cdot \hat{S}_e$
表 1. RaOH、RaOD 和 RaF 的拟合参数（图 3，D 和 E）。RaOH 和 RaOD 频带起点 (T0) 的理论值取自 (32)。所有旋转常数 (B0) 和自旋-旋转常数 (𝛾) 的理论值均通过相对论精确双分量方程-运动耦合簇 (X2C-EOM-CC) (46, 47) 计算获得 [关于方法及与实验的比较，请参见 (37)]。对于 RaF 的中分辨率拟合，T0 参考于 C2Σ1/2 +(𝑣′′ = 1) 振动电子跃迁 (图 3A)。括号中的值为拟合的标准误差 (1σ)，而方括号中的值对应于波长计的不确定度。
(高分辨率) $\tilde{X}$
RaOH 实测值 理论值 实测值 理论值
T 0 (cm−1) 0 0 15,739.4220(2) [20] 15,749
B 0 (MHz) 5814.3(7) 5818 5780.3(6) 5783
γ (MHz) 151(3) 165 –7641(4) –13,574
RaOD 实测值 理论值 实测值 理论值
T 0 (cm−1) 0 0 15,728.2246(2) [20] 15,730
B 0 (MHz) 5256.3(6) 5258 5208.9(6) 5226
γ (MHz) 143(2) 149 –6739(3) –12,342
(中分辨率) C2Σ+(𝒗’=0)
RaF 实测值 理论值
T 0 (cm−1) 16,171.920(8) 16,199
B 0 (MHz) 5663(6) 5647
γ (MHz) –12,388(90) –13,443
$\text{C}^2\Sigma^+ (v' = 0) \leftarrow \text{X}^2\Sigma_{1/2}^+$ 的 $v'' = 1 \to v' = 0$ 频带系统的染料激发（图 3A 和图 S8）。通过光学滤波对强烈的 $v' = 0 \to v'' = 0$ 衰减进行检测。与 RaOH 数据类似，在脉冲染料线宽下分辨出了 $Q_{21} + R_2$ 和 $P_1 + Q_{12}$ 级联中孤立的低-N 特征。由于 RaF 的基态 $\text{X}^2\Sigma^+$ 参数已经确定 (15)，这些特征可用于提取 $\text{C}^2\Sigma^+$ 态的分子参数，详见表 1。
讨论与展望 我们已经演示了冷放射性分子的低温制备和高分辨率激光光谱分析，并实现了含镭中性多原子分子的检测与表征，使其能够受益于广泛的现代量子科学工具。本工作中开发的技术具有广泛的适用性，为在台面设置中对各种放射性物种 (1) 进行精密研究建立了路径。
随着冷样品的产生，目前用于稳定物种以提高光谱带宽和分辨率的先进光谱技术，现在可应用于放射性原子和分子的研究。宽带光源结合高光学色散探测器可以实现快速的、多太赫兹宽带光谱采集，同时保留旋转和精细结构分辨率 (41)。
分子束的形成 (19) 将使激光冷却成为可能，预计这在这些物种中是可行的 (10–12, 15)，从而开辟广泛的精密测量应用。这些分子的电子结构使得许多先进的光学陷阱 (42, 43) 和精密测量方案 (18, 24–26, 44) 能够被提出并得到验证。我们的方法可用于许多放射性系统，包括含有带自旋、八极变形 $^{225}\text{Ra}$ ($I = 1/2$) 和 $^{223}\text{Ra}$ ($I = 3/2$) 同位素的分子同位素异构体 (14, 45)，我们预计能够...
鉴于已证明的信噪比，采用该方法的项研究将能够对当前实验极限前沿的电荷-宇称 (CP) 破坏强子物理进行高灵敏度搜索。
参考文献与注释
致谢 作者感谢 H. Issaian 和 A. Jefferson 在项目规划和运行过程中提供的广泛辐射安全支持与建议，以及 S. Hwang 和加州理工学院固体核磁共振 (NMR) 设施对合成试剂的验证。C.J.C. 和 P.Y. 感谢 A. Duarte 在获取激光硬件方面的帮助，感谢 Y. Zeng 对控制系统和原型激光器的贡献，感谢 M. Gababa 和 Z. Ye 在开发低温设备方面的帮助，以及 C. Zhang 在低噪声射频设计方面提供的建议。作者还感谢 J. M. Doyle、R. F. Garcia Ruiz 以及 RaX 协作组对原稿提出的有益讨论和评论。我们感谢橡树岭国家实验室和 Eckert & Ziegler 提供的本工作所用同位素。本研究中使用的一些同位素由美国能源部同位素计划提供，该计划由科学办公室负责同位素研发与生产。化学反应的计算模拟是在 Resnick 高性能计算中心进行的，该设施由加州理工学院 Resnick 可持续发展研究所支持，使用的是 QChem（版本 5.3）。本工作中报道的相对论电子结构计算使用了 CFOUR（版本 2.1）程序包。资金支持：加州理工学院的实验工作得到了美国国家科学基金会 (PHY- 2309361)、De Logi 科学技术赠款、Heising-Simons 基金会 (2022- 3361) 以及 Alfred P. Sloan 研究奖学金的支持。约翰霍普金斯大学的计算和理论工作 (C.Z. 和 L.C.) 得到了美国国家科学基金会资助（资助号 PHY- 2309253）。P.Y. 感谢加州理工学院 Eddleman 研究生奖学金的支持。M.I.H. 感谢美国国家科学基金会研究生研究奖学金和加州理工学院 Dominic Orr 研究生奖学金的支持。A.G. 感谢 Thomas Lauritsen 加州理工学院 SURF 奖学金的支持。作者贡献：概念化：C.J.C.、P.Y.、N.R.H.。实验设计与构建：C.J.C.、P.Y.。数据收集：C.J.C.、P.Y.、M.I.H.、Y.Y.。数据分析：C.J.C.、P.Y.。电子结构计算的开发与实施：C.Z.、L.C.。光谱建模、数据拟合及激光协助：T.C.S.。湿法放射化学程序的开发：A.N.G.。测量协议开发协助：A.J.。化学反应路径的计算模拟：A.G.。监督：N.R.H.。竞争利益：一份涵盖本报告所述发明的专利申请（序列号 19/551,368）已在美国提交，列出的发明人为：N.R.H.、C.J.C.、P.Y.、M.I.H. 和 Y.Y.。数据、代码和材料可用性：本工作产生的基础数据和分析代码可在加州理工学院研究数据存储库 (48) 中获取。所有材料的制备和表征细节见方法部分 (37)。许可信息：版权 © 2026 作者，保留部分权利；独家许可方为美国科学促进会。不对原始美国政府作品主张权利。https://www.science. org/about/science- licenses- journal- article- reuse
补充材料 science.org/doi/10.1126/science.aea9413 材料与方法；补充正文；图 S1 至 S10；表 S1 至 S8； 参考文献 (49–82)
10.1126/science.aea9413
2025 年 8 月 9 日提交；2026 年 5 月 18 日接收
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职业焦点：数据科学
当我的同事站在我的办公室里哭泣，向我讲述他刚刚被强制退休的细节时，我感到局促不安。当时我是一名入职一年、处于终身职评定期的助理教授，而他则是一位“名声显赫之人”——在业内享有盛誉。我为他感到难过。但作为一个不习惯哭泣的人，在他抽泣时，我不确定该看向哪里，或者该说什么来“解决”这个问题。像我那个时代的大多数男性一样，我早年接受的社会化教育是保持冷静并直接处理问题；哭泣是不可接受的，因为这会被视为软弱和脆弱。我对我的同事竟然在我的面前流泪感到震惊，而我当时感到的恐慌和困惑在之后很长一段时间里一直挥之不去。
与那位退休教师的经历是在 2 个年代之前。但多年后，在一些我处于资深地位的指导对话中，我发现自己处于类似的境地。在其中一次对话中，一位职业生涯早期的同事询问关于可能的职业转型问题。我提供了我认为实际的建议：她还没有准备好。对话继续进行。但 40 分钟后，她明显地情绪激动并开始哭泣。当我坐在那里试图恢复对话时，我感到了与多年前相同的不安感，以及对如何回应的不确定性。
大约在同一时间，一名同事在我的办公室开完会后，手在门上受伤了。他很痛苦，且明显地情绪激动。这一次，泪水完全没有让我感到不安；作为我知道如何处理的问题的一部分，这些眼泪是合理的。我确认他没有大碍，并直接采取了我接受过培训的机构安全操作程序。然而，事后我面临一个令人不安的问题：为什么当泪水反映的是生理疼痛而非情感痛苦时，我的反应如此不同？
思考这两种情况后，我意识到我需要给情感性哭泣留出更多空间，并对其传递的信号保持开放。那位职业生涯早期的同事情绪不佳的信号一直存在——犹豫、语调的细微变化、不确定的时刻。哭泣仅仅是将已经积累的情绪可视化了。我开始思考，我是否在传递信息时过于直接，以及我本可以做些什么来减轻这对她产生的情感冲击。而且，我本可以将她的哭泣视为一个机会，从而更好地了解她这个个体，而不是将其视为一个问题。
在学术界，我们很少接受过如何应对同事在面前崩溃的训练。但这件事与如何处理身体疼痛的哭喊同样重要。现在，当我的合作者开始流泪时，我知道不应该将其轻视，也不应立即试图让问题消失。我会尝试放慢对话速度，为这种反应留出空间。我会更加关注导致那一刻发生的起因，包括我说了什么以及我是如何说的。只有在之后，我才会回到触发该反应的问题上。
我仍然能感觉到早年那种不安的痕迹。但我不再将其视为需要消除的东西，因为在这些时刻，其影响深远。它们可以引导出更开放、更诚实的交流，并标志着对话发生了重要转向——从常规讨论转向更具深意的话题。眼泪可以标记出职场生活中决定最为关键的时刻：是留下还是离开，进展是否足够，或者某条路径是否依然可行。
我有时会回想起早年在办公室里的那次遭遇。今天，我会告诉年轻时的自己：我不需要去“修理”那个在哭泣的人，也不需要逃避这种情绪反应。这些眼泪应该提醒我，作为一名教师和同事，我的职责不仅仅是为了更好的绩效而领导，还要接纳那个处于该时刻背后的完整的人。
有时，最有用的做法不是止住泪水，而是注意到这些泪水可能在告诉我们关于这个人的什么，以及关于我们共同的职场生活的什么。
Gavin Schwarz 是新南威尔士大学 (UNSW) 商学院的教授。您有有趣的职业故事想分享吗？请参阅我们的作者指南：https://scim.ag/WorkingLife。
插图：ROBERT NEUBECKER
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In Malawi, aid cuts have meant new mothers like Josophine Phiri can face long waits for care. 236
225 AI in scientifi c publishing: Slower, worse, and more expensive —H. H. Thorp
226 As the Arctic warms, gray whale boom turns into a bust Scientists point to changes that jeopardize the marine mammals’ critical feeding grounds —W. Cornwall
228 In a billion-dollar gamble, NSF bets on research with an economic payoff New X-Labs initiative aims to develop breakthrough technologies—but academics aren’t sure they are welcome —J. Mervis
229 NSF bans almost all research collaborations with China Agency drops attempt to mitigate risk in favor of outright prohibition on working with most Chinese research institutions —J. Mervis
PHOTO: THOKO CHIKONDI
230 Scandinavian radar array will probe mysteries of the aurora EISCAT_3D will paint a new picture of the upper atmosphere as it is roiled by solar outbursts —R. Stone
232 U.S. researchers express outrage over proposed changes to managing federal grants White House receives 340,000 comments on rules many fear would politicize science —J. Mervis
233 Tree-killing beetle is spreading to urban forests around the world As researchers piece together the pest’s global trek, countries are working to contain the growing threat —E. Pennisi
234 Spain’s largest research body confronts its dark past Spanish National Research Council has published the stories of some 500 staff purged under Francisco Franco’s dictatorship —E. Pain
FEATURES 236 An uncertain path After the shocks of 2025, Malawi is rethinking its relationship to foreign aid—and trying to protect dramatic gains in maternal health —C. Offord
PODCAST
PERSPECTIVES 242 Lymph nodes now optional A subset of dendritic cells orchestrates the formation of tertiary lymphoid structures in tumor tissues —W. K. Decker
243 Recovering lost origins Integrated evidence helps triangulate the origins of African slaves buried on St Helena —R. A. Bentley
244 Tidying up aging organs A prostaglandin prevents macrophages from clearing toxic neutrophils in aging organs —G. A. FitzGerald
246 Bringing radioactive molecules to the table A compact source of radioactive molecules could enable new tests of fundamental physics —L. Caldwell
LETTERS 247 Seabed mining requires timely governance —C. Rühlemann
248 Social calibration of sycophantic AI —S. Meng
248 Response —M. Cheng et al.
POLICY ARTICLE 249 The rise and fall of the Amazon Soy Moratorium Challenges to the voluntary zero- deforestation pact could impose costs for forests and the soy sector —L. Rausch et al.
Sediment cores sampling the now-exposed regions of the Aral Sea basin show how drying has caused large carbon fluxes from desiccated terrains there.
252 Regaining your voice AI speech neuroprostheses can restore day-to-day communication after neurological injury —S. Stavisky
HIGHLIGHTS 255 From Science and other journals
RESEARCH SUMMARIES 258 Transcriptomics Cross-cohort analysis of expression and splicing quantitative trait loci in TOPMed —P. Orchard et al.
259 Cell biology A transcriptional biosensor reveals mechanisms of α-ketoglutarate signaling to chromatin —A. C. Sternisha et al.
Science serves as a forum for discussion of important issues related to the advancement of science by publishing material on which a consensus has been reached as well as including the presentation of minority or conflicting points of view. Accordingly, all articles published in Science—including editorials, news, commentary, and book reviews—are signed and reflect the individual views of the authors and not official points of view adopted by AAAS or the institutions with which the authors are affiliated. Science (ISSN 0036-8075) is published weekly on Thursday, except last week in December, by the American Association for the Advancement of Science, 1200 New York Avenue, NW, Washington, DC 20005. Periodicals mail postage (publication No. 484460) paid at Washington, DC, and additional mailing offices. Copyright © 2026 by the American Association for the Advancement of Science. The title Science is a registered trademark of the AAAS. Domestic individual membership, including subscription (12 months): $165 ($74 allocated to subscription). Domestic institutional subscription (51 issues): $3125; Foreign postage extra: Air assist delivery: $135. First class, airmail, student, and emeritus rates on request. Canadian rates with GST available upon request, GST #125488122. Publications Mail Agreement Number 1069624. Printed in the U.S.A. Change of address: Allow 4 weeks, giving old and new addresses and 8-digit account number. Postmaster: Send change of address to AAAS, P.O. Box 96178, Washington, DC 20090–6178. Single-copy sales: $15 each plus shipping and handling available from backissues.sciencemag.org; bulk rate on request. Authorization to reproduce material for internal or personal use under circumstances not falling within the fair use provisions of the Copyright Act can be obtained through the Copyright Clearance Center (CCC), www.copyright.com. The identification code for Science is 0036-8075. Science is indexed in the Reader’s Guide to Periodical Literature and in several specialized indexes.
260 Seismology Cyclic sealing and drainage on an oceanic transform fault —H. Yang et al.
261 Immunology Direct interaction of Vδ7 TCRs with IL17RA drives the differentiation of TH1-like γδT cells —K. Ye et al.
262 Archaeology Tracing the origins of St Helena’s liberated Africans —X. Wang et al.
263 Cancer immunology Dendritic cells control tertiary lymphoid structure development and maintenance in cancer —R. Mattiuz et al.
264 Aging Restored clearance of senescent neutrophils by tissue-resident macrophages limits organ aging —Y. J. Tan et al.
RESEARCH ARTICLES 265 Paleontology Performance trade-offs define a fundamental dental dichotomy in mammals —N. Chatar et al.
272 Electronic materials Surface-dominant transport in Weyl semimetal NbAs nanowires for next-generation interconnects —Y. Cheon et al.
280 Nanomaterials Geometrically driven reversible solid-liquid phase transition at the atomic scale —W. Cui et al.
287 Solar cells Spatiotemporally homogeneous crystallization for ambient scalable perovskite photovoltaics —B. Gao et al.
294 Quantum engineering Robust single-electron memory with quantum states manipulation —C. Liu et al.
300 Carbon cycle Drying of the Aral Sea reshapes the anthropogenic carbon inventory of Central Asia —R. Marcé et al.
306 Neurophysiology Parallel independent voltage computing along dendrites of CA3 pyramidal neurons —A. Noguchi et al.
313 Protein engineering Structure and evolution-guided design of minimal RNA-guided nucleases —P. Skopintsev et al.
319 Molecular physics Production and spectroscopy of cold radioactive molecules —C. J. Conn et al.
ON THE PODCAST
Health care in Malawi
after USAID’s end, and a rocky exoplanet with
an atmosphere
326 What tears can say —G. Schwarz
324 New Products 325 Science Careers
PHOTO: LAURA CARRAU
T
here’s a saying in the management world, popular- ized by NASA administrator Daniel Goldin in the 1990s, that the goal of technological improvements is to make products faster, better, and cheaper. Al- though this strategy had some success in the aero- space industry, the zealots of artificial intelligence (AI) have been making the same argument regarding how it will trans- form work, claiming that so little human effort will be required that humanity will enter an era of radical abundance, free from disease, drudgery, and danger, among other benefits, leaving society with more time for creative pursuits. But history tells a different story. When machines began to increase productiv- ity during the second industrial revolution, American engineer Frederick Winslow Tay- lor’s The Principles of Scientific Management encouraged corporations to use surveillance to get employees to work harder and longer, an approach that exhausted and discouraged workers and led to the transfer of knowledge and any decision-making from workers to management, while enriching the profits for only those at the top. Yet, it remains founda- tional to the American economic enterprise. Indeed, scientific publishing is starting to ex- perience some Taylorism with the insertion of AI. Rigorous human checking of AI-generated research papers is creating bottlenecks as pub- lishers strive to maintain the integrity of the scientific record. The challenge is requiring even more human effort, making the whole endeavor slower and more expensive.
Recently, the ability of large language models (LLMs) to pre- dict protein structures and to accelerate the discovery of new materials has revolutionized both fields. New AI agents can now carry out many aspects of research design and analysis. But there is a dark side. A recent paper describes how an LLM “still struggles in areas requiring nuanced clinical judgment, experimental reasoning, or deep biological thinking and syn- thesis.” In addition, some of these agents are more likely than humans to engage in what amounts to research misconduct such as cherry-picking data and manipulating statistical anal- yses until a desired result is achieved. When the agents then generate papers describing the findings, they are likely to make more errors, including hallucinating references, some of which have already made their way into the literature.
Over time, the models may well improve and correct some of these behaviors, but it was recently argued that as long as LLMs
Slower, worse, and more expensive
are used in research, these errors will always exist. LLMs work not by seeking truth or through logical reasoning but by making probable connections. And efforts to improve these programs to avoid unwanted behaviors may be all for naught because LLMs tend toward sycophantic behavior that keeps the user engaged.
These factors are complicating scientific publishing. The rate of research submissions at Science and other journals is increas- ing because conducting research and producing papers are ac- celerating. But because more papers contain more AI-generated errors, greater human oversight is required to check the find- ings. There are tools (many AI-based) that help catch errors, such as fake citations and nonsensical phrasing, but every au-
information…
AI profi teers
The creation of robust human-curated sci- entific literature has never been more crucial. The propagation of AI slop in the scientific record and generally on the internet is mak- ing science less trustworthy. But in parallel, AI enthusiasts are telling the world that the remedies should all be easy to automate, creating the impres- sion that journals can not only catch more errors but also do it more efficiently and cheaply. That’s not the reality for scientific publishing right now or likely in the future. Other workplaces, such as warehouses and trucking, are experiencing the similar challenges of surveillance in the face of the need for greater hu- man effort, which again, keeps American AI-driven productivity closer to Taylorism than to Goldin’s mantra. The history of Tay- lorism indicates that society should fight to protect the welfare and agency of those being pushed to do too much by technology in the name of production.
If the scientific community fails to address the influence of AI, then authentic research and validated findings will slow down to an expensive trickle into established knowledge, and the opportunities for flawed or fabricated information to be seen as reality will grow—all while AI profiteers cash in.
H. Holden Thorp is Editor-in-Chief of the Science journals. hthorp@aaas.org
tomated report requires further human effort to interpret the findings and work with the authors on addressing them and either revis- ing the paper or deciding not to publish it at all. This also holds for AI tools that check for image manipulation, plagiarism, and referenc- ing. However, AI tools don’t catch all errors, and they can also generate false positives, in- correctly flagging genuine human research as AI-generated.
10.1126/science.aek5570
Scientists point to changes that jeopardize the marine mammals’ critical feeding grounds
W
hale CRC-2293 was once part of a celebrated revival, a member of a burgeoning population of gray whales (Eschrichtius robus- tus) in the eastern Pacific Ocean. The population, once depleted by commercial hunting to just a few thousand animals, had flourished following the 1980 moratorium on most whale hunts, to the point that it was deemed to no longer need protection under the U.S. Endan- gered Species Act.
But the bloated corpse lying here on a beach in Washington state in mid-June marked a worrisome new development. Since 2019, gray whales have been washing ashore in unusu- ally high numbers as they migrate
A team performs a necropsy on a gray whale that washed ashore on the Washington state coast in June.
As the Arctic warms, gray whale
WARREN CORNWALL, in Ocean Shores, Washington
from Mexico, where they overwinter and give birth, some 8000 kilometers to their Arctic feeding grounds. The death toll slowed for several years. But in the past 2 years it has surged again toward record levels up and down the North American coast while overall populations have fallen to less than half their peak.
Scientists are now predicting a sustained decline. The likely cause: what Joshua Stewart, a marine ecologist at Oregon State University (OSU), calls “a fundamental regime shift in their feeding grounds in the Arctic,” a region warming four times faster than the global average.
“It’s a whole lot of bad happening at once,” biologist Jessie Huggins de- clared, as she stood next to the bus-
size carcass, one of at least 145 gray whales that have been found dead this year from Mexico to Alaska.
In bright orange overalls, rubber boots, and white latex gloves, Huggins has a particularly intimate view of the losses. As head of the marine mammal stranding program for the nonprofit Cascadia Research Collective, she’s called on to perform a necropsy almost every time a whale washes ashore in Washing- ton. In a typical year, that means approximately six gray whales. The whale she was slicing open was No. 30 so far this year, just four short of the 2019 state record.
Her work has revealed that many of the dead animals are emaciated and show signs of starvation—a find-
PHOTO: W. CORNWALL/SCIENCE
ing that has been echoed by similar examinations in British Columbia and elsewhere. Meanwhile, fewer calves are being born in Mexican waters, and scientists have clocked a population decline that started soon after whale numbers peaked at nearly 27,000 in 2016. The most recent population estimate, from 2025, suggests current numbers could be about 13,000, the lowest since the 1970s.
This time, though, the rise in stranding numbers as well as falling annual counts of whales swimming past Monterey, California, on their southward journey indicate a sus- tained bust. “It feels quite different,” Stewart says. “If anything, this up- tick in strandings is reinforcing this narrative of a major climate impact.”
Researchers point to a decline in amphipods as a leading problem, particularly in the northern Bering Sea, which was once prime feeding ground for these whales. Today the amphipods occupy a much smaller part of the area known as the Chirikov Basin, says Jackie Grebmeier, a biological oceano- grapher at the University of Mary- land Center for Environmental Sci- ence who studies amphipods there. Changes in ocean currents through the basin over the past 2 decades that are thought to be tied to global warming have altered sediment on the sea floor, making much of it in- hospitable to burrowing amphipods.
Where the shrimplike creatures remain, they are also smaller in size, meaning fewer calories per gulp for foraging whales. That could be because hungry whales are overfish-
ing what amphipods are left, catching the bigger shrimp while the smaller ones escape between the bony plates of baleen in the whales’ mouths, Grebmeier says. Or the amphipods, which feed on lipid-rich algae that grow under the sea ice, could them- selves be running short of food as ice dwindles in the Bering Sea.
The end result is that “you used to have this size of a pizza,” Grebmeier says of the overall amphipod population in the Bering Sea, gesturing with her hands. “Now you only have a slice.”
Sue Moore, a University of Wash- ington marine ecologist who studies gray whale ecology, suspects the spike in whale deaths might be tied to ecological changes brought on by a marine heat wave that battered the Bering Sea in 2018 and ’19. The heat is already blamed for record-low ice levels and a mass die-off of billions of snow crabs. That could mean ecosystems will no longer be able to sustain the same whale numbers as in the past. “It’s looking like some kind of tipping point to me,” Moore says.
looking like some kind of tipping point to me.
On the beach in Ocean Shores, Huggins climbed onto the whale’s flank and used a filleting knife to cut out a chunk of skin and underly- ing blubber. The fat layer showed signs that the whale was starving. A well-fed whale’s blubber is white and soft. Huggins told her 15-year-old daughter and assistant, Grace Foster, to write on a clipboard that this blubber was stiff, watery, and pink.
The whale’s intestines, once they spilled from the abdomen, bore more clues to its desperate condi- tion. The organ was packed with bits of wood and little else, a sign that it was foraging near shore in un- productive waters. “It was able to find some food, but not enough,” Huggins explained to three onlook- ers who braved the stench of rotting flesh to watch the necropsy unfold.
Then a plot twist emerged. At the back of the whale’s jaw, near its ear, an incision revealed a fracture. Huggins reached deep into the rot- ting tissue and pulled out several chunks of splintered bone. She stuffed them into plastic bags des- tined for a lab, where patho- logists would see whether the dam- age occurred while the whale was still alive. Even if it turns out a collision with something like a boat was the immediate cause of death,
Huggins noted that starvation could still have contributed if it drove the animal into perilous waters in search of food or slowed its reac- tions to oncoming marine traffic.
That problem is evident in Cali- fornia’s San Francisco Bay, where as many as three dozen gray whales have appeared in search of food in recent years. Nearly half that many were spotted this year in the bay, which is rife with boats. Thirteen whales were found dead in the area, and boat strikes are suspected in as many as six, according to the California-based Marine Mammal Center. To address the growing prob- lem, authorities in May launched a new whale-detection system de- signed by researchers at the Woods Hole Oceanographic Institution that sends out alerts in real time.
In other areas gray whales have been changing their feeding behavior, eating herring eggs in Alaska, ghost shrimp in Washing- ton, and zooplankton in Oregon. On their Arctic feeding rounds, more individuals are turning up in the Chukchi Sea, north of the Bering Sea, Moore says. Sightings suggest the whales there are feeding on krill, which swim in the upper parts of the ocean.
Taylor Azizeh, an OSU Ph.D. student supervised by Stewart, is working to understand how the whales are changing their diets and whether that improves their odds of surviving. She is analyzing tissue samples from gray whales in the Arctic going back to the 1990s, look- ing for changes in isotope signatures tied to different prey. She is also gathering tiny tissue biopsies taken from whales off the California coast as they head south to Mexico, to see whether their diet correlates with how plump they are.
Dietary flexibility might help the whales endure changes in the Arctic, Stewart says. But given the ongoing declines, he doubts it is completely replacing the lost food. Ecosystems that once supported 20,000 whales or more might, in the future, only be able to sustain half that number, he said.
“We don’t have a good prediction of where the prey supply will be in the future,” he says. “We just know it’s impacted by climate change and it’s going down.”
Sue Moore University of Washington
T
In a billion-dollar gamble, NSF bets on research with an economic payoff
New X-Labs initiative aims to develop breakthrough technologies— but academics aren’t sure they are welcome JEFFREY MERVIS
Quantum computing is among the areas supported by the National Science Foundation’s new X-Labs program.
his week the National Sci- ence Foundation (NSF) got the first hint of whether a massive new investment in applied research can buy techno- logical breakthroughs rivaling the internet. Monday marked the first of two July deadlines for proposals to a $1.5 billion NSF initiative called X-Labs, which it launched less than 2 months ago.
The agency has also created an incentive structure for X-Labs that is radically different from traditional grants, where the payoff is often limited to published results in pres- tigious journals. Instead, the X-Labs teams would win more funding—up to $300 million over 6 years—for meeting a series of ambitious mile- stones for scaling up discoveries into commercially viable technolo- gies capable of spawning entire new industries. The first two topics are interconnected quantum systems and photonics and new instrumenta- tion for sensing and imaging.
“We want to support disruptive advances in these fields … by non- traditional research organizations,” says Erwin Gianchandani, head of NSF’s Technology, Innovation and Partnerships (TIP) directorate,
which is sponsoring the initiative. Speaking at one of several webinars held to explain it, he told the audi- ence to “be creative, both in putting together your team and choosing the problem you want to tackle.” The NSF solicitation also requires teams to show they can make quick decisions on such things as hiring, procurement, contracting, and as- signing intellectual property rights, a not-too-subtle dig at the ponder- ous bureaucracy at most academic institutions.
That approach makes a lot of sense to David Awschalom, a quan- tum physicist at the University of Chicago who is assembling a team to submit a proposal. “One of the biggest challenges in research today is how to bridge the gap between proof-of-concept demonstrations, which is what academic labs do, and building a scalable technology, which is what industry does,” he says. “The X-Labs are a wonderful example of one way to do that.”
But Mini Das, an applied physi- cist at the University of Houston, says she doesn’t understand why NSF would want to exclude its core audience from an initiative that will require the best scientific minds. “If you’re looking for breakthroughs, you certainly want to include academics, because novel science eventually turns into new technolo- gies,” says Das, who plans to submit a proposal for new 3D imaging tech- nologies that can accelerate medical diagnoses and treatments as well as spur innovation in other fields.
Pamir Alpay, a materials scientist and provost at the University of Connecticut (UConn), applauds NSF for launching the X-Labs initia- tive. But he says its initial 14 May announcement was a deterrent to UConn. “They were basically saying we don’t want academic institutions to apply,” he recalls. “So we haven’t pursued it.”
The red light for Alpay and oth- ers was the requirement that the principal investigator (PI) and other “senior key personnel” devote 100% of their time to the project once it moves from a 9-month planning pe- riod into full operation. That would essentially rule out a major role for faculty members, who have teaching and service obligations in addition to their research.
PHOTO: ANGELA WEISS/AFP VIA GETTY IMAGES
“intended to include universities and other existing research institutions from the incep- tion,” an NSF spokesperson said in response to queries from Science. “Based on feedback from the community, NSF amended the funding opportunity.” But the revised notice retained the 100% rule, and NSF officials have given mixed signals during the webi- nars about how much the eligibility require- ments have really changed.
“Yes, absolutely, we expect them [academic scientists] to be key personnel,” said one TIP staffer during a webinar the day the revision was posted. A few minutes later, however, another staffer said, “I think it will be chal- lenging to maintain [one’s] current rela- tionship with the university.” TIP staff also suggested faculty members essential to the X-Lab’s success might need to take a leave of absence or, conversely, accept a lesser role in the project if they wish to maintain their current university status.
A regular NSF grant doesn’t require the PI to devote all their time to that project, and many faculty members manage multiple fed- eral grants simultaneously. Awschalom, for example, also directs the Chicago Quantum Exchange, a hub for work in the field across the state of Illinois that was a finalist in the latest round of NSF Regional Innovation Engine, another TIP program that is also in- tended to accelerate technology transfer but emphasizes boosting local economies.
Alpay worries NSF could fall short of its goal for the X-Labs—and wind up spending a lot more money—if most teams are led by researchers at companies or other non- academic organizations that haven’t previ- ously received NSF funding. “Over time, uni- versities have built up the type of research infrastructure that will be needed,” he says. President Donald Trump’s administration has criticized the high overhead rates that universities receive from the government to reimburse them for the cost of doing federal research, he notes. “But I wonder what a new organization without the existing infra- structure would charge in overhead,” he says. “I wouldn’t be surprised if the rates were much higher.”
Although NSF staffers have urged webinar participants to “think big,” applicants must cram their revolutionary ideas for an X-Lab into an eight-page proposal. Under an accel- erated review schedule, those emerging from an in-house vetting will make oral presenta- tions to NSF by the end of August. The first cohort of winners will be announced in the fall, NSF says, with the number “subject to the availability of funds and the strength and quality of proposals received.” NSF has also left open the possibility of expanding X-Labs to other fields that are priorities for the Trump administration such as biotechnology.
NSF bans almost all research collaborations with China
Agency drops attempt to mitigate risk in favor of outright prohibition on working with most Chinese research institutions
T
he U.S. National Science Foundation (NSF) has de- cided to ban collaborations between every U.S. scientist it funds and nearly all Chinese research institutions and their employees. The new policy abandons NSF’s earlier attempt to balance the potential risks and benefits of such collaborations. But it puts the agency in step with actions taken earlier this year by the much larger Department of Defense (DOD) and with congressional Republicans, who assert that any interactions with China threaten national security.
for U.S. science. Very damaging!
Peter Michelson Stanford University
The new policy, posted on 8 July and still being digested by university administrators, relies on lists of so- called restricted entities maintained by DOD and other federal agencies. The lists, which are in constant flux, contain the names of hundreds of leading Chinese universities, national laboratories, and other research in- stitutions. Any interactions with “the employees of such restricted entities” is also taboo, the NSF policy notes.
There are a handful of notable omissions, including Tsinghua Univer- sity, which 2 weeks ago announced it had hired away the 2025 winner of the Nobel Prize in Chemistry, Omar Yaghi, from the University of California, Berkeley. At the same time, observers predict U.S. universities are likely to play it safe by avoiding all interactions with their Chinese counterparts.
agency wanted to preserve some collaborations with China while mitigating the possibility of economic or military espionage of vital U.S. tech- nologies. “We cannot continue to lead the world in science and innovation if we are fixated on achieving zero risk related to research security,” explained Rebecca Keiser, now NSF’s chief of staff, in unveiling a new metric, called Trusted Research Using Safeguards and Transparency (TRUST), to “assess grant proposals for potential national security risks.”
But TRUST now appears to be history with respect to China and other countries deemed to pose a threat to U.S. national security. “NSF has determined research security risk mitigation for NSF-funded projects involving these restricted entities is not sufficient,” the new policy reads.
Representative John Moolenaar (R–MI), chair of the Select Committee on China in the House of Representa- tives, called NSF’s move “commend- able and commonsense” in a press release last week and urged other federal agencies to “follow the lead of the Pentagon and NSF.” But many scientists think it’s a bad idea that ig- nores the benefits for both sides from U.S.-Chinese collaborations.
good for U.S. science. Very damag- ing!” says Stanford University physicist Peter Michelson, who last year orga- nized a petition signed by hundreds of Stanford faculty protesting Moolenaar’s attempt to insert lan- guage further restricting collabora- tions with China into a bill that provided policy guidance to DOD. Moolenaar failed, but he continues to advocate for such legislation.
Longtime China watcher Denis Simon is even more distraught. “The NSF policy gives Moolenaar an open playing field to put anybody on the [banned] list, and I think that’s even- tually what will happen,” says Simon, former executive vice chancellor of a joint venture between Duke and Wuhan universities called Duke Kunshan University.
NSF is inviting comments on its new policy at researchsecurity@nsf. gov and plans to spell out the final version in the next update of its in- structions to grantees, which goes into effect on 1 October. Research advocates are hoping it will address many of their questions about the policy.
One of the biggest is the defini- tion of a research collaboration. Does it include casual conversations at a conference about publicly available re- search, or joint authorship on a paper in which the authors worked inde- pendently? The National Institutes of Health and NASA, for example, appear to be limiting their grantees’ freedom to co-author papers with foreign scien- tists. “Co-authorship is not necessarily equivalent to collaboration,” notes Kevin Wozniak of COGR, a nonprofit consortium of universities that tracks federal research policy. “But the National Institutes of Health calls it a factor” in deciding whether an interac- tion crosses the line, he notes.
The picture may become clearer this week, when Keiser and her counter- parts from NIH and the Department of Energy’s Office of Science are to appear before Moolenaar’s committee. But Simon, who is part of a group at the nonprofit Quincy Institute that advocates for the benefits of interna- tional research collaborations, doesn’t expect NSF to alter its policy signifi- cantly in response to community reaction.
“NSF until now has been very re- sponsible in assessing the pros and cons of any interaction with China,” Simon says. “But in the current po- litical climate, that’s no longer a ten- able position for a federal agency.”
Scandinavian radar array will probe mysteries of the aurora
EISCAT_3D will paint a new picture of the upper atmosphere as it is roiled by solar outbursts RICHARD STONE, on Svalbard in Norway T
he images captured in 2017 looked wrong. Against the pale winter sky above the Norwegian archipelago of Svalbard, tiny green smudges hovered beside an auroral curtain. The fragmented auroralike emissions (FAEs) were only a few kilometers across and lasted less than 1 minute. Most puzzling of all, they seemed to ignore invisible magnetic field lines that normally define the contours of the northern lights. “They really are a weird little thing,” says Katie Herlingshaw, a space physicist at the Uni- versity Centre in Svalbard (UNIS).
A major new instrument may finally provide answers. This fall, European Incoherent Scatter (EISCAT) AB, an inter- national organization headquartered in Sweden, plans to unveil EISCAT_3D, a $65 million next-generation radar system that will allow researchers to probe the upper atmosphere as never before. To- gether, the arrays being assembled across northern Scandinavia promise to be “the most advanced incoherent scatter radar in the world,” says Thomas Ulich, head of sci- ence for EISCAT AB, offering a panoramic
view of the ionosphere—a high-altitude layer of electrically charged plasma—as it is roiled by solar storms.
Because the contours of Earth’s mag- netic field funnel energetic particles into the atmosphere near the poles, northern Scandinavia is a good place to observe those disturbances, which aren’t just a scientific mystery. They can disrupt high- frequency radio links, increase atmo- spheric drag on low-flying satellites, and make signals from GPS and other space-based navigation systems flicker as they pass through disturbed plasma. EISCAT_3D should help scientists un- derstand those threats. It will also track growing swarms of space debris, another hazard for spacecraft.
Those practical payoffs give EISCAT_3D urgency. And for researchers, the instru- ment’s debut comes at a scientifically tan- talizing moment. “We’re in a golden age of auroral discovery,” says Stephan Buchert of the Swedish Institute of Space Physics.
Many of the surprises have come from a global network of aurora chasers. Amateurs have had eyes on the aurora
PHOTO: EUROPEAN INCOHERENT SCATTER AB, KIRUNA, SWEDEN
since the 19th century, when ship captains and monks, for example, mailed observations to scientists in Scandinavia, says Maxime Grandin, a space physicist at the Finnish Meteorological Institute. Nowadays, he says, thanks to social media and smartphone images with accurate timestamps, “citizen scientists have transformed auroral science.”
The “dawn of this new era,” Grandin says, was the discovery of STEVE, a narrow ribbon of mauve light that can stretch hundreds of kilometers across the sky and appears farther south than ordinary aurorae. The spectacle attracted widespread scientific atten- tion only after aurora buffs shared images online in the early 2010s. By combining photos with satellite measurements, researchers eventually showed that STEVE is associated with a narrow channel of heated plasma and fast-moving charged particles in the upper atmosphere.
The auroral menagerie continued to grow as amateurs helped reveal wave- like “dunes” and rapidly moving green streaks that are seen together with STEVE, dubbed the “Picket Fence.” Re- searchers on Svalbard recently added another curiosity: a faint pinkish “ghost aurora” that may involve highly excited nitrogen and oxygen mol- ecules. FAEs add still more intrigue.
Aurora enthusiasts began to report fragments about a decade ago, and they remain unexplained.
An antenna array in Sweden is one of three European Incoherent Scatter 3D sites designed to capture radar pulses bounced off the upper atmosphere.
Hundreds have been spotted near Svalbard, whose location may be key to solving the puzzle. The archi- pelago sits beneath the magnetic field’s dayside cusp, the funnellike region where charged particles from the Sun stream into Earth’s upper atmosphere, triggering aurorae. Yet the FAEs seen there appear to arise differently, from processes within the ionosphere itself. “We don’t under- stand some of the fundamental phys- ics,” Herlingshaw says.
EISCAT_3D is expected to peel back the curtain and expose the inner workings of FAEs and other newfound auroral features. With backing from its member nations—Finland, Norway, Sweden, China, Japan, and the United Kingdom—the organization has installed a transmitter-receiver array in Norway that aims powerful radar beams at the upper atmosphere, as well as thousands of receiver anten- nas in Finland and Sweden to capture the weak echoes scattered from free electrons in the ionosphere.
Current incoherent scatter radars probe the atmosphere along narrow lines of sight—like “drilling a hole in a glacier,” Grandin says. “You might be missing something super interesting a couple kilometers away, or even a few meters away.” In contrast, EISCAT_3D’s trio of antenna arrays will “paint the sky,” as project docu- mentation puts it, building 3D images of the upper atmosphere and allowing scientists to view phenomena such as FAEs in their full spatial context. “You can start looking at the energet- ics of the entire upper atmosphere,” Grandin says.
Barring “unforeseen complications,” Ulich says, a partial configuration of EISCAT_3D will be up and running late this year—just in time to catch the tail end of the Sun’s most active phase in its 11-year cycle. “We’re at solar max now,” says Lisa Baddeley, a space physi- cist at UNIS, “but it’s going to start to peter out soon.”
EISCAT_3D managers are currently working out how to allocate use of the radar to scientists from nonmember countries. They expect high demand, because EISCAT_3D is bound to reveal phenomena no one has yet imagined, Herlingshaw says. “It will be an abso- lute revolution.”
BOOST FOR TAILORED GENE TREATMENTS Building on a groundbreaking gene- editing treatment that helped heal a sick baby boy, the U.S. government is awarding up to $160 million over 5 years to develop and test therapies tailored to the disease mutations of individuals. The Advanced Research Projects Agency for Health will fund seven teams working on personalized CRISPR or other kinds of gene editors for children born with rare, life-threatening disorders affecting the bone marrow, immune system, skin, heart, brain, liver, blood, and blood vessels. The recipients include researchers at the Children’s Hospital of Philadelphia who last year devised a gene editor to fix a DNA flaw in the liver cells of an infant called Baby KJ, allowing him to avoid a liver transplant. —Jocelyn Kaiser
IMPERILED SPECIES LOSE PROTECTION President Donald Trump’s administration has weakened U.S. biodiversity conservation by significantly reducing habitat protection under the Endangered Species Act. That law prohibits the unmitigated “take” of listed species, which federal agencies have for decades understood to mean not just killing a plant or animal, but also jeopardizing its survival by harming its habitat. The Supreme Court upheld that interpretation in 1995 and the law has, for example, forced energy companies to reroute pipelines to protect species such as the Gunnison sage grouse. The change will ease development and protect private property rights, proponents say. Conservationists note that habitat loss imperils some 80% of endangered species; they will challenge the rule change in court. —Erik Stokstad
PRIMATE SANCTUARY PLAN SCRAPPED The Oregon Health and Science University has apparently abandoned a controversial plan to turn the Oregon National Primate Research Center into a sanctuary. The university’s president last week told faculty leaders that a lack of support from the U.S. National Institutes of Health had doomed the project, a source tells Science. The future of the center—one of the largest academic monkey facilities in the United States—remains uncertain, however. Research has continued since the plan was announced, but pressure from the university and state legislature, as well as a federal desire to phase out monkey studies, could ultimately force the center to close or restrict the research it does. —David Grimm
It’s terrifying … that one country
for everybody in the world.
Astronomer Samantha Lawler of the University of Regina, in The New York Times,
commenting on a decision by U.S. regulators to approve a firm’s plan to test a satellite that will use an 18-meter mirror to reflect sunlight back to Earth at night.
U.S. researchers express outrage over proposed changes to managing federal grants
White House receives 340,000 comments on rules many fear would politicize science
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he U.S. science community this week finished regis- tering its overwhelming opposition to a sweep- ing proposal by President Donald Trump’s administration to impose tighter political control over how the federal government manages trillions of dollars in federal grants and contracts, including those spent on research.
Now, scientists and others are waiting to see how the administra- tion responds to the outpouring of more than 340,000 comments on the 412-page proposal that were submit- ted by the 13 July deadline. The administration has said it wants to finalize the new guidelines by 1 October.
Many research advocates reacted with alarm on 29 May when the White House Office of Management and Budget (OMB) released the proposal, which among other things would allow political appointees to
review agency decisions on what science to fund, arbitrarily terminate grants, and prohibit research collab- orations with China and many other countries. Science, higher education, and patient advocacy organizations quickly called on their members and allies to submit comments—and tens of thousands appear to have responded.
At press time OMB had only posted 52,000 of the comments it received, making it impossible to assess how many commenters in the overall pool favored or opposed the changes to what is officially known as the Guidance for Federal Finan- cial Assistance.
Individual comments oppos- ing the changes often used strong language, however. “If I didn’t know better, I would think you guys were Chinese agents trying to destroy the American technological advan- tage,” wrote Joseph Savina, a retired scientist. “As a practicing physicist in the defense industry, I can confi- dently say that passing this rule will
guarantee European and Chinese scientific and military dominance for generations,” commented Jonathan Rameau.
Higher education organizations were more polite but no less alarmed by the potential consequences of the new marching orders, often called “uniform guidance,” for federal agen- cies. “These changes risk under- mining the predictability, stability, impartiality, and collaboration upon which America’s entire research- and-innovation system depends,” wrote the Association of American Universities (AAU), which represents 69 leading research institutions.
AAU’s 47-page comment is the lon- gest on a proposed government ac- tion in the group’s 126-year history. Among other things, it argues that OMB does not have the authority to give political appointees the final say over which grants are funded or terminated. Congress hasn’t given OMB the power, AAU asserted, “to define which categories of scientific research may be federally funded; to restrict the international scholarly collaborations that Congress has elsewhere specifically authorized, or to make the receipt of federal research funding contingent on an institution’s adherence to contested positions about civil rights law, scientific inquiry, and arbitrary and political decisions about what is in the national interest.”
Given OMB’s legal requirement to respond to every unique comment, groups urged their members to avoid form letters and explain how they would be personally impacted by the changes. And commenters delivered plenty of examples.
Cynthia Toth, a vision researcher and clinician at Duke University who works with children, wrote that a provision enabling officials to abruptly terminate a grant if it is “considered inconsistent with program goals” would create un- certainty that would have “a devas- tating impact” on her ability to re- cruit children for clinical trials—and
could potentially put those patients in danger if a study is halted with little notice. And provisions limiting international collaborations would make advancing some treatments im- possible, she wrote, because her field is small, so “clinician-scientists pool cases together across an international network. … As written, these provi- sions will set back the advancement of medical knowledge and health care in the U.S.”
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Commenters supporting the pro- posal often argued that the proposed rules would help the government reduce waste, fraud, and abuse. A let- ter from Senator Jim Banks (R–IN), for instance, decried how “taxpayer dollars have supported unlawful ac- tivities” and insisted that “OMB has clear legal authority to deny federal funding in support of these projects.”
Some backers concede the proposal—which repeatedly refers to the need to stamp out spend- ing on “woke” initiatives, such as those meant to nurture a diverse workforce—is, in part, a political statement. “This notice … will shut down millions in federal spend- ing on leftist mischief throughout the country,” Mike Gonzalez of the Heritage Foundation wrote recently on the organization’s website. “So of course they don’t like it.” The Heri- tage Foundation’s pre-election report, Project 2025, has underpinned many actions by the Trump administra- tion, including its campaign against “woke” science.
OMB rejected pleas from members of Congress, AAU, and others to ex- tend the comment period for several weeks or months. OMB has said the new rules would go into effect as soon as they’re finalized, and there is no indication it will give grantees time to prepare for them—AAU sug- gests 1 year.
Still, science advocates are hoping their outrage will put pressure on OMB to significantly revise its initial proposal—or convince Congress to intervene. That intervention could come in the form of language added to this year’s appropriations bills that would prevent the administration from spending money to implement the changes. However, lawmakers aren’t expected to complete work on those bills until after the November elections.
PHOTO: ANDREW J. JOHNSON
Tree-killing beetle is spreading to urban forests around the world
As researchers piece together the pest’s global trek, countries are working to contain the growing threat ELIZABETH PENNISI
t was named Oak City for a reason. Even a decade ago, the streets of Stellenbosch, South Africa, were lined with towering English oaks several hundred years old. European settlers had brought the species with them centuries ago, and it seemed to thrive.
But now the city’s oaks are dying, de- stroyed by the polyphagous shot-hole borer, an invasive beetle that infects oaks and at least 600 other plant species. Females drill a toothpick-size hole, lay eggs, and inoculate the wood with a fungus that produces fruit- ing bodies—food for the beetles after they hatch. The fungus and the beetle tunnels clog the tree’s water conducting channels, sometimes killing it. “We are losing a lot of the urban forest canopy,” says David Richardson, an invasion biologist at Stel- lenbosch University (SU). But the damage extends far beyond Stellenbosch.
The polyphagous shot-hole
The world’s trees are already under siege from a plethora of invasive insect pests—the emerald ash borer, the hemlock woolly adelgid, the European spruce bark beetle, to mention a few. But as their names suggest, many specialize on a single group of trees. The polyphagous shot-hole borer is an all-purpose threat, infecting many woody plants. What’s more, all it takes is one female to start an infestation, because unfertilized eggs can develop into males, which the female can then mate with.
Native to China, Taiwan, and Vietnam, the chia seed–size insect readily stows away in wood pallets, shipping crates, and plants, and it has reached not just South Africa, but a half-dozen other countries around the
world. Now, a study this week in the Jour- nal of Pest Science uses genetic tools to map its invasions and forecast future spread.
Piecing together the pest’s global trek has been challenging for researchers because several almost-identical shot-hole borers are loose on the planet. The polyphagous shot-hole borer (Euwallacea fornicatus), for instance, was in California for a decade before geneticists at the University of Cali- fornia (UC), Riverside sequenced its DNA and realized it was a new arrival. Previously, the pest had been misidentified as another less voracious invasive species, the tea shot- hole borer (E. perbrevis). “They are so damn small and similar,” says Jiri Hulcr, a forest entomologist at the University of Florida.
The new study has brought some clar- ity. An international team of researchers scoured the scientific literature, looking for reports of beetle sightings that used DNA analyses to distinguish the two spe- cies. The paper’s authors used the genetic data to build family trees and reconstruct how the insects’ likely spread, tracing at least six independent introductions of each species from their native ranges in Asia to other locales. “This study adds evidence showing how difficult it is to pre- vent the movement of nonnative insects,” says Angela Mech, a forest entomo- logist at the University of Maine.
The team also looked at the habitats and climate where the beetles are found now to project where they might show up in the future. The polyphagous shot-hole borer thrives in a broader range of temperatures and in drier climates than the tea shot-
borer is known to infect
more than 600 plant species around the world.
hole borer, and it seems to be a more aggressive colonizer. The team forecasts it could ultimately spread to parts of the Mediterranean region, the southeastern United States, Madagascar, nearly all of eastern Australia, and other places. The borer is “a perfect storm in progress,” says Esteban Ceriani Nakamurakare, a forest entomo- logist at Argentina’s National Scientific and Tech- nical Research Council and co-author of the new paper. If left unchecked, it “will fundamentally alter ecosystem structure and landscape dynam- ics wherever it gains a foothold.”
Ornamental and fruit trees seem to be particu- larly vulnerable. In South America, for instance, where shot-hole borers have spread along 3500 kilometers of coast since the pest was first de- tected in Brazil in 2020, Ceriani Nakamurakare and his colleagues have found that landscaping favorites, imported species such as box elders and plane trees, are common hosts. It’s not clear why. Ceriani Nakamurakare notes that because such trees are planted in parks and gardens, they get plenty of water, which appears to make them more attractive to the beetles. Others think stressful urban environments may weaken trees and make them more vulnerable. Hosts “are almost never healthy trees,” Hulcr points out.
The damage is not limited to urban forests, however. After the species arrived in South Af- rica in 2012, it felled trees in Stellenbosch, Cape Town, and other urban areas. But “it has now es- tablished strongly in many of South Africa’s na- tive forests and has started killing some species” there as well, says SU ecologist Francois Roets, who thinks the long-term consequences of these forest invasions will be “substantial.”
In the U.S., the beetle has moved from South- ern California, where it was initially detected, to the San Jose area. That’s fueled fears it may one day reach the almond, pistachio, and other crops in California’s fertile Central Valley. “It is a serious threat,” says Shannon Lynch, a forest pathologist at UC Davis who has been testing which tree spe- cies in California might be vulnerable.
Various groups are studying how to combat the pest’s spread. Paul Rugman-Jones, a UC Riverside entomologist, is exploring whether parasitoid wasps that are natural enemies of this borer can be used to control it in California. In Australia, Murdoch University entomologist Wei Xu recently succeeded in rearing the fungus and beetle pair in the lab—a development he hopes will help him zero in on control methods such as chemical attractants or repellents.
Australia spent $40 million pruning or removing 5000 trees in Perth after shot-hole borers were detected in the city in 2021. The effort failed to get rid of them, but according to a study published in January the beetle has yet to reach the best habitats, where its population could skyrocket. “Prevention and early detec- tion are critical,” Xu says.
Spain’s largest research body confronts its dark past
Spanish National Research Council has published the stories of some 500 staff purged under Francisco Franco’s dictatorship
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n February 1937, evolutionary biologist J.B.S. Haldane pub- lished a letter commending his colleagues at the National Mu- seum of Natural Sciences in Madrid for their resilience during the raging civil war. He singled out Antonio de Zulueta y Escolano, the museum’s di- rector and a leading Spanish figure in the nascent field of experimental genetics. “In the intervals of hiding the more precious contents of the biological museum in cellars,” Haldane wrote, Zulueta “was con- tinuing his work on the polymorphic beetle Phytodecta variabilis.”
But, when Francisco Franco took power in 1939, Zulueta’s career was abruptly derailed. His family’s politi- cal ties with the defeated Republican government and his translations of books such as Charles Darwin’s The Origin of Species probably con- tributed to him being immediately removed as museum director, says his great-granddaughter, Concepción Cortés Zulueta. “All this knowledge … was considered dangerous and degenerate” under Franco’s fascist government. The scientist recovered his laboratory teaching position 2 years later, but his research career never took off again.
Zulueta is one of hundreds of researchers, professors, and sup- port staff whose tragic stories were released to the public this month by the Spanish National Research Council (CSIC), the country’s largest public research institution, under a 2022 law that called for greater rec- ognition of all the victims of the civil war and Francoist dictatorship. All had been affiliated with the Board for the Advancement of Studies and Scientific Research (JAE), CSIC’s pre- cursor. JAE was dissolved by Franco toward the end of the war and replaced with CSIC to promote the new government’s ideologies.
of the Royal Academy of Sciences of Spain, wrote in a statement to Science. Putting a name to the people who suffered reprisals and publicly acknowledging their perse- cution “constitutes a necessary step to understand the history of Spanish science in all its complexity and to recognize those who were unjustly excluded from it.”
Created in 1907 by the govern- ment and led by Spanish Nobel laureate Santiago Ramón y Cajal, JAE modernized Spanish science by sending members for training abroad and creating a network of new research centers. When it was dissolved by Franco 3 decades later, JAE’s infrastructure and public fund- ing were handed over to CSIC, which the regime had created to reunite science and faith and to promote Spanish nationalism. JAE’s staff was purged as part of “a complete reconfiguration of the Spanish insti- tutional and scientific fabric [based on] censorship, fear, and social con- trol,” science historian Ana Romero de Pablos noted at the launch event on 1 July.
Spain generally avoided address- ing the legacy of Francoism until recently, and although individual research projects had focused on the fate of a few elite scientists, what happened to most JAE members was little known, even within their own families. To bring all their stories to life, Romero de Pablos and her colleagues dug into 13 public and private archives of “depuracíon” files documenting how JAE mem- bers were vetted for their political, religious, and intellectual alignment with Franco’s values.
The resulting database retraces the trajectories of more than 500 re- searchers, support and service staff, teachers, and students. Individuals were purged or punished for a vari- ety of perceived offenses, from not supporting the Francoist regime to pursuing research that contradicted Catholic dogmas, giving workshops
abroad, or even simply chal- lenging cultural norms—such as wearing trousers as a woman.
Ultimately, about 40% of all JAE members were lost to Spanish research. Some “went into exile and [some] underwent military trials,” even dying in jail, Romero de Pablos says. Others had to rebuild their careers out- side of academia. A few scientists were fully reintegrated into CSIC, but most of those allowed into the new organization were faced with a range of penalties. Accord- ing to the archive, Zulueta, for instance, was suspended with half of his salary for a while, and then allowed to return in 1941, but without access to institutional leadership positions.
The project is “a solid, necessary, and very promising
IMAGES: (LEFT TO RIGHT) D. STUART; CAVAN IMAGES/ALAMY
Archaeologists have deciphered the signature of an eighth century Maya mathematician and astronomer, for the first time identifying a member of the ancient civilization’s most important profession. For the Maya, astronomy and math underpinned many aspects of life, from agriculture to religion, yet the people who produced that knowledge had remained anonymous. The autograph of the astronomer, Sak Tahn Waax (“white-chested fox”), was found in a room in
initiative,” says historian Alba Fernández Gallego of the Univer- sity of Valencia. But she says the database should better differenti- ate between the roles the JAE members played in the aftermath of the civil war. “Those who were repressed appear alongside others who played an active role in the purges,” she says. Crespo agrees the platform should pro- vide more contextual informa- tion, but applauds it for allowing visitors to offer comments and corrections.
Since the death of Franco in 1975, CSIC has come a long way from its origins. During Spain’s transition to democracy, “the researchers and staff of the CSIC … played a very relevant role in designing the political science of the democracy,” says CSIC Presi-
dent Eloísa del Pino. But finding out what happened during the purge is an important exercise “to reconcile us with our past,” she says.
Cortés Zulueta, a humanities researcher who works alongside evolutionary biologists at the very same museum as her great- grandfather, says initiatives like CSIC’s platform are validating and healing for families, and healthy for a country that is still divided about its past. The proj- ect also offers a stark reminder of how scientific institutions are often the first victims of dicta- torships, del Pino says. “We must be aware of what these totalitarian processes entail, and that no society is safe from the possibility of these things hap- pening again.”
IN FOCUS
Xultun, Guatemala, near Tikal’s Temple of the Jaguar (right). The room likely housed math classes and bookmaking, researchers report this week in Antiquity. The signature (left) accompanied a formula for syncing Maya calendars with the movements of Mars and Venus. It’s an “extraordinary” find that “gives a face to Maya science,” says archaeologist Tomás Barrientos of the University of the Valley of Guatemala. —Laura Martín Agudelo
Fraction of JAE members driven out of Spanish research under Francisco Franco
to protect dramatic gains in maternal health CATHERINE OFFORD, in Malawi AN UNCERTAIN PATH
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t’s a quiet Monday morning as community health worker Fanizo Simenti arrives at the makeshift clinic in the village of Katenje, in central Malawi. The small, unfinished brick building stands in a clearing, its corrugated iron roof contrasting with the thatch on the surrounding houses. The four small patient rooms are unfurnished, except for a wooden bedframe in one reserved for expect- ant mothers. “We are looking at ce- ment so we can have a good floor, and plastering,” Simenti says, gesturing at the uncovered ground and walls. “If we could have a better bed, and a mat- tress, that would be good.”
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Katenje
Simenti hopes this health post can address the village’s long-standing need for accessible medical care, particularly for pregnant women. He had been providing basic services such as prenatal counseling and childhood immunizations under the shade of a tree, but for births and other needs, many mothers travel more than 20 kilometers to Khola Health Centre, the nearest government-run facility— an unbearable walk in intense heat or heavy rains, and expensive to reach via motorbike- or bicycle-taxi.
A couple of years ago, Simenti proposed the community build its own facility. It would provide patients shelter and privacy, and with gov- ernment support, it could even be upgraded to an official center, like Khola, with equipment and approval to provide birth assistance and other services. Gift Banda, a local farmer and businessperson, tells Science he was moved to contribute by seeing how people suffered trying to reach Khola.
GRAPHIC: V. PENNEY/SCIENCE
Photography by THOKO CHIKONDI
The community decided, “Let’s do our own clinic here,” he says.
Simenti estimates they’ve since raised about 20 million Malawi kwa- cha, about $12,000, including from local leaders, tradespeople, and a poli- tician. And although the building is far from finished, he already takes care of some people within its walls. One local mother, Magret Banda (who is not related to Gift Banda), comes here for family planning and other services with her 3-year-old daughter, and says she now makes fewer trips to Khola. She also helps clean the floor in the building so other women and children don’t cough on the dust.
Such grassroots efforts have taken on new significance since early 2025, when the U.S. government abruptly withdrew most foreign aid and dismantled the U.S. Agency for International Development (USAID), a major backer of maternal outreach clinics and other health services across Malawi. Economists estimated the country could lose more than $170 million that year, with U.S. support for sexual and reproductive health all but wiped out. Separate cuts by other foreign donors, as well as worsening fuel shortages and rampant inflation, are now further squeezing the country’s health system.
Projects such as Simenti’s may be one way for Malawi to lessen the impact of these cuts and bring public health services closer to the people that need them. One official in Kasungu district, where Katenje is located, says staff have started to en- courage other villages to emulate the approach, and Simenti says he’s been asked for advice by health workers who “want to have a similar achieve- ment.” But the initiative also reveals the limits of this kind of local solution.
Kasungu district
Bridging the distance In Malawi, a land-locked country of more than 22 million, most people live in rural areas where extreme weather, bad road conditions, and fuel shortages can hinder travel to the nearest health center. Aid cuts have hit efforts to bring health care to remote villages.
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Kasungu District Hospital
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Lilongwe
Salima district
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Makiyoni Health Centre
Salima District Hospital
Progress at stake The absence of high-quality data makes estimating maternal mortal- ity notoriously difficult, but modeling by the World Health Organization and partners sug- gests a dramatic decline in Malawi since the 1990s— although there’s still a long way to go to reach the United Nations’s 2030 Sustainable Development Goal (SDG) target of less than 70 deaths per 100,000 live births.
The rising cost of living, worsened by the fall in foreign funding, has made it harder for people to chip in. “We depend on [donations] from people” in the community, Simenti says. “We don’t force them.”
Malawi’s broader health system now faces similar uncertainty. The aid reductions highlight a need for more reliable funding, government officials say. But new policies to generate that money—for example through new taxes—and to improve how the health system uses it could take years to bear fruit. Like other sub-Saharan coun- tries reckoning with the seismic shift
Malawi 80% confidence interval Sub-Saharan Africa World
Maternal mortality ratio (deaths per 100,000 live births)
SDG target for 2030: less than 70
1985 1990 1995 2000 2005 2010 2015 2020 2025 0
in foreign assistance, Malawi stands at a crossroads, says Dan Banik, a political scientist at the University of Oslo who has studied the role of aid in the region. It may be a chance for the country to “reset” its health sector into something more resilient, he says, but it’s unclear how far these efforts can go—and what happens to health work- ers and patients during the transition.
THE CUTS OF 2025 highlighted a deep vulnerability in Malawi’s health system. External donors have for years accounted for well over half of the country’s health spending— among the highest share of any low-income country in the world— and up to 90% in sectors such as sexual and reproductive health. Although Malawi’s government pays the salaries of community health workers like Simenti, donors have contributed to their training as well as drugs and equipment, outreach clinics, and support with health financing and management.
That assistance, much of it chan- neled through nongovernmental organizations (NGOs) and interna- tional agencies, has been instrumental in improving the health of Malawi’s mothers and children, says Jeevan Sharma, a development anthropologist at the University of Edinburgh. The maternal mortality ratio, for example, fell from somewhere between 750 and well over 1000 deaths per 100,000 live births in the 1990s to an estimated 224 in 2024—well below the average for sub-Saharan Africa (see graphic, below). But the underlying challenges persist. The rate of teenage pregnancy,
which increases risks for both mother and baby, is among the highest world- wide. Poor roads, bad weather, fuel shortages, and cash-strapped facilities can hinder medical access for the 80% of Malawians who live in rural areas. Treatable infections, blood pressure disorders, and postpartum bleeding remain major killers on the country’s maternity wards.
The strain is visible at secondary health facilities such as Kasungu District Hospital (KDH), a complex of low buildings in the district capital. On this Monday morning, lines of people stretch into the parking lot; mothers breastfeed babies on the floor as nurses steer gurneys through the crowded corridors. Pregnant women often arrive here late, not knowing when to seek help and then struggling to reach the hospital. Once here, they face further delays, says Emmanuel Golombe, Kasungu’s director of health and sanitation services: He’s seen emergency cesarean sections held up because the hospital’s only operating
theater was occupied by nonmaternity patients. “The mother has to wait,” he says. “Sometimes it brings complications—maybe a ruptured uterus, maybe fetal death.”
Last year’s cuts hit donor-funded programs that had reduced pressure on the hospital and the rural com- munities it serves. Among them was MOMENTUM, an $80 million USAID program that procured equipment, supported health worker training, and funded visits for hospital staff to remote communities to provide family planning, prenatal counsel- ing, and many other services. Amref Health Africa, an international NGO that received $28 million of the funds, estimates it supported more than 1500 clinics across the five districts it worked in, reaching more than half a million people before MOMENTUM was axed. Cuts from other countries stand to make matters worse. The United Kingdom’s plans to slash aid funding by 40%, for example, threaten major initiatives in reproductive health. Golombe and others say they’re waiting to learn exactly what the cuts will mean for their facilities; one U.K. government assessment has predicted it will deprive 250,000 Malawians of access to family planning.
The disruption has prompted fears Malawi could lose hard-earned gains, and groups such as the National Organization of Nurses and Midwives of Malawi have warned of a possible rise in maternal mortality. But it’s also sparked calls for change. “We have been relying so much on partners … that when the partners fold their hands, immediately our health care system is on its knees,” says Donald Makwakwa, executive director of the Family Planning Association of Ma- lawi. His organization had already lost USAID funding in 2017, when Presi- dent Donald Trump’s first administra- tion blocked support for organizations that provided or advocated for abor- tion care, and was hit again in 2025. “What is currently happening should not be looked at from a negative point of view only,” Makwakwa says. “It’s a launchpad to think differently in terms of how, as a country, to finance our health care.”
IN LILONGWE, MALAWI’S sprawl- ing capital, officials scrambled to respond to USAID’s withdrawal. “No one expected it,” says Andrew Likaka, who became chief of health services at the Ministry of Health after a new
CREDITS: (GRAPHIC) V. PENNEY/SCIENCE; (DATA) TRENDS IN MATERNAL MORTALITY 2000 TO 2023, WORLD HEALTH ORGANIZATION (2025)
Malawian government came to power late last year. “We quickly sat down to reprogram how to work without the [lost] donors, without the NGOs.”
One approach has been to try to make health care more efficient— combining services such as HIV pre- vention and treatment with reproduc- tive care, for example. But these efforts can only go so far. “We can optimize all we want, but it’s just not enough,” says Owen Chikhwaza, director of repro- ductive health services at the ministry. “We need the actual dollars to support the health care.”
In the short term, much of that money still needs to come from foreign countries and philanthropists, officials say. But they’d like to change how it enters Malawi’s health system. Donors have tended to channel funds through NGOs and international agencies, by- passing Malawi’s government, because of concerns about corruption and mismanagement. Likaka and others argue this approach has led to duplica- tion of health efforts, poor coordina-
PHOTO: THOKO CHIKONDI
tion with government priorities, and unnecessary spending on high salaries and other overheads. Direct payments would avoid these problems and help make Malawi more independent in the long run, they say.
Many global health experts back the idea. “Provision of financial support to the Malawian government directly … would substantially reduce costs, and … enable the government to develop its own capacities, making it more resilient to future aid shocks,” says Katherine Klemperer, a policy analyst at the Center for Global Development.
The most substantial direct agree- ment so far was signed with the United States earlier this year. Under the memorandum of understanding, the U.S. government will provide $792 million to the health sector over the next 5 years, while Malawi has pledged to increase its own health spending by $143 million. (More than 30 other countries have signed similar memoranda, for an estimated total of about $14 billion in U.S. funding.) De-
tails of the agreement remain tightly guarded, despite calls for transparency from local organizations; U.S. deals with neighboring countries have been sharply criticized for clauses permit- ting U.S. access to minerals and health data. But Likaka insists Malawi’s own agreement protects citizens’ interests and confidentiality. “We did the best for the country,” he says. “We agreed in the interest of the nation.”
Malawi is also accelerating plans drawn up by previous governments to raise and better manage money within the country’s borders. The government has already increased certain taxes on income, goods, and services, and intro- duced electronic tax reporting systems to improve collection. The Parliamen- tary Committee on Health is pushing for additional “sin taxes” on products such as alcohol, and toll booths on roads. Proceeds should go into a spe- cial “national health fund” that would ensure they don’t get siphoned off to other sectors, says the committee’s chair, Anthony Masamba.
Elicy Langton (center), a student nurse-midwife, attends to mothers and their newborn babies in the postnatal ward at the Kasungu District Hospital in Malawi.
Wheelless ambulances are propped up outside the Salima District Hospital in Malawi. Only five of the hospital’s fleet are operational, with dire consequences for mothers who need emergency care.
Plans to give health facilities more autonomy to generate and manage their own funds are underway, too. For example, district hospitals like KDH have been told to open new paying wards that offer patients more space and privacy while subsidiz- ing care for others. Primary health centers are starting to receive direct funding from the government, bypassing delays and bureaucracy at the district level and helping centers buy what they need when they need it. Likaka wants to see a bigger role for private investors and health care providers, too.
The government’s work is already having an impact and will ultimately put Malawi’s health sector in a better position, Chikhwaza argues. “We have recollected ourselves” after last year’s disruption, he says.
Health advocates are more cau- tious. The health sector still receives less than 10% of the national budget, despite a decades-old commitment, shared by most African nations, to reach 15%, says George Jobe, executive director of the Malawi Health Equity Network, which represents some 200 organizations in the country and supports the government with budget analysis. Although Jobe supports
many of the government’s reforms, he warns they must be implemented fairly—without taxes further squeezing struggling communities, for example, or paying wards exacerbating inequity. “The vulnerable, the poor must not be victimized,” he says. Makwakwa agrees. “It’s high time” to increase domestic funding, he says, “but those resources must be generated in a manner that does not punish the citizens.”
OUTSIDE LILONGWE, local officials and health workers say they support the government’s efforts but add that gains from such measures have so far been uneven. KDH opened a paying ward late last year, reportedly generating nearly $100,000 in its first 6 months. It hasn’t hurt care for non- paying patients, staff insist. Instead, the additional revenue has helped pay off some of the hospital’s debts and provides a buffer during delays in gov- ernment funding, they say. Golombe says the hospital recently used the rev- enue to buy critical drugs, including dexamethasone, which can be used to protect the lungs of premature babies, and pethidine, a painkiller used in cesarean section patients.
nities have become infrequent, and mothers are paying the price, says Jaison Banda, a community health nurse and family planning coordina- tor at KDH. Emily Mvula, who lives in a village west of KDH, had her third child in 2025, a few months after MOMENTUM suddenly ended. She paid $9 to travel the 15 kilo- meters to KDH for her last pre- natal appointments, a sum not every woman can afford. Now, she says she faces difficulties accessing fam- ily planning. She sometimes takes her baby daughter to a Catholic-run center, about a 2-hour walk, but it charges for some services and doesn’t offer contraception. She wishes the outreach clinics would come back.
Plans to give primary health centers more autonomy have faced challenges, too. Makiyoni Health Cen- tre, a rural facility east of Kasungu in Salima district that was also hit by MOMENTUM’s termination, now receives direct government funding, but it’s falling short of the clinic’s needs. Staff here say they requested $20,000 last year for critical improve- ments such as patching holes in the maternity ward’s ceiling, renovating dilapidated latrines, and replacing solar-powered lights that don’t last
PHOTO: THOKO CHIKONDI
through the night, leaving some babies to be delivered by flashlight. They learned they’d been allocated less than $4000, and even that they couldn’t access until late June, says Issah Omar Nicks, the nursing officer overseeing the maternity ward. Work has only just commenced on the latrines, he adds.
Nicks and his team have been ex- ploring other ways to raise money in the meantime. They started a garden last year and have been growing and selling potatoes, he says. They also solicit a fee of about $0.60 for health passports—paper booklets normally issued by the Ministry of Health to log patient data—from people who can afford it. (Makiyoni isn’t the only health center to do so, officials tell Science, but the charges are contro- versial because the passports are important for tracking a person’s health.) Nicks estimates that in total, the ward’s initiatives have raised about $450 in the past couple years.
The funds have helped pay for cleaning supplies as well as medi- cines and stationery for record keep- ing. But they can’t solve some of the hardest challenges facing this and other rural facilities. Transport of patients in particular has become a daily struggle, as many district ambulances sit wheelless in parking lots for want of repairs or fuel. Nicks recounts the story of a mother they recently tried to transfer to Salima District Hospital during a difficult labor. They waited 2 hours for an ambulance, which only arrived after a local politician’s intervention. The mother was eventually transferred but neither she nor the baby sur- vived, he says.
Staff hope help is on the way in the form of a system called m-mama. Created by the Vodafone Foundation and partners in 2013, it connects emergency calls with private vehicle owners, like a medi- cal Uber, to get women and new- borns to health facilities quickly. M-mama is already up and running in some other sub-Saharan coun- tries; Vodafone and other donors are spending about $10 million to launch it in Malawi.
M-mama suggests one way out- side support could continue: with donors helping establish services the government adopts and the private sector helps deliver. The system is designed to ultimately be “owned and operated and funded by national
PHOTO: THOKO CHIKONDI
governments,” at a fraction of the cost of traditional ambulances, says Lee Wells, global director of m-mama for Vodafone. The launch date has been the subject of some confusion— health staff in Salima and Kasungu say they expected the service from January—but Wells says five districts should get m-mama from September, with those two districts joining the following month.
Other donors are exploring dif- ferent ways to continue support- ing Malawi’s health. Amref Health Africa recently received money from UNITAID, an agency funded primarily through a special tax on airline tickets, for a 4-year initia- tive designed to make maternal medicines and diagnostics more
accessible. Hester Mkwinda Nyasulu, Amref’s country director for Malawi, believes NGOs will continue to play an especially important role in com- munities where government services are limited. He and Jobe want to see the government strike its own deals with NGOs to help fill gaps. “If we complement each other well, we’ll be able to reach more people,” Nyasulu says.
The health system that emerges from these changing relationships could be very different from what came before, Banik says. “We’re in a phase between the old order and a new order. We don’t really know what that new phase is going to look like, but it’s certainly not going to be a return to the past.”
WHILE POLICYMAKERS and advocates debate this transition, work contin- ues as before in Katenje. As Tuesday morning rolls around, the ground inside the makeshift health clinic has been cleaned, a weighing scale hangs from the ceiling, and an open register lies on a small blue table set up to one side. Simenti offers family planning sessions most Tuesdays, but today he is running malnutrition screening for young children from a local school first. Just after 8 a.m., dozens arrive with their carers. Simenti tries to re- assure a few crying kids. “They think I’m going to immunize them,” he says.
KDH’s Banda has caught a lift with Science to Katenje to see how construction is progressing. The building is on the small side, he says,
and there’s not much space around it should the government want to upgrade it to an official primary health center. Nevertheless, he sees promise. It’s in a good location, with a big surrounding population and no other center nearby. The community could have a strong case for receiving government support, he says.
For now the project lacks money, like many plans for Malawi’s health services. Simenti hopes funds will come from somewhere—local con- tributors, NGOs, or philanthropists—to help finish what they started. But he’s proud to see the health post being used, even in the interim. For people here, building it has been a big com- mitment, he says. “Now it’s the time to give them the services.”
Joyce Chavula (center) and other mothers look on as community health worker Fanizo Simenti (left) weighs children during a nutrition screening session at Malawi’s Katenje health post.
I
lymph node
TLSs are inducible rather than canonically static immune struc- tures that form at sites of chronic inflammation in autoimmune se- quelae, transplant organ rejection, microbial infection, and cancer (3–5). Yet, although such associations argue for a role in augment- ing or perpetuating the B cell and T cell responses observed within TLSs, contradictory observations, entrenched dogma, and plain sci- entific inertia have precluded straightforward acceptance of an im- munostimulatory role in amplifying local adaptive responses. Even the classic textbook Janeway’s Immunobiology makes only scant reference to TLSs, which highlights the degree to which the field
Tumors with lymph nodes Tertiary lymphoid structure (TLS) formation involves type 1 conventional dendritic cells (cDC1s) migrating from a tumor to tumor-draining lymph nodes,
cDC1
where they become activated, along with T cells. Both cell types move back to the tumor to support TLS development and maintenance.
Early phase (~days 0 to 8) Late phase (~days 8 to 9 onward)
Persistent tumor antigen
cDC1s migrate to tumor-draining
1 Tumor antigen capture by tumor-resident
Lymph nodes now optional
Naïve T cell
2 Naïve T cell priming in tumor-
has long overlooked the relevance of these critical structures (6).
The path to the study of Mattiuz et al. arguably began just before the cancer immunotherapy revolution with a pioneering histological study on 74 early-stage lung cancer patients (7). Patients with strong evidence of TLS formation, identified and quantitated by the presence of a spe- cific subset of tumor-infiltrating dendritic cells, exhibited statistically superior clinical outcomes compared with patients with no evidence of TLS formation. This observation presaged later findings that sug- gested that inducible development of TLSs in the context of immune checkpoint inhibitor therapy (which “releases” T cells to attack cancer cells) might serve as a powerful predictor of positive clinical outcome (8–10). This insight operationalized TLSs for a new and large audience of clinical practitioners and tumor immunologists, further emphasizing critical functional attributes that were now no longer just an observa- tion. These insights led some in the field to wonder whether a better understanding of TLSs might render immune checkpoint inhibitor therapy more successful and more accessible to a broader scope of can- cer patients and tumor indications.
Mattiuz et al. used modern spatial sequencing techniques, infor- mative model tumor systems, and a mixed bone marrow chimera experimental approach to rigorously establish the central role of the lineage-committed type 1 conventional dendritic cell (cDC1) in the for- mation of TLSs. In a mouse model of lung cancer in which animals were genetically engineered to lack the cDC1 subset, TLS formation was almost completely abrogated in the tumor. Notably, the authors dem-
Cell-attracting
molecule
4 5
3 Activated cells migrate to tumor
T cell follicle
Blood vessel
4 Cell-attracting molecule
B cell follicle
GRAPHIC: A. MASTIN/SCIENCE
5 Established TLS (self-perpetuating)
onstrated that the cDC1s accumulating in TLSs were derived from a common dendritic cell progenitor and not from circulating monocytes through the use of an elegant lineage tracing system (11), further clari- fying the central role of lineage-committed cDC1s in the initiation and orchestration of the TLS-driven antitumor immune response.
Although it has long been understood that cDC1s are indispensable to the development of antitumor immunity (12–14), Mattiuz et al. now describe an even deeper level of dependence than was previously rec- ognized. As a specialized antigen-presenting cell subset with specific functional properties, cDC1s are thought to generate most antitumor cytotoxic T cells because of their ability to constitutively present anti- gens from the external environment directly to tumor-reactive T cells—a function that other conventional dendritic cell subsets do not reliably perform (15). Mattiuz et al. additionally establish that cDC1s are indis- pensable to the formation of inducible TLSs that appear to be critical to an immune-based antitumor response. Mechanistically, the authors show that cDC1s migrating from tumor-draining lymph nodes are also required for TLS formation in cancer tissue. Moreover, the authors show that, similar to secondary lymph nodes, organized TLSs attract cDC1s from tumor-draining lymph nodes by secreting the ligand for the C-C motif chemokine receptor 7 (CCR7) expressed by cDC1s. Other critical details were also experimentally determined, most prominently that the organizing T cells of a TLS are initially primed in the tumor-draining lymph nodes before migration. However, once cDC1s and T cells egress from the tumor-draining lymph nodes and migrate to the site of TLS organization, the TLS becomes an independent, self-perpetuating struc- ture that no longer requires input from the lymph nodes and instead maintains itself through local antigen presentation (see the figure). The mechanism suggests that TLSs might maintain themselves indefinitely until such time that antigen is no longer present, such as tumor resolu- tion in the context of cancer immunotherapy.
The findings of Mattiuz et al. further cement the dependence of local antitumor immunity on the development of TLSs. However, this role is unlikely to define the lasting importance of this work. Previously, TLSs had been descriptively characterized and well correlated with immune- related phenomena but without substantial insight into the underlying mechanisms. Now that one has been elegantly described and demon- strated by Mattiuz et al., the field can develop translational hypotheses that may ultimately extend the reach of cancer immunotherapy and save additional lives.
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ACKNOWLEDGMENTS W.K.D. acknowledges the support of National Institutes of Health grant 2R01-AI127387. W.K.D. declares an ownership stake in Diakonos Research, Ltd.; financial compensation from Diakonos Oncology Corporation; and a financial relationship with APAC Biotech, Pvt, Ltd., from 2015 to 2020.
10.1126/science.aei9741
Recovering lost origins
Integrated evidence helps triangulate the origins of African slaves buried on St Helena
F
St Helena, a small island in the South Atlantic, lies more than 1800 km off the west coast of Africa. Between 1840 and 1867, it served as a depot for Africans liberated from slave ships intercepted by the British Royal Navy. Nearly a third of those brought to the island died shortly after landing (2). Ar- chaeological evidence of these individuals was limited until 2008, when a routine excavation that preceded airport con- struction unexpectedly revealed a burial ground, recovering more than 300 skeletons (3). Disordered limb positions sug- gest that liberated Africans were buried rapidly, mostly with- out coffins. Some graves contained several individuals, and about a third of the dead were children. Skeletal and histori- cal evidence has pointed to scurvy, dysentery, dehydration, and violence associated with the Middle Passage as the cause.
Some graves contained items that hint at the geography of trade networks in Africa. Glass beads, for example, circulated widely across sub-Saharan Africa through long-distance ex- change routes extending from the Mediterranean across the continent (4), from Great Zimbabwe (5) to the Yoruba city of IlÈ-Ifẹ̀ (6), where craftspeople smelted and fashioned metals into tools and artworks for centuries (7). As the transatlantic slave trade intensified, some of West Africa’s largest urban centers became capitals of expansive states such as Dahomey and Oyo. These locales became involved in the slave trade, moving captives from the interior toward Atlantic ports to be exchanged for materials such as textiles, metals, firearms, al- cohol, tobacco pipes, and ceramics (8). In inland West Africa, subterranean refuges carved with iron tools may have shel- tered families during slave raids in this period (9).
This historical-geographical context helped Wang et al. in- terpret the strontium isotope signatures of individuals buried on St Helena. Historical records indicate that many Africans had embarked from ports in western Central Africa, whereas ancient DNA reveals affinities with present-day populations in Angola and the Congo Basin. Together with linguistic evidence, these data point to diverse origins among the in- dividuals represented in the cemetery. Isotope data of Wang et al. on 152 individuals further support these likely regions
of childhood residence as well as diverse origins in southern Africa for individuals with exceptionally high strontium isotope (87Sr/86Sr) ratios. Similarly, in South Africa, isotopic analyses of people enslaved by the Dutch East India Company revealed diverse geographic origins (10).
A 87Sr/86Sr ratio measured from bulk tooth enamel is ultimately just a number that reflects a combination of geology, ecology, diet, and human behavior rather than a distinct geographic location. An early demonstration of this limitation came from the Swartkrans region of South Africa, where plant samples collected within a 15-km radius yielded 87Sr/86Sr values ranging from roughly 0.727 to 0.756 (11). This local variation is comparable to the range of values modeled across vast portions of West and Central Africa in continent-scale isoscapes (12). Researchers have responded to this limitation in different ways. One is technical: Laser-ablation methods can measure fine-scale variation in tooth enamel, documenting residential movement during childhood and adolescence. Another is to ask different questions, such as using isotopic variation to identify sex-biased mobility and infer ancient kin- ship practices (13). One can also use 87Sr/86Sr ratios to test hypotheses from other information (14).
Wang et al. applied this multievidence approach to the individuals from St Helena, whose 87Sr/86Sr ratios range from ~0.713 to 0.773, with most clustering between 0.712 and 0.730. On their own, such values are consistent with a broad range of locations across West and Central Africa (12). Several individuals, however, exhibited higher 87Sr/86Sr ratios more specifically associated with inland regions of Angola, the Congo Basin, and Zimbabwe. None of the values is consistent with childhood on St. Helena itself, which is composed largely of mafic basalts with 87Sr/86Sr values of about 0.703. Interpreted alongside historical records, ancient DNA, and continent-scale isoscape models, the isotope data point to origins in west-central Africa, particularly present-day Angola and neighboring regions. Comparisons of early- and late-forming teeth from 41 individuals further revealed movement during childhood before cap- ture. Together, these findings support a reconstruction in which many captives originated within a few hundred kilometers of the west-central African coast, whereas others came from farther inland.
Wang et al. demonstrate how strontium isotope analysis has become more precise, accessible, and widely applied than it was a generation ago, enabling continent-scale isoscapes and increasingly sophisticated reconstructions of human mobility. Yet the study’s broader lesson is that no single dataset is sufficient. Additional isotope systems, compound- specific isotope analyses, residues, ancient DNA, pathogen genomes, microbial diversity, oral histories, linguistics, archival records, and ar- chaeological materials can each further constrain the range of possi- bilities. Together, these approaches can trace past lives with increasing resolution and recover some of what was lost to their descendants.
REFERENCES AND NOTES
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10.1126/science.aej4801
Tidying up aging organs
A prostaglandin prevents macrophages from clearing toxic neutrophils in aging organs
H
Oxylipins are highly potent, locally acting bioactive lip- ids of low abundance. They include prostaglandins (PGs), leukotrienes, cannabinoids, and related compounds. Their contrasting effects include promoting or restrain- ing inflammation and differentially modulating vascular tone, cellular proliferation, and thrombogenesis. Oxy- lipins are abundantly expressed on immune cells. Indeed, PGE2 has emerged as an immune checkpoint, mediating lymphocyte exhaustion through two of its four receptors, EP2 and EP4 (2). Assessing the utility of suppressing syn- thesis of PGE2 or blocking its action as an adjunct to con- ventional immune checkpoint inhibitors is underway in cancer clinical trials.
Although lymphocytes have minimal capacity to generate oxylipins, macrophages can generate them in abundance, especially PGE2 and thromboxane (Tx)A2. Besides acting on cells in its local microenvironment, PGE2 can also modify macrophage differentiation, phagocytic capacity, and migra- tion (3). However, relatively little is known of how macro- phage subsets contribute to oxylipin biology.
Tan et al. show in mice that PGE2, acting through EP2 that is increasingly expressed on aging resident macrophages, undermines their capacity to disable senescent neutrophils through a clearance process called efferocytosis (see the fig- ure). This is most striking in TRMs in the liver (Kupffer cells) and in splenic and bone marrow–derived TRMs.
TRMs are a highly abundant macrophage subset (60 to 90% in brain, liver, lung, and kidney). They originate in the yolk sac, integrate into developmental niches, and are per- sistent, accumulating metabolic and inflammatory insults as animals age. They are replenished through the conversion of short-lived monocyte-derived macrophages (MDMs) that arise postnatally from bone marrow hematopoietic stem cells and are continuously replenished from the circulation in a tissue-dependent fashion.
To address the functional consequences of their observa- tions, Tan et al. selectively deleted EP2 in cells expressing CX3CR1 (C-X3-X motif chemokine receptor 1), a marker for
Senescent neutrophil
Driving aging across organs Tissue-resident macrophages (TRMs) remove senescent neutrophils to prevent their toxic effects. Increased prostaglandin E2 (PGE2)–EP2 receptor signaling stops this clearance (efferocytosis) by inhibiting integrins. Reducing EP2 signaling rescued organ aging in mice.
No engulfment and clearance
EP2 PGE2
AC, adenylyl cyclase; AMP, adenosine monophosphate; cAMP, cyclic adenosine monophosphate; NET, neutrophil extracellular trap; PKA, protein kinase A; TFs, transcription factors.
TRMs. Because CX3CR1 is modestly expressed in MDMs, they also strat- ified cells through expression of a residency marker, TIM4 (T cell immu- noglobulin and mucin domain–containing 4) and confirmed the decline of EP2-expressing macrophages from ~80 to 40% of all macrophages. This reflected a substantial depletion in TRMs.
The reduction of EP2 expression in TRMs rescued multiple age- related phenotypes in mice. Global indices of inflammation, spatial and episodic memory, muscle strength and frailty, impaired left ventricular systolic function, stiffness, and fibrosis were all restored to a state char- acteristic of a younger, healthy animal. An important clue to the under- lying cause of this broad physiological shift was provided by the scope of proteins expressed by immune cells, which changes with age. This age-dependent remodeling of the proteome was also restored in ani- mals depleted of EP2-expressing TRMs. This pointed to the liver, where, in contrast to the lung and brain, TRMs were markedly depleted with age (from 75 to 80% of macrophages to 55%) but were restored in aged mice with a reduced amount of EP2-expressing TRMs.
Single-cell RNA-sequencing of liver in aging mice turned attention to neutrophils. Clustering these shortest-lived immune cells identified four subsets, two of which, called Neu2 and Neu3, increased from near ab- sence in young mice to 50 and 30%, respectively, in aged wild-type mice but not in mice with fewer EP2-expressing TRMs. The release of alarm- ins (peptides that activate immune response), cell cycle arrest, and the senescence-associated secretory phenotype (SASP) were associated with Neu2 cells, whereas DNA damage, neutrophil extracellular trap (NET) formation, and programmed cell death (apoptosis) were features of Neu3 cells. All of this suggests a major role for neutrophils in inflam- matory tissue damage that is characteristic of aging (in the absence of infection). TRMs restrain this process by removing senescent, apoptotic, and damaged neutrophils through efferocytosis. Tan et al. showed that EP2 signaling in TRMs disrupts efferocytosis of aging neutrophils in liver, spleen, and bone marrow of aged mice by impairing transcrip- tional control, b2 integrin activation, and postengulfment clearance from organs. Age-related accumulation of senescent neutrophils, NET- mediated tissue injury, and paracrine inflammatory and fibrotic stress were all rescued in animals depleted in EP2-expressing TRMs.
Paracrine
stress
GRAPHIC: N. BURGESS/SCIENCE
What are the translational implications of these findings? Although Tan et al. show that EP2 and EP4 expression increases with age (and disease) in the human liver, the signaling pathways involved have not
Degranulation Organ
NETosis
Several other issues merit consideration. Only one antagonist of EP2 was used in the rescue experiment. Activation of EP2 and EP4 has some overlap in ligand-induced activation of downstream signaling and mediation of lymphocyte exhaustion but diverges in other respects. In the setting of immune checkpoint blockade, combined deletion or antagonism of both receptors seems more efficacious than the lack of either one alone in mouse models. This includes the impact of deleting one or both receptors on the survival and tumor-in- filtrating capacity of chimeric antigen receptor (CAR) T cells (engineered to express a desired CAR) used in immunotherapy (4). Other an- tagonists, selective for either or both EPs, are available (5). Another point is whether EP2 or EP4 antagonism triggers a compensatory increase in ligand (PGE2) production, potentially ampli- fying pain and inflammation through EP1 (6) or platelet activation and thrombogenesis through EP3 (7). Both are pertinent when considering the therapeutic index of preventative strategies in an aging population.
One open question is the source of the PGE2 that activates EP2 expressed by aging TRMs. Does it derive from cyclooxygenase 1 or 2 ac- tivity? It could be produced by the TRMs themselves, but other immune cells or adjacent hepatocytes or fibroblasts could also be sources. It is also unclear what effect blocking EP2 may have on other immune cells. Activation of EP2 and EP4 on neutrophils in a tumor microenvironment activates a proinflammatory phenotype (8), which can either promote or suppress the tumor; PGE2 also promotes neutrophil migration in ar- thritis, further contributing to joint deterioration (9). However, PGE2 may suppress damaging neutrophil NET formation (10). EP2 also acts as a negative modulator of regulatory T cells and thereby augments their protective role in inflammatory bowel disease (11).
The findings of Tan et al. may extend beyond PGE2. Oxylipins are po- tent immunomodulators that vary in their sites and settings of produc- tion (12). Just as other oxylipins emerge as checkpoints in tumor biology (13, 14), understanding their contribution to senescence could unlock new possibilities for healthier aging.
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Bringing radioactive molecules to the table
A compact source of radioactive molecules could enable new tests of fundamental physics Luke Caldwell A
Electrons in atoms and molecules can occupy dif- ferent energy levels. By measuring the frequencies of light that drive transitions between these levels, researchers can determine their energy differences with extraordinary precision. Because these energy differences depend on the interaction of the elec- trons and nuclei, they provide a sensitive probe of nuclear structure. Electron orbitals in an isolated atom are often highly symmetric about the nucleus. This symmetry means that contributions from opposite sides of the nucleus can cancel each other out, making some nuclear properties difficult or impossible to observe in atomic spectra. In a molecule, attraction or repulsion from neighboring atoms distorts the shape of the electron cloud about the nucleus of interest, breaking this symmetry. Different regions of the nucleus are no longer sampled equally, allowing a much wider range of nuclear properties to become observable, including subtle distortions of nuclear structure and signatures of symmetry-violating interactions.
The strength of observable nuclear effects on the electrons grows rap- idly with the size of the nucleus within an atom or molecule. A heavy nucleus contains more protons and neutrons, increasing the scale of many nuclear effects. At the same time, the larger positive charge of a heavy nucleus pulls electrons into more tightly bound orbitals. Be- cause these electrons spend more time close to the nucleus, nuclear effects leave larger imprints on the electron cloud than they do in spe- cies with lighter nuclei. Many heavy nuclei are radioactive and exhibit distinct structures. In contrast to most stable nuclei, which have an es- sentially spherical shape, the same collective nuclear physics that leaves radioactive isotopes teetering on the edge of decay can lead them to adopt strongly deformed shapes. In some cases, a nucleus becomes pear-shaped, substantially amplifying observable spectral signatures of symmetry-violating effects (3), potentially revealing new physics.
Conn et al. demonstrated the production, cooling, and detection of radioactive molecules, such as radium fluoride, radium hydroxide, and radium monodeuteroxide, in a compact cryogenic apparatus compati- ble with a standard university laboratory. A radium-containing salt was mixed with xylitol—a natural sweetener used to make chewing gum— and then formed into a solid containing 10 to 50 µCi of radium-226 isotope. The specimen had radioactivity that was low enough to be managed within the radiation-safety framework of many research uni- versities. The radioactive sample was cooled to 4 K inside a copper cell filled with helium gas. Repeated laser pulses vaporized some mate- rial from the specimen surface, initiating chemistry to form radium- containing molecules. These exothermic chemical reactions left the
produced molecules internally hot with their energy distributed across many energy levels. Collisions with the surrounding helium atoms at 4 K rapidly cooled the radium-containing molecules, leaving them in only a small number of rotational and vibrational states. The result- ing molecules occupied only a handful of energy levels, making them easier to control and study. Conn et al. used laser light to measure the properties of these previously unexplored molecules (such as ro- tational moments of inertia), the knowledge of which is an important prerequisite for manipulating the molecules with lasers or using them in precision measurements.
Although the approach of Conn et al. extends the sources that pro- duce radioactive molecules, the frequent collisions of cold radioactive
molecules with helium limit the observation times available for precision measurements. Over the past decade, other groups have extracted stable molecules (such as calcium fluoride and strontium fluoride) produced in similar sources to an ultrahigh-vacuum environment where observation times can be much longer than those of Conn et al. (4). This has enabled sophisticated control over the molecule’s energy lev- els and for confinement of molecules in traps where observation times can be extremely long (5–10). If similar techniques can be extended to radium-containing molecules produced by Conn et al.’s approach, it would provide a powerful new platform for precision studies of nuclear structure and symmetry.
of phenomena…
at new physics…
Beyond radium-226, the method of Conn et al. could be adaptable to other radioactive isotopes and elements. Of particular interest is ra- dium-225, which has a pear-shaped nucleus that is expected to provide one of the strongest known enhancements of sensitivity to symmetry- violating nuclear effects (11). However, radium-225 has a half-life of only 15 days, compared with 1600 years for radium-226. Accessing ra- dium-225 may require radioactive parent isotopes that continuously re- plenish it through decay or the capability to perform direct observation at isotope-production facilities. A library of new radioactive isotopes may soon become accessible to the full range of precision experimen- tal techniques that underpin modern atomic and molecular physics. Observations of phenomena that have been inaccessible in long-lived isotopes could hint at new physics that may help to explain why the Universe contains more matter than antimatter (12).
REFERENCES AND NOTES
ACKNOWLEDGMENTS The author acknowledges support from UK Research and Innovation (MR/Y017056/1).
10.1126/science.aej2688
Regulation of deep-sea ecosystems, such as hydrothermal chimneys in the Indian Ocean, depends on the International Seabed Authority’s guidance.
Seabed mining requires timely governance A. Jaeckel’s Editorial “Seabed mining needs integrity, not haste” (30 April, 10.1126/science.aei3119) rightly emphasizes the impor- tance of robust environmental safeguards and institutional legitimacy in developing regulations for deep-seabed mining. However, framing the current developments primarily as a choice between regulatory caution and dangerous acceleration overlooks an equally serious risk: prolonged regulatory paralysis within the International Seabed Authority (ISA).
Fifteen years have passed since Fiji formally requested the ISA Council to begin developing exploitation regulations (1) under the framework established by the United Nations Convention on the Law of the Sea (UNCLOS) and the 1994 Implementation Agreement (2, 3). Since then, extensive legal drafting, stakeholder consultations, environmental research, and regional planning have been undertaken (4). Yet the Council has repeatedly missed self-imposed deadlines for adoption, and numerous key issues remain unresolved (4, 5).
PHOTO: CANADIAN SCIENTIFIC SUBMERSIBLE FACILITY (CSSF), CONTRACTED BY FEDERAL INSTITUTE
FOR GEOSCIENCES AND NATURAL RESOURCES (BGR) FOR THE INDEX PROJECT
At some point, continued delay becomes difficult to justify as prudence. Part XI of UNCLOS and the 1994 agreement were intentionally designed as an evolutionary governance frame- work, enabling progressive regulatory development alongside expanding scientific knowledge and operational experience (2, 3). Regulation should therefore evolve in response to uncertainty, rather than demanding complete prior certainty before controlled activities can begin.
The ISA’s mandate is to organize and control activities in the seabed beyond national jurisdiction (the Area) for the benefit of humankind and to ensure effective protection of the marine environment (2). Indefinite delay risks weakening legal certainty, eroding confidence in the ISA’s capacity to govern effectively, and
encouraging fragmented national or unilateral approaches that could undermine both multilateralism and the principle of the common heritage of humankind.
Absolute environmental certainty is unattainable in any major industrial sector. Decades of research have substantially expanded our understanding of polymetallic nodule ecosystems and poten- tial mining impacts (6). Although uncertainties remain, existing knowledge is increasingly sufficient to support precautionary, adaptive regulation and carefully controlled industrial projects.
Integrity and urgency are not mutually exclusive. After decades of scientific, institutional, and regulatory development, the greater danger may no longer be regulatory haste, but the inabil- ity to govern at all.
Carsten Rühlemann
Federal Institute for Geosciences and Natural Resources (BGR), Hannover, Germany. Email: carsten.ruehlemann@bgr.de
REFERENCES AND NOTES
COMPETING INTERESTS
BGR, C.R.’s employer, holds two exploration contracts issued by ISA. The views expressed are solely those of the author and do not necessarily reflect those of BGR.
Social calibration of sycophantic AI In their Research Article “Sycophantic AI decreases prosocial intentions and promotes dependence” (26 March, 10.1126/sci- ence.aec8352), M. Cheng et al. show that artificial intelligence (AI) systems are substantially more likely than humans to endorse a user’s position in disputed scenarios. Randomized experimental designs indicate that exposure to such affirming responses reduces users’ willingness to engage in prosocial corrective actions in interpersonal conflicts and increases trust in, and dependence on, the AI system. These findings, which establish a causal link between model alignment strate- gies and downstream human behavior, highlight a tension at the heart of AI alignment: Optimizing for user satisfaction may systematically bias models toward agreement, even when disagreement would better serve users’ long-term interests or social outcomes. Sycophancy is not merely a failure mode but a predictable by-product of reinforcement signals derived from user preference. However, methodological and interpre- tive questions remain.
The human baselines in the study—such as highly rated online comments or expert responses—may not adequately capture the dynamics of real-world social interactions. Humans are also likely to behave sycophantically. Everyday advice-seeking typically occurs within relational contexts (such as friends and family), in which the motivation to preserve relationships—particularly with higher-status mem- bers—may itself encourage sycophantic responses (1). As a result, the reported gap between human and AI responses may overstate the distinctiveness of model behavior.
It remains unclear whether reduced prosociality arises from emotional validation, epistemic confirmation, or perceived authority of AI systems. Disambiguating these pathways will be essential for designing interventions that preserve support- ive interaction while mitigating harmful bias.
Interpersonal conflicts in real-world settings involve higher stakes, repeated interactions, and network effects that may amplify or dampen the influence of AI feedback. Longitudinal and network-based studies—analogous to recent analyses of AI’s impact on scientific practice [e.g., (2)]—could provide a more complete account of how such biases reshape social behavior over time.
Reducing sycophancy may improve epistemic robust- ness but could also diminish the perceived empathy and usability that drive adoption. Designing AI systems that can balance supportive engagement with constructive disagree- ment—particularly for vulnerable populations—remains an open challenge.
As conversational AI becomes an increasingly embedded social actor, its role will extend beyond information provision to behavioral modulation. The findings of Cheng et al. suggest that even subtle alignment biases can scale into meaningful societal effects, underscoring the need for both technical and governance frameworks that address not only what AI knows but how it agrees.
Shaoshuai Meng
School of Life Sciences, Peking University, Beijing, China. Email: shaoshuaimeng@gmail.com
REFERENCES AND NOTES
REFERENCES AND NOTES
1964), pp. 24–45. 2. Q. Hao, F. Xu, Y. Li, J. Evans, Nature 649, 1237 (2026).
Response We thank Meng for articulating important methodological and interpretive questions about our findings. The appropriate human baseline depends on the expected social role of artificial intelligence (AI). In real-world use, AI models are perceived to serve a variety of purposes, such as adviser, neutral outside opinion, editor, and assistant (1, 2). These roles come with different expectations for how often agreement, validation, or corrective feedback should occur. To complicate matters, users often view a single AI system as fulfilling multiple roles (3, 4). Because of the ambiguity of AI’s social role, any single human baseline is an imperfect comparison point. The base- lines we used—judgments from third-party humans with no personal stake in the conflict or scenario at hand—explore one common and societally meaningful expectation: Do AI systems—despite often being seen as external, neutral, and objective information providers (5–7)—disproportionately side with the user? Our findings were also robust to an alternative baseline of online crowdworker judgments (supplementary materials, SM 2). Responses from those with closer relationships to the advice-seeker may indeed be shaped by stron- ger relational norms, reputational accountability, and lasting social consequences. Whether such alternatives would result in more or less divergence remains an open question.
We agree that disentangling the role of factors such as emotional validation and perceived authority is critical for designing interven- tions. We isolated sycophancy from anthropomorphism (warm, friendly response style) in study 2a. We found that anthropomor- phism does not account for the observed effects. We also found evidence that perceptions of objectivity make sycophancy more pernicious: In study 2b, participants who perceived the AI as more objective were more negatively affected by sycophancy. In a confer- ence presentation (8), we provided a benchmark for measuring different types of sycophancy in AI responses, differentiating between emotional validation, indirectness, and framing acceptance, and our recent unpublished work establishes a taxonomy that characterizes different types of sycophantic behaviors (9). These contributions help build the groundwork for further unpacking of these mechanisms.
We agree that it is important to explore many dimensions of external validity. In a 3-week, as yet unpublished, longitudinal study, we found that sycophantic AI resulted in lower satisfaction with real- world social interactions (10). This provides evidence for the lasting social and psychological consequences of AI sycophancy.
Myra Cheng1, Cinoo Lee2, Pranav Khadpe3, Dan Jurafsky1
1Department of Computer Science, Stanford University, Stanford, CA, USA. 2Department of Psychology, Stanford University, Stanford, CA, USA. 3Human-Computer Interaction Institute, Carnegie Mellon University, Pittsburgh, PA, USA. Email: myra@cs.stanford.edu
Computing Systems, article 106 (Association for Computing Machinery, 2026); https://doi. org/10.1145/3772318.3790739. 2. B. Bullock, J. A. Landay, M. S. Bernstein, in CHI ‘26: Proceedings of the 2026 CHI Conference
on Human Factors in Computing Systems, article 420 (Association for Computing Machinery, 2026); https://doi.org/10.1145/3772318.3790676. 3. M. Shanahan, K. McDonell, L. Reynolds, Nature 623, 493 (2023). 4. A. Kasirzadeh, I. Gabriel, Philos. Technol. 36, 27 (2023). 5. M. Glickman, T. Sharot, Nat. Hum. Behav. 9, 345 (2025). 6. G. Romeo, D. Conti. AI Soc. 41, 259 (2026). 7. S. Kapania, O. Siy, G. Clapper, A. Meena, N. Sambasivan, in Proceedings of the 2022
CHI Conference on Human Factors in Computing Systems (Association for Computing Machinery, 2022), pp. 1–18. 8. M. Cheng et al., “ELEPHANT: Measuring and understanding social sycophancy in LLMs,”
presented at the Fourteenth International Conference on Learning Representations, 2 May 2026. 9. M. Ye et al., arXiv:2605.21778 [cs.AI] (2026). 10. L. Ibrahim et al., arXiv:2605.07912 [cs.HC] (2026).
The rise and fall of the Amazon Soy Moratorium
Challenges to the voluntary zero-deforestation pact could impose costs for forests and the soy sector
Lisa Rausch1,2, Tiago N. P. Reis3, Cristiane Mazzetti4, Marcos Barrozo5, Marin Skidmore6, Holly K. Gibbs1,2 T
he Amazon Soy Moratorium (ASM) is a voluntary multisec- toral zero-deforestation pact, in which soy traders agreed to not source or finance soy on Amazon lands deforested after July 2008. Despite successes, most traders terminated their commitments under the ASM in early 2026, amid a series of legislative and administrative challenges. A coalition of Brazilian politi- cal parties and civil society organizations (CSOs) mobilized to defend the ASM, including petitioning the Brazilian Federal Supreme Court (STF) to intervene (ADI 7774 and related cases; table S1). Here, we de- scribe how the end of the ASM could impose substantial costs for forests and the soy sector. The pending final STF decision may come too late to preserve the ASM, but broader implications of this case extend beyond the agreement itself to the viability of any voluntary supply-chain stan- dards that include limits on deforestation and ecosystem conversion that are not explicitly specified by Brazilian legislation.
The ASM emerged after threats of boycotts and reputational damage associated with a Greenpeace campaign highlighting the environmen- tal risks of soy production in the Amazon. Although initially conceived as a temporary measure and renewed through a series of short-term extensions, in 2016, all parties agreed that the ASM should continue in- definitely until broader governance conditions were deemed sufficient. When the ASM began in 2006, soy expansion was a major driver of Amazon deforestation, with nearly one-third occurring through direct forest conversion (1). After the ASM was implemented by the traders that purchase ~90% of the Amazon’s soy, deforestation for new soy ex- pansion fell to nearly zero (1).
The ASM’s clear rules, uniformly implemented in large part owing to efficient, sector-wide, property-level monitoring, encouraged high levels of compliance without the need for a patchwork of costly and company-specific traceability systems. The agreement incentivized soy expansion onto the large “bank” of 9.7 to 15 Mha of land that was de- forested before the ASM’s 2008 cutoff date, allowing the Amazon’s soy area to more than triple without substantial direct forest conversion (1, 2). In doing so, the ASM reduced deforestation by 35% (1.8 Mha) in areas at risk for soy expansion during just its first 10 years, including areas outside of soy properties (3). By reducing overall pressure on forests, the ASM complemented improvements to public policy implementation (3) and contributed to historically low deforestation rates by 2012, making it the most impactful voluntary supply-chain policy ever implemented, even when accounting for evidence that some deforestation pressure may have been reallocated to other regions such as the Cerrado [(4); supplementary materials (SM) section 1].
But laws passed by Mato Grosso and other leading soy-producing states removed access to tax incentives for companies implementing environmental sourcing commitments beyond legal requirements. The constitutionality of these laws is the issue specifically under con- sideration by the STF. There has also been an investigation by Brazil’s antitrust agency (CADE) into allegations that ASM traders had acted as a cartel through coordinated implementation of the agreement (5), though this process is presently on hold while the STF deliberates.
groups that the ASM imposed costs on producers and constrained regional development in the Amazon (see SM), alongside narratives emphasizing national sovereignty and resistance to perceived external interference in domestic land-use decisions. In filings defending the ASM, CSOs showed how the ASM strengthens implementation of Bra- zil’s environmental regulations and argued that laws penalizing com- panies for adopting environmental sourcing standards beyond legal requirements violate constitutional principles of free competition and environmental protection (table S1).
COSTS OF ENDING THE ASM Although prior analyses have evaluated benefits of the ASM using ret- rospective counterfactuals (3, 4), here we provide a forward-looking estimate of the additional deforestation expected without the ASM. Building on prior estimates of the ASM’s effect on deforestation rates (3), we estimate that the end of the agreement will result in 1.4 ± 0.67 Mha of additional deforestation over the next decade relative to a coun- terfactual in which the ASM persists (SM section 1), which would re- sult in an additional 745 ± 346 million metric tons of carbon dioxide equivalents, comparable to Canada’s annual greenhouse gas emissions. This projected loss amounts to roughly 17% of the total area deforested across the Brazilian Amazon over the past decade. This estimate reflects the contribution of the ASM within a broader policy mix that inclu- des regulations, enforcement, and other market-based interven tions but does not account for important, more recent changes such as the growing biofuels sector in the Amazon.
This deforestation increase is expected because the ASM reduced incentives for clearing by limiting access to high-value soy markets for newly deforested lands, thereby lowering both the economic value of deforestation and overall pressure on forests (3). Without the ASM, incentives for direct forest conversion for soy will return alongside the role of soy expansion in driving speculative clearing (3). These effects may be especially pronounced under conditions of weakened environ- mental governance, in which private-sector commitments can serve as a backstop to declining public enforcement (6).
In total, tens of millions of hectares of forests on soy-suitable land across the Amazon could be at greater risk of conversion without the ASM in place (2). This includes 9.1 Mha (SM section 2) of forest on private properties that still could be legally cleared under the Brazilian Forest Code and as much as 28.7 Mha in undesignated public forests (lands with no legally defined purpose or protection), which are parti- cularly vulnerable to illegal conversion and land speculation (SM sec- tion 3). Increased pressure on forests will likely lead to additional illegal clearing inside Brazilian Legal Reserves as well. Although not all of this land is likely to be immediately planted to soy, these areas will be sub- ject to the overall increase in pressure on forests that will follow the end of the ASM.
The consequences of losing the ASM extend beyond impacts on fo- rests. Its removal could create material risks for Brazil’s soy sector and the companies operating in the region. Although firms are sometimes thought to avoid jurisdictions with more restrictive regulatory environ- ments (7), ASM signatories increased their presence in the Amazon over
the course of the agreement (SM section 4). In part, companies adopted the ASM because it helped manage reputational and market-ac- cess risks associated with sourcing from the Amazon while meeting increasingly stringent sustainability expectations from downstream buyers (8).
Without the ASM, companies may face growing pressure to implement more com- plex and potentially fragmented due-diligence systems to maintain access to certain export markets and meet Greenhouse Gas Proto- col Scope 3 emissions targets from upstream suppliers. Most companies exiting the ASM maintain public commitments to reduce defo- restation in their supply chains and, in some cases, through multistakeholder initiatives such as the Consumer Goods Forum (9). Long- term trading relationships could be disrupted, and companies could face considerable repu- tational and financial risks, including effects on company valuation (10). At the same time, continued deforestation poses broader sys- tem-wide risks to agricultural productivity. Forest loss in the Amazon can alter regional rainfall patterns and increase temperatures, threatening the long-term viability of soy pro- duction if ecological thresholds are exceeded locally or regionally [(11); SM section 2].
Despite claims that the ASM imposed eco- nomic hardships on producers, the end of the agreement is likely to bring few benefits for soy farmers. Most deforesta- tion after the 2008 cutoff date of the ASM also violated the Forest Code. The suspension of the ASM frees up only ~739,000 ha of soy-suitable land cleared legally after 2008, largely on properties not presently pro- ducing soy (SM section 5). Soy farms across the Amazon only have about 60,000 ha of forested areas that could still be legally cleared, less than 1% of the total soy area in the Amazon. Meanwhile, even under the ASM, soy farmers had sufficient eligible land on their own farms to expand soy in the Amazon by nearly 20% (1.7 Mha) compared with the 2024 soy area, without additional deforestation [(2); SM section 5], suggesting that considerations about expanding the production area may be more complex than the simple availability of land to do so (SM section 2). Comparing soy markets subject to the ASM with nearby untargeted re- gions, we detected no systematic differences in average farmgate prices received by farmers, suggesting that ending the agreement is unlikely to substantially increase producer earnings and also that traders did not engage in price-fixing in the ASM (SM section 6).
Mha
Mha
Mha
Instead, in addition to reducing pressure on forests more broadly, the ASM reduced incentives for illegal clearing by restricting the use of these areas in the region’s most profitable supply chains, thereby li- miting the potential for producers to benefit from Forest Code violati- ons. The relatively low costs of the ASM for soy producers, particularly in terms of land availability, combined with evidence that many of its f orest conservation benefits occurred outside of soy properties, suggest that opposition to the agreement was likely driven at least in part by incentives associated with frontier expansion rather than by hardships faced by soy producers or by concerns about national sovereignty (2, 3).
Claims that the ASM hindered local development have featured pro- minently in debates surrounding state-level regulations. Our analysis suggests that these claims are difficult to reconcile with the limited land area constrained by the ASM, the absence of detectable farmgate price effects, and evidence that soy-driven growth generates uneven local de- velopment benefits while externalizing substantial environmental and social costs (SM section 2). The ASM’s constraints on local economic de-
The area of Amazon forest, equivalent to ~2 million soccer pitches, projected to be deforested
by 2036 without the ASM in place.
Soy-suitable areas in undesignated
public forests, an area nearly the size of Italy, will be under additional
A successor system could retain a uniform framework and the ASM’s July 2008 cutoff date through either an independent monito- ring system overseen by a coalition of CSOs and trader associations or through a gov- ernment-led platform that publicly identi- fies compliant producers. Brazil’s decree no. 11.687/2023, which authorizes the Ministry of Environment to publish a “positive list” of rural properties without deforestation after 2008, provides an existing institutio- nal foundation for such an approach. A pu- blic platform identifying properties without post-2008 deforestation, independent of the activity conducted on the farm, could also support expansion of defo- restation-free production to other critical biomes, including the Cer- rado, and to additional commodities such as corn while strengthening implementation of policies in other sectors.
pressure from land speculation.
An area of forests, equivalant to the
size of Portugal, that is suitable for soy and eligible for legal clearing.
However, replicating the success of the ASM would require more than a monitoring system. Other key ingredients include sector-wide adoption (e.g., through the Brazilian Association of Vegetable Oil Indus- tries) and property-level requirements, rather than allowing farmers to split their crop between compliant and noncompliant land. Similar to the conditions under which the ASM began, sustained pressure from downstream buyers will be critical. Coordinated expectations from processors, retailers, and financial institutions in major importing reg- ions, including Europe and China, which together receive a substantial share of Amazon soy exports, could help sustain trader commitments to zero deforestation even in the absence of the ASM. Without conti- nued downstream demand, soy linked to recent deforestation may increasingly flow to less regulated markets.
Another pathway proposed by the soy industry emphasizes stronger enforcement of the Forest Code in place of deforestation-free sourcing commitments. For example, the Green Grains Protocol (PVG) is an ini- tiative led by the Brazilian Federal Prosecutors Service to reduce illegal sourcing in the soy sector. Similar to another effort aimed at limiting deforestation related to beef production, which is also administered by the prosecutors, the PVG relies on company-level monitoring against a standardized protocol, with audits contracted by firms and conducted on a sample of purchases. Compared with the ASM’s unified monitoring system, this approach may result in less consistent application of sourc- ing criteria and create loopholes that allow for ongoing deforestation. To date, the PVG has been limited to the state of Pará, though efforts are underway to expand it nationwide.
Stronger Forest Code enforcement in the soy sector is clearly needed, given evidence that as many as a quarter of soy properties have illegal deforestation. However, Forest Code compliance alone does not devalue deforestation in the same way the ASM did. Under the Forest Code,
velopment, particularly when weighed against broader risks to regional productivity and de- velopment associated with increased defores- tation, may be more limited than critics of the agreement suggest.
THE WAY FORWARD There is still a chance to avoid the worst con- sequences of the ASM’s loss through swift implementation of a replacement that pre- serves key features that contributed to the agreement’s effectiveness. Given the proxim- ity of Amazonian forests to critical ecologi- cal tipping points (12) and the urgent need to strengthen the resilience of Brazil’s ecosys- tems, maintaining strong incentives against deforestation remains essential.
noncompliance can ultimately be mitigated or regularized, whereas de- forestation after the ASM’s July 2008 cutoff date remained ineligible for soy sourcing indefinitely (13), generating a stronger disincentive for soy producers to acquire these lands. Therefore, the PVG should be com- bined with zero-deforestation commitments such as the ASM, rather than substitute them. Similarly, calls to maintain the ASM but change the cutoff date to 2020 to align with the European Union Deforestation Regulation (EUDR) could create expectations of future amnesties and reduce the deforestation deterrent effect.
Other proposed pathways are less likely to preserve the ASM’s forest conservation benefits. Individual company commitments to deforesta- tion-free sourcing, not based on a uniform monitoring system, could result in inconsistent implementation and higher monitoring and ad- ministrative costs for companies. Over time, attrition from individual commitments could fragment the market into parallel supply chains, wherein producers without recent deforestation sell to committed buyers while soy from recently cleared areas flows to less restrictive companies (4). Similarly, firm-level attempts to segregate supply by selling certified deforestation-free volumes to some customers while directing soy from recently deforested or nonverified farms to less discerning buyers could weaken incentives for sector-wide forest con- servation. Such approaches risk rewarding traders through preferen- tial market access while providing limited benefits to most producers already operating on long-cleared land. Moving from sector-wide to fragmented implementation of commitments could further under- mine the efficacy of the sector at protecting itself from the mate- rial risks associated with deforestation, including declining rainfall, higher temperatures, and reduced agricultural productivity, which are in herently shared and must be addressed with system-wide mecha- nisms (SM section 2).
If sector-wide or individual deforestation-free sourcing commitments are used as a barrier for companies to access states’ tax incentives (e.g., the laws whose constitutionality is at stake at the STF), or framed as anticompetitive by CADE, this could weaken incentives for private-sec- tor actors to address deforestation and other socioenvironmental risks. Decisions in these cases may therefore have broader cascading effects beyond the ASM, shaping whether firms view ambitious environmental standards as legally and commercially viable. Over time, this could shift the balance toward less coordinated and less ambitious approaches to sustainability, at a time when effective action is increasingly needed to address system-wide challenges. Conversely, legal decisions that reaf- firm the rights of companies to adopt environmental sourcing standards could strengthen the enabling conditions for private-sector engagement in forest conservation.
THE ASM IN CONTEXT The end of the ASM comes amid broader threats to environmental gov- ernance in Brazil. Beyond the campaign against the ASM, agricultural lobbies have expanded their influence by, for example, having advanced a bill that restricts the use of satellite imagery in environmental enforce- ment, having overturned presidential vetoes on a bill that dismantled the country’s environmental licensing system, and pushing for a consti- tutional amendment to override STF decisions defending the rights of indigenous peoples to their ancestral lands. Meanwhile, upcoming na- tional elections create uncertainty regarding future federal support for environmental protections. These dynamics are not specific to Brazil; environmental and climate priorities are increasingly being supplanted by other political priorities around the world (9).
In Brazil’s notoriously fluid political and regulatory environment, formal legality alone provides an unstable foundation for forest pro- tection, as legal standards can abruptly be weakened or redefined un- der shifting political pressures. Voluntary, market-based instruments such as the ASM have repeatedly served as important complements to public policy, helping to sustain protections when law enforcement and regulations are slow and complex (6). The distinctive role that
the ASM has played in reducing the value of deforestation extended beyond soy properties, reaching even the speculative frontier, which made it an indispensable tool in creating more favorable conditions for Brazil to implement its laws and public policies. The loss of the ASM could jeopardize Brazil’s recent progress toward meeting national targets, including zero deforestation by 2030 and net-zero greenhouse gas emissions by 2050 (14). An STF decision that supports the rights of the private sector to protect the environment without retaliation by states can help maintain this progress.
Zero-deforestation production is becoming increasingly important for Brazil’s trading relationships as well. The EUDR, though wea kened and delayed, continues to signal rising expectations for deforestation-free production, as do similar policies being considered in the United King- dom and the United States. China also signals interest in sustainability standards for imported commodities. In a June 2026 decision, the Of- fice of the United States Trade Representative explicitly cited the law in Mato Grosso that is in front of the STF to conclude that state-level pressure against voluntary zero-deforestation policies removes private incentives to curb deforestation, creating an unfair trade advantage that forms the legal basis for a 25% tariff determination against Brazil. Thus, the end of the ASM and antagonistic actions against the private sector over environmental policies in general can be expected to weaken Bra- zil’s position in trade relationships.
Although private-sector policies are a key element in the fight against deforestation, lasting deforestation reductions will depend on stronger territorial governance, including effective enforcement and fully imple- mented land-use planning, and incentives that shape land-use decisions at scale. Ending the ASM before these broader systems are strengthened risks weakening Brazil’s position as the leading supplier of deforesta- tion-free soy while increasing risks to the agricultural sector, climate goals, and Brazilian society.
REFERENCES AND NOTES
4021 (2016).
8. R. F. Ziegert, M. Sotirov, Glob. Environ. Change 88, 102916 (2024).
9. M. A. Paim, Rev. Eur. Comp. Int. Environ. Law 30, 220 (2021).
10. I. Mateska, C. Busse, A. P. Kach, S. M. Wagner, J. Supply Chain Manag. 59, 42 (2023).
11. A. T. Leite-Filho, B. S. Soares-Filho, J. L. Davis, G. M. Abrahão, J. Börner, Nat. Commun. 12,
2591 (2021).
12. P. M. Brando et al., Annu. Rev. Environ. Resour. 50, 97 (2025).
13. F. Moffette, P. Phaneuf, L. L. Rausch, H. K. Gibbs, Glob. Environ. Change 87, 102854 (2024).
14. Brazilian Government, “Brazil’s NDC: National determination to contribute
and transform” (2024); https://migrationnetwork.un.org/policy-repository/ brazils-ndc-national-determination-contribute-and-transform. 15. L. Rausch et al., Data and code for “The rise and fall of the Amazon Soy Moratorium.” Zenodo
(2026); https://doi.org/10.5281/zenodo.20736510.
ACKNOWLEDGMENTS We thank R. Heilmayr for advising on methodology and J. Munger for graphics support. World Wide Fund for Nature–Brazil (WWF-Brazil) and Greenpeace Brazil are registered as amicus curiae in ADI 7774 and related cases and were members of the Soy Working Group. This research received funding from the WWF-Switzerland under project no. BRA0133. All data and code can be accessed at Zenodo (15).
SUPPLEMENTARY MATERIALS science.org/doi/10.1126/science.aeg5368
10.1126/science.aeg5368
1Center for Sustainability and the Global Environment (SAGE), University of Wisconsin–Madison, Madison, WI, USA. 2Land Conservation Association, Madison, WI, USA. 3World Wide Fund for Nature–Brazil (WWF-Brazil), Brasilia, Brazil. 4Greenpeace Brazil, São Paulo, Brazil. 5Department of Economics, DePaul University, Chicago, IL, USA. 6Department of Agricultural and Consumer Economics, University of Illinois Urbana-Champaign, Urbana, IL, USA. Email: llrausch@wisc.edu
Regaining your voice
voice
communication after neurological injury Sergey Stavisky S
peech is one of the most remarkable and essential human behaviors. We precisely control nearly 100 muscles to pro- duce an exquisitely timed series of breaths and rapid articu- lator movements that vibrate air in just the right way so that another person can understand our verbalized thoughts. The loss of this ability owing to neurological injuries such as stroke or amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is devastating. Yet our under- standing of the neural basis of speech—and our efforts to restore this ability—have been limited because of the complexity of speaking and the lack of animal models.
B
Despite these challenges, neuroscientists have started to unravel the neural code for speech production thanks to opportunities to
Hello
Days since implantation
Cumulative hours of data
A speech restoration neuroprosthesis. (A) As the participant tried to speak, neural activity was measured using four microelectrode arrays placed in speech production–related areas of his cortex. An initial AI model predicted the likelihood of each potential phoneme at every time step. Then a pair of language models converted those phoneme probability sequences into the most likely series of words. A computer read the final sentence out loud or sent it as text to his personal computer. (B) We quantified the system’s accuracy by measuring what percentage of outputted words were incorrect (lower is better) when the participant tried to speak prompted sentences. Performance improved as we accumulated more training data and introduced improvements to the algorithms. Decoding remained consistently accurate for many months.
activity signals Phoneme probabilities
Recurrent neural network
27 1.9
34 4.0
46 6.6
48 8.0
69 8.9
74 10.1
0.5
directly measure people’s brain activity during medical procedures such as epilepsy treatment (1). Such studies revealed that computer algorithms could predict the content of speech from simultaneously recorded neural signals (2). These discoveries, when combined with 20 years of brain-computer interface (BCI) research showing that the brain still encodes movement intentions even after years of paralysis (3), suggested that it might be possible to build a speech neuroprosthesis: a device that directly translates brain activity into words, bypassing injured parts of the nervous system (4). By combin- ing neuro science and artificial intelligence (AI), this effort has made swift progress in just a few years (5, 6).
Our team recently demonstrated an AI-based speech neuroprosthe- sis capable of restoring day-to-day communication (7). We worked with a 45-year-old man who could no longer speak intelligibly because of ALS. He volunteered for our academic clinical trial and had 256 micro- electrodes implanted across three speech-related regions of his brain (cortical areas 4, 6, and 55b). We found that across the population of measured neurons, distinct spatiotemporal patterns of neural activity occurred for all 39 English phonemes. This finding enabled us to train deep learning algorithms to predict what phoneme the participant was trying to say at any given moment. Language models then strung these phoneme sequences together into words and sentences.
On the first day of its use, the neuroprosthesis achieved 99.6%
76 11.5
81 12.2
83 13.4
88 15.9
90 17.6
95 18.8
223 80.9
accuracy with a limited 50-word vo- cabulary. Given the high signal-to-noise ratio of our intracortical sensors, which capture individual neuronal action potentials, the initial calibration re- quired only 30 min of recording while the participant attempted to speak. On the second day, we expanded the avail- able vocabulary to the whole English dictionary (125,000 words) with 90.2% accuracy. The participant’s words ap- peared on-screen as soon as he tried to say them. When he finished a phrase, it was vocalized by text-to-speech soft- ware trained on old audio recordings to sound like his pre-ALS voice. That very day, the first thing he did was use the neuroprosthesis to speak to his 4-year- old daughter, who until then had no memories of being able to understand her dad.
After further training, the speech neu- roprosthesis sustained 97.5% accuracy (a 90% reduction in word error rates compared with previous studies), month after month. Each completed sentence was added to a database used for con- tinuous online learning by the AI mod- els, thereby maintaining performance over time. This growing dataset recently allowed us to deploy more powerful (but data-hungry) algorithms to achieve
99% word accuracy (8). Two years in, the participant has used this technology almost daily to say >2.7 million words. The neuroprosthesis has allowed him to chat with friends and family and even resume working full time in climate ad- vocacy by videoconferencing with and writing to his colleagues.
244 94.5
GRAPHIC: ADAPTED FROM (7) BY A. FISHER/SCIENCE
have been possible without AI. BCIs initially benefited from a bit of beginner’s luck: Simple algorithms that assumed each neuron’s activ- ity just represented a preferred movement direction—a schema long known to be grossly incomplete—nonetheless proved surprisingly effec- tive at restoring people’s ability to control a computer cursor or robotic arm (9, 10). But those methods broke down for the more complex map- ping between neural activity and speech. Fortunately, progress in deep learning, especially as applied to automated speech recognition and machine translation, arrived just in time. AI provided powerful tools that could map inputs (neural measurements) to outputs (phonemes) without precise time alignment, exploit longer-timescale context, and leverage the predictive structure of language (11–13).
Our speech neuroprosthesis provides a life-changing way to commu- nicate, but it lacks the full range of human expression afforded by our voices. Even when the resulting text is read aloud by a computer, this approach does not capture the prosody that we use to convey emotional nuance. It also does not enable the quick back-and-forth of interactive conversation or the vocal flexibility needed for singing. Fortunately, these paralinguistic elements of voice can also be decoded from cortical activity (14). Thus, the next frontier for restoring speech is to develop a BCI that essentially acts as a digital vocal tract, transforming neural activity into sounds almost instantaneously.
Real-time voice restoration is very challenging. The need for low la- tency and vocal flexibility precludes the accumulation of neural mea- surements over longer time windows or the use of language models to boost accuracy. Nonetheless, our group has made substantial progress. We first characterized how intonation is encoded in the brain of this same participant and then developed a state-of-the-art causal Trans- former-based BCI to decode both his phonetic and paralinguistic voice features with a latency of just 30 ms from action potential to sound (15). This BCI has enabled him to not only hear himself speak in real time but also modulate his synthesized voice’s intonation to ask questions or emphasize specific words. He even sang a simple melody.
Further work is needed to establish whether such performance will replicate for patients with a total inability to speak and to make imme- diately synthesized voice consistently intelligible. AI will undoubtedly play a crucial and rapidly improving role in this quest to restore the full speed, precision, and expressive richness of patients’ lost voices. In the future, AI (in particular, the inner structure of large language models) might even provide us with clues about how to decode meaning, rather than speech, for patients with more extensive damage to the brain’s speech formation system.
PHOTOS: (TOP TO BOTTOM) THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA; ZHILING ZHENG; COURTESY OF NICHOLAS JACOBSON
REFERENCES AND NOTES
Conference on Machine Learning, Pittsburgh, PA (Association for Computing Machinery, 2006), pp. 369–376. 12. A. Graves, A. Mohamed, G. Hinton, 2013 IEEE International Conference on Acoustics, Speech
and Signal Processing, Vancouver, BC (2013), pp. 6645–6649. 13. A. Vaswani et al., Proceedings of the 31st International Conference on Neural Information
Processing Systems, Long Beach, CA (2017), pp. 6000–6010. 14. B. K. Dichter, J. D. Breshears, M. K. Leonard, E. F. Chang, Cell 174, 21 (2018). 15. M. Wairagkar et al., Nature 644, 145 (2025).
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GRAND PRIZE WINNER
Sergey Stavisky received an undergraduate degree from Brown University and a PhD from Stanford University. After completing his postdoctoral fellowship, also at Stanford, he cofounded the University of California, Davis, Neuroprosthetics Lab in the Department of Neurological Surgery in 2021. His research focuses on understanding the neural basis of speech and language and developing neuroprostheses to restore these abilities. www.science.org/doi/10.1126/science.aeh4797
FINALISTS
Zhiling “Zach” Zheng received an undergraduate degree from Cornell University and a PhD from the University of California, Berkeley (UC Berkeley). After completing his postdoctoral fellowships at the Massachusetts Institute of Technology and UC Berkeley, he started his Deep Synthesis Lab in the Department of Chemistry at Washington University in St. Louis in 2025. His research combines artifi cial intelligence and synthetic chemistry to accelerate the discovery of crystalline materials for sustainability and human health. www.science.org/doi/10.1126/science.aeh4807
Nicholas C. Jacobson received an undergraduate degree from Truman State University and a PhD from the Pennsylvania State University. After completing his postdoctoral fellowship at Massachusetts General Hospital/ Harvard Medical School, he started his laboratory in the Center for Technology and Behavioral Health and Department of Biomedical Data Science at the Geisel School of Medicine, Dartmouth College, in 2019. His research uses generative artifi cial intelligence to scale precision, evidence-based psychotherapy to address the global mental health crisis. www.science.org/doi/10.1126/science.aeh4808
Reprogramming synthesis
General-purpose artificial intelligence agents are at work in the materials chemistry laboratory Zhiling Zheng E
xperimental chemistry has long been defined by intuition, patience, and the painstaking execution of trial-and-error syntheses. Porous materials such as metal-organic frame- works (MOFs) show this clearly (1, 2). Their structures can, in principle, be drawn from enormous combinations of mo- lecular building blocks to produce materials suited for clean water, air, and energy applications (3–5). Yet a substantial gap remains between the structures that can be imagined (“the conceptual space”) and the materials that can reliably be made (“the realized space”) with current synthetic methods (6). Without faster reasoning and experimentation tied together in one loop, much of this expansive design and synthesis landscape remains out of reach (7–9).
My research introduces a path toward predictive synthesis through a general-purpose artificial intelligence (AI) laboratory system built around three stages: read, design, and act (see the figure). In this context, general-purpose AI refers to AI assistants or agents capable of interpreting chemical information, generating design hypotheses, and executing experimental decisions without being restricted to a single task or material system (10). These agents operate alongside human intuition within an interconnected loop that changes the way that researchers design and synthesize new materials to expand ex- perimental reach, reduce failure rates, and unlock design-to-discov- ery timelines not feasible using traditional methods alone.
At the heart of this platform is the AI’s ability to read chemistry like a chemist. The synthesis protocols and characterization outcomes for MOFs are often buried in prose, tables, and figures scattered across more than 50,000 academic papers containing 120,000 crystal struc- tures amassed by three decades of prior MOF research (10). To ex- tract these data at scale, we built natural language workflows that use
Artificial intelligence (AI) agents show potential to unify literature, design, and experimentation to accelerate materials discovery. (A) Multimodal generative models convert text and figures into structured synthesis data to bridge unstandardized literature. (B) Fine-tuned language models enable generative design of new building blocks. (C) Multiagent systems reason over prior knowledge, run robotic experiments, and optimize outcomes in a closed loop. [Part of the schematic is adapted from Zheng et al. (10).]
OC(=O)c1cc(cc(c1)C(O)=O)C(O)=O
large language models (LLMs) to parse synthesis procedures, identify reagents (e.g., metal precursors, linkers, solvents, and modulators), and extract detailed conditions (e.g., ratios, temperatures, and time) (11). Rather than rely on keyword heuristics, the literature data min- ing agents understand chemical name entities based on context and accept human natural language as input, which substantially low- ers the barrier for synthetic chemists to use and apply AI in their workflows; our natural language workflow achieved more than 97% accuracy across diverse formats.
Experimental data often appear in figures; therefore, we extended the system to vision-language models (12) that read adsorption iso- therms, diffraction patterns, and thermal profiles from figures. These outputs are digitized and merged with text-based data to ultimately yield a unified synthesis-structure-property dataset for MOFs. Man- ual curation of such a corpus with multimodality would have taken years; however, with our literature data mining agents, a workflow that is scalable, adaptable, and generalizable to many materials chemistry schemes was achieved within several hours.
With this structured knowledge base in hand, our hypothesis is that the way that chemists design organic linkers can be learned by AI. Through fine-tuning LLMs on a literature-based dataset of 3943 MOF linker transformations, we created generative design agents that propose new yet synthesizable building blocks for MOFs that respect topological and chemical constraints (13). As a result, these design agents proposed chemical structures that helped discover 10 new materials, referred to as the long-arm MOF family (LAMOF-1 through LAMOF-10), with computational simulations showing stron- ger water harvesting performances than those of state-of-the-art alu- minum-based MOF adsorbents (4). These gains were not achieved by traditional brute-force MOF linker screening but through targeted design guided by model suggestions learned from literature-based community knowledge (11).
The act of imagining a new material is only the beginning. The more difficult part is turning that design into a real crystal. The reaction space is large, and finding the right reaction parameters is often the limiting factor in MOF discovery. To tackle this, we built a multiagent system that acts as a group of experimental chemists (14), which plans reactions, communicates with laboratory automa- tion, interprets results, and updates its ideas in real time. Agents’ tasks include a planning stage informed by literature and learned
priors, a control stage that converts nat- ural language procedures into robotic commands, an analysis stage that evalu- ates powder x-ray diffraction patterns, and an optimization stage that proposes the next experiment using both in-con- text learning and Bayesian optimization. By learning from both successes and failures (15), the AI system improves its predictions as it moves through the syn- thesis landscape.
As a demonstration, we applied this closed-loop platform with predictive syn- thesis capability to the newly proposed materials LAMOF-1 and LAMOF-2 (13, 14), whose crystallization space spans more than 106 possible reaction condi- tions. Within 120 robotic experiments conducted within 2 weeks, the agents uncovered high-crystallinity conditions that previously would have required months of manual screening effort. The platform assigned confidence to its own suggestions, handled unexpected results, and updated its choices as the campaign
GRAPHIC: ADAPTED FROM (10) BY A. FISHER/SCIENCE
progressed. What sets this platform apart is not a single model or algorithm but the behavior that emerges when a few agents work to- gether to reason, much like an experienced human researcher would (15) but at a scale and pace that human intuition alone cannot reach.
Looking ahead, it is possible to envision a future where general- purpose agents become routine in materials chemistry laboratories. Crucially, their role is not to replace human creativity but to amplify it. By linking literature, design, and experimentation into a single system that learns from every step, AI agents change how we think about synthesis. They reprogram synthesis not only in the procedural sense but in the epistemological one: what materials we ask for, how we ask for them, and how quickly we can answer. In so doing, AI helps fulfill the promise of a true laboratory partner for predictive synthesis to greatly accelerate chemical and materials discovery in real time.
REFERENCES AND NOTES
Department of Chemistry, Washington University in St. Louis, St. Louis, MO, USA. Email: z.z@wustl.edu
FINALISTS
Zhiling “Zach” Zheng received an undergraduate degree from Cornell University and a PhD from the University of California, Berkeley (UC Berkeley). After completing his postdoctoral fellowships at the Massachusetts Institute of Technology and UC Berkeley, he started his Deep Synthesis Lab in the Department of Chemistry at Washington University in St. Louis in 2025. His research combines artifi cial intelligence and synthetic chemistry to accelerate the discovery of crystalline materials for sustainability and human health. www.science.org/doi/10.1126/ science.aeh4807
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PHOTO: ZHILING ZHENG
T
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he world is experiencing a mental health crisis where the prevalence of psychiatric disorders is approximately one in five people in any given year, and the rates have been rising in the past decade (1–3). However, the global median number of mental health providers is only 13 per 100,000 individuals (4). Human providers simply cannot scale to meet this rapidly increas- ing treatment demand. Although the focus has turned to digital mental health interventions to provide further access (5), these interventions mostly apply one-size-fits-all models that fail to target patients’ most common presenting problem: psychiatric comorbidity (6). By provid-
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Treatment vs. Control: Between-group d = 0.845 [0.409, 1.282] Depression symptoms: Change from pre to post
Treatment vs. Control: Between-group d = 0.840 [0.382, 1.298] Anxiety symptoms: Change from pre to post
Treatment vs. Control: Between-group d = 0.819 [0.264, 1.373] Eating disorder symptoms: Change from pre to post
Treatment vs. Control: Between-group d = 0.903 [0.460, 1.347] Depression symptoms: Change from pre to follow-up
Treatment vs. Control: Between-group d = 0.794 [0.328, 1.261] Anxiety symptoms: Change from pre to follow-up
Treatment vs. Control: Between-group d = 0.627 [0.072, 1.182] Eating disorder symptoms: Change from pre to follow-up
0.09
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Between-group difference
Between-group difference
Between-group difference
Between-group difference
Probability
Probability
Probability
Probability
Probability
Probability
0.06
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0.03
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-20 -10 0 10 Change in depression symptoms Change in depression symptoms
0.10
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-20 -10 0 10
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-15 -10 -5 0 5 10 Change in anxiety symptoms
-15 -10 -5 0 5 10 Change in anxiety symptoms
0.08
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Between-group difference Between-group difference
0.04
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0.02
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-50 -25 0 25 Change in eating disorder symptoms
-50 -25 0 25 Change in eating disorder symptoms
Primary results from the Therabot trial. Smoothed probability distributions of within-person change in symptom severity from baseline among adults randomized to the Therabot generative-AI intervention (treatment) or a waitlist control, across three clinical domains: (top) depression, (middle) anxiety, and (bottom) feeding- and eating- disorder risk. Within each domain, the left panel shows change from baseline to post-treatment (4 weeks) and the right panel shows change to follow-up (8 weeks). The horizontal axis is the change in symptom score from baseline; values to the left of zero (dashed line) indicate symptom improvement and values to the right indicate worsening, as marked by the arrows. The shaded region shows the change scores common to both groups; dashed vertical lines mark each group’s mean change, and the bracket marks the between- group difference. Symptoms were assessed with the Patient Health Questionnaire-9 (PHQ-9; depression), the Generalized Anxiety Disorder Questionnaire-IV (GAD-Q-IV; anxiety), and the Weight Concerns Scale (WCS; eating-disorder risk); on all three, lower scores indicate fewer symptoms. Between-group effects are standardized mean differences (Cohen’s d with 95% confidence intervals, shown in each panel) derived from the time × group interaction of a cumulative-link (ordinal) mixed-effects model. All six interactions favored Therabot (d = 0.63 to 0.90; all p < 0.05). N = 210 (Therabot, n = 106; waitlist, n = 104).
Worsening
The Therabot will see you now
Control Treatment
Control Treatment
Control Treatment
Control Treatment
Control Treatment
Control Treatment
Greater improvement
Greater improvement Worsening
Greater improvement Worsening
Greater improvement Worsening
Greater improvement Worsening
Greater improvement Worsening
ing only generalized care (7), these interventions have received limited and lackluster patient engagement (8–10) as they do not produce the tailored responses that humans can provide.
Beginning in 2019, I led my laboratory in exploring whether gen- erative artificial intelligence (AI) could address these access barriers to evidence-based care and give true personalized interaction on par with what an expert human psychotherapist might provide to their patients. This technology has developed and evolved considerably over time. We naïvely started this journey by fine-tuning models on large and widely available data. We trained our first models on hun-
GRAPHIC: ADAPTED FROM (12) BY A. FISHER/SCIENCE
dreds of thousands of peer-to-peer interactions from mental health forums, based on evidence that access to these peer-to-peer inter- actions can improve some mental health outcomes (11). After these first interactions, we quickly learned that these models could not fill this void, as not only did they not follow evidence-based strategies in responding to users, but the models often responded in ways that markedly exacerbated users’ presenting issue(s). For example, in a first simulated interaction, we said, “I am feeling depressed. Some- times, I feel like I don’t want to get out of bed,” and the supposed “therapeutic” reply from this model was, “Life is such a struggle. Most days I don’t know how I have the energy to go on. I end up wanting to cry alone in a corner. I just want my life to be over.” Clearly, we needed to change our approach, so we began to adjust our models us- ing psychotherapy training video session transcripts, reasoning that we could easily train these models with what must be evidence-based techniques embedded in these thousands of video sessions. Never- theless, this effort went about as poorly as our first attempt, with responses mostly containing “Mhmm,” “Go on,” and “Your problems stem from your relationship with your mother” (when the mother had not been discussed). At this stage, it was clear that the models were adapting to the data, but we were feeding them the wrong data.
We reached a turning point at this juncture. We set aside what was easy to do and embarked on a new mission to develop a gold- standard dataset on which to train these models. These efforts culmi- nated in a project that spanned more than 6.5 years, with more than 100 people spending well over 100,000 human hours as members of the research team to develop the system, overseen by psychologists and psychiatrists, which we named Therabot. Rather than repurpose other data, which would carry with it inherent limitations, we de- signed a dataset composed of long-form narrative dialogues, written by members of the research team, between fictional patients and pro- viders with gold-standard responses. Thus, every dialogue was both written by a human and then systematically evaluated by another human to ensure that the response contained a consistent therapeu- tic orientation and interventional approach and delivered the best evidence-based care available across the wide range of nearly all top- ics that a therapist would encounter in an outpatient practice. Our approach resulted in considerable success, and our internal evalu- ations in 2022 determined that our messages were generating gold- standard clinical approaches ~90% of the time, 6 months before the public launch of ChatGPT.
After we obtained high evidence-based treatment fidelity, we fo- cused predominantly on safety for the next 2 years. We used a method called purple-teaming to systematically test these models, in which we tried to get them to misbehave and then revised both the training data and model architecture to address any resultant issues.
Once the models consistently provided safe, gold-standard, and ef- fective care, we launched the first randomized controlled trial of gen- erative AI delivering psychotherapy (12). We designed the trial with three different groups: persons with (i) depression, (ii) anxiety, or (iii) a clinically high risk for feeding and eating disorders, compared to a waitlist control condition. In the trial, participants engaged with the Therabot system on average for more than 6 hours across 8 weeks (receiving approximately eight sessions’ worth of psychotherapy). We closely supervised users’ interactions with the system, and we, as humans, provided care in crisis situations (e.g., suicidality). We found strong large differential symptom reduction in every clinical endpoint in every group with effect sizes approaching the best evi- dence-based systems in the psychiatric literature for these conditions across any modality. We also found a strong therapeutic alliance be- tween users and the system, which closely mirrored the relationship patients would have with their human providers.
PHOTO: COURTESY OF NICHOLAS JACOBSON
In sum, our well-designed generative AI systems successfully pro- vided gold-standard interventions with meaningful real-world results both safely and effectively. We expect that this intervention could
lead to a regime change in the field, given that approximately half of psychiatric patients are already using general-purpose generative AI foundation models for therapy that do not offer this evidence-based care (13). We are dedicated to finding a solution to remedy the global mental health crisis, and we continue to study the effectiveness of these systems across a range of other conditions, as well as how to scale access to these systems throughout the underserved globe.
REFERENCES AND NOTES
(2019).
4. Mental Health Atlas 2024 (2025).
5. S. Wilhelm et al., Behav. Ther. 51, 1 (2020).
6. R. Kotov et al., J. Abnorm. Psychol. 126, 454 (2017).
7. S. Hornstein, K. Zantvoort, U. Lueken, B. Funk, K. Hilbert, Front. Digit. Health 5, 1170002
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8. A. Baumel, F. Muench, S. Edan, J. M. Kane, J. Med. Internet Res. 21, e14567 (2019).
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10. J. Linardon, M. Fuller-Tyszkiewicz, J. Consult. Clin. Psychol. 88, 1 (2020).
11. K. M. Griffiths et al., PLOS ONE 7, e53244 (2012).
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Center for Technology and Behavioral Health, Geisel School of Medicine, Dartmouth College, Hanover, NH, USA. Email: nicholas.c.jacobson@dartmouth.edu
FINALISTS
Nicholas C. Jacobson received an undergraduate degree from Truman State University and a PhD from the Pennsylvania State University. After completing his postdoctoral fellowship at Massachusetts General Hospital/Harvard Medical School, he started his laboratory in the Center for Technology and Behavioral Health and Department of Biomedical Data Science at the Geisel School of Medicine, Dartmouth College, in 2019. His research uses generative artifi cial intelligence to scale precision, evidence-based psychotherapy to address the global mental health crisis. www.science.org/doi/10.1126/science.aeh4808
10.1126/science.aeh4808
CARBON CYCLE Sea change The Aral Sea, once the fourth largest inland water body in the world, now contains the world’s largest exposed dry lake bed due mostly to the diversion of its two main feeding tributaries for irrigated agriculture. What have been the consequences of this drying on the large stores of carbon contained in its sediments? Marcé et al. showed that the Aral Sea has changed from a carbon sink to a carbon source and quantified the loss of organic carbon from these sediments since the lake began shrinking in the early 1960s. Carbon emissions from the remaining submerged sediments could be three times what have occurred already if they too become desiccated. —Jesse Smith
The Aral Sea has become a source of carbon emissions as reduced input flow from rivers has left large areas exposed and dry.
NANOMATERIALS Geometry dictates phase and texture Controlling how materials transition between liquid and solid states is fundamental to materials science, but the atomic-scale mechanisms remain poorly understood, especially in confined spaces where surfaces influence nucleation. Cui et al. used in situ transmission electron micros- copy to trap and manipulate a single bismuth nanocluster within a tunable nanoscale gap. They observed revers- ible transformations between quasi-amorphous, crystalline, and liquid states driven solely by
PHOTO: AP PHOTO/ EBRAHIM NOROOZI
the cluster’s aspect ratio rather than its volume. This geometric control also dictated the crystal- lographic texture of the resulting nanowire. —Jack Huang
CELL BIOLOGY Nuclear aKG regulation Alpha-ketoglutarate (aKG) is a metabolite used by enzymes to chemically modify chromatin, which ensures appropriate gene regulation. However, how aKG is supplied to these enzymes in the nucleus is unclear. Sternisha et al. transferred an aKG- sensing transcription factor from bacteria to human cells to monitor nuclear aKG. They
found that the aKG produced by glutamate pyruvate trans- aminase 2 in mitochondria is a key source of the aKG that is shuttled to nuclei. Loss- of-function mutations in this enzyme lead to dysregulated chromatin structure and misexpression of genes that are required for brain development. —Stella M. Hurtley
QUANTUM ENGINEERING 2D materials for single- electron memory Realizing stable and distinguish- able quantum memory at the single-electron level has long been challenged by increased
parasitic gate-channel fringe capacitance, which substantially lowers the threshold voltage shift (∆Vth) caused by stored electrons as device dimen- sions are scaled down. Using atomically thin two-dimensional materials and edge-contacted metal electrodes, Liu et al. designed a coplanar drain channel source structure that enabled a nonvolatile ∆Vth of 0.5 volts at room temperature. Their work demonstrates the ability to control single- electron quantum behavior, offering promising prospects for nanoscale memory device engineering. —Yury Suleymanov
NEUROPHYSIOLOGY Dendritic independence In neurons, dendrites actively contribute to neural computa- tion, balancing cooperative interactions with the soma. However, the precise dendritic contribution to behaviorally relevant information processing
remains to be elucidated. Noguchi et al. used ultrafast in vivo voltage imaging in rodents to determine the contribution of hippocampal CA3 dendrites and soma to information processing while the animals performed virtual reality–guided naviga- tion. The results showed that dendritic branches act as an independent functional unit that can be coupled or uncoupled from somatic compartments depending on behavioral condi- tions. Based on these results, the authors conclude that CA3 pyramidal neurons are capable of local dendritic computations. —Mattia Maroso
PROTEIN ENGINEERING Designing non-natural CRISPR variants Enzyme design and engineering are challenging in part because there are few ways to improve catalytic activity but many ways to impair it. Evolution- aware approaches can leverage information from our collection of known natural sequences to guide the generation of diverse engineered enzymes that are more likely to retain function. Skopintsev et al. demonstrated engineering of an RNA-guided nuclease using inverse protein- folding models. Screening of candidates nominated by their approach revealed improvement of genome-editing activity. An experimental structure revealed how conformational dynamics are changed in the engineered enzymes, stabilizing the key RNA- DNA interface. —Michael A. Funk
METABOLISM A hepatic signal for triglyceride synthesis Hepatic steatosis can arise from triglyceride overproduction. Kwon et al. found that glycerol 3-phosphate in mouse hepa- tocytes and liver was not only incorporated into triglycerides but also stimulated triglyceride synthesis from carbohydrates, a process called de novo lipo- genesis that is regulated by
the nutrient-sensing protein complex mTORC1. Glycerol 3-phosphate was primar- ily generated in hepatocytes by glycerol kinase acting on glycerol, which is increased in obesity. In mice, hepatocyte- specific deficiency of glycerol kinase reduced triglyceride synthesis and storage as well as de novo lipogenesis in the liver. —Wei Wong
Sci. Signal. (2026) 10.1126/scisignal.aeb7989
ELECTRONIC MATERIALS Highly conducting NbAs nanowires Nanowires of the topologi- cal Weyl semimetal niobium arsenide (NbAs) are three to four times as conductive as the bulk material. Cheon et al. used thermomechanical nanomold- ing to grow single-crystalline nanowires with diameters as small as 40 nanometers. These stable nanowires also have favorable breakdown current density and thermal conductiv- ity that could enable application as interconnects in electronics. —Phil Szuromi
PHYSICS Cobalt magnons go Dirac Electrons in graphene behave like massless Dirac particles, a property that gives rise to unusual transport. Magnetic materials can host analogous waves called magnons, but finding Dirac magnons in simple metallic thin films has been difficult. Zakeri et al. studied atomically thin cobalt films and found that their magnons form Dirac-like crossings even though cobalt is a metallic magnet in which such waves are usually damped. The measurements, supported by first-principles calculations, showed that film symmetry and thickness control these magnetic states. The work establishes elemental cobalt films as a platform for study- ing high-frequency topological magnons. —Bharat Jalan
Edited by Corinne Simonti and Jesse Smith
COGNITION Female fl exibility Cognitive flexibility is the ability to adapt to unex- pected events and switch between different choices. Glewwe et al. used a touch screen–based task to test cognitive flexibility in male and female mice. In this test, the animals had to adapt to rule switches as quickly as possible to receive a reward. Female animals were able to perform more rule shifts with fewer errors than their male counterparts. Computational modeling suggested that the increased flexibility in female mice was due to their faster commitment to new rules. Paradoxically, enhanced choice stability promoted cognitive flexibility. —Mattia Maroso
Neuropsychopharmacology (2026)
10.1038/s41386-026-02397-z
SIGNAL TRANSDUCTION GPCRs on the move G protein–coupled recep- tors (GPCRs) control many biological processes and are key drug targets. Receptor activation through ligand binding initiates a complex series of signals mediated by various receptor-associated proteins and leads to recep- tor internalization from the cell surface. Whether and how such signaling events modulate internalization, and might thus affect signaling, is less well studied. Rowe et al. examined how the modula- tion of various signaling components of the m-opioid receptor affected receptor internalization in cultured human cells. Changes in such factors during receptor signaling clearly modified receptor internalization and spatial distribution of signal- ing components. The findings help to explain dynamic
receptor signaling and how a set of mutations associated with neurological disease produces their effects. —L. Bryan Ray
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2026)
10.1073/pnas.2524866123
ORGANIC CHEMISTRY Boron turns epoxides into cyclopropanes H. C. Brown and Georg Wittig shared the 1979 Nobel Prize in chemistry for discovering rather distinct types of reac- tions that respectively used boron and phosphorus to modify carbon compounds. In a reunion of sorts, Tao et al. now report a boron reagent that accomplishes a Wittig- type reaction on epoxides, replacing the oxygen with carbon. In cooperation with zinc bromide, carbon nucleophiles substituted with two boronic esters attack
PHOTO: PATRICK JUNG
a wide range of epoxides to displace the oxygen with nearly perfect stereoinversion. The cylopropane-forming reaction complements a much older phosphorus-based approach the operates with stereoreten- tion. —Jake S. Yeston
J. Am. Chem. Soc. (2026)
10.1021/jacs.6c03854
AI IN MEDICINE A spectral image of disease risk In clinical medicine, diseases are typically diagnosed in a binary way as either present or absent. The reality, how- ever, is much more complex, and most diseases exist on a continuum of risk factors, symptoms, and biological indicators. To make sense of this complexity, Forrest et al. developed a machine learn- ing method called SHIMMER, which analyzes the data from
patients’ electronic health records to come up with a “spectral health index.” This index is not a single number but rather a visual display of where a given patient falls on the spectrum for a variety of medical conditions, offering an intuitive way to quantify both disease burden and extent of risk for not-yet-diagnosed diseases for each patient. —Yevgeniya Nusinovich
Med (2026) 10.1016/j.medj.2026.101150
INTERACTIVE MATERIALS Transmitting signals like cells The spatial arrangement of cells influences how they receive, transmit, and interpret signals. Artificial systems that mimic intercellular com- munication can contribute to understanding how the physical organization of cells can affect their collective
behaviors, but precise posi- tioning of multiple artificial agents is difficult. Nishiyama et al. report a microfluidic platform in which hydrogels that act as artificial cellular units are conjugated by DNA. The size, shape, and arrange- ment of hydrogels could be easily controlled. The periodic array could be locally activated or inhibited through catalytic signal amplification, generating distinct fluorescence patterns. This demonstrates a program- mable experimental framework that can model intercellular communication. —Sumin Jin
ACS Nano (2026) 10.1021/acsnano.5c20505
CONSERVATION Seeking the ghost dog
Even as the largest remaining forests continue to be threat- ened by major deforestation, there are still many species we
know little about. Although many such species are small, one large and charismatic example is the short-eared dog (Atelocynus microtis), one of the world’s least known canids. Wallace et al. conducted the largest survey yet of this species by study- ing records, interviewing local residents, and setting camera traps across southern Peru and Bolivia. They identified variation in the presence and abundance of the spe- cies over time, including a previously unrecognized preference for intact forests. Increasing our understanding of these lesser-known spe- cies remains an important goal, but more important is understanding that by protecting forests, we protect such species even without knowing much about them. —Sacha Vignieri
TRANSCRIPTOMICS No end in sight Despite many studies analyz- ing gene expression, we do not yet have a full picture of what this regulatory landscape looks like across tissues and diverse human populations. Orchard et al. identified thousands of variants associated with gene expression levels and splicing across six tissues spanning whole blood, several types of blood cells, nasal epithelium, and lung. The more diverse ancestries of the donors in this study likely helped to uncover previously unidenti- fied variants. Despite their well-powered tissue analysis of whole blood, including nearly 6500 donors, variant discov- ery was not yet saturated, suggesting that there is still much yet unidentified varia- tion affecting gene regulation. —Corinne Simonti
SEISMOLOGY Tide-critical transforms Ocean transform faults run perpendicular to midocean ridges, accommodating slip as new crust forms through vol- canism at the ridge. Seafloor experiments along the East Pacific Rise suggested that these faults foster communica- tion between magmatic fluids and lunar tides. Yang et al. analyzed ocean-bottom seis- mometer data over 3 years and noticed that between earth- quakes, the fault produced tremor in sync with tidal strain. This tremor-tide coupling was disrupted by earthquakes as pore pressure was released and magmatic fluid moved in. Like a valve, the cracks then resealed, the pressure rebuilt, and the tremor-tide connec- tion reset for the cycle to start again. —Angela Hessler
IMMUNOLOGY A ligand for T cell receptors The molecules that stimu- late the development and function of gdT cells, a type of nonconventional adap- tive immune cell, are not well characterized. In addition to recognizing ligands through a variable region, the gdT cell receptor (gdTCR) can interact with proteins through regions encoded in the germline, a type of innate-like recognition that is also called a nonclo- nogenic interaction. Ye et al. performed a screen to identify ligands for gdTCRs belonging to mice. The interleukin-17 receptor A chain bound to the majority of Vg4Vd7 TCRs, and the germline-encoded sequences in Vd7 were a key determinant of the interaction. This receptor governed the development, maturation, and homeostasis of T helper 1–like gdT cells, helping to shape the gdT cell compartment in mice. —Sarah H. Ross
CANCER IMMUNOLOGY Dendritic cells direct TLS development Tertiary lymphoid structures (TLSs) are immune cell formations that accumulate in nonlymphoid tissues. TLSs can develop at sites of chronic inflammation such as tumor tissue and have been associ- ated with favorable responses to cancer immunotherapy. However, the mechanisms that govern the formation of TLSs remain unclear. Mattiuz et al. performed spatial profiling of human tumors and reported a key role for type 1 conventional dendritic cells (cDC1s) in the development of TLSs (see the Perspective by Decker). Early formation of TLSs relied on T cells primed by cDC1s in tumor-draining lymph nodes.
Edited by Michael Funk
By contrast, the persistence of TLSs required cDC1 accu- mulation within tumors and antigen presentation to CD4+
and CD8+ T lymphocytes to sustain B and T cell effector responses. These findings highlight cDC1s as key regula- tors of TLS function in cancer. —Priscilla N. Kelly
AGING Tuning macrophages to slow aging Increased inflammation is associated with aging and is implicated in decreased function in aging tissues. Tan et al. explored changes in older tissue-resident mac- rophages and investigated how these cells may contrib- ute to aging phenotypes in mice (see the Perspective by FitzGerald). They found that signaling by the lipid messenger prostaglandin E2 was increased in these cells. In various mouse tissues, preventing an increase in tissue-resident macrophages helped to maintain mitochon- drial function and limited other deleterious effects of aging. Tissue-resident macrophages help to reduce inflammation by removing apoptotic and dam- aged cells. One consequence of inhibiting prostaglandin E2 signaling was restored clear- ance of senescent neutrophils. These results emphasize the possible roles of macrophages and neutrophil clearance in tissue disfunction during aging. —L. Bryan Ray
MOLECULAR PHYSICS Cold radioactive molecules The spectroscopy of atoms and molecules contain- ing deformed, pear-shaped nuclei may be able to provide insight into physics beyond the Standard Model because of the amplified sensitivity to symmetry violations of such nuclei. Radium-containing molecules are prime candi- dates for these studies, but they remain a difficult target for precision spectroscopy. Conn et al. achieved the production, cooling, and high- resolution laser spectroscopy of radium-226 monohydrox- ide, monodeuteroxide, and monofluoride molecules in a tabletop apparatus (see the Perspective by Caldwell). The approach is expected to be readily extendable to a broad range of short-lived radioiso- topes and complex molecular structures. —Jelena Stajic
PALEONTOLOGY One key tooth Teeth in mammals vary in form and function both within individuals and across spe- cies depending on what they eat. One tooth that has been notable in its importance in mammalian—particularly carnivoran—evolution is the tribosphenic molar, which facilitates both crushing and slicing. Chatar et al. looked at the tooth across 250 species and found that true dual func- tion was present in fewer than 1% of species. Most species instead evolved a trade-off prioritizing one or the other function, leading to special- ization rather than duality. —Sacha Vignieri
SOLAR CELLS A slow and steady route to modules An approach that prevents the premature degradation of early-deposited perovskite regions under ambient condi- tions eliminates directional inhomogeneity and enables highly efficient and durable module operation. Gao et al. stabilized the photoactive a-phase of formamidinium lead iodide during deposition by adding 3-ureidopropyltri- methoxysilane, which buffered moisture intrusion and homogenized crystallization but allowed continued grain growth. Blade-coated modules (100 square centimeters) had a power conversion efficiency of 21.5% and retained more than 90% of that efficiency after 2300 hours under damp-heat testing at 85°C. —Phil Szuromi
IMMUNOTHERAPY Plan B (cell) for glioma The therapeutic success of anti–programmed cell death protein 1 immunotherapy against glioblastoma is limited, but cytotoxic T lympho- cyte–associated protein 4 (CTLA-4) immune checkpoint blockade has shown promise. Kim et al. showed that B cells are essential for the antitumor response after CTLA-4 block- ade in murine glioblastoma models. Treatment increased T follicular helper cell differ- entiation in tumor-draining lymph nodes, which stimu- lated the systemic production of glioblastoma-specific class-switched antibodies by antibody-secreting cells. Tumor-reactive antibodies accumulated within the tumor and tagged cancer cells for phagocytosis by intratumoral macrophages, thus promoting tumor clearance. These find- ings reveal the essential role of
tumor-draining lymph nodes in orchestrating B cell– and antibody-dependent antitumor responses, underscoring the interplay between humoral and cellular immunity in cancer treatment. —Leoma Bere
Sci. Immunol. (2026) 10.1126/sciimmunol.adz2494
ARCHAEOLOGY Where are you from? After the Abolition of the Slave Trade Act in 1807, the British Royal Navy used St. Helena as a staging ground for opera- tions to intercept slave ships. Many liberated Africans subsequently relocated, but around 8000 individuals died on the island shortly after being freed, likely due to ill- ness. Wang et al. used isotope data from sub-Saharan Africa, ancient DNA, and historical records to identify origins for 152 liberated Africans interred on St. Helena (see the Perspective by Bentley). Most individuals were predicted to come from western Central Africa, although some were likely from much farther inland, with a few even having isotope signatures of major migrations during childhood. These results demonstrate how combining such evidence may allow for repatriation of remains in the future. —Corinne Simonti
NEUROINFLAMMATION Treg cell dual action Dual-action therapies that simultaneously suppress autoreactive T and B cells and promote myelin repair are a focus of therapeutic development for multiple sclerosis. Nanoparticles coated with autoimmune disease– relevant peptide–major histocompatibility complexes (pMHCII-NPs) to induce regu- latory T cells (Treg cells) have
shown therapeutic efficacy in mouse models of multiple sclerosis. But whether the therapeutic effects of these pMHCII-NPs are solely based on autoimmune regulation or if they also involve tissue regeneration is not known. Clarke et al. used mouse models to show that pMH- CII-NP treatment reduced autoimmune-induced central nervous system lesions and inflammation, increased the number of oligodendrocytes, and promoted remyelination. A series of cell type–specific loss-of-function experiments demonstrated that amphiregu- lin produced by Treg cells and expression of the correspond- ing epidermal growth factor receptor on oligodendrocytes are required for the observed therapeutic effects, suggesting that this pathway could be tar- geted for dual-action therapies. —Daniela Neuhofer
Sci. Transl. Med. (2026) 10.1126/scitranslmed.aef2269
Cross- cohort analysis of expression and splicing
quantitative trait loci in TOPMed
expression
Trait
Peter Orchard et al.
INTRODUCTION: Most genetic variants associated with complex human traits occur in noncoding genomic regions. This complicates interpreting variant- trait associations identified in genome- wide association studies (GWASs). Molecular quantitative trait locus (QTL) analyses detect associations between genetic variants and molecular traits such as gene expression (eQTLs) or RNA splicing (sQTLs), which can be integrated with GWAS results to nominate genes and molecular mechanisms underlying GWAS signals. This strategy has been successfully applied to existing GWAS datasets, but many GWAS signals still have no known e/sQTL colocalizations.
Gene
mechanisms
Gene
RATIONALE: The National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI)
Trans- Omics for Precision Medicine (TOPMed) program has
generated 14,324 human RNA- sequencing samples, 12,863 of
which are genotyped. This dataset enables cis- and trans- eQTL and
sQTL analyses in six tissues and cell types, with the largest sample
sizes being in whole blood (n = 6454) and lung (n = 1291). The
resulting cis- and trans- e/sQTLs can be colocalized with GWAS
signals and can be applied to examine the impact of study param-
eters on e/sQTL signal discovery and downstream GWAS
colocalization analyses.
Genotype
A/C
RESULTS: We performed fine- mapping and identified up to 69,766 cis- eQTLs and 35,770 cis- sQTLs per tissue or cell type. Through downsampling analyses, we show that eQTL signal discovery is not saturated even at a sample size of 6454, although the number of
TOPMed eQTLs 1. Test for association of genetic
variants with TOPMed gene expression and RNA splicing
variant associations
nominate mediating genes and
A TOPMed e/sQTL dataset and its application to GWAS signal interpretation. We generated a genetically diverse e/sQTL dataset and integrated it with UK Biobank–derived GWAS data for 164 traits, nominating genes for 10,611 GWAS signals. Through downsampling analyses and comparisons to external datasets, we show that e/sQTL- GWAS colocalization analyses are heavily dependent on eQTL study design.
UK Biobank GWAS
Phenotypic trait Genotype
genes with at least one eQTL is saturated. In whole blood, 11,164 of
69,766 cis- eQTLs are driven by variants that are rare (minor allele
frequency < 0.001) in individuals with high genetic similarity to
Human Genome Diversity Panel European populations, emphasiz-
ing the importance of genetic diversity in eQTL studies.
We fine- mapped UK Biobank- derived GWAS data from 164 traits and colocalized the resulting 34,107 fine- mapped GWAS signals with TOPMed e/sQTL signals, identifying colocalizations for 10,611 GWAS signals. We demonstrated a strong relationship between e/sQTL sample sizes, e/sQTL signal discovery, and the number of GWAS signals with a known e/sQTL colocalization and compared TOPMed e/sQTL- GWAS colocalization results with GTEx e/sQTL- GWAS colocalization results to demonstrate the major impact of e/sQTL tissue and cell type breadth on GWAS colocalization discovery.
GWAS signals with
CONCLUSION: The TOPMed e/sQTLs represent a high- quality dataset for GWAS colocalization. However, many e/sQTL signals remain to be discovered as available sample sizes and tissue and cell types increase, and we expect this approach to uncover many currently unknown e/sQTL- GWAS colocalizations.
*Corresponding author: Stephen C. J. Parker (scjp@ umich. edu) Cite this article as
P. Orchard et al., Science 393, eadx2989 (2026). DOI: 10.1126/science.adx2989
Examine impact of eQTL study parameters on eQTL discovery and
Increasing eQTL
sample size eQTL signals discovered
Increasing number of
tissues profiled
eQTL - GWAS colocalization analysis
Full article and list of author affiliations: https://doi.org/10.1126/ science.adx2989
nominated mediating gene(s)
Cross- cohort analysis of expression and splicing quantitative trait loci in TOPMed
Peter Orchard1, Thomas W. Blackwell2,3, Linda Kachuri4,
Peter J. Castaldi5, Michael H. Cho5, Stephanie A. Christenson6,
Peter Durda7, Stacey Gabriel8, Craig P. Hersh5,9, Scott Huntsman10,
Seungyong Hwang11†, Roby Joehanes12,13, Mari Johnson14,
Xingnan Li15,16, Honghuang Lin13,17, Ching- Ti Liu18, Yongmei Liu19,
Angel C. Y. Mak10, Ani W. Manichaikul20, David T. Paik21,
Aabida Saferali5, Joshua D. Smith22, Kent D. Taylor23,
Russell P. Tracy24, Jiongming Wang2, Mingqiang Wang21,
Joshua S. Weinstock25, Jeffrey Weiss22, Heather E. Wheeler26,27,
Ying Zhou14, Sebastian Zöllner2,3,28, Joseph C. Wu21,
Luisa Mestroni29, Sharon Graw29, Matthew R. G. Taylor29,
Victor E. Ortega30, W. Craig Johnson31, Weiniu Gan32,
Goncalo Abecasis2,3, Deborah A. Nickerson22,33, Namrata Gupta8,
Kristin Ardlie8, Prescott G. Woodruff6,34, Russell P. Bowler35,
Deborah A. Meyers36, Alex Reiner37, Charles Kooperberg14,
Elad Ziv10,38,39, Ramachandran S. Vasan13,40, Martin G. Larson13,
L. Adrienne Cupples13,18, Edwin K. Silverman5,9, Stephen S. Rich20,
Nancy Heard- Costa41, Hua Tang11, Jerome I. Rotter23,
Albert V. Smith2,3, Daniel Levy12,13, NHLBI TOPMed Consortium
Multi- Omics Working Group32, NHLBI TOPMed Consortium32§,
François Aguet8‡, Laura J. Scott2,3‡, Laura M. Raffield42‡,
Stephen C. J. Parker1,2,43*‡
Most genetic variants associated with complex traits are
hypothesized to regulate gene expression. To understand
the genetics underlying gene expression variability, we
characterized 14,324 RNA- sequencing samples from the
Trans- Omics for Precision Medicine program and performed
expression and splicing quantitative trait locus (e/sQTl)
analyses in six tissues and cell types, including whole blood
(n = 6454) and lung (n = 1291). We detected tens of thousands
of secondary cis- e/sQTls, showing that secondary cis- e/sQTl
discovery remains unsaturated. We fine- mapped uK Biobank–
derived genome- wide association study (GWAS) signals from
164 traits and identified e/sQTl colocalizations for 10,611 GWAS
signals, including 7096 that colocalize with secondary e/sQTls.
Our results suggest that even larger e/sQTl analyses will
uncover additional secondary e/sQTls, further benefiting
GWAS interpretation.
Most genetic variants associated with complex human traits occur in noncoding genomic regions (1). This complicates interpreting variant- trait associations identified in genome- wide association stud- ies (GWASs). Although GWAS signals are commonly annotated with the name of the closest gene, more data are needed to determine the gene(s) impacted by trait- associated variants. Molecular quantitative trait locus (QTL) analyses detect associations between genetic variants and molecular traits such as gene expression (eQTLs) or RNA splicing (sQTLs). Because noncoding GWAS variants often act through the tran- scriptome, e/sQTL analyses are a critical step in interpreting the mo- lecular cascade of events at GWAS signals.
e/sQTL studies have made important contributions to understanding gene regulation and GWAS signals (2–7). Recent studies include the GTEx Consortium (3), which performed e/sQTL analyses in 49 tissues and cell types with up to 706 individuals with RNA- sequencing (RNA- seq)
data; the eQTLGen Consortium (6) with 31,684 individuals with whole- blood and peripheral blood mononuclear cell (PBMC) RNA- seq and micro- array data; the INTERVAL study (5), which performed e/sQTL analyses of 4732 individuals with whole- blood RNA- seq; and the DIRECT con- sortium (2), which performed e/sQTL analyses of 3029 individuals with blood RNA- seq.
These studies have important limitations. The largest sample size in any single GTEx tissue is 706, which limits power to detect weak ge- netic effects. A total of 84.6% of GTEx donors and 100% of donors in the INTERVAL and DIRECT e/sQTL analyses are of European ancestry, which limits power to detect e/sQTLs driven by genetic variants at low frequency in European samples. eQTLGen has technical limitations: The study was a meta- analysis of 37 separate studies, many of which pro- filed gene expression and genotypes using arrays. This heterogeneity in gene expression profiling and genotyping platforms complicates cross- cohort analysis; as a result, eQTLGen did not attempt to identify more than one eQTL signal per gene (i.e., no secondary eQTL signals), despite the fact that many genes are expected to have more than one eQTL signal (3, 8). Furthermore, eQTLGen did not attempt to detect sQTLs.
The National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) Trans- Omics for Precision Medicine (TOPMed) program has performed whole- genome sequencing (WGS) on >180,000 samples from >85 phenotypi- cally and ethnically diverse cohorts, generating a large dataset of genetic variation (9). In this study, we characterized 14,324 TOPMed RNA- seq samples and used existing genotypes to perform cis- and trans- eQTL and sQTL analyses in six tissues and cell types (Fig. 1, A and B), with the following aims: (i) generate a large, high- quality e/ sQTL reference dataset and (ii) explore secondary e/sQTL signal dis- covery with larger sample sizes and characterize whether this benefits e/sQTL- GWAS colocalization analyses. We found that the large TOPMed sample sizes available for e/sQTL analyses in whole blood (n = 6454) and lung (n = 1291) combined with our mega- analysis approach (di- rectly combining data from all studies, rather than meta- analyzing) enables greater detection of secondary cis- e/sQTL signals than was achieved in previous studies. We show that even with 6454 whole- blood samples, discovery of secondary cis- eQTL and primary trans- eQTL sig- nals has not reached saturation even though cis- eGene discovery has. We found that most discovered trans- eQTL colocalize with cis- e/sQTL, which is consistent with the hypothesis that cis signals often mediate trans signals. We fine- mapped 34,107 UK Biobank (UKBB)–derived GWAS signals from 164 traits (10–12) and compared GWAS signal co- localization between TOPMed and GTEx e/sQTLs (Fig. 1C). Of 2308 GWAS signals with a TOPMed cis- e/sQTL colocalization and no GTEx cis- e/sQTL colocalization, 1200 colocalize only with secondary TOPMed cis- e/sQTLs, demonstrating that larger e/sQTL sample sizes enabling extensive secondary e/sQTL signal discovery substantially improve our ability to identify e/sQTL- GWAS colocalizations.
Results Sample demographics We performed RNA- seq on 14,324 samples from the TOPMed program, including 12,863 samples from 10,195 donors with WGS- derived geno- types. RNA- seq samples represented six tissue types and eight TOPMed cohorts (fig. S1 and supplementary materials). Samples from each tissue were derived from single TOPMed cohorts, with the exception of whole blood, which included samples from six cohorts. Sample char- acteristics such as sex, age, and genetic similarity to Human Genome Diversity Panel (HGDP) reference populations (13) varied across tis- sues (figs. S1 and S2).
For each sample we partitioned the donor’s genome into tracts based on the genetic similarity to each of seven inferred HGDP ancestry com po nents (13) (sub- Saharan Africa (HGDP- AFR); Native America (HGDP- AMR); East Asia (HGDP- EAS); Europe (HGDP- EUR); Oceania (HGDP- OCN); Middle East (HGDP- MES); and Central and South Asia (HGDP- SAS); fig. S2). Most lung and nasal epithelial samples showed high genetic
Fig. 1. Study design. (A) RNA- seq sample sizes for cis- and trans- e/sQTL scans, by TOPMed study and tissue. The full TOPMed study names and accompanying abbreviations
are: Framingham Heart Study (FHS); Genes- Environments and Admixture in Latino Asthmatics (GALA II); Study of African Americans, Asthma, Genes, & Environments (SAGE);
Subpopulations and Intermediate Outcome Measures In COPD Study (SPIROMICS); Women’s Health Initiative (WHI); COPDGene Study (COPDGene); Multi- Ethnic Study of
Atherosclerosis (MESA); and Lung Tissue Research Consortium (LTRC). The diagram was generated with SankeyMATIC. (B) cis- e/sQTL scans tested MAF ≥ 0.01 variants within
1 Mb of gene TSS (for whole blood, a scan with variant MAF ≥ 0.001 was also performed). Trans scans tested variant- gene pairs on separate chromosomes (variants with MAF ≥
0.05). Splicing phenotypes (intron excision ratios) were derived using LeafCutter. (C) cis- e/sQTL signals were colocalized with trans- e/sQTL signals to nominate genes
mediating trans effects, and cis- and trans- e/sQTL signals were colocalized with 34,107 GWAS signals from 164 UK Biobank traits to nominate genes and molecular mechanisms
underlying GWAS signals.
similarity to HGDP- EUR: For 87.0% of lung samples and 91.1% of nasal epithelial samples, at least 90% of the genome showed the greatest similarity to HGDP- EUR. A total of 50.8% of whole- blood samples were HGDP- EUR–like over at least 90% of the genome, whereas for 46.7% of samples, no single inferred ancestry component accounted for more than 90% of the genome (often substantial fractions of the genome showed highest similarity to HGDP- EUR, HGDP- AFR, or HGDP- AMR). The three tissues and cell types derived solely from the Multi- Ethnic Study of Atherosclerosis (MESA) cohort (PBMCs, monocytes, and T cells) had the most heterogeneity on the basis of genetic similarity. Most notably, of PBMC samples, 31.7% were HGDP- EUR–like over at least 90% of the genome, 6.5% were HGDP- AFR–like over at least 90%
1Department of Computational Medicine and Bioinformatics, University of Michigan, Ann Arbor, MI, USA. 2Department of Biostatistics, School of Public Health, University of Michigan, Ann Arbor, MI, USA. 3Center for Statistical Genetics, School of Public Health, University of Michigan, Ann Arbor, MI, USA. 4Department of Epidemiology and Population Health, School of Medicine, Stanford University, Stanford, CA, USA. 5Channing Division of Network Medicine, Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA, USA. 6Division of Pulmonary, Critical Care, Allergy, and Sleep Medicine, School of Medicine, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA. 7Department of Pathology and Laboratory Medicine, Larner College of Medicine, University of Vermont, Burlington, VT, USA. 8Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA, USA. 9Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA, USA. 10Department of Medicine, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA. 11Department of Genetics, Stanford University, Stanford, CA, USA. 12Population Sciences Branch, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA. 13Framingham Heart Study, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health and Boston University, Framingham, MA, USA. 14Division of Public Health Sciences, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle, WA, USA. 15Division of Data Driven and Digital Medicine, Department of Medicine, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, USA. 16Division of Pulmonary, Critical Care, and Sleep Medicine, Department of Medicine, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, USA. 17Department of Medicine, University of Massachusetts Chan Medical School, Worcester, MA, USA. 18Department of Biostatistics, School of Public Health, Boston University, Boston, MA, USA. 19Division of Cardiology, Department of Medicine, School of Medicine, Duke University, Durham, NC, USA. 20Depart- ment of Genome Sciences, School of Medicine, University of Virginia, Charlottesville, VA, USA. 21Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University, Stanford, CA, USA. 22Northwest Genomics Center, University of Washington, Seattle, WA, USA. 23The Institute for Translational Genomics and Population Sciences, Department of Pediatrics, The Lundquist Institute for Biomedical Innovation at Harbor- UCLA Medical Center, Torrance, CA, USA. 24Laboratory for Clinical Biochemistry Research, Larner College of Medicine, University of Vermont, Burlington, VT, USA. 25Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University, Baltimore, MD, USA. 26Program in Bioinformatics, Loyola University Chicago, Chicago, IL, USA. 27Department of Biology, Loyola University Chicago, Chicago, IL, USA. 28Department of Psychiatry, University of Michigan, Ann Arbor, MI, USA. 29Department of Medicine, Adult Medical Genetics Program, University of Colorado Anschutz Medical Campus, Aurora, CO, USA. 30Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Mayo Clinic, Phoenix, AZ, USA. 31Collaborative Health Studies Coordinating Center, University of Washington, Seattle, WA, USA. 32National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA. 33Department of Genome Sciences, University of Washington, Seattle, WA, USA. 34Cardiovascular Research Institute, University of California, San Francisco; San Francisco, CA, USA. 35Department of Genomic Sciences and Systems Biology, Cleveland Clinic, Cleveland, OH, USA. 36Department of Medicine, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ, USA. 37Department of Epidemiology, University of Washington, Seattle, WA, USA. 38Institute for Human Genetics, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA. 39Helen Diller Family Comprehensive Cancer Center, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA. 40Department of Medicine, School of Medicine, Boston University, Boston, MA, USA. 41Chobanian & Avedisian School of Medicine, Boston University, Boston, MA, USA. 42Department of Genetics, University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, NC, USA. 43Department of Human Genetics, University of Michigan, Ann Arbor, MI, USA. *Corresponding author. Email: scjp@ umich. edu †Present address: Department of Statistics and Institute of Applied Statistics, Jeonbuk National University, Jeonju, Republic of Korea. ‡These authors contributed equally to this work. §TOPMed Consortium authors and affiliations are listed at the end of this paper.
of the genome, 5.2% were HGDP- EAS–like over at least 90% of the genome, and for 56.5%, no single inferred ancestry component ac- counted for more than 90% of the genome.
Primary cis- e/sQTL signal discovery To identify genetic variants associated with gene expression or RNA splicing, we performed cis- e/sQTL scans using unrelated subjects and a single time point for each individual (Fig. 1, A and B), testing variants with minor allele frequency (MAF) ≥0.01. The sample size per tissue ranged from 352 (monocytes) to 6454 (whole blood) (figs. S3 and S4). We used a mega- analysis approach because we found it yielded similar results as a meta- analysis approach (fig. S5 and supplementary text).
We identified 9330 to 19,465 genes with a significant cis- eQTL (cis- eGenes) and 3290 to 8795 genes with a significant cis- sQTL (cis- sGenes) [5% false discovery rate (FDR); Fig. 2A]. The number of significant cis- e/ sGenes in each tissue correlated strongly with sample size. In whole blood and lung, tissues profiled in both TOPMed and GTEx, the rate of cis- e/sGene discovery in TOPMed exceeded that of GTEx, reflecting the greater TOPMed sample sizes [fig. S6; 19,465/22,187 tested genes (87.8%) in TOPMed whole blood were eGenes versus 12,360/20,315 (60.8%) in GTEx whole blood]. The rate of cis- eGene discovery in TOPMed whole blood was comparable to that in the INTERVAL study [17,233/ 19,166 tested genes (90.0%) were eGenes] and the larger eQTLGen study [16,987/19,250 tested genes (88.2%) were eGenes], suggesting that cis- eGene discovery is largely saturated below TOPMed whole- blood sample size (n = 6454). Primary cis- e/sQTL signals in TOPMed showed high direction- of- effect concordance in GTEx, eQTLGen, INTERVAL, and OneK1K (14) (figs. S7 to S16), supporting the robustness of our results. As expected given the tissue specificity of many eQTLs, direction- of- effect concordance was higher between matched tissue datasets than unmatched ones (figs. S16 to S18).
C
Fine- mapping of cis- e/sQTL signals reveals tens of thousands
of secondary signals
Many genes are expected to have multiple independent cis- e/sQTLs,
and detecting secondary signals provides a more comprehensive pic-
ture of gene expression regulation and may increase the number of
colocalizations with other QTL and GWAS signals. We used SuSiE (15)
A B D
Fig. 2. cis- e/sQTL summary. (A) Sample sizes per tissue (top panel), number of genes with a significant cis- e/sQTL (cis- e/sGenes) and number of SuSiE credible sets discovered per cis- e/sGene (second from top), credible set sizes (third from top), and number of primary or secondary (including tertiary, quaternary, etc.) cis- e/sQTL signals per tissue (bottom). (B) Cis- eQTL saturation analysis, and comparison to other published datasets (from eQTL Catalogue or GTEx). Number of cis- eGenes discovered at each downsampled sample size (left) and total number of cis- eQTL signals discovered (right; 95% credible sets). Results are shown for 1% FDR cis- Genes because eQTL Catalogue fine- maps QTL signals for 1% FDR cis- e/sGenes. (C) Functional annotation enrichments for whole- blood cis- e/sQTLs. Enrichment calculated relative to control credible sets matched on MAF, LD, and number of genes tested against; error bars represent 95% confidence intervals. (D) Effect size (absolute allelic fold change) for cis- eQTL in whole- blood scan with MAF 0.1% threshold.
to fine- map independent cis- e/sQTL signals, generating 95% credible sets for each signal. Throughout this work, “signal” denotes a 95% cred- ible set, “secondary signal” denotes any e/sQTL signal that is not the most significant signal for the gene (see Materials and methods), and “top PIP variant” denotes the variant with the greatest posterior inclu- sion probability (PIP) in each 95% credible set (the variant statistically judged most likely to be causal). This identified 10,282 to 69,766 and 4992 to 35,770 total cis- eQTL and cis- sQTL signals per tissue, respec- tively (Fig. 2A). In whole blood and lung, this represents a meaningful increase in signals detected relative to previous studies [518.2, 22.5, and 16.3% increase versus GTEx, INTERVAL, and DIRECT whole- blood cis- eQTLs, respectively (eQTLGen only reported primary signals); and 114.4% increase versus GTEx lung cis- eQTLs] (Fig. 2B) (2, 3, 16–18). Of the 69,766 whole- blood cis- eQTL signals 44,562 (63.9%) were not de- tected in GTEx, DIRECT, INTERVAL, or eQTLGen blood (see Materials and methods and table S1). In whole blood, we discovered a median of three cis- eQTL and two cis- sQTL signals per cis- e/sGene (Fig. 2A). A total of 28,715 (41.2%) whole- blood cis- eQTL and 13,393 (37.4%) whole- blood cis- sQTL 95% credible sets contained a single variant (Fig. 2A), a substantial increase in resolution relative to previously published results [e.g., 2112 (18.7%) of GTEx whole- blood cis- eQTL credible sets contained a single variant; fig. S19].
Because whole- blood cis- eGene discovery is saturated at the TOPMed sample size, we asked whether the total number of cis- eQTL signals is also at or near saturation. To test this, we downsampled the whole- blood sample set and reperformed cis- e/sGene discovery and fine- mapping
(Fig. 2B and figs. S20 and S21). Whereas cis- e/sGene discovery began to saturate around 3000 samples, the number of total cis- e/sQTL signals did not saturate even at the full whole- blood sample size, suggesting that additional cis- eQTL and cis- sQTL signals will be discovered with larger sample sizes.
Characterization of cis- eQTL and sQTL by functional annotation, tissue, and inferred ancestry Cis- eQTLs were enriched in transcription factor (TF) binding sites, and cis- e/sQTL signals were enriched in splice regions, although cis- eQTLs not colocalizing with cis- sQTLs showed no splice- region enrichment (Fig. 2C; figs. S22 to S24; and tables S2 and S3). cis- eQTL signals were enriched in enhancer, active transcription start site (TSS), flanking active TSS, and weak and strong transcription chromatin states, whereas cis- sQTL signals were enriched in active TSS, flanking active TSS, weak and strong transcription, transcription at gene 5′ and 3′, and genic en hancer chromatin states (Fig. 2C and figs. S25 and S26). This is consistent with the fact that cis- eQTL signals are more likely than cis- sQTL signals to be in promoters and less likely to be in a gene body (fig. S27). Both primary and secondary cis- sQTL signals were enriched in splice regions, but the enrichment was stronger for primary cis- sQTLs (fig. S28 and table S4). Primary and secondary cis- eQTL signals were enriched in active TSS and enhancer chromatin states, but active TSS enrichment was stronger for primary cis- eQTL signals (fig. S29).
In the case that a TF activates rather than represses gene expression, eVariant alleles that disrupt that TF’s motifs should associate with decreased gene expression, whereas alleles that strengthen a motif should associate with increased expression. The reverse is expected for TFs that repress gene expression. To explore these effects, we per- formed variant- sensitive motif scanning and, for each TF position weight matrix, noted which cis- eVariant alleles favor TF binding and which alleles associate with increased gene expression (fig. S30 and table S5). Although many TFs are known to act as both activators and repres- sors in different contexts (19), several TF motifs display associations with gene expression that suggest a tendency to activate. Most notably, alleles creating or strengthening many ETS family motifs associated with increased gene expression in ~70% of instances, mirroring previ- ous findings in pancreatic islets (20).
Cis- e/sQTL signals may be tissue- specific or shared across tissues, and sharing may reflect the extent to which local genomic function is shared across tissues (3, 21). We determined the fraction of signals shared, defined as credible set overlap, between lung and nasal epithelial and whole blood, conditional on a gene being tested in both tissues (fig. S31). The fraction of lung and nasal epithelial cis- eQTL signals shared with blood was 46.9 and 44.7%, respectively (sharing was lower when quantified using a subset of samples from 323 donors contributing nasal epithelial and whole blood data; see supplementary materials). Relative to cis- eQTL signals, sharing was higher for cis- sQTL (63.5 and 60.2% for lung and nasal epithelial, respectively; Fisher’s exact test P value for lung = 9.98 × 10−192 and odds ratio = 1.97). Primary signals were more likely to be shared than secondary signals (fig. S31; for lung cis- eQTL, Fisher’s exact test P = 2.9 × 10−69 and odds ratio = 1.66), al- though this difference mostly disappears when controlling for signal strength (fig. S32). Relative to unshared signals, shared eQTL signals showed stronger enrichment in active TSS chromatin states, and shared
Table 1. TOPMed eQTLs with low MAF in HGDP- EUR–like samples are missing from other large eQTL resources. For each whole- blood cis- eQTL signal, does the lead eVariant have MAF > or < 0.001 in HGDP- EUR–like samples (samples with at least 75% of the genome showing greatest similarity to HGDP- EUR samples), and does the eQTL appear (for the same gene) in any of GTEx whole- blood, eQTLGen, INTERVAL, or DIRECT cis- eQTLs?
eQTLGen, INTERVAL, or DIRECT
HGDP- EUR–like MAF ≥ 0.001 HGDP- EUR–like MAF < 0.001
TOPMed cis- eQTL overlaps cis- eQTL in GTEx whole blood,
25,058 146
Previous work comparing eQTLs across ancestry groups (usually inferred using genetic similarity to reference populations) has found that variant allele frequency, rather than effect size heterogeneity, un- derlies most ancestry- specific eQTLs (22–26). Because many eQTL studies use primarily European ancestry samples, eQTLs driven by variants that are rare or missing in European populations are expected to be missing from many existing datasets. We therefore asked to what extent the genetic diversity of the TOPMed RNA- seq data contributes to the discovery of additional eQTL signals. We found that of the 69,766 whole- blood cis- eQTL signals, 11,164 derive from variants with MAF < 0.001 in HGDP- EUR–like samples (samples with ≥75% of the genome showing the highest similarity to HGDP- EUR; table S7). Of these 11,164 signals, 93% of the variants are common (MAF ≥ 0.01) in HGDP- AFR– like samples (≥75% of the genome showing the greatest similarity to HGDP- AFR), and 14% are common in HGDP- AMR–like samples (≥50% of the genome showing the greatest similarity to HGDP- AMR; see Materials and methods), which is consistent with previous eQTL analy- ses within TOPMed (24) and expectations based on the greater genetic heterogeneity and smaller linkage disequilibrium (LD) blocks in African populations relative to non- African populations (27–29). We then asked whether TOPMed eQTLs driven by variants that are rare in HGDP- EUR–like samples are less likely to be found in other large eQTL resources (Table 1). Notably, of these 11,164 cis- eQTLs, only 1.3% are discovered in blood cis- eQTL scans in any of the GTEx, eQTLGen, INTERVAL, or DIRECT consortia (all of which are mostly or entirely composed of European samples), compared with 42.8% of the 58,602 cis- eQTLs with MAF ≥ 0.001 in HGDP- EUR–like samples. Both sets show similar enrichment around the TSS (fig. S37), suggesting that both are of high quality. This demonstrates that the diversity in TOPMed contributes to discovery of e/sQTLs that are missing from other large datasets.
Large whole- blood sample size enables discovery of lower MAF cis- e/sQTL signals Due to sample- size limitations, many cis- e/sQTL studies test only vari- ants with a MAF of 0.01 or greater (3, 6, 17, 20, 30, 31). To explore our ability to detect cis- e/sQTL signals involving rarer variants, we ran a second set of whole- blood cis- e/sQTL scans, applying a 0.001 MAF threshold. With the lower MAF threshold, the average number of vari- ants tested against each gene more than doubled (7866 versus 17,195 for the MAF ≥ 0.01 and MAF ≥ 0.001 cis- eQTL scans, respectively). Notably, the fraction of tested variants that were specific to HGDP- AFR–like, HGDP- EUR–like, or HGDP- AMR–like samples increased as the MAF threshold decreased (0.2% of variants in MAF ≥ 0.01 scan versus 16.7% of variants in MAF ≥ 0.001 scan, when considering those three well- represented groups), mostly reflecting variants that were specific to HGDP- AFR–like samples (figs. S38 to S40). Whereas the number of cis- e/sGenes showed little change compared with a 0.01 MAF threshold (19,465 and 19,394 cis- eGenes at 0.01 and 0.001 MAF thresholds, respectively, and 8795 versus 8873 cis- sGenes), the number of total signals detected increased by ~9% (from 69,766 to 76,545 cis- eQTLs, and 35,770 to 39,001 cis- sQTLs). As expected, low-MAF cis- eQTLs had larger effect sizes than high-MAF cis- eQTLs (Fig. 2D) (4).
A
B
The top PIP variant for 16,217 cis- eQTL and 7302 cis- sQTL signals had MAF < 0.01, though a majority of those variants were common (MAF ≥ 0.01) in at least one of the HGDP- EUR–like, HGDP- AFR–like, or HGDP- AMR–like groups (fig. S41). A total of 7479 cis- eQTL and 3290 cis- sQTL signals had MAF < 0.01 in all three ancestry groups. Cis- e/sQTL signals with MAF < 0.01 in all three ancestry groups generally showed direc- tionally similar enrichment patterns as those with MAF ≥ 0.01 in all three groups, though the degree of enrichment often differed (figs. S42 and S43 and table S8): For example, cis- sQTL signals with MAF < 0.01 were more strongly enriched in splice regions and genic enhancers than those with MAF ≥ 0.01 (fig. S42).
C
D
Integration of trans- e/sQTL signals with cis signals identify regulatory relationships and biological pathways To identify genetic variants that regulate gene expression and splicing in trans, we performed trans- e/sQTL scans using gene- variant pairs on separate chromosomes (variant MAF ≥ 0.05). Detection of trans signals is more difficult than detection of cis signals because trans signals are weaker, and an untargeted trans scan entails a higher multiple- testing burden. We identified 1 to 1725 trans- eGenes and 0 to 127 trans- sGenes per tissue (5% FDR; Fig. 3, A and B, and fig. S44). A saturation analysis revealed a near- linear relationship between sample size and the num- ber of trans- eGenes discovered, suggesting that trans- eGene discovery is not saturated at TOPMed sample sizes (fig. S45).
In whole blood, after LD- based clumping, 614 distinct trans- eVariants were discovered for 1725 trans- eGenes; 171 variants were trans- eVariants for >1 gene (accounting for 1282 total trans- eGenes; ta- ble S9). Trans- eVariants were enriched in missense and 3′ untranslated region (UTR) variants, although only a small fraction overlapped these annotations (figs. S46 and S47). Our top trans- eVariant by number of trans- eGenes was rs946588154 (chr7_50342615_A_G) (chr, chromo- some), which was a trans- eVariant for 260 genes. This variant was a cis- eQTL credible set variant for genes IKZF1 and GRB10 and a cis- sQTL variant for IKZF1 in whole blood. The second- ranked trans-e Variant
Fig. 3. trans- e/sQTL results. (A) Number of trans- eGenes and trans- sGenes as a function of sample size. TOPMed tissues are linked to the corresponding GTEx and DIRECT
tissues. Unlike TOPMed and GTEx, DIRECT did not apply a MAF threshold. TOPMed and GTEx defined trans as “different chromosome,” whereas DIRECT defined trans as “different
chromosome or gene- variant pair ≥5 Mb apart.” (B) Effect size (absolute allelic fold change) for trans- eQTL and cis- eQTL with MAF ≥ 0.05 in whole blood (cis- eQTL effect sizes
from MAF ≥ 0.001 scan). (C) Number of trans- eQTL and trans- sQTL credible sets discovered when fine- mapping the region around primary trans- e/sQTL signals (±1 Mb).
(D) Two (of three total) whole- blood trans- eQTL signals for gene AGAP2. One colocalizes with a RREB1 cis- sQTL, and one contains a RREB1 missense variant, suggesting that
both variants impact AGAP2 expression through distinct functional effects on RREB1. The credible set variants for the third AGAP2 trans- eQTL signal are in an RREB1 intron.
In whole blood, we identified 61 distinct trans- sVariants (table S10). The four with the largest number of trans- sGenes in whole blood in- cluded variants rs946588154 (chr7_50342615_A_G; 16 trans- sGenes) and rs1354034 (chr3_56815721_T_C; 30 trans- sGenes); rs6939187 (chr6_163408503_T_C; 8 trans- sGenes), a whole- blood cis- eQTL for gene QKI, which encodes an RNA splicing regulator (32), as well as for long noncoding RNA CAHM; and rs7613875 (chr3_49934081_C_A; 5 trans- sGenes), which sits 5.9 kb upstream of the gene encoding splicing regu- lator RBM6 (33).
Different trans- eGenes sharing a trans- eVariant might represent genes in a pathway or network. To explore this, we performed gene ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia Of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analyses for groups of 10 or more genes sharing the same whole- blood trans- eVariant (table S11) (34). Fourteen of 25 such groups showed significant GO:BP or KEGG pathway enrichments. For example, one cis- eVariant (rs16947425; chr17_64066984_C_A) for gene ERN1—which encodes endonuclease IRE1a—and gene PRR29 (un- known function) was a trans- eVariant for 13 trans- eGenes, including known ERN1 downstream target XBP1 (35, 36) and XBP1 target genes including DNAJB9. ERN1 is a regulator of the endoplasmic reticulum (ER) stress response (35, 36), and five of the 13 trans- eGenes were in the “Protein processing in ER” KEGG pathway (39.1- fold enrichment; nomi- nal P = 1.0 × 10−7). Among ER response pathways, IRE1a- XBP1 is the most highly conserved (37, 38), with an emerging role in regulation of inflammation and immune response (38–40). These results suggest that trans signals can provide insight into biological pathways.
Primary and secondary trans signals converge on potential mediator genes To identify trans- e/sGenes that may share multiple signals with a po- tential regulatory cis- e/sGene, we fine- mapped trans- e/sQTL signals within the 2- Mb window centered on each trans- e/sGene’s lead trans- e/
sVariant (Fig. 3C and table S12). Within the 2- Mb windows, 327 of the 1876 trans- eGene–tissue pairs had >1 trans- eQTL (16 of the 146 trans- sGene–tissue pairs).
In whole blood, trans- eVariants were enriched for overlap with cis- e/ sQTL signals, and trans- sVariants were enriched in cis- eQTL (fig. S48). In total, 32.9% of distinct whole- blood trans- eVariants overlap at least one whole- blood cis- eQTL or cis- sQTL signal (31.1% for trans- sVariants). Cis- eGenes for cis- eQTL overlapping trans- eQTL were 3.7- fold enriched for TF genes (P < 1 × 10−3; fig. S49). The overlap between cis and trans signals is consistent with the hypothesis that many trans effects are mediated by cis effects.
To nominate mechanisms and genes for whole- blood trans- e/sQTL signals, we colocalized whole- blood trans signals with cis signals and noted whether each trans- e/sQTL credible set contained protein- altering variants or UTR variants (Fig. 3D and figs. S50 to S52). We also fine- mapped 34,107 Pan- UKBB EUR GWAS signals (12) for 164 UKBB traits (10, 11) (table S13) and determined whether each trans- e/sQTL credible set colocalized with a GWAS signal for blood cell abundance or other traits (figs. S50 to S52). Only 15.9% of trans- eQTL credible sets and 16.9% of trans- sQTL credible sets did not colocalize with a cis-e/sQTL or GWAS signal or contain protein- altering or UTR variants. In total, 58.8% and 45.8% of trans- eQTL and trans- sQTL credible sets, respectively, colocal- ized with at least one cis- e/sQTL signal. For some trans- eGenes with mul- tiple credible sets, these annotations suggest that different trans- eQTL signals for the same gene are due to different functional effects on a single mediator gene. For example, the trans- eGene AGAP2 showed three trans- eQTLs, one of which colocalized with a RREB1 cis- sQTL and one of which represented a RREB1 missense variant (Fig. 3D).
Across all tissues, we found 30 cis- e/sGenes with >1 cis- e/sQTL sig- nal colocalizing with >1 trans- e/sQTL signal from at least one trans- e/ sGene (158 distinct cis- trans gene pairs) (table S14). For example, in lung, two ENOX1 cis- eQTLs colocalized with two COL5A1 trans- sQTLs (fig. S53). IKZF1 cis signals accounted for 76.6% (121/158) of these multicolocalizing gene pairs. Of 146 gene pairs where >1 trans- eQTL from gene 1 colocalized with >1 cis- eQTL from gene 2, directions of effect were consistent across the colocalizing signals (variants that increased expression of gene 1 either always increased or always de- creased expression of gene 2) in 140 (95.9%) of the pairs (table S14). In the most extreme case, trans- eGene BTN3A3 showed four whole- blood trans- eQTL signals that colocalized with four cis- eQTL signals for its known regulator NLRC5; for all four signal pairs, the allele as- sociated with increased NLRC5 expression associated with increased BTN3A3 expression, which is consistent with NLRC5’s role in activat- ing BTN3A3 (41).
GWAS signals frequently colocalize with secondary e/sQTL signals To assess the utility of this dataset to identify target genes for GWAS signals, we colocalized all TOPMed cis- and trans- e/sQTL signals with the 34,107 fine- mapped European Pan- UKBB GWAS signals from 164 traits (tables S13 and S15). We additionally ran e/sQTL scans on HGDP- EUR–like subsets of the RNA- seq data (fig. S54, A and B, and table S16) to obtain ancestry group–matched e/sQTL results for colocalization with the EUR GWAS signals. Because the goal of e/sQTL- GWAS inte- gration is commonly to interpret the GWAS signals, here we examined how many GWAS signals colocalized with at least one e/sQTL signal, rather than the inverse.
A total of 10,611 GWAS signals (31.1%) colocalized with at least one cross ancestry–group cis- /trans- e/sQTL in at least one tissue (SuSiE- coloc PP.H4 posterior probability of colocalization ≥0.8; Fig. 4, A and B; 94.8% of colocalized GWAS signals colocalized with only cis signals, 1.7% with only trans signals, and 3.6% with at least one cis and at least one trans signal). A total of 9410 GWAS signals (27.6%) colocalized with at least one HGDP- EUR–like cis- /trans- e/sQTL (fig. S54C), suggesting that in this case, the sample- size advantage of the cross ancestry–group e/sQTL scans outweighed the advantage of ancestry group matching.
However, we also observed 887 GWAS signals that colocalized with HGDP EUR–like e/sQTL but not cross ancestry–group e/sQTL. We high- light the GWAS colocalizations with cross ancestry–group e/sQTL here.
GWAS traits with the greatest fraction of GWAS signals colocalizing with an e/sQTL signal generally corresponded to tissue relevant traits; for example, monocyte QTL signals were particularly likely to colocalize with “monocyte count” GWAS signals (fig. S55). Colocalization recov- ered many known gene- trait associations as well as nominated new genes (supplementary text and fig. S56). In whole blood, 5872, 3331, 524, and 74 GWAS signals colocalized with cis- eQTL, cis- sQTL, trans- eQTL, and trans- sQTL signals, respectively, and thousands of GWAS signals colocalized with multiple e/sQTL types (fig. S57). Of the 10,611 colocalizing GWAS signals, 41.9% colocalized with a signal from more than one gene (across all tissues and modalities) (fig. S58). In whole blood, 44.6% of GWAS signals with a colocalization colocalized only with cis- e/sQTL signal(s) from the nearest tested gene (fig. S59). Of the 10,611 GWAS signals, 2876 (27.1%) colocalized only with secondary signals (fig. S60) and most (7096; 66.9%) colocalized with at least one secondary signal, emphasizing the importance of secondary e/sQTL signals in nominating effector genes for GWAS hits.
We identified 659 instances in which multiple neighboring GWAS signals for a given trait colocalized with multiple e/sQTL signals from the same gene and same e/sQTL type (table S17). For example, two cis- eQTL signals at the IL2RA locus colocalize with two GWAS signals for albumin/globulin ratio (Fig. 4, C and D, and fig. S61). Both cis- eQTL sig nals are single- variant credible sets (chr10_6052734_C_T; chr10_ 6053965_C_A), and the signals are in a single IL2RA intron. The se- quence surrounding chr10_6052734_C_T was previously shown via a CRISPR activation screen to regulate IL2RA expression (42). Three cis- eQTL signals for HK1 colocalized with three GWAS signals for mean corpuscular volume (red blood cell volume; Fig. 4, E and F, and fig. S62). HK1 is critical to red blood cell function; mutations in HK1 are known to cause nonspherocytic hemolytic anemia (43, 44). In the most extreme case, four monocyte count GWAS signals colocalized with four whole- blood CEBPB cis- eQTL signals (fig. S63); CEBPB regulates monocyte development, survival, and gene expression (33, 45, 46), although these GWAS signals also colocalized with e/sQTL signals for other nearby genes (SMIM25 and/or LINC01270), suggesting that CEBPB may not be the target gene, or only target gene, at this locus.
e/sQTL tissue diversity and sample size both contribute to GWAS colocalization analyses Many GWAS signals have no known e/sQTL colocalization. One expla- nation for this is that they affect a trait through a different molecular mechanism. Alternatively, the GWAS signal might correspond to an e/sQTL signal that is highly specific to a tissue or cell type, time point, or context, or the GWAS signal might correspond to an e/sQTL signal that is too weak to be detected in a dataset. To explore the relative impact of tissue type breadth versus sample size in detecting e/sQTL colocalizations with GWAS signals, we colocalized GTEx autosomal cis- e/sQTL signals from 49 tissues with the Pan- UKBB GWAS signals and compared the results with TOPMed autosomal cis- e/sQTL colo- calization results (fig. S64). A total of 12,025 GWAS signals colocalized with at least one GTEx cis- e/sQTL, compared with 10,198 colocalizing with at least one TOPMed cis- e/sQTL (MAF ≥ 0.01 scans). GWAS signals colocalizing with GTEx but not TOPMed cis- e/sQTL tended to colocal- ize in a smaller number of GTEx tissues than those colocalizing with both GTEx and TOPMed cis- eQTLs, suggesting that these reflected more tissue- specific effects (fig. S64B) that are not present in the re- stricted TOPMed tissue set. In whole blood (GTEx n = 670; TOPMed n = 6454), 2895 GWAS signals colocalized with a GTEx cis- e/sQTL compared with 7082 with a TOPMed cis- e/sQTL, and in lung (GTEx n = 515; TOPMed n = 1291), these values were 3142 and 5379 for GTEx and TOPMed, respectively. GWAS signals colocalizing with TOPMed but not GTEx whole- blood cis- e/sQTLs tended to colocalize with weaker
C
Fig. 4. Colocalization of e/sQTL with Pan- UKBB GWAS signals. (A) Number of GWAS signals colocalizing with at least one e/sQTL credible set from each tissue and modality
(cross- ancestry e/sQTL scans). (B) Heatmap displaying—for each GWAS signal with at least one e/sQTL colocalization—the maximum coloc posterior probability of colocalization
for each tissue and modality. (C and D) Two IL2RA cis- eQTL signals colocalize with two albumin/globulin ratio GWAS signals. Marginal P values are displayed in (C), and log
Bayes factors for each of the two colocalizing effects, represented by the two colors, are displayed in (C); for the eQTL panel, the sign of each variant reflects the direction of
effect on the gene’s expression for the GWAS trait–increasing allele in the colocalizing GWAS effect. (E and F) Three HK1 cis- eQTL signals colocalize with three mean corpuscular
volume GWAS signals.
E F
D
cis- eQTLs than those colocalizing with both TOPMed and GTEx whole- blood cis- e/sQTLs (fig. S64C). These results demonstrate that tissue breadth as well as sample size have a major impact on colocalization detection.
To determine if the number of GWAS signals colocalizing with a whole- blood eQTL has reached saturation in our dataset, we colocal- ized the Pan- UKBB GWAS signals with the cis- eQTLs identified using nested subsets of the whole- blood data (fig. S65). We found that the number of colocalizing GWAS signals continues to increase up to the current sample size, although at a decreasing rate. This suggests that GWAS signals not colocalizing with eQTLs at the current sample size may colocalize in even larger eQTL datasets in the tested tissues.
Discussion In this study, we present cis- and trans- e/sQTL results from six tissues and cell types profiled within the TOPMed program. The large sample sizes and uniformly processed individual- level data (as opposed to a meta- analysis) enables fine mapping of tens of thousands of secondary e/sQTL signals with high resolution.
Although a substantial fraction of GWAS signals do colocalize with e/sQTLs, many still have no known e/sQTL colocalization. Common explanations for missing colocalizations include limited power to de- tect e/sQTL, incorrect context (tissue and cell type, time point, and environmental conditions), and molecular mechanisms beyond the gene expression and RNA splicing phenotypes captured by the RNA- seq protocol used in this study. Nonetheless, our analyses provide empirical evidence that power and context will be important factors in uncovering additional GWAS colocalizations.
In regards to power, previous studies have pointed to systematic differences between genes and variants uncovered in GWAS and eQTLs, reflecting different selective constraints that result in differ- ences in the effects that each study type is powered to detect (47). Nevertheless, these systematic differences shrink as power to detect eQTLs increases (47, 48), and greater numbers of GWAS signals colo- calize with eQTLs in larger eQTL studies (48). Through subsampling analyses, we demonstrate that even with 6454 samples, we have not saturated cis- /trans- eQTL discovery and that GWAS colocalizations con tinue to be discovered, although the rate of new GWAS signals found to have at least one colocalization does slow. The impact of e/sQTL study power is also evident in the substantial increase in GWAS signals colocalizing with TOPMed whole- blood eQTLs versus GTEx whole- blood eQTLs.
In regards to context, we found that the breadth of tissue types in GTEx results in more GWAS signals with a colocalization when leverag- ing all 49 GTEx tissues relative to all 6 TOPMed tissues and cell types, reflecting the fact that many e/sQTLs are tissue and cell type specific (3). Taken together with the above observation that eQTL power in a single tissue is a major limiting factor in GWAS colocalization discov- ery, these results suggest that a substantial fraction of GWAS colocal- izations remain to be discovered with greater e/sQTL sample sizes in a large array of tissues and cell types.
In regards to trans- e/sQTL discovery, we found substantially more whole- blood trans- eGenes (1725) than GTEx (13), a similar number as DIRECT (1670) but fewer trans- eGenes than studies that tested a more restricted set of variants (e.g., eQTLGen detected 6298 trans- eGenes but tested only 10,317 trait- associated variants, and INTERVAL de- tected 2058 trans- eGenes but tested only cis- eVariants) or used a more expansive definition of trans (4, 7). Trans analyses are underpowered and prone to artifacts (49), leading to lower overlap in trans- eGenes between studies than one might expect. Only 78.1, 48.4, and 26.9% of TOPMed whole blood trans- eGenes are trans- eGenes in eQTLGen, INTERVAL, and DIRECT, respectively (overlap between other pairs are likewise limited; e.g., 58.0% of DIRECT trans- eGenes and 68.4% of INTERVAL trans- eGenes are trans- eGenes in eQTLGen). Although some of this is attributable to basic differences in testing procedures,
this limited overlap also reflects the difficulty of these analyses. Never- theless, ~85, 99, and ~80% of eQTLGen, INTERVAL, and DIRECT primary trans- eQTLs showed the same direction of effect in TOPMed (regard- less of statistical significance). Using the π1 statistic (50), we estimate that the proportions of primary eQTLGen, INTERVAL, and DIRECT trans- eQTLs that replicate in TOPMed are 0.653, 0.984, and 0.632, re- spectively. Furthermore, TOPMed trans- eQTL hotspots frequently over- lapped previously established trans- eQTL hotspots (figs. S66 and S67) (7); for example, our top trans- eVariant, rs946588154 (chr7_50342615_A_G; a trans- eVariant for 260 genes) is in perfect LD (1000G EUR popula- tions based on LDlink) with rs149007767 (chr7_50330658_C_T) (51), which is a trans- eQTL hotspot in eQTLGen and DIRECT. DIRECT and TOPMed both nominate IKZF1 and GRB10 as associated cis- eGenes that may mediate the trans effects (2).
Previous studies have found considerable overlap between trans- and cis- eQTL signals (3, 7), suggesting mediation of trans signals by cis signals. Other potential mechanisms underlying trans- e/sQTLs include direct changes to a protein sequence, changes in posttranscriptional regulation (52, 53), changes in cell type composition, and changes in a trait that in turn affects gene expression. We found that most trans signals at current sample size also have cis effects, which is consistent with cis mediation. Larger analyses are needed to evaluate whether this remains true as power to detect trans effects improves and to further characterize functional enrichment signals for trans- eVariants, which is challenging with the limited number of currently detected signals. A substantial fraction of trans signals (36.1% of whole- blood trans- eQTLs) colocalize with GWAS signals for blood cell–type abun- dance traits (e.g., neutrophil count); in some cases the trans signal may drive the GWAS signal, but in other cases the causality may be reversed (the change in cell type abundance may cause genes with differential expression across cell types to appear to be trans- eGenes). Although the use of gene expression principal components (PCs) should correct for cell type proportions, future single- cell RNA- seq e/sQTL analyses are needed to fully dissect these effects. Future work could also incorporate cell type proportion estimates to improve power and to allow testing of cell type interaction effects, which can enable the detection of cell type–specific QTLs (54).
Although the TOPMed samples for several tissues were collected from more genetically diverse cohorts than in previous studies, HGDP- EUR–like donors are still over- represented in this study. As our analy- sis and other eQTL studies have shown (22–26, 55), greater genetic ancestry diversity will enhance our ability to detect eQTL/sQTL vari- ants that are rare in one genetic similarity or ancestry group but com- mon in others. Although we utilized genetic similarity thresholds to derive group- differentiated allele frequencies and highlight QTLs found in our multiancestry dataset unlikely to be identified in HGDP- EUR–like participants only, our main analysis includes all participants, regardless of genetic similarity grouping, reflecting the continuum of allele frequencies and genetic similarity across included participants. We acknowledge that discrete ancestry or similarity groupings can reinforce inaccurate typological thinking, and we use such categoriza- tions only to guide postanalysis data display and QTL annotation and demonstrate the potential advantages of including greater genetic ancestry representation than are found in many other prior eQTL/ sQTL studies. eQTLs in individuals with finer- scale genetic similarity to more specific subcontinental reference populations could not be explored in the current work owing to limited sample size but should be examined in future larger studies. Similarly, cohort- level demo- graphic differences limit some of our conclusions; for example, overlap between whole- blood and lung cis- eQTLs may be affected by ancestry, age, and disease phenotype differences between the donors.
Although several TOPMed cohorts have longitudinal data, the cur- rent study did not attempt to utilize this. Future studies could examine changes in e/sQTL behavior over time, e.g., interactions between e/sQTL and age. Because metadata such as diet or medications is often limited,
we did not examine any context- specific effects. Context- specific e/sQTLs are an area of increasing interest and have been proposed as one ex- planation for limited eQTL- GWAS overlap (56).
We show that although many e/sQTLs remain to be discovered, the joint analysis of TOPMed RNA- seq and genotype data defines e/sQTLs at high resolution, generating a powerful resource for those studying the effects of human genetic variation.
Materials and methods RNA- seq mapping RNA- seq reads were mapped to the GRCh38 reference genome. We used a GRCh38 reference fasta file that included ERCC spike- ins and excluded ALT, HLA, and decoy contigs, and used a collapsed GENCODE v30 gene annotation. The collapsed annotation was generated using a GTEx consortium script: https://github.com/broadinstitute/gtex- pipeline/commits/master/gene_model/collapse_annotation.py, and ERCC annotations were appended.
Reads were mapped with STAR v. 2.6.1d (except for MESA, which used STAR v 2.5.3a with an index built from the GENCODE v26 gene annotation), using default parameters except–twopassMode Basic–out- FilterMultimapNmax 20–alignSJoverhangMin 8–alignSJDBoverhangMin 1–outFilterMismatchNmax 999–outFilterMismatchNoverLmax 0.1– alignIntronMin 20–alignIntronMax 1000000–alignMatesGapMax 1000000–outFilterType BySJout–outFilterScoreMinOverLread 0.33– outFilterMatchNminOverLread 0.33–limitSjdbInsertNsj 1200000– outSAMstrandField intronMotif–quantMode TranscriptomeSAM GeneCounts–outSAMtype BAM Unsorted–outSAMunmapped Within– chimSegmentMin 15–chimJunctionOverhangMin 15–chimOutType Junctions WithinBAM SoftClip–chimMainSegmentMultNmax 1–out- SAMattributes NH HI AS nM NM ch–outSAMattrRGline ID:rg1 SM:sm1
Duplicates were marked using picard (v. 2.18.17; https://broadinstitute. github.io/picard) MarkDuplicates with default parameters except ASSUME_SORT_ORDER=coordinate.
Gene counts, transcript per million (TPM) expression values, and QC metrics for each sample (including MESA samples) were computed using RNA- SeQC v. 2.3.3 (57), with parameter–stranded rf.
Matching RNA- seq samples to whole- genome genotypes For each RNA- seq sample, we run vt discover2 (https://github.com/atks/vt) on the RNA- seq .bam file, restricting to reads with mapping quality ≥ 20, to identify candidate variant sites. The output from vt discover2 is converted to a crude diploid genotype at each site by approximately 'round(2 * AD / DP)'. These genotypes are compared to the genotypes for all samples in TOPMed freeze 9b, restricted to PASS variants with minor allele frequency (MAF) ≥0.05 TOPMed- wide in coding exons as defined by GENCODE v34. The comparison calculates nonreference genotype concordance as:
SUM [(GT_rna > 0) && (GT_rna == GT_ref)] / SUM (GT_rna > 0) where the sums are over all sites with TOPMed- wide minor allele frequency ≥ 0.05 in coding exons, and integers GT_rna, GT_ref rep- resent genotypes for the RNA- seq or a whole genome reference sample respectively, coded as 0, 1 or 2 nonreference alleles. The comparison to all sequenced samples in freeze 9b separates into three clusters: putative matches with high concordance (85 to 93%), putative matches to a related sample (55 to 65%), and then putative unmatched samples (40 to 50%). We declare an RNA- seq sample as unmatched if its highest genotype concordance with any sample in freeze 9b is below 83%.
For MESA cohort samples only, expected WGS- RNA matches are used and matches where the RNA- seq sample failed fingerprinting or expression- based sex check are dropped.
In total, 733 donors contributed data from more than one tissue or cell type (fig. S68), including 334 donors from the MESA cohort that contributed T cell, monocyte, and PBMC RNA- seq samples, and 324 donors from the COPDGene cohort that contributed nasal epithelial and whole- blood samples.
Partitioning of genomes according to similarity to HGDP samples (local and global ancestry inference) Local ancestry was inferred using RFMix v2 (58) with the following option:–node- size=5. For reference haplotypes used in local ancestry inference, we obtained the HGDP (13) and processed the data accord- ing to (59), ending up with 938 individuals and 639,958 autosomal single- nucleotide polymorphisms (SNPs). We then condensed the 53 populations in HGDP into the seven inferred ancestral groups described in (13): (i) Sub- Saharan Africa (referred to as HGDP- AFR), (ii) Central/ South Asia (HGDP- SAS), (iii) East Asia (HGDP- EAS), (iv) Europe (HGDP- EUR), (v) Native America (HGDP- AMR), (vi) Oceania (HGDP- OCN), (vii) Middle East (HDGP- MES). After running RFMix, we summed up inferred local ancestry across all genetic windows of each individual to calculate global ancestry proportions, i.e., the fraction of the genome with the highest similarity to each of the seven HGDP inferred ances- try groups; these values were used to describe donor ancestry/admix- ture and assign individuals to ancestry groups as described below.
Genetic ancestry refers to segments of an individual’s genome that have been inherited from their ancestors. In practice we approximate this from some quantitative measure of genetic sharing between indi- viduals in our study and the HGDP reference populations. As such, ge- netic ancestry is an estimate that has some error and variability (60, 61).
Assignment of individuals to inferred ancestry groups For some analyses we grouped samples according to their genetic similarity to the HGDP inferred ancestry groups (e.g., “HGDP- EUR– like samples”). Unless otherwise specified, a sample was assigned to a group if at least 75% of that sample’s genome showed the highest simi- larity to that HGDP group. For HGDP- AMR–like samples, we selected a lower threshold (50%) to increase participant inclusion in the related analyses, and because AMR reference panels include many individuals with significant admixture themselves (esp. EUR and AFR) (29). If a sample did not meet the 75% threshold for any of the HGDP groups (50% for HGDP- AMR), it was left unassigned and omitted from the analysis; in some tissues, this left a substantial fraction of samples un- assigned to an ancestry group [e.g., 1845 of 6454 (28.6%) whole- blood samples]. The number of samples assigned to each ancestry group in each tissue under these criteria are listed in table S18.
Genetic variation is continuous and we acknowledge that imposing a discrete structure using somewhat arbitrary cutoffs is problematic (60, 61). We selected thresholds to create groupings for cross- population comparisons of e/sQTLs. These comparisons are intended to provide insight into genetic architecture of gene expression and the effects of varying demographic histories. Use of a broad global ancestry estima- tion also helps avoid the intrinsic challenges associated with the distinct population descriptors used between TOPMed studies and the demo- graphic nuances of each study.
Genotypes Genotypes for WGS samples matching an RNA- seq sample were ex- tracted from the freeze 9b TOPMed BCF files (62). Only autosomal + chrX SNPs and short indels [<50 base pairs (bp)] were used.
Selection of unrelated subjects Autosomal SNPs with FILTER=PASS and MAF ≥ 0.01 were used for determining subject relatedness. Relatedness was calculated using KING v. 2.2.7 (63) (options–degree 5–related). An unrelated set of sub- jects for downstream analysis was generated from the KING output as follows. First, subjects were ranked according to the number of inferred relatives they had (related meaning fourth degree or greater relatedness). Next, the individual with the fewest relatives was added to the unrelated sample set, and any subjects that this individual was related to were dropped from further consideration. This step was iteratively performed until all samples had either been added to the unrelated sample set or had been dropped from the analysis.
Genotype principal components analysis Principal components analysis (PCA) was performed on the genotypes of the unrelated subjects, utilizing a set of LD pruned and thinned common (MAF ≥ 1%) SNPs. EIGENSOFT (64, 65) (git commit 09ed563f) was used for the PCA, computing the top 15 PCs (smartpca.perl with options - k 15 - m 0). The genotype PCA is plotted in fig. S69.
RNA- seq quality control No hard thresholds were set on individual quality control (QC) met- rics; a PCA- based approach was used to label samples as outliers or nonoutliers, and outlier samples were excluded from e/sQTL scans. For each cohort/tissue combination, we performed DESeq2 size factor- based normalization of gene counts (66) (as implemented in pyqtl (https://github.com/broadinstitute/pyqtl) function deseq2_normal- ized_counts), dropped genes for which fewer than 10% of samples had a normalized count of at least 10, filled zeros with a value equal to one- half of the minimum observed nonzero value for that gene, log10 transformed the matrix, and then performed PCA. A sample was la- beled as an outlier in PC space if any of the following criteria were met:
1) The sample’s Mahalanobis distance, computed with the top 5 PCs, corresponded to a χ2 P value < 0.001.
2) Along any of the top 10 PCs, the sample’s absolute deviation from the median, normalized by the median absolute deviation across all samples for that PC, was ≥5.
Selection of samples for e/sQTL scans For each tissue, samples for the cis- eQTL scan were selected via the following procedure (fig. S70):
1) Exclude samples that were outliers in PC space. 2) Exclude samples without a known WGS match. 3) Exclude samples where the subject (WGS match) is not in the unrelated subject set.
4) Exclude samples with unclear sex based on gene expression. Sex was inferred using TPM values for genes XIST (on chrX) and RPS4Y1 (on chrY) (fig. S71).
5) Keep only one sample per subject. This was done randomly, except: A) For samples from the SPIROMICS cohort, samples from the base- line timepoint were preferred, if the subject had a sample from this time point.
B) For samples from the MESA cohort, samples from exam 5 were preferred, if the subject had a sample from this time point.
cis- eQTL scans For each tissue, using the samples selected for inclusion in the cis- eQTL scan:
1) Gene counts were filtered to include only autosomal and chrX genes.
2) Genes counts were normalized using the edgeR TMM procedure (67), as implemented in pyqtl function edger_cpm.
3) Lowly expressed genes, defined as those where <20% of samples have a TPM value of >0.1, were dropped.
4) TMM- normalized gene expression values were inverse normal transformed.
To generate gene expression PCs to be used as covariates in the cis- eQTL scans, we performed PCA on the inverse normal transformed gene expression matrix, excluding genes with low mappability (map- pability < 0.5, using mappability values from (49); genes without map- pability scores were dropped prior to PCA as well).
Covariates for each tissue were: 1) Whole blood: cohort + inferred sex + 10 genotype PCs + 100 gene expression PCs
2) Lung: inferred sex + 10 genotype PCs + 75 gene expression PCs 3) Nasal epithelial: inferred sex + 10 genotype PCs + 30 gene ex- pression PCs
5) PBMCs: inferred sex + 10 genotype PCs + 30 gene expression PCs 6) Monocytes: inferred sex + 10 genotype PCs + 30 gene expres sion PCs SNPs and indels meeting the following criteria were tested: 1) Marked as PASS in the TOPMed VCF files. 2) MAF ≥ 1% in the scan samples (for whole blood, two sets of scans were run, one using MAF ≥ 1% and one using MAF ≥ 0.1%)
For each gene, genetic variants within 1 Mb of the gene TSS were tested. Gene TSS locations were determined using pyqtl’s gtf_to_tss_ bed function.
The number of gene expression PCs to use for each tissue was de- termined by examining the relationship between the number of cis- eGenes detected and the number of PCs used as covariates, and selecting the point at which the number of cis- eGenes began to level off (fig. S72).
cis- eQTL scans were performed using tensorQTL v. 1.0.7 (68), modi- fied to add a second inverse normalization of the gene expression values following residualization against the scan covariates (modified code at https://github.com/porchard/tensorqtl/tree/5ea048f2705035d f1cb87e59eb143a54805cadeb).
Permutations were used to identify eGenes (tensorQTL mode = cis; q- value lambda = 0 and seed = 2021). Full summary statistics were computed using tensorQTL mode cis_nominal. cis- eQTL signals for cis- eGenes were fine- mapped using the SuSiE (15) implementation in tensorQTL. For monocytes, T cells, and nasal epithelial samples, we set the SuSiE L parameter (number of nonzero effects to consider when fitting the SuSiE model) to 10. For lung, PBMCs, and whole blood, we ran SuSiE with multiple L values (10 and 20 for lung and PBMCs; 10, 20, and 30 for whole blood) and for each gene selected the minimum L greater than or equal to the maximum number of credible sets dis- covered across tested Ls. By default the SNP PIP values reported by SuSiE represent an aggregation across single effects; we therefore cal- culated single- effect PIP values using the Bayes factor matrix [PIP_ij = BF_ij / sum(BF_j), for SNP i and single effect j, where BF represents Bayes factors and the sum is across SNPs; in practice the difference be tween the single- effect PIP values and the PIP values reported by SuSiE tends to be extremely minor]. A small minority of credible sets were duplicates (credible sets containing the same SNPs and PIP values); such duplicate credible sets were collapsed into single credible sets.
Cis- eQTL analyses on the subset of HGDP- EUR–like samples were performed in the same manner as full- sample cis- eQTL analyses, ex- cept for the number of phenotype PCs and SuSiE L parameters (listed in table S19). The number of phenotype PCs was selected by examining the relationship between PCs used and eGenes discovered.
For some downstream analyses, we utilized only the top PIP variant per credible set. In the case that two variants had the same PIP (i.e., were in perfect LD), we arbitrarily selected one of them (the first one based on ascending alphabetical- order sorting).
cis- sQTL scans We quantified splicing using LeafCutter (69) intron excision ratios.
Prior to quantifying splicing, samples were remapped in a variant- aware manner using STAR (70) v. 2.6.1d with WASP (71) filtering (–waspOutputMode SAMtag–varVCFfile $vcf–outSAMattributes NH HI AS nM NM ch vW), otherwise using the same mapping parameters used in the initial STAR mapping. Reads were filtered to unambiguously mapped reads passing WASP filtering [samtools view - h - q 255 $bam grep - v “vW:i:[2- 7]”] (62) and exon- exon junction counts were com- puted using regtools (72) v. 0.5 (regtools junctions extract - a 8 - m 50 - M 500000 - s 1 filtered.bam).
We used LeafCutter’s leafcutter_cluster_regtools.py to cluster in- trons [–minclureads round(tissue N/5)–mincluratio 0.001–maxintronlen 500000], additionally modifying the procedure to exclude introns sup- ported by fewer than [round(tissue N / 10)] samples. We mapped the intron clusters to genes using the map_clusters_to_genes.R GTEx (3) script (implementing LeafCutter function map_clusters_to_genes).
We removed introns with no counts in the majority of the samples, and removed introns with low variability across samples using the intron cluster fraction Z- score filter introduced in (3) [removing in- trons where three or fewer samples have abs(cluster fraction z- score)
6 and no more than three samples have abs(cluster fraction z- score) 0.25]. The resulting matrix was normalized using LeafCutter’s prepare_ phenotype_table.py script, and then each splicing phenotype was inverse normalized. This matrix was used as input to the cis- and trans- sQTL scans, and splicing PCs used as scan covariates were calculated on this matrix.
We used inferred sex, 10 genotype PCs, 10 splicing phenotype PCs, and (for whole blood) TOPMed cohort as scan covariates (fig. S73).
SNPs and indels meeting the following criteria were tested: 1) Marked as PASS in the TOPMed VCF files. 2) MAF ≥ 1% in the scan samples (for whole blood, two sets of scans were run, one using MAF ≥ 1% and one using MAF ≥ 0.1%)
For each gene, genetic variants within 1 Mb of the gene TSS were tested. Gene TSS locations were determined using pyqtl’s gtf_to_tss_ bed function.
cis- sQTL scans were performed using tensorQTL v. 1.0.7 (68), modi- fied to add a second inverse normalization of the splicing phenotypes following residualization against the scan covariates (modified code at https://github.com/porchard/tensorqtl/tree/5ea048f2705035df1cb8 7e59eb143a54805cadeb).
Permutations were used to identify sGenes (tensorQTL mode = cis; q- value lambda = 0 and seed = 2021, grouping phenotypes by gene). To get gene- level cis- sQTL credible sets, we identified introns that have a variant association strong enough to pass genome- wide FDR 5% thresh- old (based on tensorQTL mode cis_nominal significant phenotype- variant pairs), fine- mapped cis- sQTL signals for each such intron using the SuSiE implementation in tensorQTL (SuSiE L = 10), and then, for each gene, collapsed credible sets across introns by identifying overlap- ping credible sets and keeping the credible set with larger max PIP.
Cis- sQTL analyses on the subset of HGDP- EUR–like samples were performed in the same manner as full- sample cis- sQTL analyses (in- cluding leafcutter phenotype generation), except for the number of phenotype PCs and SuSiE L parameters (listed in table S19). The num- ber of phenotype PCs was selected by examining the relationship be- tween PCs used and sGenes discovered.
For some downstream analyses, we utilized only the top PIP variant per credible set. In the case that two variants had the same PIP (i.e., were in perfect LD), we arbitrarily selected one of them (the first one based on ascending alphabetical- order sorting).
Determining primary versus nonprimary signals For any analyses performed prior to fine- mapping, “primary” refers to the variant most strongly associated with the expression/splicing of each gene.
Following fine- mapping, to rank cis- eQTL signals for each gene as primary, secondary, tertiary, etc., for each gene with a fine- mapped signal we fit a single, joint eQTL model using the same covariates and pheno- types as in the cis- eQTL scan and including all of the top PIP variants for each of the gene’s credible sets. The variants were then ranked by their corresponding coefficient P values from this model. Rarely, a single variant was the top PIP variant for more than one cis- eQTL credible set (2 such cases for lung cis- eQTL scans; 4 such cases for PBMC cis- eQTL scan; 73 and 92 such cases for MAF < 0.001 and MAF < 0.01 for whole- blood cis- eQTL scans, respectively). In such cases, the relative order of the credible sets was determined based on the credible set ID (credible set “1” being ranked above credible set “2,” etc).
The procedure for ranking cis- sQTL signals was the same, except that in the case that a gene’s cis- sQTL credible sets were derived from
1 splicing phenotype, individual models were run for each of the splicing phenotypes to obtain the variant coefficient p- values before generating the gene- level credible set rankings.
In some analyses, e.g., functional enrichment analyses, e/sVariants were collapsed across genes so as not to be double- counted in the case that the same variant was an e/sVariant for >1 gene. In such cases an e/sVariant might correspond to the primary signal for one gene but not another. If the e/sVariant was not either primary or nonprimary for all related genes, it was excluded from that analysis.
Gene and variant mappability and cross- mappability Gene mappability, variant mappability, and cross- mappability between genes was calculated as described in (49) using a NextFlow (73) imple- mentation of their pipeline (available at https://github.com/porchard/ crossmap- nextflow) and the uncollapsed GENCODE v30 GTF file, with exon kmer length set to 100 bps, UTR kmer length set to 36 bps, and allowing two mismatches.
trans- eQTL scans trans- eQTL scans were performed using the same normalized gene expression matrices and covariates as cis- eQTL scans, except we dropped some gene expression PCs from the covariate matrices to avoid adjusting out trans effects. To determine which gene expression PCs might capture trans effects and therefore should be dropped from the covariate matrix for the trans- eQTL scan, we used tensorQTL to test for an association between each variant and each gene expression PC, using the same covariates as in the cis- eQTL scan minus the gene expression PCs. The strongest association observed for each gene ex- pression PC and each tissue is shown in fig. S74. For whole blood, PCs 3, 25, and many PCs beyond PC50 strongly (P < 1 × 10−15) associated with a genetic variant. The variant most strongly associated with PC3 was rs2814778 (chr1_159204893_T_C), which is the known causal vari- ant for benign neutropenia and is associated with neutrophil percent- age and lymphocyte percentage (74–76); PC3 may therefore capture cell type abundance, and we elected to keep PC3 as a covariate. The variant most strongly associated with PC25 was chr3_56815721_T_C, which was previously identified as a trans- eQTL in several studies (77–79); we elected to exclude PC25 as a covariate. In addition, we excluded whole- blood gene expression PCs beyond PC50. No PCs were dropped for any other tissues.
All trans- eQTL scans tested variants with MAF ≥ 0.05. To reduce the probability of mapping artifacts, we removed variants with mappabil- ity <1. To identify trans- eGenes and their respective trans- eVariants, we used tensorQTL mode–trans to test for associations between variant- gene pairs on separate chromosomes. Due to the large number of pairs tested, we saved summary statistics for pairs with nominal P < 1 × 10−5 only. Mappability- related artifacts may trigger false- positive trans signals as described in (49). We therefore excluded genes with map- pability <0.8 from analysis, filtered out variant- gene pairs where the gene cross- maps to a gene within 1 Mb of the variant, and tested only protein- coding genes and lincRNAs.
We used permutations to determine the significance of associations. We repeatedly generated an inverse normalized phenotype and tested it against all variants, performing 20,000 such permutations and re- cording the strongest association per chromosome achieved in each permutation. We then used the beta- approximated P value approach from FastQTL (80) to compute the adjusted P value for each gene’s stron- gest association, based on the most extreme permuted associations on any chromosome except the gene’s chromosome. We then applied Benjamini- Hochberg correction to these adjusted P values to get genome- wide FDRs. trans- eGenes were those with FDR < 5%.
For each trans- eGene, we fine- mapped trans- eQTL signals in the 2- Mb region centered on the primary trans- eVariant using the tensorQTL SuSiE implementation with SuSiE L = 10.
Trans- eQTL analyses on the subset of HGDP- EUR- like samples were performed in the same manner as full- sample trans- eQTL analy- ses, except for the number of phenotype PCs and SuSiE L param- eters (listed in table S19). For whole- blood (EUR) trans- eQTL scans,
trans- sQTL scans trans- sQTL scans were performed using the same normalized splicing phenotype matrices and covariates as cis- sQTL scans.
All trans- sQTL scans tested variants with MAF ≥0.05. To reduce the probability of mapping artifacts, we removed variants with mappabil- ity <1. To identify trans- sGenes and their respective trans- sVariants, we used tensorQTL mode–trans to test for associations between variant- splicing phenotype pairs on separate chromosomes. Due to the large number of pairs tested, we saved summary statistics for pairs with nominal P < 1 × 10−5 only. Mappability- related artifacts may trigger false- positive trans signals as described in (49). We therefore excluded genes with mappability <0.8 from analysis, filtered out variant- gene pairs where the gene cross- maps to a gene within 1 Mb of the variant, and tested only protein- coding genes and lincRNAs.
We used permutations to determine the significance of associations in a similar manner as was done for trans- eQTL scans, additionally adjusting for the number of splicing phenotypes tested per gene as done in (3). In short, we repeatedly generated an inverse normalized phenotype and tested it against all variants, performing 20,000 such permutations and recording the strongest association per chromosome achieved in each permutation. To determine the significance of the most extreme p- value for a gene with X splicing phenotypes, we used the CDF of the first order statistic for a sample size of X from the beta- approximated CDF. We then applied Benjamini- Hochberg correc- tion to these adjusted p- values to get genome- wide FDRs. trans- sGenes were those with FDR < 5%.
For each trans- sGene, we fine- mapped trans- sQTL signals in the 2- Mb region centered on the primary trans- sVariant using the ten- sorQTL SuSiE implementation with SuSiE L = 10. For each trans- sGene we ran fine mapping using only the splicing phenotype corresponding to the primary trans- sQTL, i.e., the phenotype with the strongest association.
Trans- sQTL analyses on the subset of HGDP- EUR- like samples were performed in the same manner as full- sample trans- sQTL analyses, except for the number of phenotype PCs and SuSiE L parameters (listed in table S19).
Clumping of primary trans signals For analyses involving primary trans- e/sVariants (for example, count- ing the number of trans- eGenes per trans- eVariant), highly linked primary trans- e/sVariants were clumped together to limit double- counting signals that likely derived from the same trans- e/sVariant but that were by chance assigned to separate variants. For each tissue and modality, we calculated the in- sample R2 between all trans- e/ sVariants and sorted trans- e/sQTL variants according to the most significant trans- e/sQTL P value for each trans- e/sVariant. All trans- e/ sQTL variants in high LD (R2 ≥ 0.9) with the most significant trans- e/ sVariant was clumped with that variant, and this procedure was itera- tively applied using the remaining unclumped trans- e/sVariants until no variants remained. The trans- e/sVariant with the most significant P value in each clump became the representative of that clump, and all trans- e/sQTL pairs involving a variant within the clump were reas- signed to that representative variant.
For the tissue and modality with the greatest number of hits (whole- blood trans- eQTL), this reduced the number of trans- eVariants from 810 to 614.
When fine- mapping trans- e/sQTL signals, the 2- Mb fine- mapping windows were centered on the original (unclumped) trans- e/sVariants.
Allelic fold change Allelic fold change (81) was calculated using the calculate_afc function in tensorQTL (v. 1.0.7) and the top PIP variants per credible set (for
Saturation analyses Saturation analyses were performed using nested subsets of whole blood samples ranging in size from 500 to 6000 samples in steps of 500. Generation of the gene expression/splicing phenotype matrix (in- cluding Leafcutter intron clustering) and the scan itself was performed in an identical manner as for the full cis- e/sQTL and trans- eQTL scans, except for cis- e/sQTL scans the fine- mapping was performed using a range of different phenotype PCs in order to show that differences between sample sizes were not due to number of PCs used. For cis- eQTL scans, fine- mapping was run with both SuSiE L = 10 and 20, and the final value of L was selected for each gene using the same criteria as in the full cis- eQTL scans; for cis- sQTL scans fine- mapping was run with SuSiE L = 10. For trans- eQTL scans, any phenotype PCs beyond 50 and any phenotype PCs that associated most strongly with variant chr3_56815721_T_C (the variant correlated with gene expression PC25 in the full whole- blood cis- eQTL covariates) were dropped from the covariate matrix to avoid inadvertently adjusting out trans effects.
Chromatin states Hg38 chromatin states were taken from (82). We matched TOPMed tissues to corresponding Roadmap Epigenomics cell type as follows. TOPMed whole blood and TOPMed PBMCs were matched to Roadmap Epigenomics Primary mononuclear cells from peripheral blood (E062); TOPMed lung was matched to Roadmap Epigenomics lung (E096); TOPMed monocytes was matched to Roadmap Epigenomics Primary monocytes from peripheral blood (E029); TOPMed T cells were matched to Roadmap Epigenomics Primary T cells from peripheral blood (E034); and TOPMed nasal epithelial was matched to Roadmap Epigenomics A549 EtOH 0.02pct Lung Carcinoma Cell Line (E114).
Functional enrichments SnpEff annotations (83) were extracted from the TOPMed freeze 9b VCF file.
Enrichments of cis- e/sQTL credible sets in annotations were deter- mined relative to control credible sets matched on chromosome, MAF, LD, and number of genes tested against. For each variant included in the scan, we calculated the number of variants that it is in LD with (R2 ≥ 0.9; LD calculated using the TOPMed samples in the scan), the number of genes it was tested against in the scan, and the MAF. Then, for each credible set, we took the top PIP variant and selected a control variant that was tested against a similar number of genes and has approximately n LD proxies where n = (size of credible set – 1), and has a similar MAF (as similar as possible after filtering on the first two conditions). Then, the control credible set is that control variant and its LD proxies.
Clumped primary variants were used for trans- e/sQTLs enrich- ments. Enrichments were determined relative to control variants matched on chromosome and MAF (variants were binned into 50 equally spaced MAF bins). Only variants included in the trans scan were con- sidered (e.g., all control variants had mappability = 1). Each trans- e/ sVariant was represented only once (e.g., a variant that was a trans- eVariant for two genes was not double- counted).
We used logistic regression to score enrichments. For a given an- notation type (e.g., chromatin states or SnpEff annotations), we build a logistic regression model using the true signals and the control signals (credible sets + control credible sets in the case of cis- e/sQTL signals; primary hits + controls in the case of trans- e/sQTLs). The regression outcome was whether the signal was a true signal (1) or a control signal (0), and predictors were binary indicators of whether any variants in the true/control signal overlapped each of the annota- tions from that annotation type (e.g., for chromatin states, all the possible chromatin states were predictors in the model). Annotations
TF motif cis- eVariant overlap versus gene expression directionality analysis Motif scans were performed using the 540 nonredundant motifs from (84), using FIMO (v. 5.5.3, with default parameters and a 0- order Markov background model generated using fasta- get- markov) (85). We used variant- sensitive motif scans to account for the fact that an al- ternative allele might create a TF binding site missing from the refer- ence genome, or destroy a TF binding site present in the reference genome, by scanning both the reference sequence as well as replacing the reference alleles with alternative alleles.
Using the variant- sensitive motif scans, for each PWM, we counted the number of whole blood cis- eQTL signals overlapping a motif for that PWM (using the top PIP variant in each credible set from the MAF ≥0.001 cis- eQTL scan). We then calculated how often the allele that increased expression of the target gene increased the strength (FIMO score) of the motif hit. We excluded PWMs with less than 20 eQTL– motif hit overlaps. To determine whether any deviation from 0.5 was significant, we computed a P value with a two- sided binomial test and performed Bonferroni correction across PWMs.
trans- e/sQTL enrichment in cis- e/sQTL credible sets Enrichment of clumped primary whole- blood trans- e/sQTLs in whole- blood cis- e/sQTL credible sets was calculated with a Fisher’s exact test relative to the MAF- matched trans- e/sQTL control variants used in the functional enrichments. Each trans- e/sVariant was counted only once, regardless of the number of trans- e/sGenes associated with it.
TF gene enrichment among cis- eGenes for cis- eQTL overlapping trans- eQTL This was calculated using a permutation test. First, for each cis- eGene with at least one credible set, we determined whether the gene encodes a TF based on the list of TF gene Ensembl IDs from (86). Then, for each trans- eVariant, we determined which cis- eGenes had a cis- eQTL credible set containing the trans- eVariant, and whether any of those cis- eGenes were TF genes. We then counted the number of trans- eVariants that had at least one associated TF cis- eGene. To generate a null distribution for this statistic, we permuted the gene → is_TF re- lationships and re- computed the number of trans- eVariants having at least one associated TF cis- eGene, repeating this process 1000 times.
trans- eQTL GO term enrichment For each set of ≥10 trans- eGenes sharing a whole- blood trans- eVariant (after LD clumping), we performed a GO/KEGG pathway enrichment analysis using gprofiler (34). As the background set of genes we used all genes tested in the whole- blood trans- eQTL scan that had at least one nominal P < 1 × 10−5. We only tested GO:BP and KEGG terms/ pathways with at least 5 genes and no more than 1000 genes. P values were Bonferroni corrected within each trans- eVariant.
Colocalization Colocalizations were performed with coloc v. 5.2.1 (87) using Bayes factor matrices from SuSiE (coloc.susie function) and default priors. A colocal- ization was called in the case that the posterior probability of H4 (the posterior probability that the same variant underlies the signal in both modalities) was at least 0.8. In the case that an implausible one- to- many colocalization was implied by the coloc output (e.g., a single cis- eQTL credible set colocalizing with two GWAS credible sets from the same GWAS), the colocalization with the highest posterior probability was kept.
For whole- blood cis- e/sQTL- GWAS colocalizations, we used MAF ≥ 0.01 cis- e/sQTL for consistency across tissues and in the comparison with GTEx. Colocalization results using MAF ≥ 0.001 were highly simi- lar to results using MAF ≥ 0.01.
Pan- UKBB GWAS fine- mapping We used EUR and AFR LD matrices and GWAS summary statistics from Pan- UKBB (12) (v. 0.3; in hg19 coordinates; https://pan.ukbb. broadinstitute.org/) for fine- mapping UKBB GWAS signals. For each genetic ancestry cluster (based on reference panel similarity) we in- cluded only pass- QC phenotypes, and to avoid analyzing multiple highly correlated phenotypes we kept only phenotypes from the maxi- mally independent set. We additionally dropped potentially sensitive phenotypes, such as those relating to mental health, sexual activity, alcohol use, and intelligence. This left 172 EUR GWAS phenotypes and 32 AFR GWAS phenotypes (table S13). Of the 172 EUR GWAS pheno- types and 32 AFR GWAS phenotypes, 166 and 17 phenotypes had at least one genome- wide significant variant.
To determine genomic windows to fine- map, for each GWAS we iden- tified the most genome- wide significant variant not yet in a fine- mapping window, took the 500- kb window centered on that variant as a fine- mapping window, and repeated this procedure until no genome- wide significant variants (P < 5 × 10−8) remained. We then merged over- lapping fine- mapping windows such that they would be fine- mapped together. After merging, we dropped windows >10 Mb in size (LD ma- trices were available only up to a radius of 10 Mb). We additionally dropped a small number of windows with an excessive number of vari- ants (>40,000) in the LD matrix.
Signals were fine- mapped using SuSiE (v. 0.11.92; susie_rss func- tion). Low- confidence variants were excluded, as were variants that failed to lift from hg19 to hg38 or that lifted to the same position as another hg19 variant. We set the SuSiE L parameter to 10, and itera- tively raised it to 20, 30, and then 40 in the case that (i) the model failed to converge at the current value of L, or (ii) the number of cred- ible sets discovered met or exceeded (L * 0.7). If more than one L was used, we calculated the maximum number of credible sets discovered across all tested values of L, and selected the final model as the one with the smallest L exceeding the maximum number of credible sets discovered. We then lifted SuSiE results to hg38, excluding any fine- mapping windows that did not lift.
Fine- mapping resulted in 34,107 EUR credible sets but only 96 AFR credible sets (table S13), reflecting the small sample sizes for AFR GWAS in UKBB. Because there were so few AFR credible sets, we used only EUR credible sets in downstream analysis.
Presence of TOPMed whole blood cis- eQTL signals in GTEx whole blood / DIRECT / INTERVAL / eQTLGen We considered a TOPMed whole blood cis- eQTL signal to be present in GTEx whole blood if the TOPMed cis- eQTL credible set overlapped a GTEx whole blood cis- eQTL credible set.
We considered a TOPMed whole blood cis- eQTL signal to be present in eQTLGen if the TOPMed cis- eQTL credible set overlapped a eQTL- Gen primary eQTL or its LD proxies (R2 ≥ 0.8 based on TOPMed whole- blood samples).
We considered a TOPMed whole blood cis- eQTL signal to be present in DIRECT if the TOPMed cis- eQTL credible set overlapped a DIRECT conditional eQTL or its LD proxies (R2 ≥ 0.8 based on TOPMed whole- blood samples).
We considered a TOPMed whole blood cis- eQTL signal to be present in INTERVAL if the TOPMed cis- eQTL credible set overlapped an INTERVAL conditional eQTL or its LD proxies (R2 ≥ 0.8 based on TOPMed whole- blood samples).
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trait loci in TOPMed,” version v1, Zenodo (2025); https://doi.org/10.5281/ zenodo.17957236.
acKNOWleDGMeNts
We gratefully acknowledge the studies and participants who provided biological samples and
data for TOPMed. The Framingham Heart Study (FHS) acknowledges the dedication of the
FHS study participants without whom this research would not be possible. The authors thank
the other investigators, the staff, and the participants of the MESA study for their valuable
contributions. A full list of participating MESA investigators and institutes can be found at
https://www.mesa- nhlbi.org. The GALA II study collaborators include S. Thyne, UCSF;
H. J. Farber, Texas Children’s Hospital; D. Serebrisky, Jacobi Medical Center; R. Kumar, Lurie
Children’s Hospital of Chicago; E. Brigino- Buenaventura, Kaiser Permanente; M. A. LeNoir, Bay
Area Pediatrics; K. Meade, UCSF Benioff Children’s Hospital, Oakland; W. Rodriguez- Cintron,
VA Hospital, Puerto Rico; P. C. Avila, Northwestern University; J. R. Rodriguez- Santana, Centro
de Neumologia Pediatrica; L. N. Borrell, City University of New York; A. Davis, UCSF Benioff
Children’s Hospital, Oakland; S. Sen, University of Tennessee and F. Lurmann, Sonoma
Technologies. The authors acknowledge the families and patients for their participation and
thank the numerous health care providers and community clinics for their support and
participation in GALA II. In particular, the authors thank study coordinator S. Salazar; the
recruiters who obtained the data: D. Alva, G. Ayala- Rodriguez, L. Caine, E. Castellanos, J. Colon,
D. DeJesus, B. Lopez, B. Lopez, L. Martos, V. Medina, J. Olivo, M. Peralta, E. Pomares,
J. Quraishi, J. Rodriguez, S. Saeedi, D. Soto, A. Taveras; and the lab researcher C. Eng who
processed the biospecimens. The SAGE study collaborators include H. J. Farber, Texas
Children’s Hospital; E. Brigino- Buenaventura, Kaiser Permanente; M. A. LeNoir, Bay Area
Pediatrics; K. Meade, UCSF Benioff Children’s Hospital, Oakland; L. N. Borrell, City University
of New York; A. Davis, UCSF Benioff Children’s Hospital, Oakland and F. Lurmann, Sonoma
Technologies. The authors acknowledge the families and patients for their participation and
thank the numerous health care providers and community clinics for their support and
participation in SAGE. In particular, the authors thank study coordinator S. Salazar; the
recruiters who obtained the data: L. Caine, E. Castellanos, B. Lopez, S. Saeedi; and the lab
researcher C. Eng who processed the biospecimens. The authors thank the SPIROMICS
participants and participating physicians, investigators, study coordinators, and staff for
making this research possible. More information about the study and how to access
SPIROMICS data are available at https://www.spiromics.org. We would like to acknowledge
the following current and former investigators of the SPIROMICS sites and reading centers:
N. E. Alexis, W. H. Anderson, M. Arjomandi, I. Barjaktarevic, R. Graham Barr, P. Basta,
L. A. Bateman, C. Bellinger, S. P. Bhatt, E. R. Bleecker, R. C. Boucher, R. P. Bowler, R. G. Buhr,
S. A. Christenson, A. P. Comellas, C. B. Cooper, D. J. Couper, G. J. Criner, R. G. Crystal, J. L. Curtis,
C. M. Doerschuk, M. T. Dransfield, M. B. Drummond, C. M. Freeman, C. Galban, K. Gershner,
M. K. Han, N. N. Hansel, A. T. Hastie, E. A. Hoffman, Y. J. Huang, R. J. Kaner, R. E. Kanner,
M. Kesimer, E. C. Kleerup, J. A. Krishnan, W. W. Labaki, L. M. LaVange, S. C. Lazarus, F. J. Martinez,
M.- L. McDonald, D. A. Meyers, W. C. Moore, J. D. Newell Jr, E. C. Oelsner, J. Ohar, W. K. O’Neal,
V. E. Ortega, R. Paine, III, L. Paulin, S. P. Peters, C. Pirozzi, N. Putcha, S. Raman, S. I. Rennard,
D. P. Tashkin, J. M. Wells, R. A. Wise, and P. G. Woodruff,. The project officers from the Lung
Division of the National Heart, Lung, and Blood Institute were L. Postow and L. Viviano.
Funding: Molecular data for the Trans- Omics in Precision Medicine (TOPMed) program was
supported by the National Heart, Lung and Blood Institute (NHLBI). RNASeq for “NHLBI
TOPMed: Whole Genome Sequencing and Related Phenotypes in the Framingham Heart
Study” (phs000974) was performed at the Northwest Genomics Center (HHSN268201600032I).
Genome Sequencing for “NHLBI TOPMed: Whole Genome Sequencing and Related
Phenotypes in the Framingham Heart Study” (phs000974)” was performed at Broad
Genomics (HHSN268201600034I, 3U54HG003067- 12S2, 3R01HL092577- 06S1). RNA- seq
for “NHLBI TOPMed: Genetic Epidemiology of COPD (COPDGene) (phs000951)” was
performed at the Northwest Genomics Center (HHSN268201600032I). Genome Sequencing
for “NHLBI TOPMed: Genetic Epidemiology of COPD (COPDGene) (phs000951)” was
performed at Broad Genomics (HHSN268201500014C) and the Northwest Genomics Center
(3R01HL089856- 08S1). RNA- seq for “NHLBI TOPMed - NHGRI CCDG: Genes- Environments
and Admixture in Latino Asthmatics (GALA II) (phs000920)” was performed at Broad
Genomics (HHSN268201600034I). Genome Sequencing for ““NHLBI TOPMed - NHGRI
CCDG: Genes- Environments and Admixture in Latino Asthmatics (GALA II) (phs000920)” was
performed at NYGC Genomics (3R01HL117004- 02S3). RNA- seq for “NHLBI TOPMed: Study of
African Americans, Asthma, Genes and Environment (SAGE) (phs000921)” was performed
at Broad Genomics (HHSN268201600034I). Genome Sequencing for “NHLBI TOPMed:
Study of African Americans, Asthma, Genes and Environment (SAGE) (phs000921)” was
performed at NYGC Genomics (3R01HL117004- 02S3) and the Northwest Genomics Center
(HHSN268201600032I). RNA- seq for “NHLBI TOPMed: SubPopulations and InteRmediate
Outcome Measures In COPD Study (SPIROMICS) (phs001927)” was performed at Northwest
Genomics Center (HHSN268201600032I). Genome Sequencing for “NHLBI TOPMed:
SubPopulations and InteRmediate Outcome Measures In COPD Study (SPIROMICS)
(phs001927)” was performed at Broad Genomics (HHSN268201600034I). RNA- seq for
“NHLBI TOPMed: MESA and MESA Family AA- CAC (phs001416)” was performed at Northwest
Genomics Center (HHSN268201600032I) and Broad Genomics (HHSN268201600034I).
Genome Sequencing for “NHLBI TOPMed: MESA and MESA Family AA- CAC (phs001416)” was
performed at Broad Genomics (3U54HG003067- 13S1, HHSN268201600034I,
HHSN268201500014C). RNA- seq for “NHLBI TOPMed: Women’s Health Initiative (WHI)
(phs001237)” was performed at Broad Genomics (HHSN268201600034I). Genome
Sequencing for “NHLBI TOPMed: Women’s Health Initiative (WHI) (phs001237)” was
performed at Broad Genomics (HHSN268201500014C). RNA- seq for “NHLBI TOPMed: Lung
Tissue Research Consortium (LTRC) (phs001662)” was performed at Northwest Genomics
Center (HHSN268201600032I). Genome Sequencing for “NHLBI TOPMed: Lung Tissue
Research Consortium (LTRC) (phs001662)” was performed at Broad Genomics
(HHSN268201600034I). Core support including centralized genomic read mapping and
genotype calling, along with variant quality metrics and filtering were provided by the TOPMed
Informatics Research Center (3R01HL- 117626- 02S1; contract HHSN268201800002I). Core
support including phenotype harmonization, data management, sample- identity QC, and
general program coordination were provided by the TOPMed Data Coordinating Center
(R01HL- 120393; U01HL- 120393; contract HHSN268201800001I). The Framingham Heart
Study (FHS) acknowledges the support of contracts NO1- HC- 25195, HHSN268201500001I
and 75N92019D00031 from the National Heart, Lung and Blood Institute and grant
supplement R01 HL092577- 06S1 for this research. Dr. Vasan is supported in part by the Evans
Medical Foundation and the Jay and Louis Coffman Endowment from the Department of
Medicine, Boston University School of Medicine. The WHI program is funded by the National
Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, U.S. Department of Health and
Human Services through contracts 75N92021D00001, 75N92021D00002,
75N92021D00003, 75N92021D00004, 75N92021D00005. The COPDGene study
(NCT00608764) is supported by grants from the NHLBI (U01HL089897 to National Jewish
Health and U01HL089856 to Brigham and Women’s Hospital), by NIH contract
75N92023D00011 to National Jewish Health, and by the COPD Foundation through
contributions made to an Industry Advisory Committee that has included AstraZeneca, Bayer
Pharmaceuticals, Boehringer- Ingelheim, Genentech, GlaxoSmithKline, Novartis, Pfizer and
Sunovion. This study utilized biological specimens and data provided by the Lung Tissue
Research Consortium (LTRC) supported by the National Heart, Lung, and Blood Institute
(NHLBI). The LTRC TOPMed project was also supported by P01 HL114501 and R01 HL133135.
Whole- genome sequencing (WGS) for the Trans- Omics in Precision Medicine (TOPMed)
program was supported by the National Heart, Lung and Blood Institute (NHLBI). WGS for
“NHLBI TOPMed: Multi- Ethnic Study of Atherosclerosis (MESA)” (phs001416.v3.p1) was
performed at the Broad Institute of MIT and Harvard (3U54HG003067- 13S1). Centralized read
mapping and genotype calling, along with variant quality metrics and filtering were provided
by the TOPMed Informatics Research Center (3R01HL- 117626- 02S1). Phenotype
harmonization, data management, sample- identity QC, and general study coordination, were
provided by the TOPMed Data Coordinating Center (3R01HL- 120393- 02S1), and TOPMed
MESA Multi- Omics (HHSN2682015000031/HSN26800004). The MESA projects are
conducted and supported by the National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) in
collaboration with MESA investigators. Support for the Multi- Ethnic Study of Atherosclerosis
(MESA) projects are conducted and supported by the National Heart, Lung, and Blood
Institute (NHLBI) in collaboration with MESA investigators. Support for MESA is provided by
contracts 75N92020D00001, HHSN268201500003I, N01- HC- 95159, 75N92020D00005,
N01- HC- 95160, 75N92020D00002, N01- HC- 95161, 75N92020D00003, N01- HC- 95162,
75N92020D00006, N01- HC- 95163, 75N92020D00004, N01- HC- 95164, 75N92020D00007,
N01- HC- 95165, N01- HC- 95166, N01- HC- 95167, N01- HC- 95168, N01- HC- 95169, UL1-
TR- 000040, UL1- TR- 001079, UL1- TR- 001420, UL1TR001881, DK063491, HL148610, and
R01HL105756. The Genes- environments and Admixture in Latino Asthmatics (GALA II) Study
was supported by the National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institute of
Health (NIH) grants R01HL117004 and X01HL134589; study enrollment supported by the
Sandler Family Foundation, the American Asthma Foundation, the RWJF Amos Medical Faculty
Development Program, Harry Wm. and Diana V. Hind Distinguished Professor in
Pharmaceutical Sciences II and the National Institute of Environmental Health Sciences grant
R01ES015794. The Study of African Americans, Asthma, Genes and Environments (SAGE) was
supported by the National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institute of Health
(NIH) grants R01HL117004 and X01HL134589; study enrollment supported by the Sandler
Family Foundation, the American Asthma Foundation, the RWJF Amos Medical Faculty
Development Program, Harry Wm. and Diana V. Hind Distinguished Professor in
Pharmaceutical Sciences II. The authors would like to acknowledge the University of North
Carolina at Chapel Hill BioSpecimen Processing Facility (https://bsp.web.unc.edu/) and
Alexis Lab (https://www.med.unc.edu/cemalb/alexislab/) for SPIROMICS sample processing,
storage, and sample disbursements. The University of North Carolina BioSpecimen
Processing Facility (RRID: SCR_021290 ; https://bsp.web.unc.edu) was supported in part by
NCI Cancer Center Support Grant 5P30CA016086- 46 and the NIEHS UNC Center for
Environmental Health and Susceptibility Center grant 5P30ES010126. SPIROMICS was
supported by contracts from the NIH/NHLBI (HHSN268200900013C,
HHSN268200900014C, HHSN268200900015C, HHSN268200900016C,
HHSN268200900017C, HHSN268200900018C, HHSN268200900019C,
HHSN268200900020C), grants from the NIH/NHLBI (U01 HL137880, U24 HL141762, R01
HL182622, and R01 HL144718), and supplemented by contributions made through the
Foundation for the NIH and the COPD Foundation from Amgen; AstraZeneca/MedImmune;
Bayer; Bellerophon Therapeutics; Boehringer- Ingelheim PharmaceuticalsChiesi Farmaceutici
S.p.A.; Forest Research Institute; Genentech; GlaxoSmithKline; Grifols Therapeutics; Ikaria;
MGC Diagnostics; Novartis Pharmaceuticals Corporation; Nycomed GmbH; Polarean;
ProterixBio; Regeneron Pharmaceuticals; Sanofi; Sunovion; Takeda Pharmaceutical Company;
and Theravance Biopharma and Mylan/Viatris. L.K. was supported by funding from National
Cancer Institute (R00CA246076). L.M.R. is funded by R01AG075884. H.T., A.R., C.K., and
S.Hw. were supported by grant R01HL142017. Author contributions: Conceptualization: P.O.,
T.W.B., L.K., P.J.C., M.H.C., S.Hw., H.T., A.V.S., F.A., L.S., L.M.R., S.C.J.P.; Data curation: P.O.,
T.W.B., P.D., S.Ga., S.Hu., S.Hw., R.J., M.J., X.L., A.C.Y.M., D.T.P., J.D.S., M.W., J.We., Y.Z., V.E.O.,
W.C.J., N.H., F.A.; Formal analysis: P.O., J.Wa., J.S.W.; Funding acquisition: S.A.C., S.Ga., C.P.H.,
Y.L., K.D.T., S.Z., V.E.O., W.G., G.A., D.A.N., N.G., K.A., P.G.W., R.P.B., D.A.M., A.R., C.K., E.Z., R.S.V.,
M.G.L., L.C., E.K.S., S.S.R., N.H., H.T., J.I.R., A.V.S., D.L., F.A., L.S., L.M.R., S.C.J.P.; Investigation:
P.O., P.D., S.Ga., X.L., J.D.S., J.We.; Project administration: T.W.B., P.J.C., M.H.C., S.A.C., S.Ga.,
C.P.H., H.L., C.L., Y.L., A.W.M., A.S., K.D.T., R.P.T., S.Z., J.C.W., L.M., S. Gr., M.R.G.T., V.E.O., G.A.,
D.A.N., N.G., K.A., P.G.W., R.P.B., D.A.M., A.R., C.K., E.Z., R.S.V., M.G.L., L.C., E.K.S., S.S.R., N.H.,
H.T., J.I.R., A.V.S., D.L., F.A., L.S., L.M.R., S.C.J.P.; Resources: P.D., S.Ga., H.L., C.L., R.P.T., R.P.B.;
Supervision: T.W.B., P.J.C., M.H.C., S.A.C., S.Ga., C.P.H., Y.L., A.W.M., A.S., K.D.T., R.P.T., S.Z.,
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E.Z., R.S.V., M.G.L., L.C., E.K.S., S.S.R., N.H., H.T., J.I.R., A.V.S., D.L., F.A., L.S., L.M.R., S.C.J.P.;
Visualization: P.O.; Writing – Original draft: P.O., T.W.B., J.S.W., A.V.S., F.A., L.S., L.M.R., S.C.J.P.;
Writing – Review & editing: P.O., T.W.B., L.K., X.L., A.W.M., H.E.W., M.R.G.T., A.V.S., D.L., F.A., L.S.,
L.M.R., S.C.J.P. Competing interests: P.J.C. has received grant support from Bayer and
consultant fees from Verona pharmaceuticals. M.H.C. has received grant support from Bayer.
E.K.S. has received institutional grant support from Bayer and Northpond Laboratories. C.P.H.
reports grant support from Boehringer- Ingelheim, Novartis, Bayer and Vertex. J.C.W. is
co- founder of Greenstone Biosciences. V.E.O. previously served on independent data and
monitoring committees (IDMC) for Regeneron and Sanofi, and receives compensation from
the American Medical Association for his role as associate editor for JAMA. F.A. is an employee
of Predicta Biosciences and is an inventor on a patent application related to TensorQTL filed
by the Broad Institute. L.M.R. is a consultant for the TOPMed Administrative Coordinating
Center (through Westat). S.C.J.P. is supported by Pfizer and consulted for Novo Nordisk.
G.R.A. is an employee of Regeneron Pharmaceuticals and owns stock and stock options for
Regeneron Pharmaceuticals. Data, code, and materials availability: Cis- and trans- e/sQTL
summary statistics and fine- mapping results are available in the TOPMed Genomic Summary
Results repository (dbGaP phs001974). Credible set summaries are additionally available on
Zenodo (88). Individual level data are available through the database of Genotypes and
Phenotypes (dbGaP) at accession nos. phs000974 (FHS), phs000920 (GALAII), phs000921
(SAGE), phs001927 (SPIROMICS), phs001237 (WHI), phs000951 (COPDGene), phs001416
(MESA), and phs001662 (LTRC). The TOPMed RNA- seq processing pipeline is available at
https://github.com/broadinstitute/gtex- pipeline/blob/master/TOPMed_RNAseq_pipeline.
md and on Zenodo (89). Source code for analyses and figures is available at https://github.
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NhlBi tOPMeD cONsORtiUM
Namiko Abe44, Laura Almasy45, Seth Ament46, Pramod Anugu47, Paul Auer48, Dimitrios Avramopoulos49,
Adithya Balasubramanian50, R. Graham Barr51, Lucas Barwick52, Terri Beaty49, Diane Becker49,
Lewis Becker49, Amber Beitelshees46, Takis Benos53, Marcos Bezerra54, Joshua Bis55, Jennifer Brody55,
Ulrich Broeckel48, Jai Broome55, Karen Bunting44, Erin Buth55, Vincent Carey56, Cara Carty57,
Richard Casaburi58, Mark Chaffin59, Christy Chang46, Yi- Cheng Chang60, Sameer Chavan61,
Bo- Juen Chen44, Wei- Min Chen62, Seung Hoan Choi59, Lee- Ming Chuang60, Ren- Hua Chung63,
Matthew Conomos55, Elaine Cornell64, Carolyn Crandall58, James Crapo65, Jeffrey Curtis66,
Coleen Damcott46, Sean David67, Lisa de las Fuentes68, Paul de Vries69, Ranjan Deka70, Dawn DeMeo56,
Scott Devine46, Huyen Dinh50, Harsha Doddapaneni50, Qing Duan71, Ravi Duggirala72, Charles Eaton73,
Lynette Ekunwe47, Adel El Boueiz74, Leslie Emery55, Charles Farber62, Jesse Farek50, Nora Franceschini71,
Chris Frazar55, Mao Fu46, Stephanie M. Fullerton55, Lucinda Fulton68, Shanshan Gao61, Yan Gao47,
Margery Gass75, Heather Geiger44, Auyon Ghosh56, Chris Gignoux76, David Glahn77, Stephanie Gogarten55,
Da- Wei Gong46, Harald Goring78, Daniel Grine61, C. Charles Gu68, Yue Guan46, Michael Hall47, Yi Han50,
Daniel Harris79, Ben Heavner55, David Herrington80, Brian Hobbs56, Elliott Hong46, Karin Hoth81,
Chao (Agnes) Hsiung63, Jianhong Hu50, Yi- Jen Hung82, Haley Huston83, Chii Min Hwu84, Rebecca Jackson85,
Deepti Jain55, Jill Johnsen55, Rich Johnston86, Kimberly Jones49, Michael Kessler46, Alyna Khan55,
Ziad Khan50, Wonji Kim74, John Kimoff87, Greg Kinney88, Holly Kramer89, Christoph Lange90, Ethan Lange61,
Cathy Laurie55, Cecelia Laurie55, Meryl LeBoff56, Sandra Lee50, Wen- Jane Lee84, David Levine55,
Joshua Lewis46, Yun Li71, Xihong Lin90, Simin Liu73, Yu Liu76, Barry Make49, Alisa Manning59,74,91, JoAnn Manson56,
Lisa Martin92, Melissa Marton44, Susan Mathai61, Susanne May55, Patrick McArdle46, Merry- Lynn McDonald93,
Sean McFarland74, Daniel McGoldrick55, Caitlin McHugh55, Hao Mei47, James Meigs91, Vipin Menon50,
Nancy Min47, Matt Moll56, Zeineen Momin50, May Montasser94, Josyf C. Mychaleckyj62, Rakhi Naik49,
Take Naseri95, Pradeep Natarajan59, Sarah C. Nelson55, Bonnie Neltner61, Caitlin Nessner50,
Osuji Nkechinyere50, Jeff O’Connell46, Tim O’Connor46, Heather Ochs- Balcom96, Geoffrey Okwuonu50,
James Pankow97, Cora Parker98, Gina Peloso99, Juan Manuel Peralta72, Marco Perez76, James Perry46,
Ulrike Peters75, Lawrence S. Phillips86, Toni Pollin46, Julia Powers Becker61, Meher Preethi Boorgula61,
Bruce Psaty55, Dandi Qiao56, Nicholas Rafaels61, Mahitha Rajendran50, Laura Rasmussen- Torvik100,
Aakrosh Ratan62, Robert Reed46, Elizabeth Regan65, Muagututi‘a Sefuiva Reupena101, Rebecca Robillard102,
Carolina Roselli59, Ingo Ruczinski49, Alexi Runnels44, Pamela Russell61, Kathleen Ryan46, Ester Cerdeira Sabino103,
Shabnam Salimi46, Sejal Salvi50, Steven Salzberg49, Kevin Sandow104, Jireh Santibanez50, Karen Schwander68,
Frank Sciurba53, Frédéric Sériès105, Amol Shetty46, Aniket Shetty61, Brian Silver106, Robert Skomro107,
Tanja Smith44, Sylvia Smoller108, Beverly Snively80, Adrienne M. Stilp55, Garrett Storm88, Elizabeth Streeten46,
Jessica Lasky Su56, Yun Ju Sung68, Jody Sylvia56, Adam Szpiro55, Margaret Taub49, Simeon Taylor46,
Timothy A. Thornton55, Machiko Threlkeld55, Lesley Tinker76, David Tirschwell55, Hemant Tiwari93,
Catherine Tong55, Michael Tsai97, Dhananjay Vaidya49, Tarik Walker61, Robert Wallace81, Avram Walts61,
Fei Fei Wang55, Heming Wang56, Karol Watson58, Jennifer Watt50, Lu- Chen Weng91, Jennifer Wessel109,
Kayleen Williams55, Carla Wilson56, James Wilson110, Lara Winterkorn44, Quenna Wong55,
Baojun Wu111, Huichun Xu46, Lisa Yanek49, Ivana Yang61, Seyedeh Maryam Zekavat59, Snow Xueyan Zhao65,
Wei Zhao66, Xiaofeng Zhu112
44New York Genome Center, New York, NY, USA. 45Children’s Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, USA. 46University of Maryland, Baltimore, MD, USA. 47University of Mississippi, Jackson, MS, USA. 48Medical College of Wisconsin, Milwaukee, WI, USA. 49Johns Hopkins University, Baltimore, MD, USA. 50Baylor College of Medicine Human Genome Sequencing Center, Houston, TX, USA. 51Columbia University, New York, NY, USA. 52The Emmes Corporation, Rockville, MD, USA. 53University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA, USA. 54Fundação de Hematologia e Hemoterapia de Pernambuco - Hemope, Recife, Brazil. 55University of Washington, Seattle, WA, USA. 56Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA, USA. 57Washington State University, Pullman, WA, USA. 58University of California, Los Angeles, Los Angeles, CA, USA. 59Broad Institute, Cambridge, MA, USA. 60National Taiwan University, Taipei, Taiwan (Province of China). 61University of Colorado at Denver, Denver, CO, USA. 62University of Virginia, Charlottesville, VA, USA. 63National Health Research Institute Taiwan, Miaoli County, Taiwan (Province of China). 64University of Vermont, Burlington, VT, USA. 65National Jewish Health, Denver, CO, USA. 66University of Michigan, Ann Arbor, MI, USA. 67University of Chicago, Chicago, IL, USA. 68Washington University in St. Louis, St. Louis, MO, USA. 69University of Texas Health at Houston, Houston, TX, USA. 70University of Cincinnati, Cincinnati, OH, USA. 71University of North Carolina, Chapel Hill, NC, USA. 72University of Texas Rio Grande Valley School of Medicine, Edinburg, TX, USA. 73Brown University, Providence, RI, USA. 74Harvard University, Cambridge, MA, USA. 75Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA, USA. 76Stanford University, Stanford, CA, USA. 77Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA, USA. 78University of Texas Rio
Grande Valley School of Medicine, San Antonio, TX, USA. 79University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, USA. 80Wake Forest Baptist Health, Winston- Salem, NC, USA. 81University of Iowa, Iowa City, IA, USA. 82Tri- Service General Hospital National Defense Medical Center, Taiwan (Province of China). 83Blood Works Northwest, Seattle, WA, USA. 84Taichung Veterans General Hospital Taiwan, Taichung City, Taiwan (Province of China). 85Ohio State University Medical Center, Columbus, OH, USA. 86Emory University, Atlanta, GA, USA. 87McGill University, Montréal, Canada. 88University of Colorado at Denver, Aurora, CO, USA. 89Loyola University, Maywood, IL, USA. 90Harvard School of Public Health, Boston, MA, USA. 91Massachusetts General Hospital, Boston, MA, USA. 92George Washington University, Washington, DC, USA. 93University of Alabama, Birmingham, AL, USA. 94National Heart, Lung, and Blood Institute, Bethesda, MD, USA. 95Ministry of Health, Government of Samoa, Apia, Samoa. 96University at Buffalo, Buffalo, NY, USA. 97University of Minnesota, Minneapolis, MN, USA. 98RTI International, Research Triangle Park, NC, USA. 99Boston University, Boston, MA, USA. 100Northwestern University, Chicago, IL, USA. 101Lutia I Puava Ae Mapu I Fagalele, Apia, Samoa. 102University of Ottawa, Ottawa, Canada. 103Universidade de Sao Paulo, Sao Paulo, Brazil. 104Lundquist Institute, Torrance, CA, USA. 105Université Laval, Quebec City, Canada. 106UMass Memorial Medical Center, Worcester, MA, USA. 107University of Saskatchewan, Saskatoon, Canada. 108Albert Einstein College of Medicine, New York, NY, USA. 109Indiana University, Indianapolis, IN, USA. 110Beth Israel Deaconess Medical Center, Cambridge, MA, USA. 111Henry Ford Health System, Detroit, MI, USA. 112Case Western Reserve University, Cleveland, OH, USA.
sUPPleMeNtaRY MateRials
science.org/doi/10.1126/science.adx2989
Supplementary Text; Figs. S1 to S76; Tables S1 to S19; References (90–113);
MDAR Reproducibility Checklist
10.1126/science.adx2989
Submitted 14 March 2025; accepted 5 May 2026
A transcriptional biosensor reveals mechanisms
of α- ketoglutarate signaling to chromatin
Alex C. Sternisha†, Haocheng Li†, et al.
INTRODUCTION: The metabolite α- ketoglutarate (αKG) is a substrate for dioxygenase enzymes that demethylate histones and DNA in the nucleus, influencing gene expression, cell fate, and tumor suppres- sion. Despite the importance of nuclear αKG for chromatin- modifying enzyme function, mechanisms that govern this metabolite pool remain poorly defined. Revealing these mechanisms is vital for understanding how appropriate chromatin structure and gene expression patterns are maintained under homeostatic conditions and dysregulated in disease.
RATIONALE: Deciphering how nuclear αKG abundance is regulated in human cells has been challenging for several reasons. First, methods developed to study compartmentalized metabolism in mitochondria, lysosomes, and other organelles are not readily transferrable to nuclei. Second, intracellular αKG is regulated by a complex network of more than 100 enzymes and transporters that act directly on this metabolite. To address these challenges, we sought to create a biosensor capable of detecting changes in nuclear αKG and use it to identify the molecular processes that govern this metabolite pool.
RESULTS: We engineered the transcriptional “αKG- ON biosensor system” by leveraging NtcA, an αKG- responsive cyanobacterial transcription factor. Chimeric NtcA proteins were expressed together with a fluorescent reporter gene driven by a synthetic promoter featuring NtcA binding sites derived from cyanobacterial genomes. Together, these elements enabled fluorescence- based monitoring of the nuclear αKG pool in living human cells. We used the αKG- ON biosensor system in a forward genetic screen to identify genes that play dominant roles in controlling αKG abundance in nuclei. This approach uncovered an interorganelle pathway that mediates the transfer of αKG from mitochondria to nuclei. Within this pathway, mitochondrial glutamic-pyruvic transaminase 2 (GPT2) synthesizes αKG that is preferentially exported to the cytosol through the SLC25A11 transporter, a component of the malate- aspartate shuttle. Once in the cytosol, αKG may enter the nucleus or undergo catabolism to glutamate by the branched- chain amino acid transaminase 1 (BCAT1). Our findings align with prior research showing that BCAT1 competes with chromatin demethylating enzymes for access to nucleocyto- solic αKG and reveal sequential activities of GPT2 and SLC25A11 as key suppliers of this metabolite pool.
Disrupting this interorganelle pathway of αKG metabolism caused chromatin hypermethylation in cultured cells in vitro and in tissues in vivo. A mouse model of GPT2 deficiency, an inborn error of metabolism caused by inactivating mutations in GPT2, displayed increases in methylation of both DNA and histones in brain tissue coupled with profound dysregulation of neurodevelopmental gene expression programs. Administering an esterified form of αKG to Gpt2- null mice restored chromatin methylation patterns, normal- ized gene expression, and improved mouse fitness, establishing a
Mechanisms governing αKG- dependent chromatin demethylation. Dioxygenases
that demethylate DNA and histones require αKG. The αKG- ON biosensor system
enables monitoring of the nuclear αKG pool that sustains activity of these enzymes.
The mitochondrial GPT2 transaminase and SLC25A11 transporter act together
to supply αKG to the nucleocytosolic compartment. In GPT2 deficiency, this
pathway is impaired, causing chromatin hypermethylation and dysregulation of
neurodevelopmental genes. GFP, green fluorescent protein; TET, ten- eleven
translocation methylcytosine dioxygenases; KDM, histone lysine demethylase.
[Figure by Melissa Logies]
causal link between nuclear αKG depletion and the molecular pathogenesis of GPT2 deficiency.
CONCLUSION: This study provides a tool for monitoring αKG abundance in the nuclei of human cells and defines a pathway for mitochondrion- to- nucleus transfer of αKG that sustains epigenomic regulation. These findings underscore compartmentalized metabo- lism as a critical determinant of epigenetic state and reveal nuclear αKG depletion as a driver of neurodevelopmental defects in GPT2 deficiency. Moreover, our work suggests that αKG supplementation represents a potential strategy to counteract pathogenic mecha- nisms in patients with this disorder.
Corresponding authors: Eric M. Morrow (eric_morrow@ brown. edu); Samuel K. McBrayer (samuel. mcbrayer@ utsouthwestern. edu) †These authors contributed equally to this work. Cite this article as A. C. Sternisha, Science 393, eadx8675 (2026). DOI: 10.1126/ science.adx8675
Full article and list of author affiliations: https://doi.org/10.1126/ science.adx8675
A transcriptional biosensor reveals mechanisms of α- ketoglutarate signaling to chromatin
Alex C. Sternisha1,2†, Haocheng Li1†, Kumar Gajendra3,4, Yi Xiao1,
Xin Zhao1,5,6,7, Jeffrey I. Traylor1,8, Lei Guo9, Ji Hyung Jun1,
Morgan Fleishman3,4, Tracey Shipman1, Vinesh T. Puliyappadamba1,
Pranita Kaphle1, Qing Ouyang3,4, Michael Schmidt3,4,
Diana D. Shi1,10,11,12, Milan R. Savani1,2, Alexander C.- Y. Tsai10,12,
Joyce H. Lee12, Ruth Gordillo13, Javier Garcia- Bermudez1,7,14,
Yoon Jung Kim1,14, Shih- Chia Tso15, Chad A. Brautigam15,16,
Lauren G. Zacharias1, Thomas P. Mathews1, Lin Xu7,9,
John G. Doench17, Vidyasagar Koduri18, Kalil G. Abdullah19,20,
Michalis Agathocleous1,7,14, Laura A. Banaszynski1,5,6,7,
Ralph J. DeBerardinis1,7,14,21,22, Eric M. Morrow3,4,
Samuel K. McBrayer1,7,14,23
The metabolite α- ketoglutarate (αKG) is required for chromatin
demethylation, but mechanisms that control αKG abundance in
the nucleus are poorly defined. We designed a biosensor to
monitor this metabolite pool in human cells using an αKG-
responsive cyanobacterial transcription factor, NtcA, and used
it to identify genes that regulate αKG in the nucleus. We defined
an interorganelle pathway in which sequential mitochondrial
activities of glutamic-pyruvic transaminase 2 (GPT2) and
the SlC25A11 transporter supply nuclear αKG. In a mouse
model of GPT2 deficiency, an inborn error of metabolism,
Gpt2 loss caused histone hypermethylation in the brain and
dysregulated neurodevelopmental genes. Restoring αKG
counteracted these changes and promoted mouse fitness.
Our work provides a tool to directly monitor nuclear αKG
and reveals nuclear αKG depletion as a key pathogenic
mechanism underlying GPT2 deficiency.
Metabolites serve as substrates for enzymes that chemically modify DNA and histones (1, 2). Metabolites such as acetyl–coenzyme A (acetyl- CoA) and oxidized nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) regu- late chromatin acetylation, whereas S- adenosylmethionine (SAM) and α- ketoglutarate (αKG) regulate methylation (3, 4). αKG plays a key role in cell fate control and tumor suppression because dysregulation of αKG availability alters cell- state transitions (5–9). Recurrent, cancer- associated mutations in metabolic enzymes produce oncometabolites that directly interfere with αKG signaling to chromatin and prime cells for malignant transformation (10–18). Despite this important regulatory role for the nuclear αKG pool, we have limited insights into the molecu- lar mechanisms that control it. This is due to a paucity of experimental
1Children’s Medical Center Research Institute, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, USA. 2Medical Scientist Training Program, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, USA. 3Department of Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Brown University, Providence, RI, USA. 4Center for Translational Neuroscience, Carney Institute for Brain Science and Warren Alpert Medical School, Brown University, Providence, RI, USA. 5Cecil H. and Ida Green Center for Reproductive Biology Sciences, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, USA. 6Department of Obstetrics and Gynecology, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, USA. 7Harold C. Simmons Comprehensive Cancer Center, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, USA. 8Department of Neurological Surgery, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, USA. 9Quantitative Biomedical Research Center, Department of Health Science & Biostatistics, Peter O’Donnell Jr. School of Public Health, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, USA. 10Department of Radiation Oncology, Mass General Brigham, Harvard Medical School, Boston, MA, USA. 11Krantz Family Center for Cancer Research, Massachusetts General Hospital, Boston, MA, USA. 12Department of Medical Oncology, Dana- Farber Cancer Institute, Harvard Medical School, Boston, MA, USA. 13Touchstone Diabetes Center, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, USA. 14Department of Pediatrics, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, USA. 15Department of Biophysics, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, USA. 16Department of Microbiology, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, USA. 17Broad Institute of Harvard and Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA. 18Division of Hematology, Brigham and Women’s Hospital and Harvard Medical School, Boston, MA, USA. 19Department of Neurosurgery, University of Pittsburgh School of Medicine, Pittsburgh, PA, USA. 20Hillman Comprehensive Cancer Center, University of Pittsburgh Medical Center, Pittsburgh, PA, USA. 21Howard Hughes Medical Institute, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, USA. 22The Eugene McDermott Center for Human Growth and Development, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, USA. 23Peter O’Donnell Jr. Brain Institute, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, USA. *Corresponding author. Email: eric_morrow@ brown. edu (E.M.M.); samuel. mcbrayer@ utsouthwestern. edu (S.K.M.) †These authors contributed equally to this work.
We pursued a synthetic biology approach to monitor the nuclear αKG pool in living human cells, motivated by an αKG- sensing mecha- nism in cyanobacteria. Cyanobacteria assimilate nitrogen by scaveng- ing ammonium and using it to synthesize glutamine and glutamate from αKG (19). Under nitrogen starvation, αKG accumulates and is sensed by the transcription factor NtcA (20). αKG binding increases the affinity of NtcA for DNA (21), enabling activation of genes involved in the response to nitrogen deprivation (22). We hypothesized that a chimeric NtcA transcription factor could be adapted to drive expres- sion of a synthetic reporter gene that serves as a proxy for nuclear αKG pool size in human cells. This would allow for unbiased, forward genetic approaches to identify genes that regulate cellular αKG metabolism and play dominant roles in controlling abundance of this metabolite in the nucleus.
Designing and optimizing the αKG- ON biosensor system to monitor nuclear αKG To address the paucity of tools to measure nuclear αKG in human cells, we sought to adapt a cyanobacterial, αKG- regulated transcription fac- tor, NtcA (23), to drive expression of a reporter gene in a nuclear αKG–dependent manner. This biosensor (hereafter, the αKG- ON bio- sensor system) included a chimeric NtcA transcription factor and a promoter- reporter gene DNA element that can be transactivated by NtcA (Fig. 1A). We posited that fusing NtcA to a nuclear localization signal (NLS) and transactivation domain would allow us to direct NtcA chimeras to the nucleus and drive transcription in human cells. Furthermore, engineering a synthetic promoter with NtcA binding sites (hereafter, the αKG response element, or αKG- RE) and placing it upstream of a green fluorescent protein (GFP) reporter gene would allow us to monitor changes in nuclear αKG. This design schema is based on biochemical (21) and structural (20, 24, 25) studies establish- ing that αKG binding to NtcA homodimers triggers transcription factor binding to successive DNA major grooves (Fig. 1B). We generated puri- fied, recombinant NtcA that specifically bound αKG with a dissociation constant (Kd) of 2.0 mM (fig. S1, A and B), which is in line with whole- cell αKG levels in human cells (26).
We first screened components of the αKG- ON biosensor system in human embryonic kidney (HEK) 293 cells (Fig. 1C and fig. S1C). To create αKG- RE promoters, we derived NtcA binding sites from the promoters of glutamine synthetase–encoding glnA or glnN genes in Synechocystis sp. PCC 6803 or Pseudanabaena sp. PCC 6903 genomes (22, 27, 28) (fig. S1, D and E). We incorporated binding sites either individually or in five- repeat tiles upstream of a minimal cytomegalo- virus (CMV) promoter. To assess outputs of the system, we treated cells with or without cell- permeable dimethyl- αKG (dm- αKG), measured GFP expression with flow cytometry, and monitored the percentage of cells that shifted into a GFPhigh population within each αKG- RE–expressing stable line. Several combinations of NtcA chimeras and αKG- RE pro- moters displayed basal GFP reporter transactivation (presumably prompted by endogenous nuclear αKG) that was enhanced by dm- αKG
C
E
D
NtcA
NtcA
αKG-ON biosensor system
αKG-RE
αKG-RE
αKG-RE
NtcA NtcA
NtcA NtcA
NLS
NLS
NLS
NLS
VP64
VP64
VP64
VP64
glnA, PCC 6803 glnN, PCC 6803 NtcA DNA
site
binding sites
glnN, PCC 6903
Native sequence
Native spacers and sequence
TRE spacers and sequence Minimal CMV promoter
dm-αKG:
dm-αKG
GFP
GFP
GFP reporter
NtcA chimeras
EV
EV
GFP expression
(% of cells)
EV
Fig. 1. Development and optimization of the αKG- ON biosensor system to monitor the nuclear αKG
pool. (A) Schema of αKG- ON biosensor system transcriptional activity in the presence and absence of αKG.
αKG- RE, αKG response element; NLS, nuclear localization signal; VP64, transcriptional activator Herpes
Simplex Viral Protein 64; GFP, green fluorescent protein. (B) Cryo–electron microscopy structure of NtcA
homodimer bound to DNA and αKG. Resolution was not sufficient to resolve αKG within this complex. Data are
derived from Protein Data Bank accession 8H40 (24). (C) Pairwise combinatorial screen of αKG- ON biosensor
system architectures in HEK293 cells. HEK293 lines stably expressing αKG- RE elements were transiently
transfected with NtcA chimeras or an empty vector (EV; negative control). αKG- ON biosensor system
activation (GFP expression) was quantified by means of flow cytometry in cells treated with 1 mM dimethyl-
αKG (dm- αKG) or dimethyl sulfoxide (DMSO) for 48 hours before analysis. GFP expression (percent of cells)
was determined by means of a gating strategy using EV- transfected, DMSO- treated cells as a baseline.
(D) Immunoblot of the VP64- NtcA- 2xNLSSV40 chimera in nuclear (N; lamin B1 marker) and cytosolic
[C; glyceraldehyde- 3- phosphate dehydrogenase (GAPDH) marker] fractions prepared from HEK293 cells
engineered to express the NtcA chimera or EV. (E) Flow cytometry quantification of αKG- ON biosensor
system activation (GFP expression) in αKG- RE–expressing HEK293 cells transduced with the VP64- NtcA-
2xNLSSV40 chimera or EV and treated with DMSO or the indicated doses of dm- αKG for 48 hours. Data are
means ± SEM. *P < 0.05 [ordinary one- way analysis of variance (ANOVA)].
NtcA homodimer
lamin B1
GAPDH
*
chimera
supplementation. Notably, dm- αKG did not induce GFP in empty vector– expressing cells without NtcA chimeras. The αKG- RE promoter con- taining tiled NtcA binding sites from the PCC 6903 glnN promoter with tetracycline response element (TRE)–derived spacers was selected for further study.
We sought to optimize αKG- ON biosensor system performance by improving functionality of the NtcA chimeric transcription factor. Cell fractionation experiments showed that NtcA chimeras were not exclu- sively nuclear and that some chimera expression constructs produced truncated protein products (fig. S1F). In silico analyses identified cryp- tic nuclear export sequences in the VP64 peptide (fig. S1G). Eliminating VP16 monomer peptides that comprise VP64 enhanced nuclear local- ization but reduced biosensor output (fig. S1, H and I). Testing other mammalian transactivation domains (29–32) revealed that the Zta
VP64 NtcA NLS
VP64 NtcA NLS
VP64 NtcA NLS
VP64 NtcA NLS
VP64 NtcA NLS
VP64 NtcA NLS
GFP expression (% of cells)
0 10 20
DNA Binding Domain (DBD)
αKG Effector
Binding Domain (EBD)
VP64 NtcA NLS NLS
The αKG- ON biosensor system responds
to compartment- specific changes in
αKG abundance
To assess specificity of the αKG- ON biosensor sys-
tem, we produced a gradient of intracellular αKG
levels in HEK293 cells by reducing glutamine (a
source of αKG) or by supplementing dm- αKG (fig.
S3A). We also created mutants of the VP64- NtcA-
2xNLSSV40 chimera that lack αKG (R90E, in which
arginine at position 90 is replaced with glutamate)
or DNA (ΔDBD) binding functions and expressed
them or an empty vector in HEK293 cells. Only the
wild- type (WT) NtcA chimera evoked a gradient of
GFP expression that correlated with intracellular
αKG (Fig. 2, A to H). Supplementing dm- αKG fully
rescued decreased biosensor output caused by glu-
tamine deprivation, indicating that this effect was
αKG- dependent (Fig. 2I and fig. S4, A and B). WT
and R90E NtcA chimeras (20, 33) were used in tan-
dem going forward and are hereafter referred to as
“functional” and “inactive” versions of the αKG- ON
biosensor system, respectively. We examined the
effect of cell- cycle phase on biosensor output het-
erogeneity and observed increased GFP expression
in both the functional and inactive arms during
G2/M phases, potentially because of increased re-
porter gene copy number (fig. S3, B and C). Bio-
sensor output was not affected by supplementation
with (R)- 2- hydroxyglutarate- Bis(trifluoromethyl)
benzidine [(R)- 2HG- TFMB], a cell- permeable ester
of the oncometabolite (R)- 2HG (fig. S4, C to E)
(34), or dimethyl succinate, a cell- permeable ester
of the oncometabolite succinate (fig. S4, F to H).
Expressing an IDH1- R132H cDNA led to (R)- 2HG up- regulation (which
was blocked by the mutant IDH1/IDH2 inhibitor vorasidenib) and
histone hypermethylation (fig. S4, I and J). IDH1- mutant cells displayed
a modest increase in αKG- ON biosensor system output (fig. S4K), but
this effect was (R)- 2HG–independent because it was not altered by vora-
sidenib. Given the structural similarity between (R)- 2HG, succinate,
and αKG, our findings indicate that biosensor output is uncoupled
from processes of oncometabolite- driven chromatin hypermethylation.
Thus, the αKG- ON biosensor system was specifically regulated by in-
tracellular αKG levels and required both the αKG and DNA binding
activities of the NtcA transcription factor.
C N C N
80 DMSO 0.3 mM 1 mM 3 mM
αKG exchange across the inner mitochondrial membrane is con- trolled by dedicated transport mechanisms, partitioning mitochon- drial αKG metabolism from that in other organelles. By contrast, the
transactivation domain enhanced nuclear localiza- tion and eliminated truncated protein products (fig. S1J). We removed unnecessary methionine residues to prevent alternative translation prod- ucts and replaced the c- myc–derived NLS with two SV40 large T- antigen–derived NLSs, which im- proved nuclear localization (fig. S1K). VP64- NtcA- 2xNLSSV40 displayed increased nuclear localization and αKG- RE promoter activation relative to other chimeras (Fig. 1, D and E, and fig. S1L). Further- more, VP64- NtcA- 2xNLSSV40 exhibited enhanced or equivalent transcriptional activity compared with that of Zta- NtcA- NLSc- myc when expressed under promoters of varying strength (fig. S2, A to R). Thus, we selected the EF1α promoter–driven VP64- NtcA- 2xNLSSV40 chimera (or mutants thereof) for further studies.
0.5
0.5
B D
EV
C
NtcAWT Chimera
I
1.0
0.0
0.0
Counts
Counts
Counts
Counts
102 103 104 0
102 103 104 GFP
102 103 104 GFP
102 103 104 GFP
GFP
G F H
NtcAR90E Chimera
NtcA∆DBD Chimera
EV NtcAWT Chimera NtcAR90E Chimera NtcA∆DBD Chimera
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
GFP MFI
GFP MFI
GFP MFI
GFP MFI
GFP MFI
Gln: dm-αKG:
-
-
Functional
** *
Gln (mM): dm-αKG (mM):
αKG (relative
to sgControl)
sgControl
sgControl
sgBCAT2 sgBCAT1
sgBCAT2 sgBCAT1
O N
FLAG
BCAT1-FLAG
BCAT2-FLAG
MTS-BCAT1-FLAG
+
+
- + +
- +
- +
+
- +
Fig. 2. The αKG- ON biosensor system responds to metabolic and genetic perturbations of the nuclear αKG pool. (A to D) Representative histograms and (E to H) quantification of GFP expression in αKG- RE–expressing HEK293 cells with EV or one of three VP64- NtcA- 2xNLSSV40 chimeras: WT NtcA, NtcAR90E mutant, or DNA binding domain (DBD)–deleted NtcA mutant. Cells were cultured under the indicated concentrations of glutamine and/or dm- αKG for 72 hours. In (E) to (H), data are normalized to 2 mM Gln condition. P < 0.001 (ordinary one- way ANOVA). (I) GFP expression normalized to 2 mM Gln condition in HEK293 cells with functional (NtcAWT) or inactive (NtcAR90E) versions of the αKG- ON biosensor system and cultured with indicated concentrations of Gln and/or dm- αKG for 72 hours. *P < 0.01 (unpaired t test). (J) Schema of branched chain amino acid (BCAA) metabolism by BCAT1 and BCAT2 transaminases. BCKA, branched chain α- ketoacid. (K) Relative αKG levels in whole- cell extracts by means of liquid chromatography–mass spectrometry (LC- MS) from HEK293 cells with BCAT1 or BCAT2 deletion. P < 0.01 (unpaired t test). (L) Relative nuclear αKG levels (normalized to sgControl line) in cells from (K) with the functional αKG- ON biosensor system. P < 0.01 (unpaired t test). (M) Quantification of GFP expression (normalized to sgControl+EV lines) in HEK293 cells with a functional or inactive version of the αKG- ON biosensor system. Cells expressed Cas9 and a control or a BCAT1 sgRNA, as well as an sgRNA- resistant BCAT1 cDNA or EV. (N) Immunofluores- cence microscopy of HEK293 cells expressing FLAG- tagged BCAT1WT enzyme, BCAT2WT enzyme, or a BCAT1 mutant enzyme with an N- terminal mitochondrial targeting sequence (MTS) peptide. Merge shows overlay of all signals. Scale bar, 10 μm. (O) Relative nuclear αKG levels [GFP median fluorescence intensity (MFI) normalized to EV line] in cells expressing the functional αKG- ON biosensor system and engineered as in (N) or expressing an EV. *P < 0.05, P < 0.01 (unpaired t tests). In (E) to (I), (K) to (M), and (O), data are means ± SEM.
sgControl: sgBCAT1:
EV: BCAT1 cDNA:
Mito- Tracker DAPI Merge
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
EV BCAT1-FLAG
BCAT2-FLAG MTS-BCAT1-FLAG
nuclear and cytosolic αKG pools are thought to equilibrate owing to the flow of metabolites and other small molecules through nuclear pores (35, 36). Consistent with this idea, increased ac tivity of the cytosolic branched chain amino acid transaminase 1 (BCAT1), but not mitochondrial BCAT2, has been shown to cause DNA hypermethylation in leukemia cells (Fig. 2J) (37). This interaction was attributed to BCAT1 dependent depletion of nucleocytosolic αKG, which is a substrate for ten eleven translocation (TET) methylcytosine dioxygenases. We exploited this difference between BCAT paralogs to assess the ability of the αKG ON biosensor system to monitor compartmentalized αKG metabolism. Deletion of BCAT2 caused a larger increase in whole cell αKG levels relative to deletion of BCAT1 (Fig. 2K and fig. S5A). Conversely, BCAT1, but not BCAT2, deletion el evated nuclear αKG levels, as indicated by functional biosensor output (Fig. 2L). This effect of BCAT1 deletion was rescued by expression of a single guide RNA (sgRNA)–insensitive BCAT1 cDNA (Fig. 2M and fig. S5, B and C). Moreover, BCAT1 deletion did not affect output of the inactive αKG ON biosensor system. BCAT1 and BCAT2 paralogs have distinct properties beyond subcellular localization. We next engineered cells to express FLAG tagged WT BCAT1, WT BCAT2, or a BCAT1 mutant har boring an N terminal mitochondrial targeting sequence (MTS) (fig. S5D). We confirmed that WT BCAT1 localized to the nu cleocytosolic compartment, whereas WT BCAT2 and MTS BCAT1 enzymes were mitochondrial (Fig. 2N). Overexpression of WT BCAT1 reduced nuclear αKG levels, whereas WT BCAT2 and MTS BCAT1 did not (Fig. 2O). Thus, the αKG ON biosensor system senses compartment specific changes in αKG abundance caused by genetic manipulation of metabolic enzyme function.
A forward genetic approach identified genes that regulate the nuclear αKG pool We next devised an unbiased forward genetic screen to determine the key molecular regulators of the nuclear αKG pool (Fig. 3A). We used U251 differentiated glioblastoma cells because of their excellent performance in genetic screens (38, 39). We engi neered U251 cells with a highly active αKG RE promoter (tiled NtcA binding sites from the Synechocystis sp. PCC 6803 glnA promoter with native spacer sequences) (Fig. 1C) and WT or R90E NtcA chimeras. We then introduced Cas9 and a custom “αKG Regulators” CRISPR deletion sgRNA library targeting 127 genes encoding proteins that directly synthesize, catabo lize, or transport αKG (data S1). Cells that displayed GFP ex pression in the top and bottom 10 percentiles of each arm were then isolated by means of fluorescence activated cell sorting (FACS) and processed for sgRNA quantification. We identified sgRNAs that altered biosensor output in an αKG dependent manner by surveying patterns of sgRNA enrichment or depletion selectively observed in functional biosensor expressing cells.
This screen produced four gene level “hits” (data S2). Dele tion of BCAT1 and DLD increased nuclear αKG levels, whereas deletion of GPT2 and SLC25A11 depleted this metabolite pool (Fig. 3B). Notably, sgRNAs that targeted these four genes were preferentially enriched or depleted in cells expressing the func tional versus inactive version of the biosensor (Fig. 3C, fig. S7A, and data S2). Our findings implicate two mitochondrial pro teins, the alanine transaminase GPT2 and the malate/αKG antiporter SLC25A11, as key suppliers of αKG in the nucleus. Conversely, the mitochondrial dihydrolipoamide dehydroge nase DLD and the nucleocytosolic BCAA transaminase BCAT1 represented suppressors of nuclear αKG. Observing BCAT1 as a top hit suggested that the screen was successful, given pre vious work (37) and our earlier data linking BCAT1 with nega tive regulation of the nuclear αKG pool (Fig. 2, L and M). We
C
Functional Inactive
Functional
Inactive
Functional
Functional Inactive
VP64 NtcA NLS NLS +
GFP
GFP
GFP
GFP
αKG-RE
αKG-RE
‘αKG Regulators’ CRISPR KO Library
B
VP64 NtcAR90E NLS NLS +
KO depletes
nuclear αKG
nuclear αKG
-log10FDR
1.0
1.0
SLC25A11
-10 -5 0 5 10 -6 -3 0 3 6 0
0.5
0.5
log2FC
log2FC
E F G
Functional Inactive Functional Inactive
Functional Inactive Functional Inactive
sgBCAT1 #1
BCAT1
sgBCAT1 #1
sgBCAT1 #1
sgBCAT1 #3
sgBCAT1 #3
sgBCAT1 #3
sgControl
sgControl
sgControl
sgControl
sgControl
sgControl
sgControl
sgControl
sgControl
sgControl
GFP MFI
GFP MFI
GFP MFI
GFP MFI
vinculin
vinculin
vinculin
I J K
sgSLC25A11 #1
sgSLC25A11 #2
sgSLC25A11 #2
sgSLC25A11 #2
0.0
0.0
sgControl sgSLC25A11 #1
sgControl sgSLC25A11 #1
DLD
** **
Fig. 3. A forward genetic screen reveals molecular regulators of the nuclear αKG pool. (A) Schema of a FACS- based CRISPR- Cas9 deletion screen to identify genes that control nuclear αKG. (B) Volcano plot of gene- level statistics from the CRISPR- Cas9 screen in U251 cells engineered with the functional αKG- ON biosensor system shown in (A). FC, fold change; FDR, false discovery rate. Gene- level scores were derived from the ratio of sgRNA read counts in the top 10% versus bottom 10% of GFP- expressing cells. (C) Enrichment or depletion of individual sgRNAs targeting BCAT1, DLD, SLC25A11, or GPT2 from CRISPR- Cas9 screens in U251 cells engineered with functional or inactive versions of the αKG- ON biosensor system. (D to K) Validation of nuclear αKG pool regulation by sgRNAs targeting BCAT1, DLD, SLC25A11, or GPT2. [(D), (F), (H), and (J)] Immunoblots of BCAT1, DLD, SLC25A11, or GPT2 expression in U251 cells engineered to express Cas9 and control or indicated sgRNAs. [(E), (G), (I), and (K)] Quantification of GFP expression (GFP MFI normalized to sgControl lines) in cells from (D), (F), (H), and (J) engineered with functional or inactive versions of the αKG- ON biosensor system. P < 0.05, P < 0.01, **P < 0.001 (unpaired t tests). In (C), (E), (G), (I), and (K), data are means ± SEM.
top10%
[sgRNA ]
[sgRNA ]
* **
validated two sgRNAs targeting each of these genes, demonstrating effective depletion of protein products and preferential regulation of functional αKG- ON biosensor system output (Fig. 3, D to K). We also rescued nuclear αKG depletion caused by GPT2 or SLC25A11 deletion by expressing sgRNA- insensitive cDNAs for each target (fig. S6, A to D),
top10% bot10%
bot10%
sg5 sg4 sg3 sg2 sg1 sg5 sg4 sg3 sg2 sg1 sg5 sg4 sg3 sg2 sg1 sg5 sg4 sg3 sg2 sg1
BCAT1 DLD SLC25A11 GPT2
KO increases
sgDLD #2
sgDLD #2
sgDLD #2
sgDLD #3
sgDLD #3
sgDLD #3
sgGPT2 #2
sgGPT2 #2
sgGPT2 #2
sgGPT2 #3
sgGPT2 #3
sgGPT2 #3
vinculin GPT2
We compared nuclear and absolute, whole- cell αKG levels in stable lines with deletion of the aforementioned genes (fig. S8A). Whereas dele- tion of GPT2, SLC25A11, OGDH, and BCAT1 pro- duced congruent effects on whole- cell and nuclear αKG pools, deletion of DLD, GLUD1, BCAT2, and IDH3A did not. For example, DLD loss increased nuclear αKG but had minimal effect on whole- cell αKG (fig. S8B). These data further highlight abil- ity of the αKG- ON biosensor system to detect compartment- specific changes in αKG abundance that may not be accurately inferred from changes in whole- cell αKG content. We also surveyed how deletion of these genes affected cell proliferation. In general, we observed modest or negligible re- ductions in cell fitness relative to control sgRNA- expressing cells (fig. S8, C to J). However, one sgRNA targeting OGDH [a common essential gene (40)] nearly abolished proliferation (fig. S8K), an effect that correlated with potent OGDH protein deple- tion (fig. S7I). To ask how sgRNAs targeting es- sential genes affect biosensor output, we deleted the ribonucleoprotein gene SNRPG (small nuclear ribonucleoprotein polypeptide G). SNRPG- deficient lines failed to grow and displayed in- creased GFP levels in both functional and inactive biosensor- expressing cells (fig. S8, L to N). This effect was partly attributable to autofluorescence of dying cells because SNRPG- deficient cells lack- ing the GFP reporter construct also displayed higher signal in the GFP channel (fig. S8O). These results helped explain enrichment of toxic OGDH sgRNAs in the GFPhigh population of inactive biosensor- expressing cells (fig. S7B) and validated our use of the inactive biosensor to deprioritize sgRNAs that cause αKG- independent changes in GFP signal (Fig. 3A). Notably, sgRNAs targeting the top “hits” in our screen (BCAT1, DLD, GPT2, and SLC25A11) did not cause gross defects in cell fitness or mitochondrial function (fig. S8, D to G and P), nor did they pervasively increase output of the inactive biosensor (Fig. 3C).
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
validating on- target effects of sgRNAs. Genes that did not score as “hits” in our screen included those encoding the BCAA transaminase BCAT2, glu- tamate dehydrogenase 1 (GLUD1), the IDH3A subunit of the isocitrate dehydrogenase 3 (IDH3) complex, and the OGDH component of the oxo- glutarate dehydrogenase complex (OGDC) (fig. S7B). These enzymes are mitochondrial, suggest- ing that metabolic reactions in this organelle make variable contributions to the nuclear αKG pool. We validated the inability of BCAT2 to reg- ulate nuclear αKG (fig. S7, C and D), corroborat- ing our previous experiments (Fig. 2L). GLUD1 has a very minor role in controlling nuclear αKG in this model system (fig. S7, E and F). We did observe moderate negative and positive regulation of nuclear αKG upon acute IDH3A and OGDH deletion, respectively (fig. S7, G to J). It may be possible to capture moderate effects such as these in future screens by reducing the stringency of fluorescence intensity thresholds used for cell sorting. Reducing the gating strin- gency from top and bottom 10 to 30% for IDH3A sgRNAs decreased relative variance between replicates (fig. S7, K and L).
An interorganelle pathway controls αKG- dependent chromatin demethylation We hypothesized that the proteins nominated by our screen form a molecular network that dictates the flow of αKG from mitochondria to nuclei (Fig. 4A). We propose that GPT2 contributes a major fraction
Control
B
D
-
-
-
-
-
-
E F
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
DNA Methylation C
**
*
**
1.15
1.5
5mC : C Ratio
(Normalized)
1.10
1.0
1.05
0.5
1.00
0.0
0.95
sgGPT2 #2
sgGPT2 #2
sgGPT2 #2
sgGPT2 #2
sgGPT2 #3
sgGPT2 #3
sgGPT2 #3
sgGPT2 #3
sgSLC25A11 #1
sgSLC25A11 #1
sgSLC25A11 #1
sgSLC25A11 #1
sgControl
sgControl
sgControl
sgControl
sgSLC25A11 #2
sgSLC25A11 #2
sgSLC25A11 #2
sgSLC25A11 #2
Ascorbate
Control Ascorbate
Functional Inactive
Functional Inactive
**
2.0 **
0.15
0.05
0.00
GFP MFI
GFP MFI
sgControl: sgGPT2 #3:
+
+
+
+
+
+ +
+
+
+
+ +
+
+
+ +
+
+
+
+
+ +
+
- +
- +
- +
+ +
+
+
- +
- +
- +
+
- +
- +
- + +
- +
- +
- + +
- +
+
+
- +
- +
+
- +
- +
- +
- +
- +
+
- +
+
- +
+
- +
+ +
+
- +
sgDLD #2: sgDLD #3:
sgDLD #2: sgDLD #3:
p=0.23
Fig. 4. A mitochondrion- to- nucleus pathway of αKG metabolism controls chromatin methylation. (A) Schema of localization patterns and functions of proteins that regulate nuclear αKG. OGDC, oxoglutarate dehydrogenase complex; Pyr, pyruvate; TETs, ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenases; KDMs, Jumonji C domain- containing histone lysine demethylases. (B) Immunoblots of histone H3 total protein levels or trimethyllysine posttranslational modifications in U251 cells engineered to express Cas9 and control, GPT2, or SLC25A11 sgRNA. Cells were treated with or without 200 μM ascorbate- 2- phosphate. (C) Ratios of 5- methyldeoxycytidine (5mC) to deoxycytidine (C) in hydrolyzed genomic DNA isolated from cells in (B). Ratios are normalized to ascorbate- treated sgControl line. n = 4 biological replicates per condition. P < 0.01 (unpaired t test), P = 0.23 (ordinary one- way ANOVA). (D) Quantification of GFP expression (GFP MFI normalized to sgControl+EV lines) in U251 cells engineered to express Cas9 and control or SLC25A11 sgRNA, as well as GPT2 cDNA or EV. Cells were also engineered with functional or inactive versions of the αKG- ON biosensor system. P < 0.01, P < 0.001 (unpaired t tests). (E) Quantification of GFP expression (GFP MFI normalized to sgControl lines) in U251 cells engineered to express Cas9 and control, GPT2, or DLD sgRNA. Cells were also engineered with functional or inactive versions of the αKG- ON biosensor system. *P < 0.01, P < 0.001 (unpaired t tests). (F) α- 15N- Glutamine stable isotope tracing for 2 hours in U251 cells engineered to express Cas9 and control, GPT2, or DLD sgRNA. Fractional enrichment of the Ala (M+1) isotopologue relative to fractional enrichment of the Glu (M+1) isotopologue is shown for each line. P < 0.05, **P < 0.01 (unpaired t tests). In (C) to (F), data are means ± SEM.
sgControl: sgSLC25A11 #1: sgSLC25A11 #2:
EV: GPT2 cDNA:
0.20
AlaM+1/GluM+1
0.10
sgControl: sgGPT2 #2: sgGPT2 #3:
of the αKG pool that is exported from mitochondria in cells that dis- play robust GPT2- dependent alanine synthesis. Another fraction is controlled by IDH3 and OGDC activities in the tricarboxylic acid (TCA) cycle, as reflected by changes in biosensor output caused by acute IDH3A, OGDH, and DLD deletion (Fig. 3, F and G, and fig. S7, G to J). Although OGDH sgRNAs did not score in the screen (likely owing to
H3K4me3
Total H3
Total H3
Total H3
H3K9me3
H3K27me3
α-15N-Gln tracing
chronic toxicity), OGDH deletion did increase nuclear αKG in short- term experiments con- ducted before OGDH depletion caused loss of fitness (fig. S7, I and J). DLD is the E3 subunit required for generating lipoamide to support catalytic cycles of three mitochondrial enzyme complexes: OGDC, pyruvate dehydrogenase (PDH), and branched chain α- ketoacid dehydro- genase (BCKDH). BCKDH and PDH activities are unlikely to account for DLD- dependent con- trol of the nuclear αKG pool because neither BCAT2 (the upstream regulator of BCKDH) nor PDHA1 (the E1 subunit of PDH) deletion altered functional αKG- ON biosensor system output (figs. S7, C and D, and S9, A and B). DLD likely regulates nuclear αKG through OGDC. DLD loss (Fig. 3, F and G) phenocopies nuclear αKG ac- cumulation caused by acute OGDH deletion (fig. S7, I and J). Considering that both DLD and OGDH are required for OGDC activity, it is not clear why DLD sgRNAs preserved cell viability, whereas OGDH sgRNAs did not (fig. S8, E and K). To complete this interorganelle molecular net- work, our data suggest that mitochondrial αKG produced by GPT2 or through TCA cycle activity is exported by the SLC25A11 transporter. In the nucleocytosolic compartment, αKG is predomi- nantly catabolized to glutamate by BCAT1 or used as a substrate by Jumonji C domain–containing histone lysine demethylase (KDM) or TET αKG- dependent dioxygenases to promote histone and DNA demethylation, respectively.
To test this model, we first asked whether nu- clear αKG depletion caused by GPT2 or SLC25A11 deletion led to impaired histone or DNA de- methylation. GPT2 or SLC25A11 deletion caused histone 3 lysine 4 (H3K4) and H3K9 hyper- methylation in the presence, but not absence, of ascorbate (Fig. 4B and fig. S9, C to E). A similar trend was observed for H3K27 trimethylation (H3K27me3). In U251 cells, H3K4me3 was most responsive to changes in nuclear αKG, so we preferentially monitored this mark in subse- quent in vitro studies. Methylation of deoxycyti- dine nucleosides in genomic DNA also increased upon GPT2 or SLC25A11 deletion (Fig. 4C), al- though this effect did not reach statistical sig- nificance in genome- wide assays. Supplementing GPT2- null cells with dm- αKG rescued nuclear αKG and H3K4, H3K9, and H3K27 hypermeth- ylation (fig. S9, F to J). Treating GPT2- WT cells with dm- αKG did not cause histone demethyl- ation, suggesting that nuclear αKG is not limiting for activity of KDM enzymes un der nutrient- replete conditions. Control of nuclear αKG by GPT2 and SLC25A11 is generalizable because depletion of either protein reduced nu clear αKG in two other neural cell lines: immortalized normal human astrocytes (NHA) astrocytes and
TS516 patient- derived glioma stem- like cells (fig. S10, A to D). GPT2 deletion in TS516 cells also led to nuclear αKG depletion when these cells were cultured with physiological concentrations of alanine and glutamine and subjected to variations in glucose, pyruvate, and oxygen (fig. S10E). Therefore, GPT2 supplies αKG to the nucleus across meta- bolic stress conditions that are relevant in vivo.
Mitochondrial GPT2 and SLC25A11 activities supply the nuclear αKG pool The functions of GPT2 and SLC25A11 implied that they act in a linear pathway to produce and export αKG, respectively, from mitochondria. GPT2 overexpression increased αKG levels in the nucleus in an SLC25A11- dependent manner (Fig. 4D and fig. S12A). Additionally, GPT2 up- regulation did not rescue histone hypermethylation caused by SLC25A11 deletion (fig. S12, B to E). To assess subcellular distribution of GPT2 activity, we first quantified GPT2 splice isoforms endogenously ex- pressed by U251 and NHA cells (fig. S11, A and B). In both cell types, the predominant transcript expressed, ENST00000340124.9, encodes full- length GPT2 protein with a predicted N- terminal MTS (fig. S11, C and D). However, the second most abundant transcript expressed in both cell lines, ENST00000440783.2, features a distinct 5′ exon structure and encodes a GPT2 protein isoform that lacks an MTS. Over expression of the two dominant GPT2 transcripts in U251 cells revealed the pro- tein product of ENST00000440783.2 clearly localized to the nu cleocyto- solic compartment, in contrast to the full- length ENST00000340124.9 (fig. S11, E and F). Overexpression of the truncated GPT2 enzyme had a negligible effect on nuclear αKG (fig. S11G). Thus, αKG produced in mitochondria by GPT2 is exported by SLC25A11 to supply the pool of αKG in nuclei.
We next sought to investigate the interaction between GPT2 and DLD. Both GPT2- WT and GPT2- null cells displayed increased nuclear αKG upon DLD deletion (Fig. 4E and fig. S12, F and G), and DLD dele- tion rescued histone hypermethylation caused by GPT2 loss (fig. S12, H to K). Thus, DLD- dependent regulation of αKG signaling to chro- matin does not require GPT2. Deletion of OGDH also increased output of the functional αKG- ON biosensor system independent of GPT2 (fig. S12, L and M), albeit with confounding effects on inactive biosensor output due to loss of cell fitness. We next performed stable isotope trac- ing with α- 15N- glutamine in control cells or those lacking GPT2, DLD, or both enzymes to determine the effect of DLD loss on GPT2 flux, using the ratio of alanine labeling to glutamate labeling as a marker of GPT2 activity (Fig. 4F and fig. S12N). DLD deletion reduced GPT2 flux in the direction of pyruvate catabolism, and GPT2 deletion abol- ished alanine labeling by α- 15N- glutamine. Thus, GPT2 and DLD occupy critical but distinct, nonoverlapping nodes within the nuclear αKG regulatory network.
A mouse model of GPT2 deficiency displays chromatin hypermethylation in the brain We evaluated a mouse model of GPT2 deficiency to determine the epigenetic regulatory role of GPT2 in vivo. GPT2 deficiency is a rela- tively recently described inborn error of metabolism caused by auto- somal recessive inheritance of loss- of- function mutations in the GPT2 gene (41–44). These mutations cause neurological and intellectual impairment. In mice, whole- body Gpt2 deletion leads to death 17 to 30 days after birth (45). This phenotype is fully recapitulated by neuron- specific deletion of Gpt2, underscoring a critical function for this en- zyme in supporting neuronal development and homeostasis (46). We surveyed global histone methylation profiles of various tissues from whole- body Gpt2- deletion [Gpt2 KO (knockout)] and Gpt2 WT mice and observed pervasive H3K4, H3K9, and H3K27 hypermethylation in the brains of Gpt2 KO animals at postnatal day 19 (P19) (Fig. 5A and fig. S13, A and H to J). There was generally little effect of GPT2 loss on histone methylation in other organs, aside from hypermethyl- ated H3K9 in heart tissues and hypermethylated H3K9 and H3K27 in
spleen tissues (fig. S13, B to G). We also observed a trend toward global 5mC enrichment in genomic DNA extracts from Gpt2 KO versus Gpt2 WT mouse brain tissues (Fig. 5B). This trend was specific to brain because Gpt2 loss did not alter genomic 5mC levels in kidney tissues (Fig. 5C). Performing genome- wide analysis of 5mC with single- base resolution, we observed a significant increase in DNA methylation in Gpt2 KO versus Gpt2 WT brain tissues (Fig. 5D). Thus, Gpt2 loss causes chromatin hypermethylation in the brain.
Pyruvate is enriched in cerebrospinal fluid and dictates GPT2- dependent αKG synthesis We hypothesized that tissue- specific differences in the levels of GPT2 substrates, rather than differences in GPT2 expression, determine the directionality and magnitude of GPT2 flux. GPT2 is reversible and can also catabolize αKG and alanine, yielding pyruvate and glutamate. Alanine levels are reduced in brain tissues of Gpt2 KO mice (42), sug- gesting that net flux through GPT2 likely moves in the direction of αKG and alanine synthesis in brain tissue in vivo. Thus, we asked whether increased pyruvate availability may be a driver of GPT2- dependent αKG and alanine synthesis in the central nervous system (CNS). The pyru- vate content of cerebrospinal fluid (CSF) is nearly twofold greater than that of blood in both children and adults (fig. S13, K and L), suggesting that the local supply of pyruvate may be greater in the CNS than in peripheral organs. To determine whether pyruvate availability affects GPT2- dependent supply of the nuclear αKG pool, we evaluated α- 15N- glutamine stable isotope tracing and αKG- ON biosensor system output in control or GPT2 KO cells cultured in medium with or without py- ruvate. Pyruvate supplementation stimulated GPT2 flux in the direc- tion of alanine and αKG synthesis (fig. S13, M and N) and markedly elevated nuclear αKG (fig. S13O). GPT2 deletion abolished both effects. Pyruvate supplementation caused GPT2- dependent trends toward H3K4, H3K9, and H3K27 hypomethylation (fig. S13, P to S). Thus, the preferential epigenetic regulatory function of GPT2 in the CNS may be driven by high microenvironmental pyruvate concentrations.
Gpt2 loss dysregulates chromatin methylation and neurodevelopmental gene programs in an αKG- dependent manner Most research on the molecular pathogenesis of GPT2 deficiency has focused on defects in alanine biosynthesis, glutamine- dependent TCA cycle anaplerosis, and glutamatergic neurotransmission (42, 47). Our work suggests that depletion of nuclear αKG and chromatin hyper- methylation may contribute to disease phenotypes as well. To test the hypothesis that nuclear αKG depletion causes the chromatin changes seen in Gpt2 KO mouse brains, we administered dm- αKG to Gpt2 WT and Gpt2 KO mice. Treatment with dm- αKG rescued histone hyper- methylation caused by Gpt2 loss (Fig. 5, E to H) and preferentially affected gene expression in brain tissues of Gpt2 KO mice relative to that of Gpt2 WT controls (Fig. 5, I to K, and data S6). dm- αKG supple- mentation also rescued weight loss in Gpt2 KO mice that precedes their early postnatal lethality (Fig. 5L and fig. S13T) (45). Thus, defects in αKG signaling to chromatin appear to play a central, causal role in the molecular pathogenesis of GPT2 deficiency.
We also evaluated the epigenetic regulatory role of GPT2 in tumors. PIK3CA mutations increase GPT2 activity in cancer cells (48). Using PIK3CA- mutant HCT116 colorectal cancer cells, we generated isogenic GPT2 WT and GPT2 KO stable lines and implanted them subcutane- ously into immunodeficient mice. We treated mice with dm- αKG or vehicle and subsequently harvested tumors for histone methylation analysis. GPT2 loss caused H3K4, H3K9, and H3K27 hypermethylation, and these effects were rescued by means of dm- αKG treatment (fig. S14, A to D). Vehicle- treated GPT2 WT and GPT2 KO tumors grew at similar rates, indicating that histone hypermethylation is not caused by non- specific loss of cancer cell fitness in GPT2- deficient tumors (fig. S14E). These data indicate that GPT2- dependent control of chromatin meth- ylation occurs in diverse biological contexts.
Brain
Gpt2 WT Gpt2 KO
Gpt2 WT
Gpt2 WT
K
Gpt2 WT
Gpt2 KO
Gpt2 KO
Gpt2 WT
Gpt2 KO
Gpt2 WT
Gpt2 KO
Gpt2 KO
E
Vehicle dm-αKG
H
Vehicle dm-αKG
L
Vehicle
dm-αKG
I J
n=69 n=116
-log10(p value)
1.0
1.0
-log10(p value)
-6 -4 -2 0 2 4 6 0
2.0
2.0
log2FC: dm-αKG vs Vehicle
H3K4me3
H3K9me3
H3K27me3
Fig. 5. Gpt2 loss causes αKG- dependent epigenetic dysregulation and reduced fitness in mice. (A) Immunoblots from brain tissues of Gpt2 WT or Gpt2 KO mice.
(B and C) 5mC- to- deoxycytidine ratio in hydrolyzed genomic DNA isolated from (B) brain or (C) kidney tissues from Gpt2 WT or Gpt2 KO mice. n = 3 tissues per arm. P values
are from unpaired t tests. (D) Genome- wide, locus- specific analysis of 5mC levels in brain tissues from Gpt2 WT and Gpt2 KO mice. P value is from Wilcoxon signed rank test.
(E) Immunoblots from brain tissues of Gpt2 WT or Gpt2 KO mice treated with vehicle or 600 mg kg−1 dm- αKG. (F) H3K4me3, (G) H3K9me3, and (H) H3K27me3 quantification
from blots in (E). Normalized intensities were expressed relative to the mean of vehicle- treated Gpt2 WT samples. n = 5 brain tissues per arm. P < 0.05, P < 0.01,
P < 0.001 (unpaired t tests). (I and J) Volcano plots from RNA- seq analysis of brains from (I) Gpt2 WT mice and (J) Gpt2 KO mice treated with vehicle or 600 mg kg−1
dm- αKG. (K) Differentially expressed genes from (I) and (J). P values were calculated by means of χ2 test. (L) Weights of Gpt2 KO mice treated with vehicle (n = 10 mice) or
600 mg kg−1 dm- αKG (n = 9 mice), normalized to Gpt2 WT mice. *P < 0.001 (paired t test). In (B), (C), (F) to (H), and (L), data are means ± SEM.
Kidney
p<0.001
(Normalized)
(Normalized)
F G
H3K9me3
H3K27me3
** *
** **
H3K27me3 :
H3K4me3
H3K9me3 :
H3K4me3 :
H3K9me3
0.5
0.5
H3K27me3
0.0
0.0
n.s.
Weight
Weight
We next performed chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP- seq) for H3K4me3, H3K9me3, and H3K27me3 marks in chromatin from Gpt2 KO and Gpt2 WT mouse brains. In agreement with immunoblot analyses of global H3K4me3, H3K9me3, H3K27me3 (Fig. 5A), these marks were enriched at loci throughout the genome in brain tissues from Gpt2 KO mice (Fig. 6, A to C, and data S3 to S5). H3K27me3 marks are well established to suppress transcriptional out- put. To identify genes that display both H3K27 hypermethylation and decreased expression in the brains of Gpt2 KO mice, we integrated RNA- sequencing (RNA- seq) data from the brains of Gpt2 KO and WT mice (data S6) with H3K27me3 ChIP- seq data (Fig. 6D and data S5). More than 800 genes down- regulated in Gpt2 KO mouse brain tissues also displayed H3K27 hypermethylation, identifying a subset of tran- scriptional changes that are linked to nuclear αKG depletion.
Gene ontology (GO) analysis highlighted terms related to nervous system development, neurogenesis, and gliogenesis (Fig. 6E and data S7), suggesting that H3K27me3 hypermethylation affects gene programs related to postnatal nervous system development. In addition, genes related to intracellular calcium regulation, a key effector of neuronal electrochemical signaling, and locomotory behavior were substantially altered. Furthermore, the H3K27me3- associated high- CpG- density pro- moters (HCP) and cranial nerve development gene sets were decreased in Gpt2 KO mouse brains relative to Gpt2 WT and rescued with dm- αKG treatment (Fig. 6, F to I, and data S6). We surveyed three genes with key
1.5
1.5
p=0.23
1.03
5mC : C Ratio
5mC : C Ratio
1.02
1.02
1.01
1.01
1.00
1.00
Total H3
Total H3
Total H3
Total H3
Total H3
0.99
0.99
Gpt2 KO H3K4me3
Upregulated Downregulated
p<0.00001 69
p=0.97
0.98
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
KO dm-αKG: - + WT - +
KO dm-αKG: - + WT - +
KO dm-αKG: - + WT - +
roles in postnatal CNS development that are dysregulated by Gpt2 loss and rescued with dm- αKG treatment (Fig. 6, J to O). Hapln4 encodes an extracellular matrix protein that stabilizes synaptic perineuronal nets (49). Hapln4 down- regulation is associated with impaired inhibitory neurotransmission (50) and neurodegenerative processes in aging and stroke (51). Etv4 encodes a transcription factor (52, 53) required for development of motor and sensory neuron circuits (54, 55). Notch3 is expressed in cerebral vascular smooth muscle cells and neural progeni- tor cells and causes decreased blood flow and aberrant neuronal dif- ferentiation when inactivated (56–58).
The H3K4me3 mark is thought to play a stabilizing but not driving role in gene transactivation (59). More than 1200 genes were H3K4me3 hypermethylated and overexpressed in Gpt2 KO mouse brains (fig. S15A and data S3 and S6), including many related to amino acid and nutrient starvation, synaptic translation, cognition, and neuropeptide signaling (fig. S15B and data S8). We surveyed three of these genes, including Eif4ebp1, which is stimulated by the integrated stress response (60); Cux2, which encodes a transcription factor that controls neurogenesis and synaptogenesis (61, 62); and Nrg3, which encodes a neuregulin family member that regulates cortical interneuron migration (63). Aberrant up- regulation of each of these genes was suppressed with dm- αKG treatment (fig. S15, C to H). These data establish a key epigenetic regulatory function for GPT2 in vivo and reveal epigenetic dysfunction as a contributor to defective neurodevelopment in GPT2 deficiency.
Gpt2 KO vs Gpt2 WT
-log10(q value)
0 50 100 150 200 250
-1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5
Differential modification
(fraction of Gpt2 WT)
(fraction of Gpt2 WT)
16 17 18 19 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1
16 17 18 19 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1
Postnatal day
Postnatal day
B E
KO
KO
KO
WT - +
H3K4me3
-1
-1.5
1.5
1.5
1 0
kb from TSS
-3 0 3 kb from TSS
-3 0 3 kb from TSS
p<0.001
p<0.001
p<0.001
KO WT
KO WT
KO WT
-10.0
0.10 0.12 0.14 0.16 0.18
0.2 0.4 0.6 0.8
-0.6
-0.6
G
Enrichment score (ES)
Enrichment score (ES)
Enrichment score (ES)
Enrichment score (ES)
H3K27me3
H3K27me3
Meissner_Brain_ HCP_with_H3K27ME3
Meissner_Brain_ HCP_with_H3K27ME3
H3K27me3
H3K27me3
H3K27me3
0.0 -0.2 -0.4
0.0 -0.2 -0.4
0.0 -0.2 -0.4
0.0 -0.2 -0.4
I
Gpt2 WT Vehicle Gpt2 KO
Gpt2 WT Vehicle Gpt2 KO
Vehicle
Vehicle
Vehicle
Vehicle
K L M N O
1kb
1kb
WT1.5
WT 1
WT1.5
Hapln4
Hapln4
development
H3K9me3
Cranial_ Nerve_Development
Cranial_ Nerve_Development
** *
*
CPM
CPM
CPM
Fig. 6. αKG- dependent neurodevelopmental gene dysregulation occurs in Gpt2 KO mice. (A) H3K4me3, (B) H3K9me3, or (C) H3K27me3 ChIP- seq results from Gpt2 WT or Gpt2 KO mice brains. Tornado plots and quantification of aligned histone methylation densities. (D) Integrative analysis of H3K27me3 ChIP- seq and RNA- seq datasets from brain tissues of Gpt2 WT and Gpt2 KO mice. (E) Gene ontology analysis of genes derived from analysis in (D). (F to I) Enrichment plots for [(F) and (G)] genes with high- CpG- density promoters (HCP) bearing the H3K27me3 mark in brain and [(H) and (I)] cranial nerve development genes. NES, normalized enrichment score. (J, L, and N) Density tracks for H3K27me3 ChIP- seq for H3K27me3 hypermethylated and down- regulated neurodevelopmental genes in Gpt2 KO mouse brains. (K, M, and O) RNA- seq counts per million (CPM) expression plots are included for indicated genes from Gpt2 KO and Gpt2 WT mice treated with or without dm- αKG. n = 10 brain tissues for vehicle- treated Gpt2 WT and Gpt2 KO mice and n = 8 brain tissues for Gpt2 WT and Gpt2 KO mice treated with dm- αKG. P < 0.05, *P < 0.01 (unpaired t tests). In (K), (M), and (O), data are means ± SEM.
Discussion In this work, we introduced the αKG- ON biosensor system as a tool that enables robust, specific measurement of changes in nuclear αKG pool size. Our work expands on techniques available to measure αKG in live cells. Previous fluorescence resonance energy transfer (FRET)– based tools were largely used to monitor αKG in bacteria (33, 64–69). The αKG- ON biosensor system may be advantageous for monitoring αKG in human cells when compartmental specificity, high sensitivity, and enhanced stability of αKG sensing are desired. We determined the Kd of NtcA binding to αKG to be 2.0 mM and whole- cell αKG content of U251 cells to be 1.35 mM. Accordingly, the biosensor detected changes in nuclear αKG abundance when whole- cell αKG varied from ~0.5 to 6 mM. Michaelis constant (Km) values for αKG binding to TET and KDM enzymes are 5 to 60 μM (70), implying that nuclear αKG may not be limiting for their activities. However, these Km values were derived from studies of recombinant, purified enzymes in the absence of competing inhibitory molecules, such as succinate and fumarate (4). Our work establishes that nuclear αKG is not limiting for chromatin demethylation under basal conditions but becomes limiting when the enzymes and transporters that supply this metabo- lite pool are impaired.
kb from center
0.5 0.6 0.7 0.8
-3 0 3 kb from center
Gpt2 KO dm-αKG Gpt2 KO
Gpt2 KO dm-αKG Gpt2 KO
** p=0.07
KO dm-αKG: - + 0
1.5 10.0
(log2FC Gpt2 KO vs Gpt2 WT)
-10 -3 -2 -1 0 1 2 3 10
Expression (log2FC: Gpt2 KO vs Gpt2 WT)
0 2 4 6 8 10 **
Etv4
Etv4
KO dm-αKG: - + WT - +
KO dm-αKG: - + WT - +
Results from our biosensor- enabled forward genetic screen in- formed a conceptual model of nuclear αKG regulation. GPT2 and TCA cycle activities regulate αKG produced in mitochondria that is subse- quently exported to the cytosol through SLC25A11. αKG may then diffuse into nuclei through nuclear pores (35, 36). The nuclear αKG pool sustains dioxygenases involved in chromatin demethylation and is antagonized by BCAT1, which is in agreement with prior research (37). Supporting the physiological relevance of this model, GPT2 activ- ity is critical for establishing appropriate chromatin methylation pat- terns in the brain.
Our findings suggest that nuclear αKG in human cells is controlled differently than the nuclear pools of acetyl- CoA and SAM, which also serve as substrates for chromatin- modifying enzymes. Adenosine 5′- triphosphate (ATP)–citrate lyase (ACLY) (71, 72), acetyl- CoA synthe- tase 2 (ACSS2) (73–75), pyruvate dehydrogenase (PDH) (76, 77), and methionine adenosyltransferase (MAT) (78–80) have been shown to localize to the nucleus to facilitate chromatin modification. By con- trast, we found that nuclear αKG is principally derived from mitochon- drial metabolism. GPT2 has been reported to localize to the nucleus (81), but we observed that mitochondrial GPT2 activity supplies αKG to nuclei. We also showed that SLC25A11 is epistatic to GPT2 in an
Gpt2 KO: H3K27me3-enriched
and downregulated genes
Nervous system
Neurogenesis
Gliogenesis
Regulation of Ca2+
concentration
Locomotory behavior
log2(fold enrichment)
0.1 2.5 1.25 -log10(FDR)
NES = -2.15 FDR = 0.001 -0.6
5kb
Notch3
Notch3
0 25 50
interorganelle pathway that sustains the nuclear αKG pool. This find- ing aligns with a study of familial paraganglioma that demonstrated that SLC25A11 loss- of- function mutations phenocopy chromatin hy- permethylation caused by oncometabolite- producing SDH or FH muta- tions (82).
Our work provides insights into the pathogenesis of GPT2 defi- ciency. Symptoms of this disorder include global developmental delay, hypotonia, delays or failure to develop speech and walking, and epi- lepsy (41–44). Loss of GPT2- dependent alanine synthesis is implicated in these disease- related phenotypes because alanine supplementation improves the health of cultured neurons and mice lacking Gpt2 (45). Our findings revealed loss of GPT2- dependent αKG synthesis to be another contributor to neurological dysfunction in GPT2 deficiency. Genes related to neurogenesis and synaptogenesis were dysregulated in Gpt2 KO mice. αKG supplementation normalized these effects and prevented weight loss that precedes lethality in these animals. Our study establishes that nuclear αKG pool depletion and epigenetic reprogram- ming drive the pathology of GPT2 deficiency and that αKG supple- mentation may represent a promising strategy to treat this disorder.
Materials and methods Experimental model details Mice: All experiments involving live mice were carried out in accor- dance with the National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals under the protocols approved by the Brown University Institutional Animal Care and Use Committee (24- 09- 0009) and UT Southwestern Medical Center (2019- 102795) Institutional Ani- mal Care and Use Committee. Animal welfare assessments were carried out daily during treatment periods. All care and treatment of experimen- tal animals were carried out in strict accordance with Good Animal Practice as defined by the US Office of Laboratory Animal Welfare.
Gpt2 cryopreserved mutant embryos were established through re- sources at the Knockout Mouse Project at University of California, Davis (Project ID CSD24977). The background of the embryos is C57BL/6N, and these mice were fully backcrossed into a C57BL/6J line. The target- ing construct involved a gene trap (splice acceptor) and LacZ- Neo cas- sette (42). The mice under the C57BL/6J background were then fully backcrossed onto the CD- 1 line. Heterozygous males and heterozygous females were mated to produce offspring of both genders and all geno- types. Animals were genotyped by PCR with forward primer GPT2 neF (5′– TGATGGCACTCTGCACCTAC- 3′) and reverse primer GPT2 neR (5′– TCACTCTTGGCTCTGGACCT- 3′) for a WT band of 830 bp and a mutant band of 900 bp, as described previously (42). Mice were maintained on standard chow. Where indicated, mice were treated once daily with vehicle or 600 mg kg−1 dm- αKG (Sigma 349631) by in traperitoneal injec- tion starting on postnatal day 0 (P0). On postnatal day 19 (P19), tissues including brain, heart, liver, kidney, lungs, spleen, stomach, colon, and sciatic nerve were harvested. All tissues were immediately snap- frozen and subsequently stored in liquid nitrogen until further analysis.
NCR/NU mice (Taconic) were used for subcutaneous xenograft ex- periments. Tumor cells were injected into female mice at 6 weeks of age, and experimental groups were matched for age.
Cell lines: NHA cells (human astrocytes immortalized with HPV E6 and E7 and hTERT, sex unknown) were a kind gift of R. Pieper (UCSF) (83). HEK293 cells (female) were purchased from ATCC (CRL- 1573). HEK293T cells (female, transduced with SV40 T- antigen) were a kind gift of W. G. Kaelin Jr. (Dana- Farber). U251 cells (male) were purchased from Sigma (09063001- 1VL). HOG cells (human oligodendroglioma line from a male) were a gift of P. Paez (SUNY Univ. at Buffalo). Human TS516 glioblastoma stem- like cells (GSCs) (sex unknown) were obtained from I. Mellinghoff (MSKCC) and reported previously (84). HCT116 cells (male) were a kind gift of J. Garcia- Bermudez (UTSW).
NHA, and HCT116 cells were cultured in DMEM (Gibco 11995065) with 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin unless otherwise stated. HOG cells (human oligodendroglioma line from a male) were cultured in IMDM medium (Gibco 12440061) with 10% FBS and 1% penicillin/ streptomycin. TS516 cells were cultured in NeuroCult NS- A Basal Me- dium (Human) with Proliferation Supplement (StemCell Technologies 05750) supplemented with EGF (20 ng/ml), bFGF (10 ng/ml), Heparin (2 μg/ml), 1% penicillin/streptomycin, amphotericin B (250 ng/ml), and Plasmocin (2.5 μg/ml). Where indicated, HOG cells were treated with 250 nM vorasidenib (Wuxi Apptec) for 48 hours. Where indicated, TS516 cells were placed in a modular hypoxia incubator chamber (Baker Ruskinn InvivO2) that was flushed with 1% O2, 5% CO2, and 94% N2.
Methods NtcA binding site prediction: Previously defined gene- specific NtcA bind- ing sites were compared with the consensus NtcA binding site. The PRODORIC database of prokaryotic gene regulation was used to con- struct a position weight matrix defining the prevalence of nucleotides at each position within conserved NtcA binding sites derived from vari- ous cyanobacterial genomes. The PRODORIC database was accessed at https://www.prodoric.de.
Nuclear export signal prediction: The NetNES1.1 tool (85) was used to evaluate putative nuclear export signals (NES) throughout the pri- mary amino acid sequence of the VP64- NtcA- NLSc- myc NtcA chime- ra. The NetNES1.1 tool was accessed at https://services.healthtech. dtu.dk/services/NetNES- 1.1.
Mitochondrial targeting sequence prediction: Prediction of mitochon- drial targeting sequences in protein products of GPT2 splice isoforms was conducted using TargetP- 2.0. The TargetP- 2.0 tool was accessed at https://services.healthtech.dtu.dk/services/TargetP- 2.0.
NtcA structural analysis: Structural data describing the interaction be- tween NtcA and DNA were derived from a cryo- electron microscopy (cryo- EM) study of the cyanobacterial transcription activation com- plex involving NtcA and NtcB (Protein Data Bank accession 8H3V). The NtcA- DNA complex was isolated from the larger transcription activa- tion complex cryo- EM structure using Pymol software (Schrödinger).
Protein purification and microscale thermophoresis: NtcA was prepared by GenScript in Storage Buffer (100 mM HEPES, pH 7.4, 500 mM NaCl, 0.2 mM EDTA, 0.005% Nonidet P- 40, 10% Glycerol). MST Buffer was pre- pared similarly to Storage Buffer but containing only 320 mM NaCl and no Glycerol. NtcA was concentrated to 20 μM (measured by using extinc- tion coefficient 803,210 M−1cm−1 at 205 nm) and fluorescently labeled by mixing 200 μl of the 20 μM solution to 1 μl of diluted Cyanine- 5 NHS dye (a mixture of 1 μl of 40 mM dye in DMSO and 2 μl of MST Buffer). The labeling reaction was incubated at room temperature in the dark for 20 min and centrifuged in a microcentrifuge at maximum speed for 10 min at 4°C to remove insoluble material. Free dye was removed using a GE PD Miditrap G- 25 column equilibrated with 9 ml of MST Buffer. The eluted Cyanine- 5- labeled NtcA was centrifuged again for 10 min at maximum speed in a microcentrifuge to remove residual turbidity. Both αKG (Sigma- Aldrich K1128) and oxaloacetate (OAA) (Sigma- Aldrich O7753) were weighed (with precision to 0.1 mg) and dissolved in MST Buffer to prepare stock solutions of 100 mM. MST experiments on NtcA with titrating αKG were conducted in triplicate, and a single titration was performed with OAA. To set up an experi- ment, a 20 μl aliquot of 100 mM αKG or OAA in MST buffer was seri- ally diluted 1:1 into 14 additional tubes (i.e., 10 μl was taken from the first tube and mixed with the 10 μl MST Buffer in the second tube, and this process was repeated). The sixteenth tube contained only 10 μl of MST Buffer (no ligand). To each of these sixteen samples, 10 μl of 100 nM labeled NtcA in MST Buffer was added, yielding a final concentration
of 50 nM for NtcA, and a top concentration of αKG or OAA at 50 mM. The mixtures were incubated in the dark at room temperature for at least 30 min before the commencement of the thermophoretic experi- ment in the premium capillaries. Experiments were conducted at am- bient temperature (approximately 22°C) in a NanoTemper NT.115 BLUE/RED instrument using the red filter set, 7% LED power, and 80% MST power. The pre- IR fluorescence period was 5 s, followed by a 30 s IR- on phase, and 5 s of post- MST monitoring. All MST data were ana- lyzed in PALMIST (86), and figures were rendered in GUSSI (87).
Cloning: All synthetic DNA sequences, DNA plasmids, and CRISPR- Cas9 sgRNA sequences are listed in tables S2 to S6. In- Fusion cloning reac- tions were transformed into XL10- Gold Ultracompetent Cells (Agilent Technologies) following manufacturer’s protocol. Gateway cloning reactions were performed with BP Clonase II (Invitrogen) or LR Clonase II (Invitrogen) enzymes. Gateway cloning reactions were transformed into HB101 Competent Cells (Promega). Ligation reactions were trans- formed into XL10- Gold cells. PCR reactions were performed using KOD Xtreme Hot Start DNA Polymerase (EMD Millipore).
αKG- RE promoter/GFP reporter gene lentiviral vectors: First, sense and antisense ssDNAs comprising αKG- RE synthetic promoters were an- nealed to produce dsDNAs. In parallel, a blasticidinresistance- P2A- GFP cDNA flanked 5′ by a minimal CMV promoter was cloned into pEN_ TTmcs (Addgene 25755) via In- Fusion cloning (In- Fusion HD Cloning Kit, Takara 639650) to produce the vector pEN_TTmcs- PCMVmin- blastR- P2A- GFP. Next, In- Fusion cloning was used to insert αKG- RE sequences into pEN_TTmcs- PCMVmin- blastR- P2A- GFP while removing the Tetra- cycline Response Element (TRE) from this vector. The resulting plas- mids were referred to as pEN_TTmcs- [αKG- RE]- PCMVmin- blastR- P2A- GFP.
To accommodate αKG- RE promoter/GFP reporter gene expression in settings in which preservation of cellular blasticidin sensitivity was de- sired, the blastR- P2A cassette 5′ to the GFP cDNA was deleted by In- Fusion cloning, yielding pEN_TTmcs- [αKG- RE]- PCMVmin- GFP vectors. For experiments testing the impact of GFP turnover on the dynamic range of the αKG- ON biosensor system, an hPEST domain was appended 3′ to the GFP reporter, yielding pEN_TTmcs- [αKG- RE]- PCMVmin- blastR- P2A- GFP- hPEST vectors.
To create a promoterless Gateway lentiviral Destination vector, the PGK promoter was removed from pLenti PGK Neo DEST (w531- 1) (Addgene 19067) by In- Fusion cloning to produce the vector pLenti Neo DEST. Finally, Gateway LR cloning reactions (Invitrogen Gateway LR clonase, Fisher Scientific 11- 791- 100) were performed between αKG- RE/GFP reporter gene- containing pEN_TTmcs vectors and the pLenti Neo DEST vector to generate lentiviral vectors for human cell transduction.
Lentiviral vectors for cDNA expression: Gateway destination vectors used for expression of NtcA chimeras and other cDNAs include: pLenti- Ubc- HA- Gate- PGK- HYG (Addgene 107396), pLenti PGK Hygro DEST (w530- 1) (Addgene 19066), pLenti- EF1α- Gateway- PGK- Hygro (kind gift of W. G. Kaelin Jr.), and pLenti CMV Hygro DEST (w117- 1) (Addgene 17454).
CRISPR- Cas9 lentiviral vectors: Cloning of sgRNAs (listed in table S5) into vectors was performed using FastDigest BsmBI (Esp3I) (Thermo Sci- entific) to digest plasmids. Oligonucleotides were annealed and phos- phorylated using T4 PNK (NEB) in T4 Ligation Buffer (NEB). A ligation reaction with digested lentiGuide- puro (Addgene 52963), lentiCRISPR_v2 (Addgene 52961), lentiCRISPR_v2- blast (Addgene 83480), or lentiCRISPRv2- mCherry (Addgene 99154) plasmids and the phosphorylated oligonu- cleotides was performed using Quick Ligase (NEB).
Stable cell line generation: Lentivirus was made using TransIT- LT1 Trans- fection Reagent (Mirus Bio MIR 2304). HEK293T cells were transfected by mixing TransIT- LT1 Transfection Reagent with expression vectors
(listed in table S4) and packaging plasmids psPAX2 (Addgene 12260) and pMD2.G (Addgene 12259) in a ratio of 4:3:1. Virus- containing media were collected 48 and 72 hours after transfection and passed through a 0.45 μm filter to remove cell debris. Cells to be transduced were plated at a density of 150,000 to 300,000 cells per well in a 6- well plate. The next day, lentivirus was added with polybrene (MedChem Express HY- 112735) at a final concentration of 8 μg/ml. Cells were then incubated with lentivirus overnight before discarding lentivirus- containing medium and expanding the cells.
Antibiotic concentrations for selection of lentivirus- transduced cell cultures were as follows: puromycin (1 to 2 μg/ml), hygromycin (500 μg/ml), G418 (1 mg/ml), blasticidin (50 μg/ml), zeocin (50 μg/ml).
αKG- ON biosensor system expression: DNA plasmids used to express NtcA chimera and αKG- RE/GFP reporter components of the αKG- ON bio- sensor system in each figure panel are listed in table S6. Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (Invitrogen 11668027) was used for tran- sient transfection of NtcA chimeras. Stable cell lines were generated as described above.
CRISPR screening and analysis: U251 cells expressing the αKG- ON bio- sensor system were transduced with a Cas9 plasmid with a zeocin resistance marker. Lentivirus containing the custom “αKG Regulators” CRISPR- Cas9 library (data S1) was infected at a multiplicity of infection (MOI) of ~0.3. 3E6 cells were infected per arm of the screen, with cells plated at a density of 1.5E6 cells per well of a 6- well plate. After transduc- tion, cells were split into three replicates per arm and selected with pu- romycin. One week post- transduction, cells were plated at 250,000 cells per well (1.5E6 total per replicate per arm), and media was changed daily until day ten post- transduction, when cells were harvested for FACS. For each replicate of each arm, the top 10% highest GFP express- ing cells, as well as the bottom 10% of GFP expressing cells, were sorted into separate tubes.
Genomic DNA was extracted from cells using the Blood & Tissue DNeasy kit (Qiagen). sgRNA cassettes were amplified and appended to Illumina primers by PCR using KOD Xtreme Hot Start DNA Polymerase (EMD Millipore). Amplicons were purified using SPRI Right Side Size Se- lection using a 0.7× ratio. Library QC was performed using a TapeStation instrument (Agilent). Library DNA content was quantified using a Qubit fluorometer (Thermo Fisher Scientific) before library sequencing. The sequencing results were then analyzed by MAGeCK (88) and Apron (Genetic Perturbation Platform, Broad Institute of MIT and Harvard).
Immunoblotting: Cells were lysed with EBC lysis buffer with protease inhibitor added (Roche). Nuclear and cytoplasmic fractionation was per- formed using the NE- PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents (Thermo Scientific 78833). For histone Western blots, cells were lysed using 2x loading buffer. Lysate protein concentrations were measured using the Bio- Rad Protein Assay Dye Reagent (5000006). Extracted pro- teins were boiled at 100°C for 10 min, subjected to polyacrylamide gel electrophoresis using the Mini- PROTEAN system (Bio- Rad), and trans- ferred onto nitrocellulose membranes using the Mini Trans- Blot Cell (Bio- Rad). Primary antibodies (listed in table S1) were suspended in 5% BSA in TBST and secondary antibodies were diluted in 5% milk in TBST. For histone blots, secondary antibodies were diluted in 5% BSA in TBST. Immobilon Western Chemiluminescent HRP substrate (EMD Millipore) or Clarity and Clarity Max ECL Western Blotting Sub strates (Biorad, for histone blots) was used for visualization and imaging was performed using an ImageQuant 800 biomolecular imager (Amersham). For den- sitometric analysis, Western blot images were scanned using Adobe Photoshop (Adobe Systems Inc.) and quantified with the gel analysis macros available in FIJI (NIH, https://imagej.net/software/fiji).
using a FACS Aria II SORP (4 or 5 lasers) from BD Biosciences. Analysis of flow cytometry and FACS data was performed using FCS Express software from De Novo Software. Cells for analysis were suspended in Annexin Binding Buffer with 50 ng/ml DAPI.
(
For initial experiments to determine the optimal transcription factor configuration, cells were plated at 150,000 cells per 6- well plate and transfected the next day (day 1). Medium changes were performed daily, starting on day 2 up to cell harvest and analysis on day 4.
For cells transduced with an αKG- RE promoter/GFP reporter and NtcA chimera in a single vector, cells were plated at 125,000 cells per well in a 6- well plate followed by three days of media changes [gluta- mine deprivation as well as dm- αKG (Sigma 349631) supplementation] before analysis.
For cells transduced with an αKG- RE promoter/GFP reporter and NtcA chimera in separate vectors, cells were plated at 250,000 cells per well in a 6- well plate and subjected to two days of media changes before analysis.
3 π
Cell cycle synchronization: To synchronize U251 cells at the G1/S phase, cells were cultured with 2 mM thymidine (Sigma T1895) for 18 hours, washed with PBS, and then cultured in fresh media for 9 hours before incubating again with thymidine for 16 hours. To synchronize cells at the G2/M phase, cells arrested by thymidine treatment were cultured in fresh medium for 10 hours. Cells were stained with 20 μM Hoechst 33342 (Thermo Scientific 62249).
Immunofluorescence: 500,000 HEK293 or U251 cells were plated on 6 Micro- well glass bottom plates with 20 mm microwell 1.5 cover glass (Cellvis P06- 20- 1.5- N). The plate was pre- treated with 0.01% poly- l- ornithine solution (Sigma- Aldrich P4957) for HEK293 cells. The next day, 100 nM MitoTracker Red CMXRos (Cell Signaling Technology 9082S) was added in 2 ml cell culture medium and incubated at 37°C for 20 min. 4% paraformaldehyde was added to the cells after removing media with MitoTracker Red, followed by 0.2% Triton- X 1000 incubation and blocking with 0.2% fish skin gelatin (Sigma- Aldrich G7041). Primary antibody was added in 0.2% fish skin gelatin and incubated overnight at 4°C, including anti- FLAG Tag (1:800) or anti- HA Tag (1:1000) anti- bodies (listed in table S1). A 2 mg/ml stock of Goat anti- Mouse IgG (H+L) Cross- Adsorbed Secondary Antibody conjugated to Alexa Fluor 488 was diluted 1:2000 in 1 ml of 0.2% fish skin gelatin and added after pri- mary antibody and incubated at 4°C on a rocker for 2 hours. 300 nM DAPI in 0.2% fish skin gelatin was added for the last 5 min of incuba- tion. Images were obtained in dual camera mode on a CSU- W1 spin- ning disk confocal microscope (Nikon).
Pyruvate quantification in blood and CSF: Absolute pyruvate concen- trations in blood or CSF samples from children or adults were obtained from Geigy Scientific Tables, 1981 (89).
Liquid chromatography–mass spectrometry and stable isotope trac- ing: Cells were plated at a density of 250,000 cells per well in a 6- well plate for all LC- MS analyses unless otherwise stated. For relative quantification of metabolite abundance, cells were subjected to two days of media changes with supplementation of (R)- 2HG- TFMB [a kind gift of R. Looper (University of Utah)], dimethyl succinate (Sigma- Aldrich W239607), or DMSO before collection and analysis.
For stable isotope tracing experiments, cells were plated at a density of 25,000 cells per well in a 6- well plate. Cells were cultured in the presence or absence of 1 mM pyruvate for three days, with media changes each day. Two hours before harvest, media was changed again to glutamine- free DMEM supplemented with 4 mM unlabeled glutamine or 4 mM α- 15N- glutamine, and with or without 1 mM pyruvate.
Samples were washed twice with ice- cold saline and snap frozen in liquid nitrogen. Cells were harvested by scraping and metabolites were extracted directly in 80% acetonitrile (1 μl per 1,000 cells) and vortexed
for 20 min at 4°C. Cells were then centrifuged at maximum speed for 10 min in a microcentrifuge at 4°C. The supernatant was harvested and centrifuged an additional time to remove debris.
To quantify αKG from cell extracts using isotope dilution mass spec- trometry, metabolites were extracted from cells as described above. 1,2,3,4- 13C4, αKG (Cambridge Isotope Laboratories, CLM- 4442- PK) was added to each extract so that each sample contained a final concentra- tion of 200 nM internal standard. Alongside these extracts a calibra- tion curve consisting of 10 calibrator points ranging from 10 nM to 10 μM αKG (Sigma- Aldrich K1128) was prepared. 1,2,3,4- 13C4 αKG was added to each calibrator, so the final concentration of the internal standard was also 200 nM.
For absolute quantification of αKG, peaks for the native metabolite and internal standard were integrated in TraceFinder 5.2 SP1 software (Thermo Fisher). The known concentrations of each calibrator were added to the software to generate a linear regression curve with 1/X2 weighting. αKG levels were quantified against this curve. For each ex- perimental condition, a duplicate cell sample was used to measure cell number and volume. The contents of each well were trypsinized and the cell number and volume were measured using a Beckman VI- CELL- XR Counter. Whole- cell αKG concentrations were calculated using the total moles in a whole- cell sample, the total number of cells per sample, and the volume of each cell. Cellular αKG concentration was calculated as Ccell = CmeasVext
αKG concentration, Cmeas is the measured αKG concentration in the extract based on standard curve, Vext is the final extract volume, Ncell is the total number of cells extracted, and d is the mean cell diameter. Cells were approximated as spheres, so the single- cell volume cal cu- la tion is 4
d 2
3π(d∕2)3. Metabolite separation and concentration was achieved with a Millipore ZIC- pHILIC column using a linear gradient of 10 mM ammo- nium acetate in water, pH 9.8 (Mobile Phase A) and acetonitrile (Mobile Phase B), as previously described (90). Metabolites were detected with a Q Exactive HF- X or Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific) at a resolving power of either 120,000 or 240,000 at full width at half maxi- mum (FWHM), a scan range set to 80–1,200 m/z, and polarity switching, as previously described (91). To determine relative abundances of αKG, peaks were integrated using El- Maven 0.12.0 software (Elucidata) and total ion counts were quantified using TraceFinder 5.2 SP1 software (Thermo Fisher). Peaks were normalized to total ion counts using the R statistical programming language.
For stable isotope tracing studies, natural isotope abundance cor- rection was performed using the AccuCor package in the R statistical programming language (92).
Gas chromatography–mass spectrometry: Quantification and analysis of steady state αKG levels were performed using methods previously described (93). Briefly, cells were plated in 6- well plates at a density of 125,000 per well. Media was changed daily for 3 days, and on day 4, cells were washed with ice- cold normal saline, and plates were snap frozen with liquid nitrogen. Metabolites were extracted by adding 350 μl ice- cold 70% methanol to each well. Cells were scraped off each well, and the cell suspension was transferred into an Eppendorf tube on dry ice. To each sample, 150 μl chloroform was added, and the sam- ples were vortexed at 4°C for 20 min, followed by centrifugation at 17,000 g for 10 min. The upper layer of methanol containing polar me- tabolites was transferred to a separate tube and dried overnight on a vacuum rotary evaporator (CentriVap, Labconco) at 4°C. Samples not used immediately for analysis were stored at - 80°C.
Dried samples were derivatized by adding 20 μl methoxamine (MOX, Thermo Fisher 45950) per sample and vortexed for 20 min at 4°C, fol- lowed by incubation at 37°C for 1 hour. 30 μl N- tert- Butyldimethylsilyl- N- methyltrifluoroacetamide with 1% tert- Butyldimethylchlorosilane (TBDMS, Sigma 375934) was then added to each sample. The samples
)3, where Ccell is the estimated intracellular
Ncell ⋅4
GC- MS analysis was performed on derivatized samples using an Agilent 7890B GC/5977A MSD system. Peak integration was performed using the Metran software tool (94). Relative metabolite quantification analyses were performed by normalizing metabolite ion counts to total ion counts measured within each sample.
DNA methylation: For analysis of U251 stable lines, cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS and 1% penicillin- streptomycin as described in the cell culture methods. After gene knockout, cells were divided into two groups: one supplemented with 200 μM ascorbate- 2- phosphate and the other without. The cells were maintained under these conditions for 2.5 weeks before harvesting.
Genomic DNA (gDNA) was extracted from cultured cells or brain or kidney tissues of Gpt2 WT or Gpt2 KO mice using the Qiagen Blood & Tissue DNeasy kit, with RNase (NEB) added to remove RNA. The DNA was eluted in nuclease- free water and incubated with DNA Degradase Plus and Benzonase for four hours. Enzymatic reactions were quenched with methanol, and the samples were speed- dried. Finally, the dried samples were reconstituted in ammonium formate for UHPLC- MS/MS analysis. Samples were analyzed at the UT Southwestern Metabolic Phe- notyping Core. 5 μl of sample was injected on Nexera X2 UHPLC coupled to an LCMS- 8060 (Shimadzu Scientific Instruments) triple quadrupole mass spectrometer using the electrospray ion source in positive mode. 5- methyldeoxycytidine (5mC), 5- hydroxymethyldeoxycytidine (5hmC), and deoxycytidine (C) were analyzed by selective reaction monitoring using the following transitions: 5mdC 242 → 126, 5hmdC 258 → 124 and 258 → 142, dC 228 → 112. Targeted nucleosides were resolved on a Shimadzu Cell Culture Profiling Column using a gradient of solvent B MeOH/MeCN (1:1, v/v) 0.1% formic acid over solvent A H2O 0.1% formic acid at a 0.350 ml/min flow rate.
Detection of locus- specific 5mC levels was performed via duet mul- tiomics solution evoC (biomodal). The duet multiomics solution evoC method (95) and analysis were performed according to the manufac- turer’s instructions, using 80 ng of genomic DNA as starting material from Gpt2 WT or Gpt2 KO mouse brain tissues.
Seahorse assays of mitochondrial function: Oxygen consumption rate (OCR) was assessed using the Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit. 10,000 cells in each well were plated one day before the assay. Next day, the culture medium was replaced with OXPHOS assay medium, which consisted of DMEM without phenol red, supplemented with 2 mM glu- tamine, 1 mM sodium pyruvate, and 10 mM glucose, adjusted to pH 7.4. The plate was pre- incubated at 37°C for 1 hour in a non- CO2 incubator. OCR measurements were initially taken under basal conditions, fol- lowed by sequential injections of specific reagents: 2 μM oligomycin, an inhibitor of Complex V that enables the calculation of mitochondrial ATP production; 1 μM carbonyl cyanide- p- trifluoromethoxyphenylhydrazone (CCCP), an un coupling agent used to determine maximal respiration and spare capacity; and finally, 1 μM antimycin A, inhibitor of Complex III to halt mito chondrial respiration and allow the determination of non- mito chondrial respiration.
Cell proliferation: Cell proliferation assays were performed using a Celigo Image Cytometer (Revvity). Cells were plated in 96- well plates at a seeding density of 5,000 cells per well. To construct growth curves, cells were incubated with 20 μΜ Hoechst 33342 (Thermo Scientific 62249) and 1.0 μg/ml propidium iodide (PI) (Thermo Scientific P3566) dyes and viable cell numbers were measured each day from day 0 to day 4. To ensure robustness, we performed three independent repli- cates, each in technical triplicate, for each condition.
system (BioHPC) on an established Nextflow (v 20.01.0) platform for RNA- seq analysis called Astrocyte (v 2.1.0). Reads were trimmed us- ing TrimGalore (v 0.4.1) and then aligned using HiSAT (v2.0.1). Picard (v 1.127) was then used to mark and remove duplicate reads. Transcript- level splice isoform expression analysis was performed using the HiSAT, StringTie (v 1.1.2), and Ballgown protocol which has been described (96). Ballgown is available through the Bioconductor suite through the R statistical environment (R v 4.1.1.). U251 RNA- seq data were obtained from the European Nucleotide Archive project (accession PRJEB3371) as well as from NCBI BioProject database (accession PRJNA631805) (97). Normal human astrocyte control RNA- seq data were obtained from NCBI (accession PRJNA631805) (98).
RNA- seq: Total RNA from 10 mg brain tissue samples was extracted using the RNeasy Mini Kit according to manufacturer’s protocol (Qiagen 74004) and resuspended in 30 μl nuclease- free water. RNA- seq was performed and analyzed by Plasmidsaurus.
RNA- seq analysis: Gene ontology (GO) analysis was performed via the gene ontology platform (https://geneontology.org). Volcano plots were generated using ggplot2, displaying log- transformed P values on the y axis and log2 fold changes on the x axis. Gene set enrichment analysis (GSEA) was conducted using GSEA software (v.4.3.3) (https://www. gsea- msigdb.org). The normalized enrichment score (NES) and the false discovery rate (FDR) Q value were calculated by permuting gene set types, with a significance threshold of FDR ≤ 0.25 used to identify signifi- cantly enriched gene sets.
ChIP- seq: About 20 mg brain tissue for each sample and histone marker were lysed with a TissueLyser (Qiagen), then cross- linked with 1% form- aldehyde in PBS for 10 min at room temperature. Cross- linking reac- tions were quenched with glycine for 5 min, followed by washes in cold PBS. The crosslinked tissue was homogenized using a cooled blade homogenizer in homogenization buffer (50 mM Tris- HCl pH 7.5, 1% Nonidet P- 40, 0.25% deoxycholic acid, 1 mM EDTA). Then, cells were lysed with Farnham Buffer (5 mM PIPES, pH 8.0, 85 mM KCl, 0.5% Nonidet P- 40, 1 mM DTT, 0.1 mM PMSF), followed by SDS Lysis Buffer (50 mM Tris- HCl pH 7.9, 10 mM EDTA, 1% SDS, 1 mM DTT) to obtain soluble chromatin.
Chromatin was sheared using a Covaris M220 Focused- ultra sonicator to generate DNA fragments approximately 200 to 400 bp in size, as verified by gel electrophoresis. The sonicated chromatin was cen- trifuged at maximum speed in a microcentrifuge for 1 min at 4°C to remove insoluble debris. The soluble chromatin supernatant was diluted 1:9 with Dilution Buffer (20 mM Tris- HCl pH 7.9, 300 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0.5% Triton X- 100, 1 mM DTT, 0.2 mM PMSF) supplemented with a protease inhibitor cocktail (Roche). The diluted chromatin was precleared with 20 μl/ml protein A- agarose beads (ThermoFisher Scientific) on a nutator for 1 hour at 4°C. After cen- trifugation at 1000 g for 3 min at 4°C, the supernatant was reserved for immunoprecipitation and 24 ng of spike- in chromatin (Active Motif 53083) was added per sample, with 2% set aside as input DNA. For immunoprecipitation, antibodies used included 5 μl H3K9me3 (Abcam AB8898 1063771- 1), 5 μl H3K4me3 (Active Motif 39159) or 15 μl H3K27me3 (Cell Signaling 9733), along with 2 μg of spike- in antibody (Active Motif 61686), which were bound to 50 μl protein G Dynabeads (Invitrogen). The mixture was incubated with precleared supernatant overnight at 4°C with rotation. The Dynabeads were washed sequentially with the following buffers: low- salt wash buffer (10 mM Tris- HCl, pH 8, 2 mM EDTA, 0.1% SDS, 1% Triton X- 100, 150 mM NaCl), high- salt wash buffer (10 mM Tris- HCl, pH 8, 2 mM EDTA, 0.1% SDS, 1% Triton X- 100, 500 mM NaCl), LiCl wash buffer (10 mM Tris- HCl, pH 8, 1 mM EDTA, 1% NP- 40, 1% Na- Deoxycholate, 250 mM LiCl), and a final wash with TE buffer containing 50 mM NaCl. Chromatin was eluted, incubated overnight at 65°C, and treated with
For library preparation, 3 ng of H3K4me3 ChIP DNA, 10 ng of H3K9me3 ChIP DNA, and 10 ng of H3K27me3 ChIP DNA were used with the NEBNext Ultra II DNA Library Preparation Kit for Illumina (NEB). Library quality was assessed using a High Sensitivity D5000 ScreenTape on an Agilent 2200 TapeStation and quantified with the Qubit dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher). Libraries with unique adaptor barcodes were multiplexed and sequenced on an Illumina NextSeq 2000 platform (paired- end, 100 base pair reads), with a se- quencing depth of 30 million reads per sample for H3K4me3 ChIP, 50 million reads for H3K9me3 ChIP, and 40 million reads per sample for H3K27me3 ChIP.
ChIP- seq analysis: Fastq files were trimmed with TrimGalore (v.0.6.10), and quality control was performed both before and after trimming using FastQC (v.0.12.1). ChIP- seq reads were aligned to the mm10 reference genome using Bowtie2 (v.2.5.1). The sam files were con- verted to bam files by Samtools (v.1.6). PCR duplicates were removed with PicardTools (v.3.0). Signals were normalized using the spike in values of the samples and the input. We chose Macs2 (v.2.2.9.1) to call the peaks using the broad peaks setting for H3K9me3 and H3K27me3 (FDR < 0.1); we used the narrow peaks for H3K4me3 (FDR < 0.1) in the analysis. ChIP- seq peaks that were significantly increased or decreased in the Gpt2 KO mice were then identified using the DiffBind (v.3.16.0) package in R (v.4.2). Bigwig files for heatmap generation were created from bam files using the bam- Coverage function in deepTools. For visualization, representative track diagrams were generated using the Integrated Genomics Viewer (IGV) (v.2.9.4).
Subcutaneous xenotransplantation: Subcutaneous HCT116 xenografts were established by injecting HCT116 cells into the flanks of 5- week- old female NCR/NU mice (Taconic). Briefly, 106 cells were resuspended in a 100 μl suspension prepared by mixing 50 μl PBS with 50 μl Matrigel (Corning 354234) and injected subcutaneously into the flank. Four days after implantation, mice were treated with vehicle or 600 mg kg−1 dm- αKG by daily intraperitoneal injection. Tumor size was mea- sured by calipers one week after implantation. Mice were sacrificed when tumors reached ~500 mm3, and tumors were harvested for down- stream analyses.
Statistical analysis: Statistical analysis was performed using Graphpad Prism software. Figure legends include information on all statistical tests performed. P values were calculated by unpaired t tests for tests of statistical significance involving comparison of two independent groups. For comparisons between an experimental condition and the designated control condition in immunoblot analyses of histone methylation marks in cultured cells, one- sample t tests were used to calculate P values in the experimental condition relative to a refer- ence value established by the control condition (i.e., 1.0). For com- parisons between two groups that did not include the designated control condition in immunoblot analyses of histone methylation marks in cultured cells, P values were calculated using paired t tests. For immunoblot analyses of histone methylation marks in tissues, P val- ues were calculated using unpaired t tests. For tests of statistical sig- nificance involving comparison of three or more groups, P values were calculated by one- way ANOVA tests. For analyses of H3K4me3, H3K9me3, and H3K27me3 distributions in Fig. 6, A to C, P values were calculated by Kolmogorov- Smirnov tests. For the genome- wide 5mC analysis in Fig. 5D, P value was calculated by Wilcoxon signed rank test. For the comparison of gene expression changes in Fig. 5K, P value was cal- culated by χ2 test. For comparisons of two groups with significantly different variances, Welch’s t test was used. For all tests, P values less than 0.05 were considered statistically significant.
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acKNOWleDGMeNts The authors thank members of the McBrayer, DeBerardinis, Morrow, Shi, and Abdullah laboratories for insightful feedback; I. Mellinghoff (Memorial Sloan Kettering Cancer Center)
for TS516 GBM cells; W. G. Kaelin Jr. (Dana- Farber) for DNA plasmids; R. Pieper (UCSF) for
NHA cells; R. Looper (University of Utah) for (R)- 2HG- TFMB; members of the Genetic
Perturbation Platform (GPP) at the Broad Institute of MIT and Harvard for CRISPR screening
resources; J. Florencio and M. I. Muro Pastor (Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis)
for NtcA anti- serum; and S. A. Sloan and L. Nieland for experimental assistance (Emory).
Diagrams were produced in Adobe Illustrator using material from Biorender (https://
biorender.com) and/or Noun Project (https://thenounproject.com). Funding: This work was
supported by National Institutes of Health/National Cancer Institute grant R01CA258586
(to K.G.A. and S.K.M.); National Institutes of Health/National Cancer Institute grant
R01CA289260 (to K.G.A. and S.K.M.); National Institutes of Health/National Institute of
Neurological Disorders and Stroke grant R01NS142141 (to S.K.M.); National Institutes of
Health/National Institute of General Medical Sciences grant R01GM158820 (to S.K.M.);
National Institutes of Health/National Cancer Institute grant P50CA165962 (to S.K.M.); National
Institutes of Health/National Cancer Institute grant U19CA264504 (to S.K.M.); Cancer
Prevention and Research Institute of Texas grant RR190034 (to S.K.M.); Cancer Prevention
and Research Institute of Texas grant RP230344 (to S.K.M.); Cancer Prevention and Research
Institute of Texas grant RP240489 (to S.K.M.); Distinguished Scientist Award from the
Sontag Foundation (SKM); Jonesville Foundation (to S.K.M.); The Nick Gonzales Foundation
for Brain Tumor Research (to S.K.M.); National Institutes of Health/National Cancer Institute
grant K12CA0903354 (to D.D.S.); Burroughs Wellcome Career Award for Medical Scientists
(D.D.S.); Lubin Family Foundation Scholar Award (D.D.S.); National Institutes of Health/
National Cancer Institute grant F30CA271634 (to M.R.S.); National Institutes of Health/
National Cancer Institute grant K99CA277576 (to Y.X.); Human Frontier Science Program
postdoctoral fellowship award LT0018/2022- L (to Y.X.); National Institutes of Health/National
Institute of General Medical Sciences grant DP2GM159178 (to J.G.- B.); National Institutes
of Health/National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases grant
1R01DK145539- 01 (to J.G.- B.); Cancer Prevention and Research Institute of Texas grant
RR210059 (to J.G.B.); American Cancer Society grant RSG- 24- 1255384- 01 (to J.G.- B.);
Pew- Stewart Cancer Scholar (to J.G.- B.); Cancer Prevention and Research Institute of Texas
Core Facilities Support Award RP240494 (to L.G.Z., T.P.M., R.J.D., and the CRI Metabolomics
Facility); National Institutes of Health/National Institute of General Medical Sciences grant
R35GM124958 (to L.A.B.); National Institutes of Health/National Institute of Child Health and
Human Development grant R01HD109239 (to L.A.B.); The Welch Foundation I- 2025 (to
L.A.B.); American Cancer Society grant 134230- RSG- 20- 043- 01- DMC (to L.A.B.); National
Institutes of Health/National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases grant
R01DK125713 (to M.A.); Howard Hughes Medical Institute (.R.J.D); National Institutes of
Health/National Institute on Aging grant R01AG0874550 (to E.M.M.); National Institutes of
Health/National Institute of Neurological Disorders and Stroke grant R01NS121618 (to
E.M.M.); and National Institutes of Health/National Institute of Neurological Disorders and
Stroke grant R01NS113141 (to E.M.M.). Author contributions: Conceptualization: A.C.S.,
V.K., K.G.A., R.J.D., E.M.M., S.K.M. Data curation: H.L. Formal analysis: A.C.S., H.L., X.Z., J.I.T.,
L.G. Funding acquisition: E.M.M., S.K.M. Investigation: A.C.S., H.L., K.G., Y.X., J.I.T., J.H.J., M.F.,
T.S., V.T.P., P.K., Q.O., M.S., D.D.S., A.C.- Y.T., J.H.L., R.G., Y.J.K., S.- C.T., L.G.Z., T.P.M., R.G.
Methodology: A.C.S., K.G., J.H.J., M.F., Q.O., M.S., T.P.M., M.A. Project administration: K.G.A.,
E.M.M., S.K.M. Software: X.Z., M.R.S., C.A.B., L.A.B. Resources: K.G., X.Z., L.G., M.F., Q.O., M.S.,
M.R.S., J.G.- B., C.A.B., J.G.D., L.A.B. Supervision: D.D.S., C.A.B., T.P.M., L.X., K.G.A., L.A.B., M.A.,
E.M.M., S.K.M. Validation: H.L. Visualization: A.C.S., H.L., S.K.M. Writing – original draft: A.C.S.,
H.L., S.K.M. Writing – review & editing: A.C.S., H.L., E.M.M., S.K.M. Competing interests:
S.K.M. receives research funding from Servier Pharmaceuticals. S.K.M. and K.G.A. have
intellectual property interests related to brain tumor metabolism (US patent application serial
no. 63/597,523) and are cofounders of Gliomet. S.K.M. is a founder of Gliomic. R.J.D. is a
founder and advisor at Atavistik Bioscience and an advisor for Vida Ventures, Illumina, and
Faeth Therapeutics. Data, code, and materials availability: Further information and
requests for resources and reagents should be directed to and will be fulfilled by the lead
contact, S.K.M. (samuel. mcbrayer@ utsouthwestern. edu). DNA constructs generated in this
study are available upon request or from Addgene. Data are available in the main text or the
supplementary materials. RNA- seq data have been deposited on Gene Expression Omnibus
(GEO) (GSE325502). ChIP- seq data have been deposited on GEO (GSE325503). Synthetic
DNA sequences have been deposited on GenBank. License information: Copyright © 2026
the authors, some rights reserved; exclusive licensee American Association for the
Advancement of Science. No claim to original US government works. https://www.science.
org/about/science- licenses- journal- article- reuse
sUPPleMeNtaRY MateRials science.org/doi/10.1126/science.adx8675 Figs. S1 to S15; Tables S1 to S6; MDAR Reproducibility Checklist; Data S1 to S9
10.1126/science.adx8675
Submitted 6 April 2025; resubmitted 12 February 2026; accepted 5 May 2026
Cyclic sealing and drainage on an oceanic transform fault
Hao Yang, Lingling Ye, Haijiang Zhang*
INTRODUCTION: Oceanic transform faults, which accommodate
strike- slip motion between offset midocean ridge segments, have
long been viewed as conservative plate boundaries dominated by
simple shear and largely devoid of magmatic input. This two-
dimensional (2D) paradigm, established since the advent of plate
tectonic theory, has been increasingly challenged by observations of
pronounced structural heterogeneity, magmatic intrusions, and
active hydrothermal circulation at ridge- transform intersections.
High- resolution geophysical images of these faults show 3D
damage zones with strong along- strike variability, especially in
the shallow crust. This structural complexity provides a hydrother-
mal plumbing system that links deep magmatic volatiles to the
seafloor, suggesting a dynamic fault zone where fluids play a
critical role in the seismic cycle.
RATIONALE: A key to understanding fluid- rock interactions is tremor, a sustained, harmonic seismic signal highly sensitive to small stress perturbations, such as Earth tides. Although tidal modulation of tremor is well documented in subduction zones and volcanic settings, it remains unknown whether such phenomena occur within oceanic transform faults and what it reveals about fault zone permeability and earthquake behavior. We analyzed continuous waveforms from a dense ocean- bottom seismometer array deployed on the Gofar transform fault of the East Pacific Rise, a site with well- known repeating large ruptures and a seismic barrier segment.
RESULTS: We discovered persistent harmonic tremor originating from shallow depths (0 to 4.5 km below the seafloor) within the barrier zone, a region that arrests large rupture propagation but hosts abundant microseismicity. Before an M4 earthquake (E2) on
-4.5°
E2
Tremor- tide correlation on the Gofar transform fault. (Top left) The tremor source zone (red contour) spatially coincides with the barrier segment, along with microseismicity (gray dots), two M4 earthquakes (E1 and E2, red stars), and seismic networks (red triangles). (Top right) Schematic hydrothermal circulation and deep volatile supply to the tremor zone. (Bottom) Correlation between tremor signals (red) and tidal volume strain (blue) before the E2 rupture, but this correlation breaks down after E2.
2.0
Latitude
-4.6°
-106.1° -105.9° -105.8°
Amplitude
1.9
-25
8 September 2020, tremor amplitude closely tracked semidiurnal
tides with a small phase lag and a high correlation with tidal
volumetric strain. This high- correlation period coincided with
reduced microseismicity, gradually declining b- values, and system-
atically falling compressional to shear wave velocity (Vp/Vs) ratios,
together indicating progressive gas accumulation in a sealed,
pressurizing fracture network. Immediately after the M4 rupture,
the tremor- tide correlation collapsed, seismicity surged, b- values
rebounded, and Vp/Vs rose sharply, signaling rupture- driven
drainage and rapid fluid reinfiltration. This pattern repeated over
multiple earthquake cycles, with tidal coupling recovering over
weeks as hydrothermal resealing progressed through mineral
precipitation and pressure solution. The inferred tremor sources,
located using waveform migration, coincide spatially with the
barrier zone, and the observed phase lags are consistent with
poroelastic modeling of pore pressure response to tidal loading
in a medium with evolving permeability.
CONCLUSION: These observations reveal a valve- like cycle of sealing, pressurization, rupture, and drainage operating within an oceanic transform fault. The findings recast transform faults from passive shear boundaries into active, fluid- critical systems where energy release is paced by the interplay of magmatic volatile supply, permeability evolution, and tidal loading. This mechanism may operate globally at volatile- rich transform faults, with implications for understanding earthquake cycles and hazard.
*Corresponding author. Email: zhang11@ ustc. edu. cn Cite this article as H. Yang et al., Science 393, eaed5665 (2026). DOI: 10.1126/science.aed5665
Longitude
Tremor-Tide correlation Decorrelation
-10 -5 0 5 10 -15
Along fault location relative to E2 (km)
Full article and list of author affiliations: https://doi.org/10.1126/ science.aed5665
1.8
1.7
Volume Strain (nstr)
Cyclic sealing and drainage on an oceanic transform fault
Hao Yang1, Lingling Ye2, Haijiang Zhang1,3*
Oceanic transform faults have been considered conservative, shear- dominated boundaries, yet their proximity to magmatic systems implies fluid involvement. In this work, we discovered tidally modulated tremor at the Gofar transform fault along the East Pacific Rise. Tremor amplitude correlates with semidiurnal tides during periods of sparse seismicity and low in situ compressional to shear wave velocity ratio (Vp/Vs), but this correlation weakens following earthquake swarms accompanied by high Vp/Vs. We propose a valve- like sealing- drainage dynamic process where sealing traps volatiles and boosts tidal sensitivity, sustaining tremor activity until rupture opens high porosity and permeability pathways, which silences tremors, triggers microseismicity, and resets the system through hydrothermal resealing. Thus, transform faults are likely permeable and tide critical, with energy release oscillating between tremors and rupture, paced by magmatic volatile supply and healing.
Oceanic transform faults, which accommodate strike- slip motion be- tween offset midocean ridge segments, have long been viewed as con- servative plate boundaries dominated by simple shear and largely devoid of magmatic input. This two- dimensional (2D) paradigm, established since the advent of plate tectonic theory (1), has been increasingly chal- lenged by observations of pronounced structural heterogeneity, mag- matic intrusions, and active hydrothermal circulation at ridge- transform intersections (2–4). High- resolution geophysical images reveal that these faults are not simple planes but complex 3D damage zones, with fault architecture and material properties varying strongly along strike (5, 6). This structural complexity, particularly in the shallow crust, provides a hydrothermal plumbing system that links deep magmatic volatiles to the seafloor, suggesting a dynamic fault zone where fluids play a critical role in the seismic cycle (7, 8).
Key to understanding these fluid- rock interactions is tremor: a sustained, nonimpulsive seismic signal characterized by narrow- band and often harmonic spectra that lasts from minutes to days (8–11). In subduction zones and volcanic systems, tremor is highly sensitive to kilopascal- level stress perturbations, such as those from tides, and is commonly linked to pressurization and fluid flow within critically stressed fractures (8–11). The presence of tremor on midocean ridges and submarine volcanoes as well as its synchronization with tidal cycles indicate that shallow fracture networks can amplify weak pe- riodic stresses into observable tremor responses (12–15). However, it remains unclear whether comparable tidally modulated tremor oc- curs within oceanic transform faults and how any such tremor relates to fault zone properties and microseismicity.
The Gofar transform fault on the East Pacific Rise (EPR) slips at ~14 cm yr−1. At its western G3 segment, magnitude 6 (M6) ruptures recur quasiperiodically every 5 to 6 years on two ~15- km- long rupture patches separated along strike by a ~10- km- long seismic barrier that has prevented rupture propagation from M6 earthquakes on both sides but
1Key Laboratory of Precision Geodesy, School of Earth and Space Sciences, University of Science and Technology of China, Hefei, China. 2Department of Earth and Space Sciences, Southern University of Science and Technology, Shenzhen, China. 3Mengcheng National Geophysical Observatory, University of Science and Technology of China, Mengcheng, China. *Corresponding author. Email: zhang11@ ustc. edu. cn (H.Z.)
hosts abundant microseismicity extending to the uppermost mantle (16) (Fig. 1). Various lines of evidence from wide- angle seismic refraction imaging (17, 18), seismicity analysis using local dense arrays (19–23), controlled- source electromagnetic inversion (24), and dynamic source modeling (21) indicate that elevated deep fluids and/or intensified fault damage most likely generate and sustain this seismic barrier zone.
In this work, we report the discovery of tidally modulated harmonic tremor in the seismic barrier zone of the Gofar transform fault using data from a dense array of ocean- bottom seismometers (OBSs). We show that the tremor amplitude closely tracks semidiurnal tides, al- though this coupling abruptly breaks down following moderate M4 earthquake ruptures. The period of strong tremor- tide correlation co- incides with a lower seismicity rate and a gradual drop in compres- sional to shear wave velocity ratio (Vp/Vs). By contrast, when the correlation breaks down, we observed an increase in microseismicity and a rapid rebound in Vp/Vs. We interpret these observations as evi- dence for cyclic sealing and drainage processes occurring within the oceanic transform fault, governed by the coevolution of fault zone per- meability and pore pressure: Progressive hydrothermal sealing traps volatiles, amplifying tidal stresses and sustaining tremors until earth- quake rupture reconnects fluid pathways, drains fluids, and resets the system. This valve- like mechanism recasts transform faults from pas- sive shear boundaries into active, fluid- controlled 3D systems where energy release is paced by the interplay of tidal loading, fluid migration, and variations in fault zone permeability.
Tidal modulation of harmonic tremor We identified persistent, harmonic tremor signals characterized by emergent onsets (signals begin gradually and increase in amplitude slowly) and durations from tens of minutes to hours (Fig. 2, A and B) from continuous waveforms of a dense OBS array deployed at the G3 segment of the Gofar transform fault (25). The tremor exhibited a stable spectral structure with a fundamental frequency range of ~2 to 8 Hz (Fig. 2, B, D, and E), consistent with the narrowband signature typical of fluid- induced resonance (9, 12). The tremor signal weakened mark- edly following an M4 earthquake on 8 September 2020 (marked as event E2 in Fig. 1; Fig. 2, A to C), indicating a natural subsurface origin rather than ship or oceanic noise. The OBS array indicates a mixed tremor ori- gin produced by the superposition of shallow, complex, small- amplitude sources (fig. S1). Its narrow- band, intermittent energy release and varia- tions among stations reflect localized sources related to oscillations of fluid- filled cracks or boiling- induced cavities, with multiple weak radia- tors superposed in the near field rather than a single compact source. Resonance of these radiators can be sensitively modulated by small external stress perturbations by opening or closing cracks and altering fluid pathways (9, 26), consistent with observations at the 9°50′N EPR and Brothers volcanic hydrothermal systems (12, 14).
We located tremor sources using a waveform- migration method with a semblance- based imaging condition, well suited for detecting and lo- cating continuous narrowband tremor signals (27, 28). The inferred sources lie within ~4.5 km below the seafloor and nearly coincide with the previously inferred barrier region along the G3 segment of the Gofar transform fault (Fig. 1B and figs. S2 to S5; see materials and methods).
The root- mean- square (RMS) amplitude of tremor in the 2- to 8- Hz band varied systematically with the calculated total tidal volume strain, including contributions from solid Earth tide [or body tide referred to in (29)], regional ocean- mass loading, and direct water- column loading (fig. S6; see materials and methods). The M2 tidal constituent (~12.4 hours) was the dominant contributor to the total tidal volume strain in the study area, and the two were almost coincident, except for some slight differences in amplitude (fig. S7). Thus, we used the M2 tidal constituent to analyze the correlation between tidal and RMS time se- ries. Before the E2 rupture, the RMS amplitude exhibited an evident semidiurnal modulation with a slight but resolvable phase lag (Fig. 2C). By contrast, after the M4 E2 earthquake, this modulation broke down,
-4.5°
-4.5°
-4.0°
B
2.0
-4.6°
-106.0° -105.9° -105.8° -4.7°
Fig. 1. Tectonic setting and seismicity of the Gofar transform fault. (A) Map view of the EPR midocean ridge and transform system, with the Gofar (sections G1, G2, G3), Discovery, and Quebrada fracture zones (FZs) taking up transform slip between EPR spreading centers. Blue triangles denote ocean- bottom seismometers deployed from 2019 to 2022. The inset shows the regional plate boundary context. (B) Close- up of the study area on the Gofar transform fault (G3). Focal mechanisms show historical moment magnitude (Mw) ≥ 6.0 events from the Global Centroid Moment Tensor catalog (https://www.globalcmt.org/) (58, 59). Cyan and yellow ellipses show the M6 earthquake ruptures and barrier zone, respectively (22). Black dots represent relocated earthquakes from this study. The red contour outlines the region enclosing the top 25% of tremor energy. (C) Depth (below sea surface) profile of seismicity along the G3 segment relative to the location of the 8 September 2020 M4 earthquake (E2). The 11 August 2020 M4.1 earthquake (E1) is also marked. The profile defines three distinct domains: a shallow hydrothermal zone (seafloor to ~5 km), an intermediate brittle regime (~5- 9 km), and a deeper magmatic- volatile domain (>9 km) rich in CO2, as evidenced by low- Vp/Vs anomalies. The red dashed line indicates the approximate Moho depth. The Vp/Vs model is from (5).
1.9
and the RMS amplitude was dominated by short- lived, high- amplitude spikes related to local microearthquakes (Fig. 2C). Amplitude spectral densities (after excluding detected earthquake signals) showed elevated 2- to 8- Hz energy during the tremor- tide correlation interval but strongly reduced 2- 8- Hz power during the decorrelation interval (Fig. 2D). The 2- hour time series before the M4 earthquake further revealed more sustained narrowband, harmonic energy versus weaker, intermittent tremor- band energy afterward (Fig. 2E). This tremor- tide correlation is observed across the array, and is generally stronger in station clusters A1 and A2 than in A3 (fig. S8), indicating lateral heterogeneity in tremor source strength.
Semidiurnal periodicity is clearly expressed in both the frequency and phase domains (Fig. 3; see materials and methods). After removing time windows containing detected earthquakes, the periodogram of the tremor RMS time series during the tremor‒tide correlation interval dis- plays a dominant spectral peak precisely at the M2 period in the station- averaged spectrum (Fig. 3A and fig. S8A). Weaker but distinct diurnal peaks at K1 and O1 are also present. During the correlation interval, pairwise correlations of RMS time series are high (fig. S9A). In the decor- relation interval, these tidal peaks are strongly reduced (Fig. 3A and fig. S8B), and pairwise station correlations drop markedly (fig. S9B). During the correlation interval, the tremor RMS series traces a harmonic curve fitting the M2 tidal signals, with a high cross- correlation coefficient
We detected and relocated the events during the observation period (fig. S12; see materials and methods). Before event E2, the seismicity rate dropped together with b- values and in situ Vp/Vs ratios (Fig. 4; see materials and methods). The decrease of Vp/Vs can be interpreted as a transition toward a more gas- rich pore system. Gas is highly compressible, so it lowers the effective fluid bulk modulus and preferentially reduces P- wave speed, thus lowering Vp/Vs, whereas liquid- dominated cracks yield higher Vp/Vs (30, 31). This interpretation is consistent with sustained, deep magma degassing feeding the shallow hydrothermal net- work, and similar gas- liquid control on Vp/Vs has been reported in volcanic- hydrothermal settings (32). The gas- rich state of the fracture network suggests that the system is in a sealing stage. The decreasing trend in b- value, along with the lower seismicity rate, also indicates a progressive buildup of shear stress as the shallow fracture network tightens and sealing advances. After the E2 rupture, this pattern reversed abruptly: Seismicity intensified, the b- value rebounded, and Vp/Vs rose tran- siently (Fig. 4), marking rupture- driven opening of the sealed system. The increase in b- value suggests more distributed cracking, whereas the Vp/Vs jump indicates rapid hydraulic reconnection and fluid re- charge, with gases escaping in newly opened fractures. Together, these features indicate a transient, stress- driven increase in permeability that disrupted the tidal coupling at the tremor sources. Alternative explana- tions for elevated Vp/Vs, such as crack closure, pore collapse, or thermal transients, are unlikely because they cannot simultaneously account for the contemporaneous rise in both b- value and seismicity on this timescale.
-15
-10 -5 0 5 10
Along fault location relative to E2 (km)
This breakdown of the tremor- tide correlation after the E2 rupture is a direct manifestation of the anticipated “valve- opening” event. The co- seismic rupture and subsequent fracturing from aftershocks transiently increased fault- zone porosity and permeability, enhancing hydraulic con- nectivity and accelerating pore- pressure equilibration, thereby reducing pore- pressure retention and weakening the transmission of tidal loading to the crack system. Consequently, the tremor, although sometimes
of 0.92 and a phase lag of – 21.0°, whereas the decorrelation interval is nearly flat with low similarity to the tidal curve (Fig. 3B). Similar disruption- and- recovery cy- cles occurred during three additional in- tervals associated with M~4 earthquakes in 2020, and the inferred phase lags vary among episodes (figs. S10 and S11).
Breakdown and recovery of tremor- tide correlation after rupture The tremor‒tide correlation breaks down after the M4 earthquake rupture, reveal- ing a dynamic valve- like mechanism. The system's response to the M4.0 earthquake rupture on 8 September 2020 (E2) pro- vides a sensitive test of the tidal coupling framework. Across the array, tremor‒tide correlation collapses (Fig. 3 and fig. S8B). Concurrently, the interstation correla- tion across the array breaks down (fig. S9B), indicating a fundamental change in tremor- generating processes.
1.8
1.7
C
E
Tremor-Tide correlation Decorrelation A
-40
-40
-40
RMS
RMS
RMS
08-05 08-10 08-15 08-20 08-25 08-30 09-04 09-09 09-14 09-19 09-24 09-29
08-05 08-10 08-15 08-20 08-25 08-30 09-04 09-09 09-14 09-19 09-24 09-29
-25
-25
-25
-80
-80
B
Frequency (Hz)
Frequency (Hz)
Frequency (Hz)
Frequency (Hz)
08-20 08-21 08-22 08-23 08-24 08-25
09-13 09-14 09-15 09-16 09-17 09-18
-60
-60
-60
ASD (μm s-1 Hz-0.5)
2 4 6 8 10 12 14 16
Fig. 2. Semidiurnal tidal modulation of tremor energy and its postmainshock loss of correlation. (A) RMS velocity amplitude at station A301 (2 to 8 Hz; red) from 1 August to 1 October 2020, overlaid with the total tidal volume strain (blue; extension positive). The gray and black vertical lines mark the 11 August 2020 M4.1 (E1) and 8 September 2020 M4 (E2) earthquakes, respectively. (B) Power spectral density (PSD) spectrogram, highlighting persistent narrow- band harmonic tremor energy at 2 to 8 Hz from 20 August to early September. (C) Five- day zooms for the correlation window from 20 to 25 August and the decorrelation window from 13 to 18 September, illustrating the transition from clear tidal modulation to the breakdown of correlation after the E2 mainshock. (D) Amplitude spectral densities (ASDs) computed for the time windows in (C) after removing earthquake signals. (E) Two- hour raw seismic waveform and spectrogram on 21 August and 13 September, respectively.
present, lost its tidal correlation. In fact, the correlation of tremor RMS and tidal signals started to decrease about 3 days before the E2 mainshock (Fig. 2A), indicating that the system may have already experienced some aseismic slip to facilitate the drainage of fluid and gases.
In the weeks following the E2 rupture, as aftershock activity decays, tidal modulation gradually reemerges (fig. S15, A to E). This recovery occurred on a timescale controlled by chemical- mechanical sealing processes, such as pressure solution and mineral precipitation (e.g., silica, carbonates), which reduce permeability (7, 33). As the system resealed, pore pressure rebuilt and the gas fraction increased, leading to a gradual reduction in Vp/Vs. Strengthening tremor- tide correlation thereby tracks the progressive reloading process. The fault zone re- turned to a near- critical state with near- lithostatic pore pressure, where the semidiurnal tide could again efficiently pump the tremor sources. Following a later M4.3 rupture on 27 November 2020 (E4),
Aug. 20 to Aug. 25
Sep. 13 to Sep. 18
Date in 2020
Date in 2020
2-hours seismic signals on Aug. 21, 2020
02:00 03:00 04:00 2
02:30 03:30
2-hours seismic signals on Sep. 13, 2020
02:00 03:00 04:00 02:30 03:30
tremor- tide correlation again diminished, indicating a renewed perme- ability increase that weakened the tidal coupling (fig. S15F).
We further evaluated the behaviors of the system during other nearby M4 earthquakes within the observation period and found that the 11 August 2020 M4.1 earthquake (event E1) only caused a negligible effect on the tremor- tide coupling (Fig. 2 and fig. S16) compared to event E2. Seismic waveforms of both E1 and E2 (fig. S17) exhibit low- frequency or mixed- band characteristics, indicating fluid involvement and longer source durations (34). The key difference is that E2 occurred within the tremor source zone and ruptured the shallow damage zone (Fig. 1 and fig. S10), thereby producing much stronger disruption of tremor- tide correlation than E1. By contrast, E1 was located farther away from the tremor zone and may have primarily affected deeper magmatic de- pressurization and degassing with little effect on the tremor zone. The other three earthquakes (D1, D2, and E4) occurring within the tremor
Vol. Strain (nstr)
Vol. Strain (nstr)
-20 PSD(dB)
-20 PSD (dB)
-20 PSD (dB)
A
M2 K1 O1 Correlation Decorrelation
1.0
Normalized amplitude
Normalized amplitude
0.8
0.8
0.8
0.6
0.6
0.6
0.4
0.4
0.2
0.2
0.0
0.0
1.8
1.5
-21¡
12 15 18 21 24 27 30 Period (hours)
B
M2 Tide B
0.5
-180° -60° 60° 180° 300° 420° 540° Tidal phase
0.9
Fig. 3. Tidal correlation and breakup before and after the M4 rupture (E2). (A) Mean periodogram of vertical RMS averaged over all stations for the correlation (red) and decorrelation (cyan) windows (defined in Fig. 2). Dashed lines mark the tidal constituents M2 (12.4 hours), K1 (23.9 hours), and O1 (25.8 hours). (B) Phase- folded mean RMS across all available stations relative to the M2 tide, with tremor- tide cross- correlation coefficients 0.92 and 0.44 for correlation and decorrelation windows, respectively. The dashed black curve shows sinusoidal fit for the correlation interval. During this interval, the tremor energy (red) follows the M2 tide with a phase lag of −21.0°.
Depth (km)
b-value
0.7
1.9
08-10 08-20 08-30 09-09 09-19 09-29
In-situ Vp/Vs
1.7
1.6
1.4
08-10 08-20 08-30 09-09 09-19 09-29 Date in 2020
Fig. 4. Coevolution of seismicity and fault- zone properties. (A) Temporal variation of relocated earthquakes. Circle size scales with earthquake magnitude. Three M4.0+ earthquakes (E1 to E3) are highlighted by red stars. The red curve shows daily seismicity rate, and the dashed magenta curve shows the temporal evolution of the b- value. Only events above the completeness magnitude (Mc = 0.3) are plotted and used to compute the seismicity rate and b- value. (B) Temporal variations in in situ Vp/Vs at five fixed spatial anchors (A0 to A4). Error bars indicate the 95% confidence intervals of the Vp/Vs estimates, and each marker is plotted at the center of its estimation window. The thick red curve is the average Vp/Vs value from five anchors. Details of anchor locations, time window, and data fitting are shown in the supplementary materials (figs. S13 and S14).
RMS @Correlation RMS @Decorrealtion
Tremor-Tide correlation Decorrelation
This observed sequence—(i) sealed conditions with tremor- tide correlation, low seismicity, and Vp/Vs; (ii) rupture- associated loss of tremor- tide correlation, a micro- seismicity surge, and increased Vp/Vs; and (iii) gradual resealing and recovery of tremor- tide correlation—captures a complete cycle of shallow transient permeability and pore pressure evolution in the barrier zone of the Gofar transform fault. It reveals that the oceanic transform fault zone dynamically toggles between two states: a sealed, pressurized, tremor- prone state and a ruptured, high- permeability, small earthquake–prone state.
Pore pressure response of the transform fault to tides Within a poroelastic framework, tidal loading perturbs pore pressure through coupled skeletal volume change and pore- fluid compression or transport (35, 36). Combining mass conservation with Darcy's law and linearizing for small perturbations yields a first- order evolution equation for the pore pressure response (see materials and methods). We constructed a physically reasonable model in which the mainshock rupture briefly reconnects fractures or fluid pathways, represented as a step increase in permeability k (fig. S18A). Permeability then gradually recovers as chemical sealing, mineral precipitation, and particle re- bridging proceed, as observed and experimentally demon- strated (37, 38). Using the tidal volume strain as input, we forward- modeled the pore pressure response and compared it with the observed M2 modulation (fig. S18, B and C).
The model reproduces two key observations. Before the M4 rupture, the fault is relatively sealed (low k), and pore pressure responds to the semidiurnal cycle in a regime dominated by local pore spaces with limited diffusion, producing strong modulation relative to the tidal volume strain with a cross- correlation coefficient of 0.97 and phase lag of −21.0°, consistent with the observed phase lag (Fig. 3B). The negative phase lag arises from the mod- el’s diffusive flow component: As the strain rate decreases, the response becomes more drainage dominated, causing pore pressure to peak before the tidal volume strain and producing a phase lag of −90° to 0°, which is controlled by a characteristic diffusion timescale. After rupture, in- creased permeability allows pore pressure perturbations to diffuse and equilibrate more readily within the con- nected fracture network, thereby reducing the amplitude of tidal modulation (fig. S18B). This change also alters the relative contribution of the instantaneous loading and time- dependent flow components of the pore- pressure response, yielding a more negative phase lag relative to the volume strain (fig. S18C).
Daily EQ Counts
A0 A1 A2 A3 A4 Mean
We further connected the pore- pressure response to fluid- induced resonance of the tremor energy. As the fault approaches a near- critical state with fluid or gas enrich- ment, the progressive buildup of pore pressure reduces the effective normal stress, allowing semidiurnal tidal perturbations at about 10 kPa level to strongly modulate whether resonance is excited and how efficiently it radi- ates (11). Near this excitation threshold, kilopascal- level tidal stressing can slightly open or clamp fractures and change how easily fluid moves through them, so the crack or cavity oscillations can turn on and off and their ampli- tude can vary strongly, whereas the dominant frequency
changes little because it is mainly set by fracture length and shape as well as fluid viscosity (9, 26). This process explains the pronounced semi- diurnal modulation in the prerupture tremor energy that we observed on the Gofar transform fault and is comparable to observations of tremor being highly sensitive to small tidal stresses on weak faults in subduction settings (39). After rupture, the near- critical state is disrupted. The in- crease in permeability allows pore pressure perturbations to equili- brate more readily within the connected fracture network, thereby reducing the amplitude of tidal pore pressure modulation and weakening tremor- tide correlation; as sealing progresses and stress accumu- lates, the system gradually returns toward a near- critical state and tidal coupling recovers.
A conceptual model for tidal- sensitive sealing- rupture cycles The temporal variation of observed tremor, microseismicity, and Vp/Vs maps onto a conceptual model of tide- regulated, valve- like behavior in the shallow oceanic transform fault zone (Fig. 5). This model unifies the coevolution of fluid or gas supply, permeability, pore pressure, and tidal coupling gain into a repeatable, three- stage cycle.
Fig. 5. Conceptual model for a shallow “sealing- pressurization- rupture” cycle on an oceanic transform fault. (A) Schematic cross section illustrating the relationship between subsurface seismicity (black dots), hydrothermal circulation (blue arrows), CO2 degassing (gradational arrows), and deep mantle melt supply (red arrows) along the western segment (G3) of the Gofar transform fault (Fig. 1). Volatile- bearing fluids can migrate upward along the fault zone and modulate conditions within the seismogenic layer. Red stars show two M4 earthquakes (E1 and E2) on 11 August 2020 and 8 September 2020, respectively. The red contour indicates the tremor source zone. (B to D) Three- stage evolution cycle on a representative patch of the fault zone with a major flow path and small cracks in surrounding rocks. The temporal response of the pore pressure (Δp) to the volumetric strain (εv) of the tidal loading (fig. S18) is illustrated schematically for each stage, with the upper inset corresponding to Stage 1 and the lower inset showing the evolution across stages 2 and 3. (B) Stage 1, sealed and pressurized: Local mineral sealing reduces permeability and isolates a volatile- rich fluid phase, resulting in near- lithostatic pore pressure, such that small tidal stress perturbations can trigger harmonic tremors (tremor- tide correlation). Most cracks are sealed with some gas or fluid at this stage, and the permeability is low. (C) Stage 2, rupture opens pathways: Moderate M4 earthquake (EQ) ruptures break seals, open cracks, and rapidly increase permeability and porosity, leading to transient dilatancy strengthening and a local pore- pressure drop. (D) Stage 3, fluid infiltration and progressive sealing: Fluid reinfiltrates cracks in the fault zone, resulting in abundant microseismicity and high Vp/Vs; then, as pore pressure gradually builds up, sealing resumes and progressively lowers permeability and Vp/Vs.
Stage 1: Sealed and pressurized (Fig. 5B). With the shallow fracture network sealed, the continuous supply of magmatic volatiles (e.g., CO2, as evidenced by the low- Vp/Vs strip in Fig. 5A) and hydrothermal fluid from depth gradually elevates fault zone pore pressure. As the gas frac- tion increases, it drives a systematic decrease in Vp/Vs. As the reso- nance source approaches a near- critical state with near- lithostatic pore pressure, the tidal volume strain is sufficient to modulate tremor exci- tation and radiation intensity, producing tidally modulated harmonic tremor. Permeability further controls the hydraulic response time, lead- ing to a phase lag between tidal forcing and tremor energy. During this stage, microseismicity is relatively low.
Stage 2: Rupture opens pathways (Fig. 5C). When the escalating pore pressure and differential stress exceed the strength of the sealed frac- tures, the M4 earthquake rupture occurs. This “valve- opening” event breaks seals and creates new cracks, increasing porosity and permeability. The porosity gain drives transient dilatancy strengthening and a local decrease in pore pressure. In parallel, Vp/Vs increases as compress- ible gas is expelled, and liquid reinfiltrates along the newly connected
pathways, enabling rapid pore- pressure equilibration. The increase in permeability shortens the hydraulic response time and breaks down the sealed conditions needed to sustain pore pressure retention, so tremor energy no longer tracks the tidal cycle, and the tremor- tide correlation collapses. Meanwhile, the M4 rupture and subsequent stress transfer trigger a transient swarm of microearthquakes.
Stage 3: Fluid infiltration and progressive sealing (Fig. 5D). Following a rupture that reopens pathways, hydrothermal circulation promotes heal- ing and mineral precipitation within the fracture network (7, 33). This chemical- mechanical sealing reduces permeability, progressively lower- ing hydraulic connectivity and increasing pore pressure, typically accom- panied by abundant small earthquakes. The system resets to Stage 1, as sealing isolates volatile- rich fluids and restores strong tidal coupling.
(
)
(
)
(1)
(3)
In this framework, earthquake rupture in the presence of fluid acts primarily by increasing permeability and reconnecting fracture path- ways. The observed breakdown in tremor- tide correlation thus marks a transient “valve- opening” event in which enhanced hydraulic connectiv- ity weakens tidal coupling (37, 40). At the laboratory scale, short- period pore- pressure oscillations reproducibly increase the permeability of fractured rock, producing steplike gains followed by gradual recovery toward the preperturbation state. This behavior is consistent with revers- ible unclogging of fracture pathways and provides a mechanistic link between dynamic stressing and transient hydraulic opening (41).
Global implications Our work recasts oceanic transform faults from conservative shear boundaries into active, tide-fluid-magma–coupled systems systems. The observed self- sealing cycles demonstrate that the energy budget on oce- anic transform faults is not solely a function of elastic strain accumula- tion or release but that it is also paced by the internal dynamics of volatile supply and permeability evolution modulated by periodic tidal loads and moderate earthquake ruptures. This paradigm is supported by growing global evidence of first- order magmatic control in transform domains. Two- stage crustal accretion, intratransform spreading centers, and pervasive magmatism provide the sustained volatile flux and geo- metric pathways that enable cyclic sealing, pressurization, and drainage (2, 4, 42, 43). Fault zone architecture, shaped by this magmatic- tectonic interplay, creates the necessary plumbing for the valve- like behavior.
We propose that the phenomenon of tremor- tide correlation and sealing- rupture cycles is not specific to Gofar but likely widespread, par- ticularly in settings with high slip rate and high volatile flux (44), such as the Marie Celeste Fracture Zone offsetting the Central Indian Ridge (45), the Garrett transform fault with intratransform volcanism (46), the Chain transform with a broad fluid- transporting fault zone (47), and other seg- ments of the Quebrada- Discovery- Gofar system (48). Transform segments near ridge- transform intersections, areas with faster spreading rates, or regions influenced by mantle hotspots should exhibit more pronounced tremor- tide correlation and more frequent valve- like resets. This observed tremor- tide correlation is similar to tidally modulated tremors in subduc- tion zones (11) and the deep San Andreas fault zone (8) as well as tidal modulation of slow slip in Cascadia (49), suggesting that analogous tide- sensitive behaviors may emerge in other tectonic settings when faults approach near- critical, fluid- pressurized conditions. The diagnostic fin- gerprints—synchronized transitions in tremor- tide correlation, microseis- micity rate, and Vp/Vs—provide a template for identifying and quantifying these dynamic processes and potential hazard at oceanic transform faults.
Materials and methods Data RMS time series and tidal correlation calculation We used continuous waveforms recorded on 33 three- component broad- band OBS stations (Fig. 1B) around G3 for the period of 2020- 08- 01 to 2020- 12- 31, which is a subset of an OBS seismic experiment consisting of 94 stations deployed across the Gofar during 2019–2022 (Fig. 1A) (25). Data preprocessing followed standard procedures: we de- meaned and
de- trended the traces, removed instrument responses using the network inventory, and converted the waveform amplitudes to ground velocities (in μm/s). For each selected station, we bandpass- filtered the continuous velocity waveforms to the 2- 8 Hz frequency band and computed the RMS time series using a 60 s sliding window with a 30 s step. We com- puted amplitude spectra of the RMS time series with a Hanning- window periodogram, converted the frequencies to periods (hours), restricted the display to 10- 30 h, and normalized by the peak amplitude (Fig. 3). To minimize contamination from local earthquakes, we masked time windows from 10 s before to 40 s after the earthquake origin time using our relocated earthquake catalog.
εML
εML
εML
Following the tidal calculation framework described in (29), the total tidal volume strain in the study area includes three components: body tide (or solid Earth tide), regional ocean- mass loading, and direct load- ing from the overlying water column. Positive strain denotes dilatation.
We first used SPOTL (50) to calculate the horizontal strain compo- nents induced by body tide, εBT
εBT
εBT
εBT
yy . This software assumes an elastic, spherical Earth and computes tidal strain directly from the positions of the Moon and Sun. Under the plane- stress assumption, the vertical strain was then recovered from the horizontal strain com- ponents as
yy
yy
We used a Poisson’s ratio v of 0.23, corresponding to Vp = 5.4 km/s, Vs = 3.2 km/s , and ρ = 2800 kg/m3 based on previous seismic tomog- raphy studies in this area (5). The volume strain associated with body tide was then calculated as
For the ocean- tide contribution, we first predicted tidal height varia- tions, h(t), for the eight principal short- period tidal constituents (K1, K2, M2, N2, O1, P1, Q1, and S2) using the global ocean tide model EOT11a (51). We then separated the ocean- tide effect into two parts. The first is the elastic loading response caused by regional ocean- mass redistribution. For this component, we used SPOTL with mass- loading Green’s functions to calculate the horizontal strain components, εML
xx
and εML
yy , and again recovered the vertical strain under the plane- stress assumption as
The corresponding volume strain from regional ocean- mass loading is
The second part is the direct pressure loading produced by local changes in the overlying water column. The resulting vertical normal stress at the seafloor is given by
σWL
where ρw = 1030 kg/m3 and g = 9.8 m/s2. The negative sign indicates that an increase in water column height corresponds to a larger com- pressive stress. Under the uniaxial- strain assumption, the horizontal strains satisfy εWL
xx = εWL
xx and εBT
zz = − ν 1 −ν
zz = − ν 1 −ν
xx +εBT
xx + εBT
v = εBT
yy + εBT
zz (2)
xx +εML
xx + εML
v = εML
yy + εML
zz (4)
zz = −ρwgh (5)
yy = 0, and the vertical strain is
Finally, we summed the body- tide, regional ocean- mass loading, and direct water- column loading contributions at each time step to obtain the total tidal volume strain time series:
εtotal
We bandpass- filtered the total tidal strain around the semidiurnal band and computed its unwrapped instantaneous phase. We then in- terpolated the tidal series at each RMS sampling time. For each station, we computed the mean RMS waveform value in each 0.5° phase bin, which is combined to form the array- mean RMS amplitude curve. We fitted the array- mean curve with a sinusoidal curve to measure the phase lag from the difference in peaks with the range −180° to 180°. In addi- tion, we quantified phase- folded similarity by computing the maximum Pearson correlation between the fitted sinusoidal curve and the M2 tidal curve over all circular phase shifts.
To assess the spatial correlation of tremor energy, we computed a pairwise correlation between stations with Welch's method (Hanning windows, 50% overlap) using a time segment length of 12.4 h to target the semidiurnal band. For each station pair, we calculated the average correlation over 2- 8 Hz. For all stations, a N × N correlation matrix is formed with N being the number of stations. The correlation matrices before and after 8 September 2020 show array- wide high correlation (CC
0.4) before rupture and a breakdown after rupture (fig. S9).
Tremor source location We located tremor sources using the waveform migration- based method with a semblance imaging condition, which is well suited for continuous, narrowband tremor signals (52). We first constructed a 3D grid over the study area with 0.2 km spacing in all directions, and computed predicted travel times from each grid node to each station using the same shear- wave velocity model as (5). For each grid node, we time- shifted the station RMS time series (three- component) by the predicted travel times and stacked them to compute the semblance. Within each sliding win- dow, we scanned the entire grid and took the node with the maximum semblance as the most likely source location.
We validated this waveform- migration method for 56 selected M3+ earthquakes. Earthquake waveforms were bandpass- filtered to 5- 10 Hz and a 2 s sliding window with a 0.2 s step was used to scan the first 8 s after the origin time. To enable a direct comparison between waveform- based and arrival time- based locations, we used only the stations in- cluded in the tomoDD relocation. For one example earthquake, the semblance values from waveform- migration based location method are well focused around the tomoDD location (fig. S2). Overall, the waveform- based locations agree with the arrival- based tomoDD locations, with the mean difference of ~1.5 km (fig. S3). However, there is a systematic shift with waveform- based locations are more slightly distributed to the north and deeper, which is due to that waveform- based location method only uses S waves and it gives the centroid locations instead of the initiation locations from arrival- based location method.
For the tremor- tide correlation interval, we scanned the processed RMS time series using a 6 s window with a 6 s step. For each window, we retained the top 2% of grid nodes by brightness and obtained cu- mulative hit count and cumulative brightness distribution by stacking results over all windows (fig. S4). The dominant tremor sources are con- centrated near the transform fault within ~4.5 km below the seafloor, slightly shallower than the earthquake distribution. To further evalu- ate the reliability of the located tremor source zone, we constructed random noise series at the same set of stations and repeated the same analysis as described above. In the absence of coherent sources, there is no focused energy (fig. S4). We also used the 2- hour RMS time series
εWL
v = εWL
zz (7)
v (t) = εBT
v (t) + εML
v (t) + εWL
v (t) (8)
in the tremor- tide correlation interval to the located its tremor source and the result is almost identical to that located by using all RMS time series (fig. S5), suggesting that tremor sources are stable and persistent during the tremor- tide correlation interval.
Seismic event detection for the OBS array data We followed the deep- learning- based AI–PAL workflow (53) to detect and locate earthquakes. We used the continuous data from 2020- 01- 01 to 2020- 12- 31 to generate region- specific high- quality labels. PAL used an STA/LTA energy trigger with STA windows of 0.35/0.12/0.12 s (detection/ P/S), LTA windows of 3/0.4/0.4 s, a trigger threshold of 12; an S- wave amplitude window of [1, 4] s; a minimum detection gap of 5 s; and a 5- 25 Hz band- pass. Association required more than 18 stations, origin- time deviation less than 0.6 s, and P- phase residual less than 0.8 s; loca- tions were obtained by grid search (0.01° lat/lon spacing with 10% lateral margin; depth 3.5- 20 km with 1 km spacing) with mean Vp=5.9 km/s and Vp/Vs=1.85. Manual screening yielded slightly >1000 high- quality earth- quakes for training (fig. S12A).
We then self- supervised a Self- Attention RNN (SAR/LoSAR) picker on these PAL labels (100 Hz sampling; three components; 10 s sliding win- dows with 4 s stride; 128 hidden units; 3 layers; 0.2 s step with 0.04 s stride; 1000 epochs; batch size 128). The trained model was applied to the continuous data from 2020- 08- 01 to 2020- 10- 01 and from 2020- 10- 01 to 2020- 12- 31, using a per- phase probability threshold 0.9; association by the PAL required more than 6 stations with origin- time deviation less than 0.6 s and P- residual less than 0.8 s. In total, we obtained 24,126 and 34,594 events for two time periods, respectively, forming a high- quality earth- quake catalog (fig. S12B).
Earthquake relocation by the double- difference location method We first used the HYPOINVERSE method (54) to obtain absolute loca- tions. The HYPOINVERSE method iteratively minimizes travel- time residuals, with phase weights adaptively set by epicentral distance and residual. The 1D P- wave velocity profile was extracted from a 3D P- wave velocity model (5); the corresponding 1D S- wave velocity model was derived by assuming Vp/Vs = 1.9 in the crust and Vp/Vs = 1.8 in the mantle with the Moho depth at 6.85 km.
We then refined the HYPOINVERSE locations with tomoDD (55). tomoDD jointly inverts velocity structure and event locations using both absolute and relative arrival times, which is an extension of the double- difference location method (56). Here we fixed the velocity model and solved for locations using the high- resolution 3D velocity structure con- structed for the Gofar G3 segment (5). We first removed outliers based on the travel time- distance curve, and constructed event- pair dif- ferential arrival times. Waveform cross correlation was also used to calculate more accurate differential arrival times. We started from the HYPOINVERSE locations, and relocated events using the three types of travel times by the tomoDD with the 3D velocity model fixed. A two- stage strategy was adopted: (i) optimize absolute locations by having higher weights on absolute travel times; (ii) increase the weights on differential catalog arrival times and cross- correlation times to sharpen relative event locations. Events spuriously located in the water were removed using seafloor bathymetry. In total, we obtained 20,426 events for the period of 2020- 08- 01 to 2020- 10- 01, with the final RMS travel time residual of 11.1 ms for waveform cross- correlation times, and 29,741 events for the period of 2020- 10- 01 to 2020- 12- 31, with the final RMS travel time residual of 9.7 ms for waveform cross- correlation times.
In situ Vp/Vs estimation We followed the method of (57) for the in situ Vp/Vs estimation. We defined five spatial anchors A0- A4 (fig. S13) and around each anchor we expanded a 3D neighborhood until we collected 80- 90 earthquakes for in- situ Vp/Vs estimation. For the selected events around each anchor, we built high- quality P and S differential travel times for event pairs. For each event pair (i, j) and station k, we measured differential P
Sϵ
Sϵ
l
Sϵ
Sϵ
and S arrival times ΔtP(k; i, j) and ΔtS(k; i, j) using waveform cross cor- relation, and retained measurements with waveform cross- correlation coefficient cc ≥0.7. For each pair, ΔtP and ΔtS were then demeaned across stations (subtracting the station- mean for that pair) to remove pair- specific timing offsets and common terms. The resulting demeaned differentials from all qualified pairs at a given anchor were pooled for Vp/Vs estimation. Outliers were suppressed with a density filter in the (ΔtP, ΔtS) domain (DBSCAN, eps ≈ 0.03 s, min_samples ≈ 20).
) p
dp
dt
)
A V
dp
dε
dp
We estimated Vp/Vs by fitting (57),
) = −αdεv
using robust least squares inversion with multi- round 2σ clipping. In practice, we repeatedly linear fit by minimizing orthogonal misfit and removing points with orthogonal residuals > 2σ; the final slope b is taken as in situ Vp/Vs for the event cluster around each anchor. We computed a 95% confidence interval (CI) for b by performing an or- thogonal distance regression (ODR) on the final line and using the ODR slope standard error SÊb:
Repeating this procedure through time intervals yields the Vp/Vs series in Fig. 4B.
Estimation of pore pressure response to tidal forcing Following (35), pore- pressure evolution in a poroelastic medium satisfies
) Here, p is pore pressure, εv is volum- strain, α = 1 −K∕Ks is the Biot coefficient with K drained- frame bulk modulus and Ks solid bulk modulus; Sϵ = α2∕(Ku −K) is the con- strained storage compressibility with Ku undrained bulk modulus, k is permeability, μ is dynamic viscosity, and p0 is hydrostatic pressure.
μ
with Darcy flux q = −k
Integrating Eq. 11 over a representative volume V and applying the divergence theorem yields,
where overbars denote volume averages and n is the outward normal. We parameterize net drainage to an external reservoir at pressure p0 by a thin- layer Darcy approximation across a characteristic length ℓ:
V ∮)V
1 V )V
where A is the effective draining area and ν ≡V
(12)
∕A absorbs geometry. Substituting into Eq. 12 gives
Decompose p(t) = p0 + p (t) and εv(t) = ε0 + ε
Finally, under the approximations of a nearly incompressible frame such that constrained storage is fluid- dominated, Sϵ ≃ϕCw (with Cw ≡1∕Kf the fluid compressibility, ϕ is porosity), α ≃1, then,
ΔtS = a + bΔtP (9)
̂b ± t0.975,n−2SÊb (10)
) t + ∇⋅q = −α ) εv
) t (11)
μ ∇(p−p0
(p−p0
(p−p0
q ⋅ndA = −αdεv
dt + 1
dt + 1
(p0 −p)≡k
q⋅ndA≈−k
𝓁
dt + k
μν
μν
dt + k Sϵμνp = −α
v dt (15)
(13)
dt (14)
v(t). Eq. 14 becomes
The parameter τ is the characteristic diffusion timescale for pore- pressure equilibration, which governs the amplitude of the response to periodic volume strain loading and the associated phase lag for a given permeability and storage capacity.
We use the predicted total tidal volume strain εtotal
v (t) as the external loading. We define ϕ(t) = ϕ0 + ϕ (t), where ϕ0 is the background porosity set to be 0.03 and ϕ (t) is the tidal porosity perturbation converted from volume strain using the Biot coefficient. For simplicity we take α = 1.0. Fluid properties are prescribed as a dynamic viscosity μ = 1.0 × 10−3 Pa s and a high pressure water compressibility Cw = 2.0 × 10−10 Pa−1. The geomet- ric factor v is set to 1 due to limited constraints, which mainly affects the absolute response amplitude and timescale but not the relative trends associated with the evolution of permeability k(t). These parameter ranges refer to previous studies of the Gofar transform fault (21).
To represent transient permeability enhancement by rupture and subsequent sealing/healing, we prescribe a time- dependent permeability k(t) that increases rapidly around E2 on 8 September 2020 (within 1 day) from kpre = 3.5 × 10−19 m2 to kpeak = 2.0 × 10−16 m2, followed by an exponential recovery toward the pre- event level, reaching a remaining fraction of 10−5 by the end of the modeled interval (fig. S18A). Results in fig. S18 show that during the tremor- tide correlation window, the pore pressure traces the M2 tidal signals with a cross- correlation coefficient of 0.97 and phase lag of −21°, consistent with the observed phase lag of - 21° (Fig. 3B). Because pore pressure responds through diffusion, it does not follow volume strain instantaneously. As the volume strain rate decreases, the response becomes more drainage- dominated and pore pressure recovers earlier, so pore pressure leads volume strain, producing a phase lag of −90° to 0° that is controlled by a characteristic diffusion timescale (τ); by contrast, the pore pressure response to the tidal loading is extremely low during the decorrelation interval because of the high permeability.
ReFeReNces aND NOtes
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transform fault”, Zenodo (2026); https://doi.org/10.5281/zenodo.19871387.
acKNOWleDGMeNts
We are grateful for constructive comments from two anonymous reviewers. We thank Y. J. Tan
for the discussion on the oceanic tidal calculation and the team (M. Boettcher, M. Behn,
W. Fan, J. Warren, J. McGuire, J. Collins, E. Roland, and Y. Liu) who made the Gofar transform
fault OBS data publicly available. Funding: This work was supported by the National Key
Research and Development Program of China under grant no. 2022YFF0800700 (H.Z.) and
the National Natural Science Foundation of China under grant no. 42488301 (H.Y.). Author
contributions: Supervision: H.Z.; Conceptualization: H.Z., H.Y., L.Y.; Methodology: H.Y., H.Z.;
Investigation: H.Y., H.Z.; Visualization: H.Y.; Writing – original draft: H.Y., H.Z.; Writing – review
& editing: H.Z., L.Y., H.Y. Competing interests: The authors declare that they have no
competing interests. Data, code, and materials availability: The waveform data used in this
study can be accessed through the IRIS Data Management Center (25). Earthquake locations
and necessary codes used in this study are available at Zenodo (60). All other data needed to
evaluate the conclusions in the paper are included in the paper or the supplementary
materials. No new samples or physical materials were collected or generated for this study.
License information: Copyright © 2026 the authors, some rights reserved; exclusive
licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original US
government works. https://www.science.org/about/science- licenses- journal- article- reuse
sUPPleMeNtaRY MateRials science.org/doi/10.1126/science.aed5665 Materials and Methods; Figs. S1 to S18
Submitted 1 November 2025; accepted 4 May 2026; published online 25 June 2026
Direct interaction of Vδ7 TCRs with IL17RA drives the differentiation of TH1- like γδT cells
V 7
IL17RA
TCRs
interaction
like
INTRODUCTION: In stark contrast to B cells and αβT cells, γδT cells are the only class of adaptive lymphocytes for which the principles of antigen recognition remain enigmatic. Although the nature of antigens recognized by γδT cells is largely elusive, multiple lines of evidence suggest that endogenous ligands stimulate γδT cell antigen receptors (γδTCRs) to drive the differentiation of effector γδT cell subsets. Although several such molecules have been identified, in most cases, the existence of these ligands remains speculative, and the majority of γδTCRs remain orphan receptors. Recently, several butyrophilin family members were shown to regulate large γδT cell subsets in a nonclonotypic manner, i.e., through interactions with germline- encoded sequences of Vγ chains. However it remained unclear whether this nonclonotypic mode of interaction is unique to butyrophilins or if it represents a more general mechanism shaping the γδT cell compartment.
RATIONALE: To study the recognition of endogenous ligands by γδTCRs, we assessed the reactivity of a panel of murine γδTCRs against cell lines representing various components of the thymic microenvironment and sought to identify ligands for them.
RESULTS: Multiple γδTCRs displayed strong reactivity to one or more of the cell lines, with distinct activation patterns that could not be explained by recognition of previously known γδTCR ligands. This indicated that a large fraction of γδT cells recognized a diverse set of unknown endogenous molecules that did not belong to previously known classes of γδTCR ligands. Using a cDNA library screen, we identified interleukin 17 receptor A (IL17RA), a proinflammatory cytokine receptor chain not previously implicated in γδTCR signaling,
Nonclonotypic interaction of Vδ7 TCRs with IL17RA drives the generation of a TH1- like γδT cell subset with a diverse CDR3 repertoire. Left: schematic representation of the IL17RA- Vδ7 γδTCR interaction. Middle, right: in wild- type but not Il17ra- deficient mice, interaction of Vδ7 γδTCRs with IL17RA drives the selection of a large subset of Vδ7+ γδT cells with a diverse CDR3 repertoire (depicted by different colors of CDR3 loops), induces a TH1- like effector program (including up- regulation of the transcription factor Tbet), and promotes IL17RA- dependent peripheral homeostatic proliferation of these cells.
Tbet
Tbet
Tbet
Tbet
Tbet
Selection of a large subset of V 7+
IL17RA-dependent peripheral
homeostatic proliferation
IL17RA is a ligand for murine V 7
Germline-encoded sequences in V 7
are the principal determinants of the
as a ligand for two of these TCRs. Further analysis revealed that a large population of γδT cells in mouse secondary lymphoid organs exhibited IL17RA reactivity. These IL17RA- reactive γδT cells had a highly diverse repertoire of CDR3 loops [junctions formed by V(D)J recombination] but invariably used Vδ7 in their TCRs. Further experiments demon- strated that whereas both CDR3 loops and Vγ chains could modulate IL17RA reactivity, germline- encoded sequences in Vδ7 were its principal determinants, indicating that IL17RA functions as a nonclonotypic ligand for Vδ7 γδTCRs. Analysis of Il17ra−/− mice showed that IL17RA was required for thymic selection, induction of an interferon γ– secreting T helper 1 (TH1)–like effector program, and peripheral homeostatic proliferation of Vδ7+ γδT cells.
CONCLUSION: Our results show that the development of a large TH1- like γδT cell subset found in mouse secondary lymphoid organs is driven by direct recognition of IL17RA by Vδ7 γδTCRs. Thus, beyond its role as a cytokine receptor, IL17RA has a second, previously unrecognized function in the immune system as a nonclonotypic TCR ligand. Together with the nonclonotypic mode of γδTCR engagement by butyrophilins, these results suggest that such interactions represent a more general biological principle underlying the organization of the γδT cell compart- ment than previously anticipated. Such selection on nonclonotypic ligands may have evolved as a mechanism to select and induce the functional maturation of large γδT cell subsets while ensuring high clonal diversity in the resulting effector populations.
Corresponding authors: Taras Kreslavsky (taras. kreslavskiy@ ki. se); Kewei Ye (kewei. ye@ ki. se) Cite this article as K. Ye et al., Science 393, eadx9264 (2026). DOI: 10.1126/science.adx9264
II17ra-deficient
Tbet Tbet
T cells with diverse CDR3 repertoire
Induction of TH1-like effector program
Strong reduction in V 7+ T cell
number
Residual V 7+ T cells remain naïve-
Full article and list of author affiliations: https://doi.org/10.1126/ science.adx9264
Direct interaction of Vδ7 TCRs with IL17RA drives the differentiation of TH1- like γδT cells
Kewei Ye1,2, Nimmy Francis1,2,3†, Josefine Dunst1,2†,
Amanda Borgenstam2,4‡, Iris Rocamonde- Lago2,4,5‡,
Stefanie Köhler6‡, Yuanyuan You1,2, Anatoly Dubnovitsky2,7,
Anja Kramer1,2, Fanxi Meng1,2, Valentin Zollner1,2, Lisa Vogg8,
Tomás J. Ryan9,10,11,12, Ken- ichi Hanada13, Tommy Regen14,
Ari Waisman14, Vivianne Malmström2,7, Erik Benson5,
Jan Kisielow15, Thomas Krey6,16,17,18,19, Thomas H. Winkler8,
Leo Hanke2,4, Taras Kreslavsky1,2
Of the three classes of lymphocytes that constitute the adaptive immune system, γδT cells are the only class for which the principles of antigen recognition remain enigmatic. Although endogenous γδT cell antigen receptor (γδTCR) ligands are thought to regulate γδT cell development, their identities are largely elusive. Here, we identified the interleukin 17 receptor A chain (Il17RA) as a γδTCR ligand that drove the differentiation of Vδ7+ γδT cells with a T helper 1 (TH1)–like effector program in mice. Il17RA promoted this differentiation through an interaction involving germline- encoded regions of the Vδ7 chain, enabling the selection of cells with a diverse CDR3 repertoire and thus acting as a nonclonotypic γδTCR ligand. Together with the nonclonotypic mode of γδTCR engagement by butyrophilins, these results suggest that such interactions represent a general biological mechanism shaping the γδT cell compartment.
Three lineages of lymphocytes, B cells, αβT cells, and γδT cells, con- stitute the adaptive immune system of jawed vertebrates. Although the antigen receptor specificities of B cells and αβT cells are well- understood, the principles of antigen recognition by γδT cells remain unclear and the nature of their antigens is largely elusive (1). Although γδT cell antigen receptors (γδTCRs) use a relatively limited set of variable (V) segments, they can exhibit extensive junctional diversity, generating a highly diverse antigen receptor repertoire (2). However, it remains unknown how this diverse repertoire is selected during thymic development of γδT cells. A large fraction of thymic γδT cells acquires effector programs and displays cell surface phenotypes char- acteristic of antigen- experienced cells (3, 4). These innate- like proper- ties suggest that many γδT cells undergo agonist selection upon interaction with endogenous γδTCR ligands. For most γδT cell sub- sets, the existence of such ligands remains hypothetical. Nevertheless, several endogenous γδTCR ligands and ligand candidates have been
1Division of Immunology and Respiratory Medicine, Department of Medicine Solna, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, Stockholm, Sweden. 2Center for Molecular Medicine,
Karolinska University Hospital, Stockholm, Sweden. 3Department of Pathology, University of Chicago, Chicago, IL, USA. 4Division of Infectious Diseases, Department of Medicine Solna,
Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, Stockholm, Sweden. 5Science for Life Laboratory (SciLifeLab), Department of Microbiology, Tumor and Cell Biology, Karolinska Institutet,
Stockholm, Sweden. 6Institute of Biochemistry, Center of Structural and Cell Biology in Medicine, University of Lübeck, Lübeck, Germany. 7Division of Rheumatology, Department of Medicine
Solna, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, Stockholm, Sweden. 8Division of Genetics, Department Biology, Friedrich- Alexander- Universität Erlangen- Nürnberg (FAU), Erlangen,
Germany. 9School of Biochemistry and Immunology, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland. 10Trinity College Institute of Neuroscience, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland. 11Florey Institute of
Neuroscience and Mental Health, Melbourne Brain Centre, University of Melbourne, Melbourne, Australia. 12Child & Brain Development Program, Canadian Institute for Advanced Research
(CIFAR), Toronto, Ontario, Canada. 13Surgery Branch, National Cancer Institute, National Institutes of Health, Rockville, MD, USA. 14Institute for Molecular Medicine and Research Center for
Immunotherapy (FZI), University Medical Center of the Johannes Gutenberg University of Mainz, Mainz, Germany. 15Repertoire Immune Medicines, Schlieren, Switzerland. 16Institute of Virology,
Hannover Medical School, Hannover, Germany. 17German Center for Infection Research (DZIF), partner site Hamburg- Lübeck- Borstel- Riems, Lübeck, Germany. 18Excellence Cluster 2155
RESIST, Hannover Medical School, Hannover, Germany. 19Centre for Structural Systems Biology (CSSB), Hamburg, Germany. *Corresponding author. E mail:
taras. kreslavskiy@ ki. se (T.K.); kewei. ye@ ki. se (K.Y.) †These authors contributed equally to this work. ‡These authors contributed equally to this work.
identified to date (1, 5). Although some of these ligands represent a collection of seemingly unrelated self- molecules (1, 5–8), members of the major histocompatibility complex (MHC) and butyrophilin fami- lies were recurrently identified as endogenous ligands for γδTCRs.
Reported MHC- related ligands and ligand candidates include MHC I and MHC I–like molecules (e.g., T10 and T22, Qa- 1, CD1b/c/d, and MR1), MHC II, as well as molecules more distantly related to MHC (e.g., ULBP4, MICA, and EPCR) (9–23). Recognition of these ligands usually involves the CDR3 loops of the TCR chains formed by V(D)J recombination. Although the functional role of these interactions in immune responses in many cases remains unclear, experiments with mouse γδT cells recognizing the MHC class Ib molecules T10 and T22 demonstrate that these ligands are involved in the thymic selection and induction of an interferon γ (IFNγ)–secreting T helper 1 (TH1)–like effector program of these cells (24, 25).
The second group of γδTCR ligands includes members of the butyr- ophilin family. These molecules regulate the differentiation, tissue localization, and activation of several large γδT cell subsets. In many cases, butyrophilin- related molecules engage γδTCRs through germline- encoded regions of their Vγ chains rather than through CDR3 loops generated by V(D)J recombination, thereby acting as nonclonotypic γδTCR ligands (26–34). This is in contrast to the clonotypic interactions that involve strong contributions from CDR3 regions. For example, the butyrophilin- related molecules Skint1 and Skint2 regulate the thymic selection and tissue homeostasis of the murine fetal wave of epidermal Vγ5Vδ1 γδT cells (26, 28, 35) [mouse Vγ nomenclature here and below according to (36)]. Similar to T10/T22- reactive γδT cells, the thymic expression of Skints induces a Th1- like phenotype in fetal Vγ5Vδ1 γδT cells (35), likely through the interaction of Skint1 with germline- encoded sequences in Vγ5 (37). Likewise, the interaction of Butyrophilin- like 1 (Btnl1)/Btnl6 and Btnl1/Btnl4 (BTNL3/BTNL8 in humans) expressed by intestinal epithelial cells with germline- encoded sequences in Vγ7 (Vγ4 in humans) induces the peripheral expansion and functional maturation of γδ intestinal intraepithelial lymphocytes (27–30). Finally, human Vγ9Vδ2 γδT cells are activated through an interaction that involves binding of BTN2A1 to the germline- encoded sequences in Vγ9, which is enabled by a conformation change induced by interaction of “phosphoantigens” with the intracellular part of BTN3A1 (30–33, 38, 39). Thus, nonclonotypic interactions of butyrophilin family members with germline- encoded sequences in Vγ chains can regulate thymic selec- tion, peripheral maturation, accumulation in specific tissues, and ac- tivation of γδT cell subsets using specific Vγ segments in their TCRs.
γδTCRs that are activated through nonclonotypic interactions with butyrophilin family members can also be triggered by additional clone- specific ligands in a CDR3- dependent manner (9, 30). It was suggested that such “dual reactivity” had evolved to enable both the nonclonal agonist selection of large γδT cell subsets and their subsequent clonal activation in the course of immune response (30).
To date, butyrophilin family members have remained the only known example of such nonclonotypic γδTCR ligands. Here, we identified in- terleukin 17 receptor A (IL17RA), a proinflammatory cytokine receptor chain not previously implicated in γδTCR signaling, as a nonclonotypic ligand for mouse Vδ7 γδTCRs that drove the differentiation of a TH1- like subset of γδT cells.
Results Widespread recognition of unknown endogenous ligands by murine γδTCRs To assess the extent to which γδTCRs recognize endogenous ligands, we cloned 55 murine γδTCRs– 31 TCRs from T cell hybridomas gener- ated from thymic γδT cells, five γδTCRs from major γδT cell subsets, and 19 TCRs from “effector” clusters of γδT cells from a single-cell RNA/VDJ- sequencing (scRNA/VDJ- seq) dataset of mouse splenic γδT cells (40) (table S1), and placed them into a retroviral vector as Tcrg- P2A- Tcrd cassettes. We expressed these γδTCRs in the TCR- negative T cell hybridoma line 16.2c11, carrying a nuclear factor of activated T cells (NFAT)–slow fluorescent timer (sFT) reporter for TCR signaling (41). We cocultured the TCR- expressing reporter cells with a panel of cell lines representing components of the thymic microenvironment. We identified 19 TCRs that reacted to at least one of these lines (Fig. 1A and table S1). Because many of these TCRs recognized different com- binations of the cell lines, we concluded that multiple distinct ligands were likely responsible for the observed reactivity patterns. However, many of these γδTCRs converged on a thymic lymphoma cell line BEKO and/or primary thymocytes (Fig. 1A and table S1).
RNA sequencing (RNA- seq) of BEKO cells did not detect expression of butyrophilin family members and showed little to no expression of genes encoding several known non- MHC I/butyrophilin–related γδTCR ligands (6, 7, 18, 22, 23), whereas several MHC I–related mol- ecules were highly expressed (fig. S1A). Because the surface expression of MHC I and related proteins depends on β2- microglobulin (B2m), we analyzed the reactivity of the γδTCRs to B2m–/– BEKO cells. Only one of 11 tested BEKO- reactive TCRs, TCR44, lost its reactivity in this setting (fig. S1B). Further analysis revealed that this TCR recognized previously known γδTCR ligands: the two closely related nonclassical MHC I molecules T10 and T22 (11, 42, 43) (fig. S1C). We concluded that many murine γδT cells recognized a diverse set of unidentified endog- enous molecules that were unlikely to belong to the known families of γδTCR ligands.
cDNA library screen identifies IL17RA as a ligand candidate for two Vδ7 γδTCRs To search for the putative γδTCR ligands, we generated a cDNA library from BEKO cells, transfected human embryonic kidney 293T (HEK293T) cells in a 96- well format with pools of ~200 cDNA- containing plasmids (~200 × 96 corresponding to ~19,200 clones per plate) and cocultured these feeder cells with the reporter cells expressing TCR55 (Fig. 1B). One cDNA pool strongly activated the reporter cells, and its serial dilution identified IL17RA as a candidate ligand for this TCR (Fig. 1C).
IL17RA was required and sufficient to induce signaling through this TCR, because Il17ra deletion in BEKO cells abrogated the reactivity (Fig. 1D), whereas coating of cell culture plastic with IL17RA protein was sufficient to induce TCR signaling in the absence of feeder cells (Fig. 1E). Assessment of the reactivity of 10 other γδTCRs demonstrated that IL17RA induced signaling through only one additional TCR, Vγ1Vδ7 TCR65 (Fig. 1F and fig. S1D), confirming that activation of the reporter by IL17RA was mediated by TCR signaling and that only some TCRs exhibited this reactivity.
Identification of IL17RA- reactive γδT cells in vivo We sought to use multimerized recombinant IL17RA as a staining reagent to detect IL17RA- reactive γδT cells. Binding of dual- strep- tagged IL17RA to streptavidin or further increasing the valency of the staining reagent by loading IL17RA on dextramers with 10 streptavidin molecules enabled staining of HEK293T cells cotransfected with TCR55- and CD3- encoding plasmids and overexpressing TCR55 at high levels. However, these re- agents failed to stain reporter cells that expressed the TCR at a lower, more physiological level (fig. S2A). Utilization of complexes containing thousands of streptactin molecules (44) for IL17RA multimerization en- abled staining of TCR55- expressing reporter cells, whereas no staining
Staining with IL17RA multimers detected a population of IL17RA multimer- binding γδT cells in lymph nodes (LNs) and spleen (Fig. 2A). TCR sequencing of single sorted IL17RA- binding γδT cells revealed that all 10 TCRδ chains from IL17RA- binding γδT cells, despite diverse CDR3 sequences, used Trav13- 4- dv7 (which encodes Vδ7) (Fig. 2B). Of the seven TCRs for which we also obtained paired Tcrg sequences, six used Vγ4 and one used Vγ1. Flow cytometric analysis confirmed that ~80% of IL17RA- binding γδT cells were Vγ4+ and the rest used Vγ1 (fig. S2B). Expression of these seven TCRs in the reporter cells conferred the reac- tivity to plate- bound IL17RA (Fig. 2C), demonstrating that the ex vivo staining of γδT cells with IL17RA multimers reflects their TCR specificity. We concluded that a population of γδT cells expressed TCRs reactive to IL17RA, and that this reactivity was compatible with diverse CDR3 se- quences and the use of at least two different Vγ chains, but appeared to be strictly associated with the utilization of Vδ7.
Most ex vivo Vγ4Vδ7 TCRs exhibit IL17RA reactivity To detect Vδ7- expressing cells in vivo, we established an RNA flow cy- tometry approach. Vδ7 RNA expression was mutually exclusive with anti- Vδ6.3 and anti- Vδ4 antibody staining (fig. S2C), and Vδ7+ cells con- stituted ~18% of splenic γδT cells, with ~77% of Vδ7- expressing cells using Vγ4 in their TCRs (fig. S2C). We therefore investigated how prevalent the IL17RA reactivity was among Vγ4Vδ7 γδT cells. All 15 Vγ4Vδ7 TCRs randomly selected from a scRNA/VDJ- seq dataset of splenic γδT cells (40), despite their diverse CDR3 sequences (Fig. 2D), exhibited a variable degree of IL17RA- reactivity (Fig. 2E). Signaling through Vγ4Vδ7 TCR21 and TCR33 from our initial collection (table S1) was also moderately but clearly activated by IL17RA (fig. S2D).
Because ~13% of splenic γδT cells used Vγ4Vδ7 TCRs (fig. S2C) and all tested Vγ4Vδ7 TCRs exhibited IL17RA reactivity (Fig. 2E) but only 1 to 3% of ex vivo γδT cells were stained with IL17RA multimers (Fig. 2A), we assessed whether different Vγ4Vδ7 TCRs bind IL17RA multimers with different efficiency. Indeed, reporter cells expressing a panel of Vγ4Vδ7 TCRs with confirmed IL17RA reactivity exhibited variable IL17RA multimer binding, and some TCRs failed to bind IL17RA at all (Fig. 2F and fig. S3A). Nevertheless, when TCRs were overexpressed to higher levels in HEK293T cells, all of these Vγ4Vδ7 TCRs, but not a con- trol Vγ4Vδ10 G8 TCR (43), were able to bind the multimerized IL17RA (fig. S3B). We tested the reactivity of these Vγ4Vδ7 TCRs to plastic coated with a suboptimal concentration of IL17RA (Fig. 2F and fig. S3A) and found that the staining efficiency positively correlated with the TCR reactivity (Fig. 2G). This suggested that the IL17RA multimer stain- ing preferentially detected cells with higher- affinity TCRs and therefore might have underestimated the number of IL17RA- reactive γδT cells. We concluded that most γδT cells using Vγ4 and Vδ7, one of the most fre- quent γ/δ chain pairings in the mouse γδTCR repertoire, exhibited IL17RA reactivity.
Germline- encoded sequences in Vδ7 are the principal determinants of IL17RA reactivity We aimed to determine the importance of Vγ and Vδ for IL17RA reac- tivity. To assess the contribution of Vγ, we replaced the original Vγ4- Jγ1- Cγ1 chain of TCR55 with all possible γ chains from other TCRs in our collection. Vγ2Vδ7 chimeric TCR failed to be expressed on the cell surface (fig. S4A), whereas the other chimeric TCRs exhibited compa- rable levels of cell surface expression and signaled in response to anti- CD3 cross- linking (fig. S4B). All of the chimeric TCRs also exhibited IL17RA binding and reactivity, albeit to varying extents (Fig. 3A). Because Trav13- 4- dv7 (encoding Vδ7) is also used in Tcra rearrangements, we assessed IL17RA reactivity of three αβTCRs using this Trav [identi- fied in public scVDJ- seq datasets (45, 46)]. None of these αβTCRs was activated by IL17RA (fig. S4C). We concluded that Trav13- 4- dv7 utilization conferred IL17RA reactivity to γδ but not αβ TCRs, and this
E
Thymic fibroblasts
B
C
F
TST4
TCR15 V 7V 4
TCR15 V 7V 4
TCR55 V 4V 7
TCR55 V 4V 7
TCR55 V 4V 7
TCR55 V 4V 7
TCR44 V 4V 5
TCR53 V 7V 6 12
TCR22 V 7V 6.3
sFT-blue (Recent TCR signaling)
sFT-blue
G
sFT-blue
sFT-blue
sFT-blue
DTN40 V 1V 6.4
D
TCR65 V 1V 7
103 104
103104 0
sFT-red
cells
BEKO
Generate cDNA library from BEKO cells
% Induction NFAT-reporter
Pools (200 cDNA) Subpools of E5 (20 cDNA) Individual cDNA from 4 & 14
4 14
E5
0 20 40 60 80 0
Pools Subpools Single clones
Il17ra
Il17ra–/– BEKO WT BEKO
Il17ra
104 105 0 sFT-red
104 105 0 sFT-red
104 105 0 sFT-red
104 105 0 sFT-red
TCR53 V 7V 6 12 TCR22 V 7V 6.3 TCR55 V 4V 7
Primary cells
Unstimulated
Co-culture
Unstimulated
Unstimulated
Co-culture
Fig. 1. Identification of IL17RA as a candidate ligand for two Vδ7 γδTCRs. (A) Indicated γδTCRs were expressed in NFAT- slow fluorescent timer (sFT) 16.2c11 reporter cells. The reporter cells were cocultured with a panel of primary cells and cell lines representing various components of the thymic microenvironment and analyzed by flow cytometry. Activation of TCR signaling induces expression of the sFT reporter and this protein shifts its fluorescence from blue to red over time. sFT reporter signal in reporter cells upon coculture is shown as red contours; black contours indicate unstimulated controls (the same unstimulated control can be shown for several cocultures). Plots with a change in
Thymic lymphoma
Thymic epithelial cells
MVEC B3
cTEC 1.2 mTEC 3.10 Thymocytes
Transfect HEK293T cells with pools of 200 cDNAs
...
pool x
pool 3
pool 3
pool 2
pool 2
pool 1
0 5 10 15 20 0
DTN40 V 1V 6.4 TCR65 V 1V 7
1B1 V 4V 6.3
T cell lymphoma
EL4
LN cells
Iterative cocultures with TCR + reporter cells
pool 1 pool x ...
0 10 20 30 40 0
Control TCR V 4V 10
Recombinant IL17RA
Control Il17ra
Control TCR V 4V 5
CD3
104105 0 IL17RA multimer
Empty vector
median fluorescent intensity (ΔMFI) of sFT- blue (between coculture and unstimulated control) ≥300 are highlighted with green boxes. Here and below, reporter induction was assessed by gating on TCRγδ+ cells as shown in fig. S18A. Representative results of two independent experiments are shown. (B) Design of the cDNA library screening experiment for γδTCR ligand identification. (C) Screening of cDNA library from BEKO thymic lymphoma cells with TCR55- expressing reporter cells identified IL17RA as a candidate ligand of TCR55. Data points represent frequencies of sFT- Blue+ of TCR55- expressing reporter cells cocultured with HEK293T cells transfected with the indicated cDNA library plasmid pools (left and center) or individual cDNA clones (right). (D) TCR55- expressing reporter cells were cocultured with WT or Il17ra–/– BEKO cells. The up- regulation of the sFT reporter was measured by flow cytometry. Representative results of three independent experiments are shown. (E) TCR55- or control Vγ4Vδ10 TCR [G8 TCR (43)]–expressing reporter cells were cultured in wells coated with recombinant IL17RA or left uncoated. The up- regulation of the sFT reporter was measured by flow cytometry. Representative results of at least five independent experiments are shown. (F) Assessment of the reactivity of 16.2c11 NFAT- sFT reporter cells expressing the indicated γδTCRs to HEK293T cells transfected with plasmid DNA encoding Il17ra or with empty vector. Representative results of two independent experiments are shown. (G) A mixture of 16.2c11 TCR– cells and 16.2c11 expressing TCR55 or a control γδTCR (Vγ4Vδ5 TCR44) was stained with streptactin multimers loaded with recombinant strep- tagged IL17RA. PE- conjugated anti- streptavidin antibody was used to detect IL17RA multimer–binding cells. The frequency of Il17RA multimer–binding cells from the TCR- expressing population was quantified. Multimer binding was assessed by gating on TCRγδ+ cells as shown in fig. S18B. Representative results of at least five independent experiments are shown.
reactivity was compatible with all tested Vγ segments, but that Vγ usage (and/or CDR3γ sequences) could modulate its strength.
To begin mapping the regions of Vδ7 responsible for this reactivity, we generated a panel of TCR55 chimeras incorporating sequences from Vδ10, the closest Vδ7 paralog among mouse Vδ segments that is not reac- tive to IL17RA (fig. S5A), covering all predicted solvent- exposed amino acid differences between Vδ7 and Vδ10 (Fig. 3B). Although all chimeric TCRs exhibited normal surface expression when cotransfected with CD3 into HEK293T cells, three lost the ability to bind IL17RA multimers and one exhibited markedly reduced binding (Fig. 3C). Analysis of all pos- sible single amino acid mutants derived from these four non- and low- binding chimeras identified six substitutions (R31S, Y36R, P50A, H55E, T60K, and T62A) that individually abrogated IL17RA binding and reac- tivity, and one (T56N) that strongly attenuated the interaction (Fig. 3D and fig. S5B). When the corresponding amino acids were mapped to a modeled structure of TCR55, most of them clustered around the same area on the Vδ7 surface (Fig. 3E and fig. S5C), suggesting a possible IL17RA interaction site.
The observation that different Vγ4Vδ7 TCRs exhibited different IL17RA binding and reactivity (Fig. 2, D to G) indicated that the variable CDR3 loops modulated the strength of IL17RA recognition. To determine whether CDR3δ, CDR3γ, or both, is involved in this modulation, we gener- ated chimeric TCRs by exchanging γ and δ chains between TCR55 and “Binder3” TCR (from an IL17RA multimer- binding γδT cell; Fig. 2, B and C) and assessed the reactivity of the two parental TCRs and two chimeras to plastic coated with a range of IL17RA concentrations. At suboptimal IL17RA concentrations, all TCRs showed distinct reactivity strength that decreased in the following order: (1) Vγ4Binder3Vδ7TCR55 chimera, (2) Binder3 TCR, (3) TCR55, and (4) Vγ4TCR55Vδ7Binder3 chimera (fig. S5D). Consistent with this hierarchy of reactivities, the Vγ4Binder3Vδ7TCR55 TCR required the lowest level of overexpression on HEK293T cells to achieve detectable IL17RA- streptavidin binding, followed by the Binder3 TCR and then TCR55 (fig. S5E). We concluded that both CDR3δ and CDR3γ loops could modulate the IL17RA reactivity of Vγ4Vδ7 TCRs.
Although additional structural studies will be required to map the actual interaction interface between IL17RA and the Vδ7 TCRs, our results suggested that IL17RA recognition is primarily determined by germline- encoded regions of Vδ7, tolerates a diverse repertoire of CDR3 sequences, and is modulated by both CDR3 loop sequence and Vγ usage.
Surface plasmon resonance analysis confirms direct interaction between Vγ4Vδ7 TCR and IL17RA To determine whether a direct interaction between a Vγ4Vδ7 TCR and IL17RA can take place in a cell- free environment, we produced soluble recombinant Vγ4Binder3Vδ7TCR55 chimeric TCR (fig. S6A) and used it as an analyte in surface plasmon resonance experiments. Vγ4Binder3Vδ7TCR55 TCR bound immobilized mouse IL17RA with an equilibrium constant (KD) in the low- micromolar range but showed no binding to human IL17RA (which did not activate signaling of a mouse Vγ4Vδ7 TCR; Fig. 3F and fig. S6B). The binding data were well described by a 1:1 kinetic model, with
good fits to the sensorgrams. However, because the analyte saturation was not achieved, the maximum analyte binding capacity of the surface (Rmax) could not be determined accurately, limiting the precision of the KD esti- mate. Because we used a higher- affinity chimeric TCR, the resulting esti- mate likely reflects affinity at (or above) the upper end of the physiological range of Vδ7 TCR affinities for IL17RA. We concluded that Vγ4Vδ7 TCR was able to interact with IL17RA directly in the absence of any auxil- iary components.
The membrane- proximal D2 domain of IL17RA mediates the activation of Vδ7 TCR signaling We investigated which parts of IL17 receptor mediated the interaction with the Vδ7 TCR. Because IL17RA, IL17RB, IL17RC, IL17RD, and IL17RE are all distant paralogs, we assessed whether other IL17R chains might activate Vδ7 TCR signaling or affect the reactivity of these TCRs to IL17RA. However, these chains neither activated TCR55 signaling alone nor enhanced reactivity when coexpressed with IL17RA (fig. S7A). We also tested whether IL17 cytokines affected the IL17RA- TCR interaction. Preincubation of multimerized IL17RA with an equimolar amount of IL17A blocked binding of IL17RA multimers to TCR55- expressing cells (fig. S7B), suggesting that IL17RA interactions with IL17A and Vδ7 TCRs were mutually exclusive. Finally, complete removal of one of the two IL17RA extracellular domains, the membrane- distal D1 domain, did not affect the reactivity (fig. S7C), indicating that the remaining membrane- proximal D2 domain was sufficient to activate Vδ7 TCR signaling.
Expression of an IL17RA- reactive γδTCR instructs acquisition of a Th1- like molecular program To characterize the phenotype of IL17RA- reactive Vδ7 γδT cells, we assessed the distribution and properties of Vγ4Vδ7 cells in several scRNA/VDJ- seq datasets of γδT cells (40, 47, 48). Vγ4Vδ7 γδT cells were predominantly found in the spleen, liver, LNs, and, as recently reported (48), in lungs, whereas they were scarce in the small intestine (Fig. 4A and fig. S8, A and B). Most Vγ4Vδ7 γδT cells were found among cells expressing Tbx21 (encodes transcription factor Tbet), Ifng, and other genes indicative of a Th1- like phenotype, including Cd27, Il2rb (encodes CD122), and Ly6c2 (49–51), with the latter two markers most accurately defining the Th1- like population (Fig. 4A and fig. S8, A to C). Indeed, most ex vivo total Vδ7+, Vγ4+Vδ7+, as well as IL17RA- binding γδT cells were CD122+Ly6C+Tbet+ and sorted IL17RA- binding γδT cells pro- duced IFNγ upon stimulation (Fig. 4, B to E). CD122 and Tbet were correlated in expression both in total and IL17RA- binding γδT cells (fig. S8D), consistent with reports that Tbet regulates Il2rb expression (52, 53). Finally, gating on Th1- like γδT cells (Tbet+) revealed that Vδ7+ cells constituted ~37% of this population (and ~1.2% of total Tbet+ T cells) in the LNs (fig. S8E).
To determine whether expression of a Vγ4Vδ7 γδTCR was sufficient to drive acquisition of this Th1- like effector program, we generated a Vγ4Vδ7 TCR transgenic (Tg) mouse line. To this end, we knocked in a cassette encoding the TCRγ(full- length)- P2A- TCRδ(VDJ only) of Binder3
S
LN Spleen Single cell index sort of IL17RA-multimer+ T cells
ND
ND
ND
D
D
G
F
3.04 1.06
TCR
TCR
TCR
104105 0 IL17RA multimer
C
TCRs from sorted IL17RA-multimer+ T cells
TCRs from sorted IL17RA-multimer+ T cells
D
CDR3 CDR3
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
V 4
LG
LG
CSY
CS
CS
Y
CS
Y
SY
TCR55
SSG
SSG
SSG
SSG
SSG
SSG
SSG
SSG
SG
SSG
SSG
SSG
SG
SSG
SSG
SSG
SSG
SSG
SG
SSG
SSG
SSG
SSG
V 1
V 1
LRS
CAVW
CA
CAVW
CA
CA
CA
CA
TCR65
GTS
GTS
Binder 1
PY
CSYG
CSYG
CSYG
CSYG
CSYG
CSYG
CSYG
CSYG
CSYG
CSYG
CSYG
CSYG
CSYG
CSYG
CSYG
CSYG
CSYG
CSYG
Binder 2
Binder 3
QG
Binder 4
IY
Binder 5
AG
Binder 6
YGD
Binder 7
Binder 8
Binder 9
Binder 10
V 7
V 7
V 7
V 7
V 7
V 7
V 7
V 7
V 7
V 7
V 7
V 7
15 randomly selected V 4V 7 TCRs
15 randomly selected V 4V 7 TCRs
V 7
V 7
V 7
V 7
V 7
V 7
V 7
V 7
LY
V 7
V 7
V 7
V 7
V 7
V 7
V 7
EKRDG
RD
QY
RY
RY
GG
PE
KGGY
Control TCR TCR957 TCR987 TCR1019 TCR1487 TCR2633 TCR3297
TCR1019 TCR1487
Control TCR TCR957 TCR987 TCR1019 TCR1487 TCR2633 TCR3297
91 37 62 4 16 0.2
104 0 IL17RA multimer
103 105
Stimulation with low amount of recombinant IL17RA
Reactivity
Reactivity
103 104
103 104
sFT-blue
sFT-blue
sFT-blue
69 64 50 33 21 8 4
104 0 sFT-red
104 0 sFT-red
Assessment of IL17RA reactivity
reporter cells
Binding
Fig. 2. IL17RA reactivity of ex vivo Vδ7 TCRs. (A) Staining of splenic and LN γδT cells with IL17RA- loaded multimers (as in Fig. 1G) and experimental schematics of the assessment of IL17RA reactivity of TCRs cloned from IL17RA- binding γδT cells. Representative gating strategy is shown in fig. S18C. (B) Vγ/Vδ utilization and CDR3 sequences of TCR55, TCR65, and TCRs sequenced from single ex vivo IL17RA- binding γδT cells (designated as “Binder 1- 10”). ND, not determined. (C) Binder 1 to 7 γδTCRs from (B) were produced by gene synthesis, expressed in 16.2c11 NFAT- sFT reporter cells, and their reactivity to recombinant IL17RA was assessed. A Vγ4Vδ4 TCR1128 was used as a negative
PLYRREA
CAM
CAM
CAM
CAM
CAM
CAM
CAM
CAM
CAM
CAM
CAM
CAM
CAM
CAM
CAM
PPHGIRGIRA
PYRRDTSWD
CAI
CAI
CAI
CAI
CAI
PGGIRA
GCPLGRRDRA
PYLPIGGIRA
VSGGIRAAPA
HMAYLGYEA
SYRRDTSFG
TKIGGTA
SYMAYLYRRDTT
IWHNIGGING
RIRA
VYRRGA
PHMAPSEGYA
WRNIGGIRA
PIYVGGIRA
DAAYDRRDTR
DYMAYLGGIRA
PGGIRS
GYMAYIGGIRA
KSEGYELA
GHIGGIP
RRDRG
KYGRDTR
RPRA
CAME
GGRRATRG
CAMEL
IL17RA multimer staining
sequencing
TDKLVF
TDKLVF
DKLVF
TDKLVF
DKLVF
TDKLVF
TDKLVF
TDKLVF
TDKLVF
TDKLVF
TDKLVF
DKLVF
TDKLVF
TDKLVF
TDKLVF
TDKLVF
TDKLVF
LVF
TDKLVF
DKLVF
TDKLVF
TDKLVF
TDKLVF
DKLVF
TDKLVF
TDKLVF
TDKLVF
Control TCR Binder 1 Binder 2 Binder 3
Binder 4 Binder 5 Binder 6 Binder 7
104 105 0 sFT-red
Control TCR TCR957 TCR974 TCR987 TCR1019 TCR1041
TCR1059 TCR1063 TCR1211 TCR1260 TCR1362 TCR1479
TCR1487 TCR2633 TCR2680 TCR3297
Unstimulated Recombinant IL17RA
Unstimulated Recombinant IL17RA
stimulated with low amount of IL17RA
% activated of TCR+ reporter cells
R = 0.8070 p = 0.0002
TCR974 TCR1362 TCR2680 TCR1260
TCR3297 Control TCR
0 50 100 0
% IL17RA-multimer+ of TCR+
TCR1211 TCR1041
TCR987 TCR1063
control. Here and below, reporter induction was assessed by gating on TCRγδ+ cells as shown in fig. S18A. Representative results of two independent experiments are shown.
(D to G) 15 Vγ4Vδ7 TCRs were randomly selected from the scRNA/VDJ- seq dataset of splenic WT γδT cells (40) (D), produced by gene synthesis, expressed in 16.2c11 NFAT- sFT
reporter cells, and their reactivity to recombinant IL17RA was assessed (E). Vγ4Vδ10 TCR G8 was used as a negative control. (F) Top: IL17RA multimer staining of reporter cells
expressing the indicated IL17RA- reactive Vγ4Vδ7 TCRs. Bottom: induction of TCR signaling of the same TCR- expressing reporter cells when stimulated by coating with a lower
amount [2 μg/ml instead of 8 μg/ml used in (E)] of recombinant IL17RA (lower panels). Vγ4Vδ10 TCR G8 was used as a negative control. (G) Correlation between frequency of
IL17RA multimer- stained cells and frequency of sFT- blue+ of TCR+ reporter cells when stimulated with 2 μg/ml recombinant IL17RA for 15 IL17RA- reactive Vγ4Vδ7 TCRs listed in
(D). Pearson correlation coefficient and the P value from a two- sided test are shown. The black line indicates simple linear regression, and the gray area between dotted curves
indicates 95% CI. Representative results of three (E) or two [(F) and (G)] independent experiments are shown.
Vγ4Vδ7 TCR (from an IL17RA multimer- binding γδT cell; Fig. 2B) into the Tcrd locus in such a way that it mimicked the rearranged configura- tion of the locus and the TCRδ VDJ cassette could be spliced to the endogenous Cδ exons (fig. S9A). In TcrdBinder3/+ mice, the accumulation of Vγ4 γδT cells was already evident among CD4/CD8 double- negative thymocytes (fig. S9B). In the periphery, about half of the splenic T cells were positive for the Tg TCR (Fig. 4F), which was expressed at near- physiological levels (fig. S9C), and most of these TCR Tg γδ splenocytes acquired a CD122+Ly6C+Tbet+ Th1- like phenotype (Fig. 4F). We con- cluded that most of Vγ4Vδ7 γδT cells, a population that exhibits IL17RA reactivity, acquired a Th1- like phenotype in vivo, and that Tg expression of a Vγ4Vδ7 γδTCR was sufficient to instruct the acquisition of this ef- fector program by most γδT cells.
IL17RA regulates the abundance and functional maturation of Vδ7 γδT cells To determine whether IL17RA expression regulated IL17RA- reactive γδT cells in vivo, we compared γδT cells in wild- type (WT) and Il17ra–/– mice. The frequency and absolute numbers of IL17RA- binding γδT cells were strongly reduced in the spleens and LNs of Il17ra–/– mice (Fig. 5A and fig. S10A). Because we observed an expansion of CD27–CCR6+ γδT cells [likely fetal- derived Th17- like cells (54)] in both WT and Il17ra–/– mice in one of the three animal facilities used in this study, and because it was more pronounced in some of the IL17RA- deficient animals (fig. S10B), we aimed to ensure that this expansion did not influence our analysis. To exclude the possibility that the proportional decrease in the IL17RA- binding cells could reflect their “dilution” by this expanded subset, we quantified the frequency of IL17RA multimer- binding cells among CD27+ γδT cells. The IL17RA- reactive γδT cells were strongly decreased even within the CD27+ compartment (fig. S10C). The decrease in IL17RA- reactive γδT cells was not restricted to the higher- affinity cells that could be stained with IL17RA multimers, because the frequency of the total Vδ7+ cells was likewise decreased in the spleen (Fig. 5B) and LNs (fig. S10D). The few remaining IL17RA multimer- binding γδT cells in Il17ra–/– mice predominantly used Vδ7 in their TCRs (fig. S11A), and expression of such TCRs (but not the few contaminating non- Vδ7 TCRs) in reporter cells conferred IL17RA reactivity (fig. S11, B and C), indicating that a small number of IL17RA- reactive γδT cells could develop in the absence of IL17RA. γδT cell numbers were also strongly decreased in Il17ra–/–TcrdBinder3/+ mice compared with their Il17ra+/+TcrdBinder3/+ counterparts (Fig. 5C). The reduction in IL17RA- reactive γδT cells in Il17ra–/– mice was not due to impaired IL17A/F sensing, because Il17a–/–
Il17f–/– mice did not exhibit any decrease in total Vδ7+ and IL17RA- binding cells (Fig. 5, A and B, and fig. S10, A and D).
The lack of exposure to IL17RA also affected the effector phenotype of the few remaining IL17RA- reactive γδT cells, because in contrast to the control mice, most of both total Vδ7+ and IL17RA- binding γδT cells in Il17ra–/– mice failed to up- regulate CD122 and Ly6C (Fig. 5, A and B, and fig. S10, A and D). We did not observe a decrease in cell numbers or loss of this Th1- like cell surface phenotype in Vδ7− γδT cell popula- tions in IL17RA- deficient mice (fig. S12, A to C). The residual γδT cells in Il17ra–/–TcrdBinder3/+ mice also largely lost their Th1- like phenotype (Fig. 5C). Both non- TCR Tg IL17RA- binding γδT cells and TcrdBinder3 γδT cells from IL17RA- deficient animals failed to up- regulate Tbet (Fig. 5, C and D) and did not produce IFNγ upon phorbol 12- myristate
13- acetate (PMA)/ionomycin stimulation (Fig. 5, C and E), in contrast to their WT counterparts. However, unlike observations made for other γδT cell subsets (25, 35), lack of ligand exposure did not lead to acquisi- tion of a TH17- like effector program by IL17RA- reactive γδT cells (Fig. 5, D and E). In fact, Il17ra–/–TcrdBinder3 γδT cells were prone to acquiring TH1- like properties after several days of in vitro activation under non- polarizing or even TH17- polarizing conditions (fig. S13).
Stratification of the total polyclonal Vδ7+ and IL17RA- binding γδT cells based on their Vγ chain usage revealed a difference between the Vγ1+ and Vγ4+ subsets. Although both populations in the Il17ra–/– mice lost their CD122+Ly6C+ TH1- like effector phenotype, only the numbers of Vγ4+ IL17RA- reactive γδT cells were strongly decreased in the knock- outs (Fig. 5B and figs. S10D and S14, A to C).
We concluded that IL17RA was required for both the accumulation and effector differentiation of IL17RA- reactive γδT cells.
In vivo exposure to IL17RA sets a higher TCR activation threshold and is required for homeostatic proliferation of IL17RA- reactive γδT cells We investigated whether peripheral Vδ7 γδT cells remained responsive to IL17RA. Il17ra+/+TcrdBinder3 cells up- regulated the activation mark- ers CD69 and CD25 upon in vitro stimulation with IL17RA and anti- CD3, but these responses were markedly attenuated compared with Il17ra–/–TcrdBinder3 cells (fig. S15A). Moreover, whereas Il17ra–/–TcrdBinder3 γδT cells up- regulated activation markers in response to WT (but not Il17ra–/–) splenocytes and thymocytes, with thymocytes inducing a stronger response (fig. S15B), Il17ra+/+TcrdBinder3 γδT cells induced low levels of CD69 only in response to WT thymocytes (fig. S15B). These results suggested that in vivo IL17RA exposure raised the TCR signal- ing activation threshold, yet IL17RA- reactive γδT cells from IL17RA- sufficient mice still could sense physiological IL17RA levels.
To assess the possible role of this IL17RA recognition by mature IL17RA- reactive γδT cells in vivo, we transferred CellTrace Violet–labeled Il17ra+/+TcrdBinder3 γδT cells into WT or Il17ra–/– recipients. Although cells transferred into Il17ra–/– recipients did not proliferate, TcrdBinder3 cells in WT recipients underwent slow self- renewal (Fig. 5F). In the polyclonal setting, some of IL17RA- binding γδT cells expressed the proliferation marker Ki67, and the frequency of such cells was de- creased in Il17ra–/– mice (Fig. 5G). We concluded that peripheral expo- sure to IL17RA promoted homeostatic proliferation of IL17RA- reactive γδT cells.
IL17RA regulates the thymic development of IL17RA- reactive γδT cells We assessed if IL17RA regulated the thymic development of IL17RA- reactive γδT cells. IL17RA- binding γδT cells were much less abun- dant in the thymus than in secondary lymphoid organs in WT, Il17ra–/–, and Il17a–/–Il17f–/– mice but were increased in number and frequency in the thymi of Il17ra–/– mice compared with the control animals (Fig. 6A). Although IL17RA- binding γδ thymocytes from control mice exhibited some level of CD122 up- regulation, this up- regulation was abrogated in Il17ra–/– mice (Fig. 6A). Moreover, whereas WT IL17RA- binding γδ thymocytes up- regulated CD73, a marker of γδT cell lineage commitment (3), this up- regulation was largely abolished in Il17ra–/– mice (Fig. 6B). Total Vδ7+ (but not Vδ7–) thymocytes also exhibited a decreased frequency of CD73+ cells in Il17ra–/– mice (fig. S16, A and B). A reduction in CD73+ γδ thymocytes
C
(Gated on CD3+)
CD3
(Gated on CD3+)
CD3
D
CD3
HEK293T
HEK293T
2 43 68 36 21 9
104 105 0 IL17RA multimer
104 105 0 IL17RA multimer
104105 0 IL17RA multimer
sFT-blue 16.2c11
B
F
104 105 0 sFT-red
10 20 30 40 50 60 70 80
V 7 V 10 V 7mut1 V 7mut2 V 7mut3 V 7mut4 V 7mut5 V 7mut6 V 7mut7
TCR55 WT V 7mut1 V 7mut2 V 7mut3 V 7mut4 V 7mut5 V 7mut6 V 7mut7
(Gated on CD3+) HEK293T
46 48 3 43 3 24 2 36
TCR55 WT E20A Q22R R31S Y36R R38N P39S V44I
r3
50 41 51 3 3 58 45 47
L47F S48Y P50A H55E T56N T60K T62A S71T
P50
58 64 6 4 20 3 3 50
Mouse IL17RA Human IL17RA
Response (RU)
0 200 400 600 800
0 200 400 600 800
Fig. 3. Contribution of Vγ usage and germline- encoded sequences of Vδ7 to the IL17RA recognition. (A) Original Vγ4Vδ7 TCR55 or TCR55 versions in which TCRγ was replaced with the indicated Vγ chains were analyzed for IL17RA binding and reactivity. Top: plasmids encoding these TCRs were coexpressed in HEK293T cells with a construct encoding all CD3 subunits. The transfected cells were stained with IL17RA multimers. Here and below, gating on CD3+ cells was applied as shown in fig. S18D. The TCR55 mutant 6 shown in Fig. 3C was used as a negative control. Bottom: the same TCRs were expressed in the reporter cells and reactivity to the recombinant IL17RA was analyzed. Reporter induction was assessed by gating on TCRγδ+ cells as in fig. S18A. Representative results of two independent experiments are shown. (B) Comparison of protein sequences of Vδ7 and Vδ10 and sequences of 7 Vδ7/Vδ10 chimeric V segments assessed in (C). Differences between Vδ7 and Vδ10 are indicated with red font. Differences that correspond to
Recombinant IL17RA
FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3
r1
r2
Difference between V 7 and V 10
Not affecting IL17RA reactivity/binding
Affecting IL17RA reactivity/binding
V 4Binder3V 7TCR55
chimera 1:1 fit
Time (sec)
Unstimulated
Not solvent exposed
ka (M-1s-1) kd (s-1)
ka (M-1s-1)
KD ( M)
8.98 x 103
5.32 x 10-2
5.92
3.35 x 103
6.04 x 10-2
18.0
5.26
6.27 x 103
3.30 x 10-2
Summary
8.25
5.74 x 103
4.73 x 10-2
estimate
HV4
100 nM 1 M
100 10-2 10-1 kd (s-1)
T62 H55
(1.89-35.88 M)
10 M
Individual experiments
Summary estimate
100 M
1 mM
residues predicted to be not solvent exposed (and therefore not tested further) are indicated with gray shading. Amino acids crucial for IL17RA binding and/or reactivity [identified in (C) and (D) and fig. S5B] are highlighted in red, and differences that do not affect IL17RA binding are highlighted in blue. FR1, CDR1, FR2, CDR2, and FR3 (including HV4) regions of the sequence are annotated. (C) Plasmids encoding WT TCR55 or its seven Vδ7/Vδ10 chimeric versions were coexpressed in HEK293T cells with a construct encoding all CD3 subunits. The transfected cells were stained with IL17RA multimers. Gating on CD3+ cells was applied. Representative results of two independent experiments are shown. (D) Single amino acid mutants of TCR55 covering all Vδ7/Vδ10 amino acid differences in Vδ7mut2, Vδ7mut4, Vδ7mut5, and Vδ7mut6 were generated and assessed as in (C). Representative results of two independent experiments are shown. (E) Model of TCR55 structure (gray indicates TCRγ, and beige indicates TCRδ) with highlighted individual amino acids in Vδ7 (bright colors) crucial for IL17RA binding and reactivity [identified in (D) and fig. S5B]. (F) Binding of soluble Vγ4Binder3Vδ7TCR55 TCR to immobilized mouse (far left) or human (left) recombinant IL17RA was assessed by surface plasmon resonance. A series of 2- fold dilutions is shown; the highest concentration of TCR used was 5 μM. Representative plots of three independent experiments are shown. The binding kinetics of three individual experiments (r1, r2, and r3) are shown on the right. Blue circle indicates the 95% CI of KD (1.89 to 35.88 μM); red dot is the measurement of an individual experiment; and cross is the summary estimate from three experiments. Data were analyzed by using a random effects model with the Hartung Knapp Sidik Jonkman 95% CI adjustments given the k = 3 measurements.
and a failure to up- regulate CD122 in the absence of IL17RA were also observed for TcrdBinder3 Tg γδ thymocytes, but in contrast to the non- Tg setting, γδT cells were decreased in Il17ra–/–TcrdBinder3 mice already in the thymus (Fig. 6C and fig. S17A). Brief ex vivo exposure of CD73– γδ thymocytes sorted from thymi of Il17ra–/–TcrdBinder3 mice to plate- bound IL17RA was sufficient to induce CD73 up- regulation (fig. S17B), whereas Il17ra+/+TcrdBinder3 thymocytes up- regulated CD73 in the absence of recombinant IL17RA, possibly due to the history of in vivo IL17RA exposure (fig. S17B). We concluded that the lack of IL17RA led to a partial block in the thymic development of IL17RA- reactive γδT cells.
Discussion Although many γδT cells already acquire effector programs during their thymic development, γδTCR ligands that drive the induction of these molecular programs remain largely elusive. Here, we demon- strated that the selection of ≥10% of total γδT cells found in secondary lymphoid organs in mice was driven by a direct interaction between Vδ7 γδTCRs and the cytokine receptor chain IL17RA.
Consistent with the ligand- dependent acquisition of a TH1- like mo- lecular program observed for several other γδT cell subsets (25, 27, 35), Vδ7 γδT cells acquired TH1- like effector properties in an IL17RA- dependent fashion. This IL17RA- driven differentiation also resulted in the adjustment of TCR signaling threshold, rendering these cells refractory to activation by the levels of IL17RA to which they are normally exposed. Nevertheless, mature peripheral IL17RA- reactive cells still sensed physiological levels of IL17RA, and this recognition drove their homeostatic proliferation.
Although a diverse repertoire of CDR3 sequences and all tested Vγ chains were permissive for IL17RA reactivity, IL17RA- reactive γδT cells invariably used Vδ7 in their TCRs. TCR mutagenesis experiments iden- tified several point mutations in Vδ7 that abrogated IL17RA binding and reactivity. These results suggest that IL17RA interacts predomi- nantly with germline- encoded sequences in Vδ7 chains, reminiscent of the nonclonotypic interaction of butyrophilin family members with germline- encoded sequences in Vγ. Thus, nonclonotypic interactions of γδTCRs with endogenous cell surface proteins are not restricted to butyrophilin- related molecules.
The identification of IL17RA as a nonclonotypic γδTCR ligand that does not belong to the butyrophilin family suggests that such interactions represent a more common mode of γδT cell recognition of their endog- enous TCR ligands than previously anticipated, raising questions about the evolutionary pressure favoring such interactions. From the two T cell lineages, αβT cells had evolved elaborate selection mechanisms that al- lowed them to focus their TCR repertoire on the endogenous ligands, MHC molecules, and couple their differentiation programs to their TCR specificities while maintaining high TCR diversity. This focusing of the αβTCR repertoire on MHC molecules is largely based on the utilization of CD4 and CD8 as coreceptors for MHC (55). Because γδT cells, to our knowledge, lack such an elaborate coreceptor- based selection system, it is conceivable that selection on nonclonotypic ligands interacting with germline- encoded parts of γδTCRs could have evolved as a more primitive
mechanism to select and induce functional maturation of large γδT cell subsets while preserving high clonal diversity in the resulting effector populations. Consistent with this notion, some γδTCRs capable of inter- acting with nonclonotypic ligands have also been shown to recognize additional clone- specific ligands through CDR3- mediated interactions (9, 30). It was proposed that such “dual reactivity” allows the discrimina- tion between nonclonotypic ligands, which regulate agonist selection and homeostasis of large γδT cell subsets, and clone- specific ligands, which may play a role in immune responses (30). It seems plausible that later in evolution, some endogenous nonclonotypic γδTCR ligands were able to acquire additional functions, such as enabling immuno- surveillance by Vγ9Vδ2 human γδT cells through the detection of a conformation change in BTN3A1/BTN2A1 in response to microbial and stress- induced compounds (31–34, 56, 57). It remains to be deter- mined whether IL17RA may have acquired such additional roles in γδT cell biology. Although IL17RA is broadly and constitutively ex- pressed (58), its expression levels vary across populations, with monocytes exhibiting the highest Il17ra expression of all cell types according to the Tabula Muris database (59). It is conceivable, for example, that such heterogeneity in expression could generate niches of high and low IL17RA abundance in tissues, which could in turn regulate the intratissue positioning of IL17RA- reactive γδT cells. It is also possible that either up- regulation of IL17RA or inducible co- localization of IL17RAhi cells with the IL17RA- reactive γδT cells (e.g., influx of monocytes into a tissue with high Vδ7 γδT cell abundance upon inflammation) could result in the activation of the latter popula- tion. Finally, it is also conceivable that additional inducible molecular components, such as posttranslational modifications of IL17RA or even yet- to- be- identified elements of a composite ligand, regulate the activa- tion of Vδ7 γδT cells. However, it also remains possible that IL17RA might act primarily as a determinant of selection and homeostasis for a diverse TH1- like γδ effector population, which could then function in an IL17RA- independent fashion.
Materials and methods Mice Il17ra–/– mice and Il17a–/–Il17f–/– mice were described previously (54, 60). WT C57BL/6J mice were obtained from Janvier Labs. Mice were bred and maintained at the Comparative Medicine Biomedicum facility of Karolinska Institutet (Stockholm, Sweden), at the Translational Animal Research Center of the Johannes Gutenberg University of Mainz (Mainz, Germany), or at the Animal Resource Center of the University of Chicago (Chicago, USA) and were kept under specific pathogen- free conditions at 30–70% RH, 22°C, with a 6:00 p.m. to 6:00 a.m. nocturnal dark- light schedule. Sex- and age- matched mice were randomly assigned to experi- mental groups in all experiments. Mice were euthanized by 5 min of CO2 asphyxiation followed by cervical dislocation. Mice at Mainz were kept in accordance with the guidelines from the Translational Animal Re- search Center of the Johannes Gutenberg University Mainz and in accordance with federal (Rhineland- Palatinate), state (Germany), and European Union policies. All mouse experiments performed at Karolinska Institutet were performed according to a valid ethical permit
B
TCR
E
TCR
V 4
TCR
-5
UMAP2
-15
-5 0 5
UMAP1
Gating for IL17RA-multimer+ (Spleen)
IL17RA-multimer+
IL17RA-multimer+
F
Ly6C
Ly6C
Ly6C
Ly6C
Ly6C
104 0 CD122
104 0 CD122
Gating for V 7+ (Spleen)
104 29
103 0 CD122
103 0 CD122
TCR Tg (Spleen)
(TCR Tg)
Total splenocytes
Tcrd+/+
(Polyclonal)
TcrdBinder3/+
6 33 103 0 TCR
ROR t
IL17A
V 7+ T cells
V 4+V 7+ T cells
TCR Tg T cells
V 1
Fig. 4. Expression of IL17RA- reactive γδTCRs is associated with acquisition of a TH1- like effector program. (A) UMAPs showing distribution of cells with Vγ4Vδ7 TCRs (identified by scVDJ- seq) of WT splenic γδT cells [scRNA/VDJ- seq dataset from (40)] (left) and expression of the signature genes of Th1- like (Ifng, Ly6c2, Tbx21, and Il2rb) and TH17- like (Rorc) γδT cells. A total of 10,179 γδT cells is depicted. (B) Expression of Ly6C and CD122 by total splenic γδT cells (left) and IL17RA multimer- binding γδT cells (right). Representative gating strategy is shown in fig. S18C. Representative results of at least five independent experiments are shown. (C) Expression of Tbet and RORγt by total splenic γδT cells (blue) or by IL17RA multimer+ γδT cells (red). Representative results of five independent experiments. (D) Production of IFNγ and IL17A by total splenic γδT cells (blue) or by IL17RA multimer+ γδT cells (red) after PMA/ionomycin stimulation. Representative results of three independent experiments are shown. (E) Characterization of splenic Vδ7+ γδT cells (top) and Vγ4+Vδ7+ γδT cells (bottom). Expression of Ly6C, CD122, and Tbet (blue, total splenic γδT cells; red, Vδ7+ or Vγ4+Vδ7+ γδT cells as indicated in the figure) was assessed by flow cytometry. Trav13- 4- dv7 (encodes Vδ7) expression was detected by RNA flow cytometry. Representative gating strategy of γδT cells is shown in fig. S18E. Representative results of three (surface markers) or two (Tbet staining) independent experiments. (F) Characterization of splenic γδT cells in WT mice (top) and TcrdBinder3/+ TCR Tg mice (bottom). Expression of Ly6C, CD122, and Tbet (blue, polyclonal non- TCR Tg γδT cells; red, γδT cells from TCR Tg mice) was assessed by flow cytometry. Representative results of four (surface markers) or two (Tbet staining) independent experiments are shown.
mouse experiments performed at the University of Chicago were per- formed according to an animal protocol (ACUP 72771) approved by the University of Chicago Institutional Animal Care and Use Committee.
TcrdBinder3 TCR Tg mice were generated by CRISPR- Cas9–mediated genome editing in mouse zygotes. Targeting of the Tcrd locus was
0 1 2 3
0 1 2 3
0 1 2
Total T cells
Total T cells
Total T cells
Total T cells
Total T cells
Total T cells
Total T cells
103 105
104 0 IL17RA multimer
102 0 Trav13-4-dv7 (V 7)
103 103 0 CD122
104 103 0 V 4
C D
103 Tbet
103 0 IFN
104 103 Tbet
104 103 Tbet
Polyclonal T cells
of Trdd1 (5′ TCAGCGCAGATTGACACAGA 3′) and downstream of Trdj2 (5′ AGACACGTTAGCTCAGCCGA 3′) (40). A single- stranded DNA repair template encompassing the 600- bp promoter region of the TRAV15D- 1 Vδ gene in front of the TCRγ(full- length)- P2A- TCRδ(VDJ only) of Binder3 Vγ4Vδ7 TCR and 250- bp homology arms was produced by gene synthesis (GenScript). A solution containing the two sgRNAs (final con- centration of 300 nM), Cas9 protein (40 ng/μl), and single- stranded DNA
% IL17RA-multimer+
IL17RA-multimer+
IL17RA-multimer+
F
G
Il17ra–/–
Il17ra–/–
Il17ra–/–
Il17ra+/+
Il17ra+/+
Il17ra–/–
Il17ra–/–
Control
Control
Control
TCR
TCR
TCR
1.18 0.37 2.32
104 0 IL17RA multimer
73 11 69
Ly6C
Ly6C
Ly6C
Ly6C
104 0 CD122
104 0 CD122
104 0 CD122
0 CD122
0 CD122
Control Il17ra–/–
IL17A
Control Il17ra–/– Il17a–/–Il17f–/– B
Control Il17ra–/– Il17a–/–Il17f–/–
Control Il17ra–/–
Il17a–/–Il17f–/–
Il17a–/–Il17f–/–
Gating for V 7+ (Spleen, total T cells)
% V 7+
V 7+
% V
V
16 6 17
104 0 Trav13-4-dv7 (V 7)
104 0 Trav13-4-dv7 (V 7)
58 15 58
Gating for V 4+V 7+ (Spleen, total T cells)
% V 4 V 7+
V 4 V 7+
V 4
V 4 V 7+
12 3 12
69 15 70
C TCR Tg (Spleen, total live cells)
Il17ra+/+ Il17ra–/–
TcrdBinder3
TcrdBinder3
TcrdBinder3/+
TcrdBinder3/+
14 3
0 V 4
of IL17RA-multimer+
% CD122+Ly6C+
CD122+Ly6C+
NS
NS
% CD122+Ly6C+
NS
NS
NS
%CD122+Ly6C+
CD122+Ly6C+
Fig. 5. IL17RA is required for the accumulation and induction of a TH1- like effector program in most Vδ7 γδT cells. (A) The frequency of IL17RA multimer- binding γδT cells (top) and the expression of CD122 and Ly6C by IL17RA multimer- binding γδT cells (bottom) were analyzed in spleens of control (WT), Il17ra–/–, and Il17a–/–Il17f–/– mice by flow cytometry. Representative plots (left) and quantification of absolute numbers of IL17RA- binding γδT cells and of IL17RA- binding γδT cells with TH1- like CD122+Ly6C+ phenotype and their frequency among total γδT cells are shown. Representative gating strategy is shown in fig. S18C. Representative results of two independent experiments are shown; results are pooled from three independent experiments (n = 7 mice for WT, n = 5 for Il17ra–/– and Il17a–/–Il17f–/–). For quantification of the absolute number, n = 6 mice for WT, n = 4 mice for Il17ra–/–, and n = 5 mice for Il17a–/–Il17f–/–. (B) CD122 and Ly6C expression by Vδ7+ γδ T cells (top) and Vγ4+Vδ7+ γδ T cells (bottom) and the frequency and absolute numbers of the
**
**
**
of total T
of total T
of total T
*
**
**
**
of V 7+ T
of V 4 V 7+ T
T cell count (x 106)
of total live cells
103 0 Ly6C
104 103 105
104 103 Tbet
103 104
103 104
T cell count (x 103)
T cell count (x 103)
ROR t
103 0 Tbet
Sorted IL17RA-multimer+ T cells E
103 0 IFN
0 IFN
T cell count (x 104)
T cell count (x 104)
T cell count (x 104)
T cell count (x 104)
CTV-labelled V 4V 7 cells
from TcrdBinder3
CD122+Ly6C+V 7+
to WT
to Il17ra–/–
103 0 CTV
IL17RA-multimer+CD27+ T cells
104 0 Ki67
% Ki67+
PMA/Ionomycin
PMA/Ionomycin
Il17ra+/+TcrdBinder3/+
Il17ra–/–TcrdBinder3/+
74 15 2 7
88 15 0 3
Harvest at Day 8 and Day 23
WT or Il17ra–/–
Donor T cells
Day 8 Day 23
104 103 0
of IL17RA-multimer+CD27+
corresponding subsets were assessed by flow cytometry in spleens of control (Il17a+/–Il17f+/–), Il17ra–/–, and Il17a–/–Il17f–/– mice. Representative plots (left) and quantification of absolute numbers of Vδ7+ and Vγ4+Vδ7+ γδT cells and of Vδ7+ and Vγ4+Vδ7+ γδT cells with TH1- like CD122+Ly6C+ phenotype and their frequency among total γδT cells (right) are shown. Representative gating strategy of γδT cells is shown in fig. S18E. Representative results of two independent experiments are shown. n = 3 mice for each group. (C) The frequency of Vγ4+ γδT cells (top, gated on total live cells), the expression of Ly6C, CD122, and Tbet at steady state, and the production of IFNγ after PMA/ionomycin stimulation (bottom) were analyzed in spleens of Il17ra+/+TcrdBinder3/+ (blue) and Il17ra–/–TcrdBinder3/+ (red) mice. Representative plots and quantification of the absolute number of Vγ4+ γδT cells and their frequency among total splenocytes are shown. Representative results of three independent experiments are shown. n = 4 mice for Il17ra+/+TcrdBinder3/+, n = 5 mice for Il17ra–/–TcrdBinder3/+. (D) Expression of Tbet and RORγt by sorted IL17RA multimer+ γδT cells (pooled from spleen and LNs) from control (WT) and Il17ra–/– mice. Representative plots of four independent experiments are shown. (E) Production of IFNγ and IL17A by sorted IL17RA multimer+ γδT cells (pooled from spleen and LNs) from control (WT) and Il17ra–/– mice after PMA/ionomycin stimulation. Representative plots of three independent experiments are shown. (F) TCR Tg γδT cells isolated and enriched from the spleens of Il17ra+/+TcrdBinder3 mice were labeled with CTV and transferred into WT or Il17ra–/– mice intravenously. Dilution of CTV in TcrdBinder3 γδT cells in recipients’ spleens was analyzed 8 days and 23 days after transfer by flow cytometry. Representative gating strategy is shown in fig. S18F. Representative plots of two independent experiments. (G) Expression of CD122 and Ki67 by splenic IL17RA multimer+CD27+ γδT cells from control (WT) and Il17ra–/– mice. Flow cytometry plots (top, concatenated from n = 3 mice) and quantification of the frequency of Ki67+ of IL17RA multimer+CD27+ γδT cells are shown. Representative results of two independent experiments are shown. n = 3 mice for each group. Data are presented as the mean ± SD. NS, nonsignificant (P > 0.05), P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001, and **P < 0.0001. Each dot represents a single mouse. Data were analyzed by two- tailed Student’s t test [(C) and (G)] or one- way ANOVA with Holm- Sidak’s multiple- comparisons test [(A) and (B)].
repair template (6 ng/μl) was injected into C57BL/6 zygotes. Correct targeting was confirmed by sequencing.
Generation of T cell hybridomas Generation of T cell hybridoma was described previously (41). In brief, γδT cells from the thymi of WT C57BL/6J mice were isolated by mag- netic enrichment or fluorescence- activated cell sorting. γδT cells were cultured in plates precoated with 10 μg/ml anti- CD3 (17A2, BioLegend) antibody in the presence of 2 μg/ml anti- CD28 (37.51, BioLegend) an- tibody and 10 ng/ml IL2 (Miltenyi Biotec). After 48 hours, stimulated γδT cells were collected, counted, and mixed with BW5147 fusion part- ner at a 1:1 or 1:2 ratio. After washing with unsupplemented Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM), the cell pellet was loosened by tapping the tube three times and kept at 37°C with constant shaking. 0.5 ml PEG- 1500 (Roche) and 2.5 to 3 ml of unsupplemented IMDM was added dropwise to the pellet 60 and 90 s, respectively, after the shaking started. Cells were then centrifuged and resuspended in IMDM supplemented with 10% fetal calf serum (FCS), 1% L- glutamine, 1% penicillin/streptomycin, 20 μM 2- mercaptoethanol, 1× HAT (Sigma), and 10 μg/ml Ciprofloxacin (Sigma) at a density of 300 stimulated T cells/ml. Cells were cultured in 96- well U- bottom plates, and the growth of hybridomas was monitored from day 5 after fusion. The expression of TCR was assessed by flow cytometry.
Plasmids TCRs were cloned as a Tcrg- P2A- Tcrd cassette into an IRES- GFP ret- roviral vector pCMMP- MCS- IRES- eGFP (61) (Addgene, 36953) using the BglII and XhoI restriction sites as described previously (62, 63). For cloning of some TCRs, a synonymous mutation introducing a restriction site for KflI was made in the Trdc region right downstream of CDR3δ. This enabled cloning of a shorter cassette using BglII and KflI sites. To obtain sequences of γδTCRs from T cell hybridomas, RNA was isolated from the hybridomas using ZYMO Quick- RNA Microprep Kit (ZYMO) followed by reverse transcription using RevertAid RT Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific). Tcrd and Tcrg sequences were amplified, and Tcrg- P2A- Tcrd cassettes were generated by overlapping PCRs and cloned into the retroviral vector as previously described (62, 63). Cassettes encoding γδTCRs identified in scRNA/VDJ- seq datasets, as well as cassettes encoding mutant versions of the TCRs, were produced by gene synthesis at Twist Bioscience or Integrated DNA Technologies.
Mouse Il17ra in pCMV- Sport6 vector was isolated from the cDNA library described below. To generate the truncated “D2 only” version of IL17RA, the sequence encoding the extracellular part of IL17RA was replaced using NheI and AflII restriction sites by a synthesized DNA fragment in which the D1 domain was removed. Mouse Il17rd in pcDNA3.1 vector and mouse Il17re in pcDNA3.1 vector were pur- chased from GeneScript. Mouse Il17rb and Il17rc were amplified from
constructs purchased from Sino Biological and cloned into the pcDNA3.1 vector using AflII and BamHI restriction sites.
To generate a retroviral construct for knocking out B2m in BEKO cells, oligonucleotides encoding sgRNA targeting B2m locus (5′-CACCGAGTATACTTGAATTTGAG- 3′ and 5′-AAACCTCAAATT- CAAGTATACTC- 3′) were annealed and cloned into pSIN- Cas9- mCherry vector digested with BbsI restriction enzyme. To generate a retro- viral construct for knocking out Il17ra in BEKO cells, oligonucleotides encoding sgRNA targeting Il17ra locus (5′-CACCGGCTGGCC- ACGGGTCGTCCCC- 3′ and 5′-AAACGGGGACGACCCGTGGCCAG- CC- 3′) were annealed and cloned into pSIN- Cas9- thy1.1 vector digested with BbsI restriction enzyme. pSIN plasmids were kindly provided by J. Zuber (IMP, Vienna).
To generate an expression construct encoding Binder3 TCRγ ectodo- main, a synthesized sequence containing an N- terminal human IL2 signal peptide (UniProtKB: P60568, residues 1 to 20), a Binder3 TCRγ ectodomain, a TEV protease cleavage site, an acidic leucine zipper (RR12EE345L) (64), and a Flag tag was cloned into the pcDNA3.1 vector using XhoI and HindIII restriction sites. To generate a construct en- coding the TCR55 TCRδ ectodomain, a synthesized sequence contain- ing an N- terminal human IL2 signal peptide, genes encoding the TCR55 Vδ7 ectodomain, a TEV protease cleavage site, a basic leucine zipper (EE12RR345L) (64), and a Twin- StrepII tag was cloned into the pcDNA3.1 vector using XhoI and HindIII restriction sites.
Production of soluble TCR Expi293F cells were transiently transfected with expression plasmids pcDNA3.1 Binder3 TCRγ and pcDNA3.1 TCR55 TCRδ at a 1:2 ratio using the ExpiFectamine 293 transfection kit (Gibco). Transfected cells were maintained in a shaking incubator (37°C, 8% CO2) in Expi293F Expression Medium (Gibco). Five days after transfection, the supernatant was harvested by centrifugation and clarified by filtration through a 0.45- μm filter. Biolock solution (IBA Life Sciences) was added to the supernatant to a final concentration of 1.8% (v/v) and incubated on ice for 20 min. The supernatant was filtered again through a 0.45- μm filter and loaded onto a 1- ml StrepTrap HP column (Cytiva). The column was washed with 100 mM Tris- HCl, pH 8, 150 mM NaCl, and 1 mM EDTA buffer, and the protein was eluted with 100 mM Tris- HCl, pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, and 2.5 mM desthiobiotin. Fractions containing the soluble TCR were buffer exchanged into 1× HBS EP+ buffer using a PD- 10 desalting column, followed by con- centrating the sample. Expression and integrity of the soluble TCR were validated by Western blot using anti- Strep and anti- Flag tag antibodies.
Production of recombinant IL17RA Soluble ectodomains of mouse and human IL17RA were produced in Drosophila melanogaster S2 cells. To allow for efficient purification, a
C
% IL17RA-multimer+
IL17RA-multimer+
Il17ra–/–
Il17ra–/–
Il17ra–/–
Il17ra+/+
Il17ra+/+
Il17ra–/–
Il17ra–/–
Il17ra+/+
Il17ra+/+
Il17ra+/+
Il17ra+/+
Il17ra–/–
Il17ra–/–
Il17ra–/–
Il17ra–/–
Il17a–/–Il17f–/–
Il17a–/–Il17f–/–
Control
Control
Control
1.0
1.0
1.0
1.0
TCR
TCR
0.33 0.70 0.36
104 0 IL17RA multimer
0.5
0.5
0.5
0.5
32 11 32
Ly6C
Ly6C
% CD122+
104 0 CD122
% CD122+
0 CD122
0 CD122
TCR Tg (Thymus, total live cells)
Il17ra+/+ Il17ra–/–
Il17ra+/+ Il17ra–/–
TcrdBinder3/+ TcrdBinder3/+
TcrdBinder3/+ TcrdBinder3/+
6 1
% CD73+
103 105 0 CD73
% CD73+
% V 4
V 4
0 V 4
*
**
52 14
CD24
* NS **
NS
of IL17RA-multimer+
of IL17RA-multimer+
CD24
of V 4 T
of V 4 T
CD122+V 4
Il17ra+/+TcrdBinder3/+
Il17ra–/–TcrdBinder3/+
Fig. 6. IL17RA regulates the thymic development of IL17RA- reactive γδT cells. (A) Analysis as in Fig. 5A but in the thymi of the same mice. Results are pooled from three independent experiments. (B) Expression of CD24 and CD73 by thymic IL17RA multimer+ γδT cells from control (WT) and Il17ra–/– mice. Representative plots (top) and quantification of the frequency of CD73+ of IL17RA multimer+ γδT cells (bottom) are shown. Results are pooled from four independent experiments (n = 4 mice for each group). (C) The frequency of Vγ4+ γδT cells (top, gated on total live cells), and the expression of Ly6C and CD122 (middle and bottom) were analyzed in spleens of Il17ra+/+TcrdBinder3/+ (blue) and Il17ra–/–TcrdBinder3/+ (red) mice. Representative plots (left) and quantification of the absolute number of Vγ4+ γδT cells and of CD122+Vγ4+ γδT cells and their frequency among total thymocytes are shown. Same mice as shown in Fig. 5C, n = 4 mice for Il17ra+/+TcrdBinder3/+, n = 5 mice for Il17ra–/–TcrdBinder3/+. Representative results of three independent experiments are shown. (D) Analysis as in (B) but in the thymi of the same mice shown in (C). Representative results of three independent experiments are shown. Data are presented as the mean ± SD. NS, nonsignificant (P > 0.05); P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001, and **P < 0.0001. Each dot represents a single mouse. Data were analyzed by two- tailed Student’s t test [(B) to (D)] or one- way ANOVA with Holm- Sidak’s multiple- comparisons test (A).
double Strep- tag was fused to the C terminus of the protein together with an enterokinase (EK) cleavage site, facilitating controlled pro- teolytic cleavage. Using an insect cell expression vector (65), S2 cells were transfected as described previously (66) with optimizations to improve performance. 2 μg of plasmid DNA was used for transfection, in combination with 0.1 μg of the pCoPuro plasmid (67). Starting 6 days after selection, the stable cell lines were adapted to Insect- XPRESS me- dium (Lonza).
To initiate soluble protein expression, the adapted cells were scaled up and induced with 4 μM CdCl2 at a density of 6 × 106 cells/ml. Five days after induction, cells were harvested by centrifugation, and sol- uble proteins were purified from the supernatant using affinity chro- matography on a Strep- Tactin XT 4Flow column (IBA Lifesciences), followed by size- exclusion chromatography using a HiLoad 26/600
1.5
of total T
T cell count
T cell count (x 106)
T cell count (x 106)
T cell count (x 106)
of total live cells
Superdex 200 pg column (Cytiva) equilibrated in 20 mM HEPES, pH 7.4, and 150 mM NaCl.
Surface plasmon resonance Binding kinetics between IL17RA and TCR were evaluated by surface plasmon resonance using a Biacore 1K instrument (Cytiva). Mouse or human IL17RA in 10 mM sodium acetate, pH 5.0, were used as a ligand and captured to 400 to 500 RUs onto an active flow cell surface of a CM5 chip (Cytiva, 29104988) through amine coupling (Cytiva, BR100050). A reference flow cell was treated in the same way but without any ligand immobilization. The interaction was measured with a single- cycle kinet- ics setup using five molar concentrations of the TCR in a 2- fold dilution series starting from either 12 μM (r1) or 5 μM (r2 and r3), depending on the experiment. The flow rate was set at 30 μl/min with a contact time
T cell count (x 103)
41 17 58 83
103 0 CD73
CD122+ IL17RA-multimer+
D Thymic TCR Tg T cells
77 16
103104
CD73+V 4
of 60 s per concentration and a final dissociation phase of 600 s. All steps were performed at 25°C and in HBS- EP+ running buffer containing 10 mM HEPES, pH 7.4, 3 mM EDTA, 150 mM NaCl, and 0.05% Tween 20. The raw data were double referenced with buffer blank injections preceding the analyte and with the data from the reference flow cell. The sensorgrams were fitted with the Biacore Insight Evaluation Software, assuming a 1:1 Langmuir binding model to obtain the association rate constant (ka), dissociation rate constant (kd), and the KD. Association and dissociation rates and their respective fit SEs were summarized us- ing a random effects model with the Hartung Knapp Sidik Jonkman 95% confidence interval (95% CI) adjustments given the k = 3 measurements. The estimates and their quantified uncertainty were used to calculate a summary estimate of KD and the rate constants (ka and kd).
Cell lines All cells were kept at 37°C in a humid incubator with 5% CO2. BW5147 fusion partner cells and 16.2c11 T hybridoma cell line, DP thymic lym- phoma (BEKO) (41), thymic epithelial cell lines (mTEC 3.10, cTEC 1.2) (68), and thymic fibroblast cell line (TST4) (69) were cultured in IMDM supplemented with 10% FCS, 100 U/ml L- glutamine, 100 U/ml penicillin/ streptomycin, and 50 μM 2- mercaptoethanol. To improve the survival of BEKO cells, they were retrovirally transduced with pMIG- BCL2- IRES- GFP construct. The endothelial cell line MVEC- B3 was cultured in RPMI 1640 supplemented with 10% FCS, 100 U/ml L- glutamine, 100 U/ml penicillin/streptomycin, and 50 μM 2- mercaptoethanol. HEK293T and the peripheral T cell lymphoma cell line EL4 were cultured in DMEM/HG supplemented with 10% FCS, 100 U/ml L- glutamine, 100 U/ml penicillin/ streptomycin, and 50 μM 2- mercaptoethanol.
Retroviral infection A total of 6 × 105 HEK293T cells were plated and cultured in 6- well plates. When the confluency reached 70%, HEK293T cells were trans- fected with 2.8 μg/well target constructs together with 1.4 μg/well pCL- Eco (Addgene, 12371) retroviral packaging plasmid using the calcium- phosphate method as described previously (70). Twenty- four hours after the transfection, the medium was changed to target cell medium. Viral supernatants were collected and filtered through 0.45- μm filters 42 and 48 hours after transfection. A total of 4 × 104 16.2c11 cells were spin- infected with viral supernatants at 500 g for 1 hour at room temperature. Cells were magnetically enriched or sorted for TCR ex- pression after transduction.
Transient expression assays HEK293T cells were plated in 96- well plates at a density of 2 × 104 to 3 × 104 cells per well. When the confluency reached 70%, HEK293T cells were transfected with 200 ng of plasmids using the Lipofectamine 3000 Transfection Reagent kit (Invitrogen, L3000001) according to the manufacturer’s instructions. Cells were then cultured at 37°C for 24 hours before the coculture assay. In the assay in which γδTCR and CD3 were cotransfected, 67 ng of γδTCR- encoding construct and 133 ng of CD3- encoding construct were used per well. In the assay in which IL17RA and its paralogs were cotransfected, 2 ng of IL17RA- encoding construct and 200 ng of the paralog- encoding construct were used per well.
Cocultures with TCR- expressing reporter cells For cocultures with adherent cells, TST4 cells (5 × 103 per well), MVEC cells (5 × 103 per well), mTEC 3.10 cells (1.5 × 104 per well), or cTEC 1.2 cells (1.5 × 104 per well) were plated in 96- well flat- bottom plates. When the confluency reached 90%, 4 × 104 per well of 16.2c11 reporter cells were added and cocultured with target cells at 37°C for 14 to 18 hours. For co- cultures with suspension cell lines and primary cells, 1 × 104 per well of 16.2c11 reporter cells were cocultured with 1.5 × 105 per well of target cells in 96- well V- bottom plates at 37°C for 14 to 18 hours. For stimulation with IL17RA protein, 96- well flat- bottom plates were precoated with
recombinant IL17RA (8 μg/ml, 1 to 2 hours at 37°C unless stated otherwise) and 4 × 104 16.2c11 reporter cells were cultured in these wells for 14 to 18 hours. As a positive control for TCR signaling, cells were incubated in 96- well flat- bottom plates precoated with 10 μg/ml anti- CD3ε (145- 2C11, BioLegend) antibody at 37°C for 14 to 18 hours. After coculture, the levels of blue fluorescent protein (sFT- Blue) expressed by the γδTCR+ reporter cells were measured with flow cytometry.
Stimulation of TCR Tg γδT cells For short- term in vitro stimulation of γδ splenocytes, γδT cells from spleens of Il17ra+/+TcrdBinder3 and Il17ra–/–TcrdBinder3 mice were en- riched by staining with allophycocyanin (APC)–conjugated anti- CD19, anti- CD11c, anti- TCRβ, anti- Ter119, anti- CD11b, and anti- CD4 followed by magnetic depletion with anti- APC magnetic beads (Miltenyi Biotec). For cocultures with ex vivo cells, 2 × 104 per well of enriched γδT cells were cocultured with 2 × 105 total splenocytes or thymocytes isolated from WT or Il17a–/– mice in 96- well V- bottom plates for 16 hours. For stimulation with IL17RA protein, 96- well flat- bottom plates were pre- coated with a serial dilution of recombinant IL17RA (2- fold dilution starting from 60 μg/ml, 2 hours at 37°C), and 2 × 104 per well of en- riched cells were cultured in these wells for 16 hours. As a positive control for TCR signaling, cells were incubated in 96- well flat- bottom plates precoated with 5 μg/ml anti- CD3ε (145- 2C11, BioLegend) antibody at 37°C for 16 hours. In all conditions, cells were cultured in IMDM supplemented with 10% FCS, 100 U/ml L- glutamine, 100 U/ml penicillin/ streptomycin, 50 μM 2- mercaptoethanol, and 10 ng/ml recombinant mouse IL7 (PeproTech). After coculture, cells were collected for stain- ing and analyzed by flow cytometry. CD69 and CD25 up- regulation on Vγ4+TCRγδ+ cells was analyzed.
For in vitro polarization of γδ splenocytes, γδT cells from spleens of Il17ra+/+TcrdBinder3 and Il17ra–/–TcrdBinder3 mice were isolated as de- scribed above. For nonpolarizing conditions, enriched γδT cells were cultured in 48- well plates [precoated with 3 μg/ml anti- CD3ε (145- 2C11, BioLegend) in phosphate- buffered saline (PBS) at 37°C for 2 hours] in IMDM supplemented with 10% FCS, 100 U/ml L- glutamine, 100 U/ml penicillin/streptomycin, 50 μM 2- mercaptoethanol, and 3 μg/ml anti- CD28 (37.51, BioLegend). For Th1- polarizing conditions, enriched γδT cells were cultured in 48- well plates [precoated with 3 μg/ml anti- CD3ε (145- 2C11, BioLegend) in PBS at 37°C for 2 hours] in IMDM supple- mented with 10% FCS, 100 U/ml L- glutamine, 100 U/ml penicillin/ streptomycin, 50 μM 2- mercaptoethanol, 0.5 μg/ml anti- CD28 (37.51, BioLegend), 10 μg/ml anti- IL4 (11B11, BioLegend), 5 ng/ml recombi- nant mouse IL2 (PeproTech), and 10 ng/ml recombinant mouse IL12 (PeproTech). For Th17- polarizing conditions, enriched γδT cells were cultured in 48- well plates [precoated with 5 μg/ml anti- CD3ε (145- 2C11, BioLegend) in PBS at 37°C for 2 hours] in IMDM supplemented with 10% FCS, 100 U/ml L- glutamine, 100 U/ml penicillin/streptomycin, 50 μM 2- mercaptoethanol, 0.5 μg/ml anti- CD28 (37.51, BioLegend), 10 μg/ml anti- IL4 (11B11, BioLegend), 10 μg/ml anti- IFNγ (XMG1.2, BioLegend), 50 ng/ml recombinant mouse IL6 (PeproTech), 5 ng/ml recombinant mouse IL23 (PeproTech), and 1 ng/ml recombinant human TGFβ (PeproTech). The cells were used in a cytokine production assay 4 days after the start of the cultures. To this end, cells were restimulated with PMA/ionomycin and analyzed as described in the “Cytokine pro duc- tion assays” section.
For in vitro differentiation of γδ thymocytes, CD4–CD8–CD24+CD73– cells (note that anti- TCR antibody was omitted to avoid undeliber- ate stimulation) were sorted from thymi of Il17ra+/+TcrdBinder3 and Il17ra–/–TcrdBinder3 mice and cultured in 96- well flat- bottom plates un- coated or precoated with 5 μg/ml anti- CD3ε (145- 2C11, BioLegend) or 50 μg/ml recombinant IL17RA in PBS at 37°C for 2 hours in IMDM supplemented with 10% FCS, 100 U/ml L- glutamine, 100 U/ml penicillin/ streptomycin, and 50 μM 2- mercaptoethanol. After 12 hours, the cells were collected for staining and analyzed by flow cytometry. Gating on Vγ4+TCRγδ+ cells was applied for analysis.
Construction of the cDNA library The overall cDNA screening approach was based on strategies previously used to identify ligands of nonconventional αβTCRs (71, 72). Total RNA was isolated from the BEKO cell line and enriched for poly(A)+ mRNA using oligo- dT magnetic beads (Thermo Fisher Scientific). cDNA was synthesized and cloned into pCMV- Sport6 vectors using the In- Fusion SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit (Takara) according to the manufacturer’s instructions. The library was electroporated into competent Escherichia coli cells, the titer of the transformed cells was determined by serial dilution, and 96- well miniprep cultures were set up, aiming to plate ~200 clones per well. Plasmids were purified with a ZymoPURE 96- well plate kit (ZYMO Research), transfected into HEK293T cells with Lipofectamine 3000 (Invitrogen) in 96- well flat- bottom plates, and left overnight before the coculture (as described above).
Screening of the cDNA library Coculture assays of sorted TCR+ reporter cells with HEK293T cells trans- fected with pools of cDNA were set up in flat- bottom 96- well plates as described above. 180 to 500 ng of plasmid DNA from each pool was used for transfection. After coculture for 14 to 18 hours, cells were collected and analyzed on LSR Fortessa flow cytometer with the High Throughput Sampler (HTS). Reporter cells were distinguished from HEK293T cells by the expression of green fluorescent protein (GFP). The frequency of sFT- blue+ reporter cells was analyzed.
To identify the individual cDNA responsible for the reactivity observed for pool E5, E. coli cells from the glycerol stock of the E5 pool were recovered by streaking onto LB agar plates. 20 individual colonies were picked and pooled for a miniprep culture for each of 19 subpools. Plasmids from the subpools were purified using a ZR Plasmid Miniprep (ZYMO Research) kit and used for HEK293T transfection and coculture assays as described above (200 ng of plasmids from each subpool were used for transfection). From the positive subpools 4 and 14, a total of 40 individual colonies (20 from each subpool) were selected, inoculated, and processed for plasmid purification. The purified plasmids were used for coculture assays as described above (200 ng of plasmids from each clone was used for transfection). Positive clones were sent for Sanger sequencing (Eurofins).
Adoptive transfer assay γδT cells from spleens of Il17a+/+TcrdBinder3 mice (CD45.2) were enriched as described in the “Stimulation of TCR Tg γδT cells” section. Enriched cells were labeled with CellTrace Violet (CTV) (Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer’s instructions, and labeling was con- firmed by flow cytometry. Frequency of γδT cells among enriched cells was quantified by flow cytometry, and 1 × 105 γδT cells per recipient were transferred to either WT (CD45.1) or Il17a–/– mice intravenously. Mice were harvested 8 or 23 days after transfer, and the CTV dilution was analyzed by flow cytometry.
Flow cytometry staining reagents Monoclonal antibodies specific for CD3 (17A2, catalog no. 100236, RRID: AB_2561456; catalog no. 564010, RRID: AB_2738540; catalog no. 100241, RRID: AB_2563945), Ly6C (HK1.4, catalog no. 128033, RRID: AB_2562351; 1G7.G10, catalog no. 130- 102- 207, RRID: AB_2660032), CD19 (6D5, catalog no. 115512, RRID: AB_313647; REA749, catalog no. 130- 112- 038, RRID: AB_2655832), CD11c (N418, catalog no. 117310, RRID: AB_313779; catalog no. 130- 122- 016, RRID: AB_2783919), TCRβ (H57- 597, catalog no. 109212, RRID: AB_313435; REA318, catalog no. 130- 120- 289, RRID: AB_2752053), TCRγδ (GL3, catalog no. 118116, RRID: AB_1731813; catalog no. 118124, RRID: AB_11204423; catalog no. 118105, RRID: AB_313829), CD4 (GK1.5, catalog no. 100412, RRID: AB_312697; catalog no. 100414, RRID: AB_312699; catalog no. 100433, RRID: AB_893330), CD8α (53- 6.7, catalog no. 100744,
RRID: AB_2562609), Ter119 (Ter119, catalog no. 116212, RRID: AB_313713), CD122 (TM- β1, catalog no. 562960, RRID: AB_2737918; catalog no. 62- 1222- 82, RRID: AB_2762652; catalog no. 123209, RRID: AB_940615), CD27 (LG.7F9, catalog no. 416- 0271- 80, RRID: AB_2925677), CCR6 (REA277, catalog no. 130- 103- 816, RRID: AB_2655942), Ki67 (SolA15, catalog no. 47- 5698- 82, RRID: AB_2688065), TCR Vγ4 (UC310A6, catalog no. 137703, RRID: AB_10569563), TCR Vγ1 (2.11, catalog no. 141112, RRID: AB_2750517; catalog no. 141109, RRID: AB_ 2750498), TCR Vδ4 (GL2, catalog no. 134905, RRID: AB_1877234), TCR Vδ6.3 (C504.17C, catalog no. 154803, RRID: AB_2728218), CD24 (M1/69, catalog no. 101813, RRID: AB_439715; catalog no. 101831, RRID: AB_2563894), CD73 (TY/11.8, catalog no. 127223, RRID: AB_ 2716102; QA20A48, catalog no. 101703, RRID: AB_2941372), CD44 (IM7, catalog no. 103019, RRID: AB_493682), CD25 (PC61, catalog no. 102037, RRID: AB_11125760), CD69 (QA17A41, catalog no. 164203, RRID: AB_2936560), CD45.1 (A20, catalog no. 110725, RRID: AB_ 893347), CD45.2 (REA1223, catalog no. 130- 124- 080, RRID: AB_ 2811590), T- bet (4B10, catalog no. 644823, RRID: AB_2561760; catalog no. 644809, RRID: AB_2028583), RORγt (B2D, catalog no. 17- 6981- 80, RRID: AB_2573253), IFNγ (REA638, catalog no. 130- 123- 283, RRID: AB_2819467; XMG1.2, catalog no. 505807, RRID: AB_315401), and IL- 17A (TC11- 18H10.1, catalog no. 130- 103- 007, RRID: AB_2660785; catalog no. 506915, RRID: AB_536017) were pur- chased from BioLegend, BD Biosciences, Miltenyi Biotec, or Thermo Fisher Scientific. Anti- streptavidin antibody (3A20.2, catalog no. 410504, RRID: AB_2571915) was purchased from BioLegend. All antibodies and staining reagents were used at dilutions specified by the manufacturer or were determined experimentally.
Flow cytometry Mouse spleen tissue, LNs, and thymi were collected, and single- cell suspensions were obtained by mincing through 70- μm cell strain- ers. For staining with IL17RA- streptavidin, APC- conjugated strep- tavidin was added to dual- strep- tagged recombinant IL17RA in a molar ratio of 1 to 2. Streptavidin was added stepwise 4 times with 10- min incubation on ice between each addition. Cells were prein- cubated in the presence of 10 μl of dasatinib (20 nM) in 96- well plates at 37°C for 12 min, followed by incubation with 10 μl of an IL17RA- streptavidin mixture containing 28 ng/μl strep- tagged IL17RA and 20 ng/μl streptavidin in PBS at room temperature for 1.5 hours with gentle mixing by tapping the plate every 15 min. After washing with 2% FCS/PBS, cells were stained with surface antibodies. For staining with IL17RA- dextramer, APC- conjugated streptavidin dex- tran (FinaBio) was added to recombinant IL17RA in a molar ratio of 1 molecule of IL17RA to 2 molecules of streptavidin. Staining then was performed as described above for IL17RA- streptavidin. For the detection of IL17RA- specific T cells with IL17RA- multimer, cells were stained with APC or APC- Cy7/APC- Vio770–conjugated anti- CD11c, CD19, TCRβ, Ter119, and CD4 (for thymus only) antibodies, followed by magnetic depletion with anti- APC microbeads (Miltenyi Biotec). After depletion, cells were incubated in 20 nM dasatinib solution in 96- well plates at 37°C for 12 min, followed by incubation with 10 to 20 μl of IL17RA- multimer mixture containing 0.1 μg/μl strep- tagged- IL17RA and 0.2 μg/μl streptactin multimers (IBA Lifesciences) in PBS at room temperature for 1.5 hours with gentle mixing by tapping the plate every 15 min. After washing with 2%FCS/PBS, cells were stained with surface antibodies and anti- streptavidin PE antibody (3A20.2, BioLegend) for 30 min on ice. Dead cells were detected using 7- amino- actinomycin D (7- AAD) (Thermo Fisher Scientific), a Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell Stain kit for 405- nm excitation (Thermo Fisher Scientific), or the fixable viability dye eFluor780 (eBioscience) according to manufacturers’ instructions and were excluded from further analysis. We noticed that the best signal- to- noise ratio for the IL17RA multimer staining was achieved when samples were run through the sorter, likely due to the removal
of nonspecifically bound multimer by shearing forces. Therefore, sam- ples were subjected to “mock sorting” in most of the multimer- staining experiments. To this end, after staining, cells within a broad gate that includes all lymphocytes were sorted, collected, and analyzed again. To perform intracellular staining of IL17RA multimer+ cells, sorted IL17RA multimer+ cells were washed with 10 mM desthiobiotin (IBA Lifesciences) solution twice to remove the multimers. Intracellular staining of tran- scriptional factors was performed using a Foxp3/Transcription Factor staining kit (Thermo Fisher Scientific) following the manufacturer’s instructions. Data were acquired on an LSR Fortessa or FACSCanto II (BD Biosciences) flow cytometer and analyzed with FlowJo software v10.10 (BD Biosciences). Cell sorting was performed using FACSAria III and FACSAria Fusion cell sorters (BD Biosciences).
Intracellular staining of Trav13- 4- dv7 mRNA was performed using a PrimeFlow RNA Assay kit (Thermo Fisher Scientific) following the manufacturer’s instructions with minor modifications. In brief, in all steps after fixation, 1/5 of the recommended volume of all reagents was used, and all incubation steps were done in a PCR thermocycler. To specifically target Trav13- 4- dv7, a type 1 probe (Assay ID: VP7DPMJ) containing oligos covering the 116- to 344- bp region of Trav13- 4- dv7 mRNA (GenBank: M26299) was used.
Cytokine production assays Cells were incubated in IMDM supplemented with 10% FCS, 100 U/ml L- glutamine, 100 U/ml penicillin/streptomycin, 50 μM 2- mercaptoethanol, 50 ng/ml PMA (Sigma), and 1 μg/ml ionomycin (Sigma) at 37°C and 5% CO2. After 1 hour, 3 μg/ml brefeldin A (Thermo Fisher Scientific) was added and cells were incubated for another 4 hours. After incubation, cells were collected for surface antibody staining and viability staining, followed by intracellular staining using a BD Cytofix/Cytoperm kit (BD Biosciences) according to the manufacturer’s instructions.
Single- cell PCR and sequencing Single cells were index sorted into 96- well PCR plates with 5 μl of lysis buffer containing 5× First Strand Buffer (Thermo Fisher), 5.6 mM DTT, 0.28% IGEPAL, and 4.4 units of RNaseOUT, and stored at –80°C. For reverse transcription, 0.45 μl of 10 mM dNTP, 100 ng of random hexamer, and 22 units of SuperScript III were added to each well after thawing the plate on ice. The reverse transcription was performed at the following conditions: 10 min at 42°C, 10 min at 25°C, 60 min at 50°C, and 5 min at 94°C. Segments spanning VDJ junctions were amplified by nested PCR using the primers as previously described (73) and the HotStarTaq Plus DNA Polymerase Kit (Qiagen). The first round of PCR was performed in a 12- μl reaction mixture containing 1 μl of cDNA, 10× PCR buffer, 250 μM dNTP, 1.5 mM MgCl2, 0.36 μM of each forward primer, 0.6 μM of each reverse primer, and 0.6 units of HotStarTaq Plus DNA polymerase. The second round of PCR was performed in a 12- μl reaction mixture contain- ing 1 μl of PCR products from the first PCR, 10× CoralLoad PCR buffer, 5× Q- solution, 250 μM dNTP, 0.36 μM of each forward primer, 0.6 μM of each reverse primer, and 0.6 units of HotStarTaq Plus DNA polymerase. PCR was initiated by 5 min at 95°C, followed by 50 cycles of 30 s at 94°C, 1 min at 62°C (64°C for the second round PCR), and 1 min at 72°C with a final extension of 5 min at 72°C. PCR products were cleaned up using a DNA Clean & Concentrator- 5 kit (ZYMO research) and sent for Sanger sequencing (Eurofins).
RNA- seq analysis of BEKO cells Total RNA from BEKO cells was isolated using ZYMO Quick- RNA Microprep Kit (ZYMO) and sent to Novogene (UK) for library preparation and sequencing (NovaSeq 6000 PE150). Analysis was performed as de- scribed previously (74).
Visualization of public scRNA- seq datasets Previously reported scRNA/VDJ- seq datasets (40, 47, 48) were ana- lyzed and visualized using the Seurat package (75, 76).
TCR modeling A structural model of Vγ4Vδ7 TCR55 was generated using SWISS- MODEL (77) (https://swissmodel.expasy.org), and the variable domains were superimposed on a reported crystal structure (1ypz.pdb) of a Vγ4Vδ10 TCR G8 (21). The model was visualized and annotated with UCSF Chimera 1.17.3 and UCSF ChimeraX (78, 79). The residues of the Vδ domain that differed between Vδ7 and Vδ10 and that were solvent accessible (not part of the hydrophobic core and not buried in the Vγ- Vδ interface) were identified.
Statistical analysis Statistical analyses were performed with GraphPad Prism 9 software. Error bars represent the SD of biological replicates unless stated otherwise. Two- tailed unpaired Student’s t tests were used to assess the statistical significance of one observed parameter between two experimental groups. An unpaired analysis of variance (ANOVA) with a Holm- Sidak multiple- comparisons test or Brown- Forsythe and Welch ANOVA with a Dunnett’s T3 multiple- comparisons test was used when more than two experimental groups were compared. For the scatter plot shown in Fig. 2G, Pearson correlation and a two- sided test were used.
ReFeReNces aND NOtes
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acKNOWleDGMeNts
We thank D. Wiest for constructs encoding T10 and T22; F. Wermeling, T. Willinger, A. Krueger,
V. Bekiaris, and V. Glaros for critical reading of this manuscript; F. Van Laethem for discussions on
cDNA library screens; and J. Rorbach and K. H. Ngo for the experiments that were not included in the
final version of the manuscript. We also acknowledge the Biomedicum Flow Cytometry Core Facility
(Karolinska Institutet) supported by KI/SLL, Human Disease and Immune Discovery Facility (the
University of Chicago), and Cytometry and Antibody Technology Facility (the University of Chicago),
for providing cell sorting and analysis services. Funding: This work was supported by the Swedish
Research Council (grants 2021- 01468 and 2025- 02610 to T. Kreslavsky, 2021- 01723 to L.H., and
2022- 04147 to E.B.); Cancerfonden (grants CAN 2018/710 and 21 1602 Pj to T. Kreslavsky);
Barncancerfonden (grants PR2021- 0117 and PR2023- 0091 to T. Kreslavsky); Radiumhemmets
Forskningsfonder (grants 211192 and 231233 to T. Kreslavsky); the Knut and Alice Wallenberg
Foundation (KAW 2024.0097 to T. Kreslavsky as co- applicant); the Hypothesis Fund (T. Kreslavsky);
Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG grants 490846870- TRR355/1 to A.W. and T.R., grant
532695030 to T.R., grant 395236335 to T. Krey and T.H.W., and stipend DU 1964/1- 1 to J.D.); and the
China Scholarship Council (stipend to Y.Y.). Authors contributions: J.D. made T cell hybridomas,
generated the cDNA library, and performed most of the experiments shown in Fig. 1. K.Y. performed
most of the other experiments and supervised A.K., who performed the TCR mutagenesis
experiments shown in Fig. 3. F.M. and V.Z. contributed to the experiments shown in Figs. 5 and 6. S.K.
and T. Krey generated recombinant IL17RA protein and performed experiments not included in the
final version of the manuscript. N.F. performed all experiments involving TCR Tg mice. Y.Y. contributed
to the cloning of several plasmids, parts of the experiments shown in Fig. 1, and many of the animal
experiments. A.D. and V.M. performed TCR55 structural modeling and designed the Vδ7/Vδ10
chimeras. L.V. and T.H.W. provided the scRNA/VDJ- seq dataset before publication and generated TCR
Tg mice. A.B., I.R.L., E.B., and L.H. produced soluble TCR and performed surface plasmon resonance
experiments. T.J.R. provided Il17ra–/– mice. K.H. provided expertise on cDNA library production and
screening. T.R. and A.W. provided the material for the initial characterization of Il17ra–/– and
Il17a–/–Il17f–/– mice and expertise on IL17/IL17R biology. J.K. generated and provided 16.2c11 sFT
reporter cells, BEKO cells, and 1A1 and 1B1 TCR encoding constructs and provided expertise on the
reporter assays and γδT cell biology. T. Kreslavsky suggested the project, supervised the study, and
wrote the manuscript. All authors critically read and edited the manuscript. Competing interests:
J.K. is an employee and stockholder of Repertoire Immune Medicines. The remaining authors declare
no competing interests.. Data, code, and materials availability: Bulk RNA- seq data are deposited
in the Gene Expression Omnibus (GEO) database under accession code GSE292182. The public
scRNA/VDJ- seq datasets used in this study were obtained from the GEO (accession codes
GSE225036, GSE222454, and GSE262064). All other data needed to evaluate the conclusions in the
paper are present in the main text or the supplementary materials. No new code was generated in
the study. The reporter cell line 16.2c11 used in this study is available from J.K. under a material
transfer agreement from Repertoire Immune Medicines to academic and noncommercial scientific
organizations for scientific purposes and to repeat this study. All other materials and new animal lines
generated in this study are available upon request without a requirement for a material transfer
agreement. License information: Copyright © 2026 the authors, some rights reserved; exclusive
licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original US government
works. https://www.science.org/about/science- licenses- journal- article- reuse. This research was
funded in whole or in part by Swedish Research Council (2021-01468, 2021-01723, 2022-04147,
and 2025-02610) and Deutsche Forschungsgemeinschaft (395236335, 532695030, and
490846870-TRR355/1). The author will make the Author Accepted Manuscript (AAM) version
available under a CC BY public copyright license.
sUPPleMeNtaRY MateRials science.org/doi/10.1126/science.adx9264 Figs. S1 to S18; Table S1; Data S1; MDAR Reproducibility Checklist
10.1126/science.adx9264
Submitted 11 April 2025; resubmitted 5 February 2026; accepted 29 April 2026
Tracing the origins of St Helena’s liberated Africans
Xueye Wang†, Judy Watson†, Helena Bennett, Andrew Pearson, Geoff M. Nowell, Joanne Peterkin,
Kate Robson Brown, Alistair Pike, Jason Laffoon, Vicky M. Oelze, Hannes Schroeder
INTRODUCTION: The transatlantic slave trade forcibly displaced
12.5 million Africans, yet the geographic origins and life histories of most remain unknown. Recovering aspects of these erased histories is a priority for descendant communities and scholars.
On St Helena, a community- led initiative has focused on recovering and commemorating the lives of the island’s liberated Africans— people rescued from illegal slave ships and brought to the island, many of whom died soon after arrival and were buried in two unmarked graveyards.
RATIONALE: While historical sources may note coastal ports of embarkation, they rarely document inland origins or early- life movements. In connection with the broader community- led initiative, we used strontium isotope (87Sr/86Sr) analysis and probabilistic spatial assignment, together with archival and available ancient DNA evidence, to reconstruct the geographic origins and early- life move- ments of St Helena’s liberated Africans, informing local discussions around commemoration, ethical stewardship, and reburial.
RESULTS: We report 193 tooth enamel 87Sr/86Sr measurements from 152 individuals. Because enamel forms during childhood and adolescence and incorporates local dietary strontium, it preserves a geochemical record of early- life residence. All individuals show 87Sr/86Sr ratios well above the St Helena baseline, confirming that they were not born on the island. The wide range of values indicates diverse African origins, including highly radiogenic signatures rarely reported in diaspora contexts.
To identify their likely homelands, we matched each 87Sr/86Sr ratio to a sub- Saharan strontium isoscape, generating probabilistic origin estimates. Integrating these results with archival and previously published ancient DNA data further constrained origins: Whereas
Diverse homelands and early- life displacement among St Helena’s liberated Africans. Strontium isotope ratios from 152 individuals, interpreted with an African isoscape and constrained by historical and ancient DNA evidence, indicate diverse origins. Most likely came from near- coastal regions in western Central Africa, but a substantial number show signatures pointing to origins far inland, implying forced movement over hundreds of kilometers. High- resolution intratooth profiles document displace- ment during childhood.
87Sr/86Sr analysis and isoscape modeling
most individuals likely came from coastal or near- coastal regions in western Central Africa, others appear to have originated much farther inland, implying forced displacement over hundreds to thousands of kilometers before embarkation.
By comparing 87Sr/86Sr signatures in teeth that formed early and late in childhood and, for a subset, using high- resolution laser ablation to trace changes across a single tooth, we can glimpse movements within Africa before embarkation. For most, the signals stay consistent, suggesting that they remained in the same region through childhood and early adolescence. However, in a smaller number, the signatures shift sharply, indicating relocation and displacement during childhood, in some cases years before reaching the coast.
CONCLUSION: This study demonstrates how integrating strontium isotope analyses with isoscape- based assignment, historical records, and available ancient DNA data can refine the provenance of human remains and recover traces of forced displacement, including during childhood. Conducted within a community- engaged framework, the findings contributed to local discussions about commemoration, potential repatriation, and the care of human remains. In this case, the diversity of inferred origins underscored the complexity of return and contributed to the decision to reinter the remains on St Helena during a public ceremony in 2022. More broadly, our study illustrates how integrating multiple lines of evidence can support ethically grounded, community-led decision-making about ancestral remains in diasporic contexts.
*Corresponding author. Email: hschroeder@ sund. ku. dk (H.S.); voelze@ ucsc. edu (V.M.O.) †These authors contributed equally to this work. Cite this article as X. Wang et al., Science 393, eaeb3661 (2026). DOI: 10.1126/science.aeb3661
Underlying geology
Full article and list of author affiliations: https://doi.org/10.1126/ science.aeb3661
M2 molar (~3-7 yrs)
M3 molar (~9-14 yrs)
Probability
Tracing the origins of St Helena’s liberated Africans
Xueye Wang1,2†, Judy Watson3†, Helena Bennett4,
Andrew Pearson5, Geoff M. Nowell6, Joanne Peterkin6,
Kate Robson Brown3, Alistair Pike7, Jason Laffoon8,
Vicky M. Oelze2, Hannes Schroeder9,10
In the mid- 19th century, St Helena became a key receiving point for Africans “liberated” from illegal slave ships by the British Royal Navy. Of the ~27,000 landed, ~8000 died soon after arrival and were buried locally. In connection with a broader community- led commemorative effort, we analyzed tooth enamel strontium isotope (87Sr/86Sr) data for 152 individuals, including high- resolution intratooth profiles, to identify likely origins and infer forced movements before embarkation. Isoscape- based probabilistic assignment, integrated with historical evidence and published ancient DNA data, constrains homelands ranging from coastal Central Africa to far inland areas, revealing long- distance movements, sometimes beginning in childhood. By refining provenance, these data informed local decisions about care and potential repatriation, highlighting the complexities of return and ultimately supporting reburial on St Helena.
The transatlantic slave trade was one of the largest and most conse- quential episodes of forced migration in history, transporting >12.5 mil- lion Africans across the Atlantic, with >1.8 million estimated to have died during the Middle Passage (1). Archival research has revealed major trends, including intensification in the 17th and 18th centuries, shifts in the relative importance of African coastal regions, and changes in the sex and age composition among the captives (2, 3). Yet the pre cise geographic origins of many individuals remain difficult to reconstruct. The Transatlantic Slave Trade Database records ports of embarkation and disembarkation (1), but coastal shipping points often drew captives from vast catchment areas. Ancient DNA (aDNA) studies are start ing to shed new light on individual origins (4–7), but resolving fine- scale geographic origins remains challenging. In this study, we used stron- tium isotope analyses to help address this gap and provide insight into the diverse origins of those forcibly displaced by the transatlantic slave trade.
Located in the middle of the South Atlantic, the island of St Helena played a pivotal role during the final decades of the transatlantic slave trade (Fig. 1A). Following the Abolition of the Slave Trade Act in 1807, the island served as a maritime staging post for the Royal Navy’s West Africa Squadron, which was tasked with intercepting slave ships en- gaged in human trafficking off the African coast. Intercepted vessels were then brought to vice- admiralty courts in Sierra Leone, the Cape Colony, or St Helena for trial (8). Consequently, St Helena’s role tran- sitioned from a maritime way station to a depot for liberated Africans.
1Center for Archaeological Science, Sichuan University, Chengdu, China. 2Anthropology Department, University of California, Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA. 3Department of Archaeology and Anthropology, University of Bristol, Bristol, UK. 4St Helena National Trust, Broadway House, Mainstreet, Jamestown, St Helena. 5Cotswold Archaeology, Kemble, UK. 6Department of Earth Sciences, Durham University, Durham, UK. 7Department of Archaeology, University of Southampton, Southampton, UK. 8Faculty of Archaeology, Leiden University, Leiden, Netherlands. 9Globe Institute, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark. 10School of Archaeology, Faculty of Humanities, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark. *Corresponding author. Email: hschroeder@ sund. ku. dk (H.S.); voelze@ ucsc. edu (V.M.O.) †These authors contributed equally to this work.
Archival records indicate that St Helena received 26,866 Africans be- tween 1840 and 1863 (1). Most had embarked from ports in western Central Africa, with smaller numbers originating from West and Southeast Africa (Fig. 1 and data S1). The majority of these individuals did not remain on the island for long and were subsequently resettled in South Africa or British colonies in the Caribbean and South America (8, 9). However, many arrived malnourished and in poor health, and an estimated 8000 died on St Helena soon after arrival (9). Their re- mains were buried in two unmarked graveyards in Rupert’s Valley on the north side of the island (8, 9).
In 2007 and 2008, archaeological excavations related to the con- struction of St Helena’s first commercial airport uncovered the articu- lated remains of 325 individuals in two large graveyards in Rupert’s Valley, together with additional disarticulated human remains from an unknown number of individuals (9) (fig. S1 and supplementary text S3). The location and burial context suggest that the graves are associ- ated with liberated Africans who died on the island between 1840 and the early 1860s. During this period, the Liberated African Establishment housed hundreds of individuals at a time, providing them with rudi- mentary shelter, food, and medical care (8).
In the wake of these discoveries, discussions involving local stake- holders and international experts developed over time regarding how best to study, commemorate, and care for the remains. These efforts eventually led, in 2016, to the formation of the Liberated African Ad- visory Committee (LAAC) under the auspices of the St Helena National Trust. The LAAC has worked to recover knowledge about the origins and lived experiences of the liberated Africans, to guide the ethical treatment and eventual reburial of the human remains and associated grave goods, and to advocate for a memorial and interpretive center at the site. As part of these broader, evolving efforts, we conducted strontium isotope analyses on 152 individuals, integrating these results with previously published aDNA (7) and historical evidence (1, 8) to refine understanding of their geographic origins and to evaluate the extent to which such evidence could inform discussions around po- tential repatriation of their remains.
Strontium isotope (87Sr/86Sr) analysis has emerged as a valuable method for identifying migrants in archaeology, including forced migrants in the context of the transatlantic trade in enslaved Africans (10–17). The 87Sr/86Sr ratios in human tooth enamel primarily reflect the underlying geology of the area where an individual lived during the period of enamel formation (i.e., childhood and adolescence; sup- plementary text S4) (18). Given the widespread distribution of an- cient Precambrian rock formations in Africa and their correspondingly high 87Sr/86Sr ratios (19, 20), this method is particularly effective for identifying first- generation enslaved Africans in the African diaspora (11, 13, 16, 21). However, pinpointing their exact origins has been much more challenging because similar isotopic signatures can be found across multiple geographic locations, compounded by the lack of suitable reference data from Africa (12). Recent advancements in spatial assignment modeling (22, 23), along with the development of a large- scale bioavailable strontium isotope map (isoscape) of sub- Saharan Africa (19), now provide an important foundation for more accurately estimating the geographic origins of captive Africans during the transatlantic slave trade.
Using geographic assignment modeling (24) and the published strontium isoscape (19), we estimated the most likely origins of 152 lib- erated Africans on the basis of their tooth enamel 87Sr/86Sr ratios. By integrating these isotope- based assignments with historical evidence and previously published aDNA data for a subset of individuals (7), we further refined potential homelands, highlighting the value of com- bining multiple lines of evidence. Additionally, we analyzed paired early- and late- forming teeth (e.g., premolars and third molars) from 41 individuals to reconstruct their movements before embarkation. For 10 individuals, we also conducted high- resolution measurements across single teeth using laser ablation multi- collector inductively
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Number of captives
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Fig. 1. Historical context. (A) Map showing the location of St Helena and African embarkation ports for liberated Africans brought to St Helena (1840–1863); circle size denotes estimated numbers. Basemap from Natural Earth (https://www.naturalearthdata.com). (B) Numbers of liberated Africans landed on St Helena (1840–1863) by embarkation port. Data are derived from the Transatlantic Slave Trade Database (data S1) (1).
coupled plasma mass spectrometry (LA- MC- ICP- MS) to reveal intra- individual mobility patterns during the period of tooth formation. Together, these analyses shed light on two aspects of the trade in en- slaved Africans that have been difficult to reconstruct: individuals’ likely regions of origin and their forced movements before embarkation.
The origins of St Helena’s liberated Africans The origins of St Helena’s liberated Africans were likely diverse, al- though historical records indicate that the vast majority came from western Central Africa, with smaller numbers from the Bight of Benin and the port of Quilimane in Southeast Africa (Fig. 1). Data from the Transatlantic Slave Trade Database indicate that >90% of the captives transported to St Helena between 1840 and 1863 were shipped from 11 coastal ports in western Central Africa, including Benguela, Novo Redondo, and Quicombo in central Angola, and Luanda and the port of Ambriz in the north (Fig. 1B and data S1). Only two ships embarked from ports outside Central Africa—namely, Mozambique and the Bight of Benin—accounting for 2 and 1.3% of the total number of captives brought to St Helena, respectively (1). This is further supported by data from the vice- admiralty court on St Helena, which reveal that most ships that were intercepted by the Royal Navy and brought to St Helena were captured off the coast of western Central Africa (8).
Western Central Africa
Ambriz
Luanda
Benguela
Southeast Africa
Quilimane
Genetic evidence further supports the historical data: aDNA analy- sis of 20 individuals from Rupert’s Valley revealed affinities with present- day populations from Gabon and northern Angola, while also showing considerable diversity indicating that they did not de- rive from a single ethnic group or population (7). These results are consistent with eyewitness accounts by Royal Navy personnel on the island, who reported multiple languages among the captives, includ- ing Congo and Benguela dialects (25). They also align with historical evidence from archives in Cuba, Angola, and Brazil, which indicates that ∼72% of captives shipped from Central African ports between 1831 and 1855 originated from three linguistic groups in Angola and the Congo River basin (26, 27) (supplementary text S2). Together, these multiple lines of evidence help narrow down the likely origins of St Helena’s liberated Africans; however, where exactly they origi- nated remains uncertain.
Congo River
Strontium isotopes confirm diverse origins The 87Sr/86Sr results of 193 samples from 152 individuals display a wide range of values, from 0.71278 to 0.77254 (data S2). The vast majority of individuals (116 of 152) fall within the range between 0.712 and 0.730,
Congo North
Cabinda
Coanza River
1840 1841 1842 1843 1844 1846 1847 1848 1849 1850 1857 1859 1860 1861 1862 1863
Year
500 1000 1500 2000 2500 3000
with the remaining individuals having 87Sr/86Sr ratios exceeding 0.730, indicating that they grew up in areas with highly radiogenic bedrock. In contrast, three modern microfauna tooth enamel samples from St Helena yielded markedly lower 87Sr/86Sr ratios, ranging between 0.70783 and 0.70832 (Fig. 2A and data S3), reflecting the island’s young volcanic geology and substantial marine strontium inputs (28). All analyzed individuals exhibited substantially higher 87Sr/86Sr ratios than the local baseline, confirming their nonlocal origins, while the breadth of values indicates highly diverse origins consistent with archival evi- dence. Compared with other colonial- era sites related to the slave trade, St Helena’s liberated Africans exhibit some of the highest 87Sr/86Sr ratios (fig. S2 and data S4). The only other site in the African diaspora with a similar range of values is the cemetery of Pretos Novos in Rio de Janeiro, Brazil (13), which was used to bury enslaved Africans who had died shortly after arrival.
Isoscape modeling constrains possible origins across sub- Saharan Africa To further investigate the geographic origins of the individuals, we con- ducted isotope- based geographic assignment using individual tooth enamel 87Sr/86Sr data in conjunction with a recently published stron- tium isoscape of sub- Saharan Africa (19, 24). The dataset was divided into 10 groups at intervals of 0.005 (Fig. 2A), with representative in- dividuals from each group mapped to illustrate general trends (Fig. 2B and fig. S3). Individuals with 87Sr/86Sr ratios between 0.710 and 0.730 could have originated from a wide range of possible locations, reflect- ing the limited geographic resolution within this interval; however, predictive accuracy improved at higher values. Group 1 (n = 11) most likely originated from coastal western Central Africa or areas north of Cameroon. Groups 2 to 4 (n = 137), which form the largest portion of the dataset, suggest diverse origins across western Central Africa. Group 2 spans much of this region, including northwestern Angola, whereas group 3 exhibits a similar distribution but with lower prob- abilities north of the equator. In group 4, the likelihood of origins north of Cameroon diminishes, with a stronger probability for origins in present- day Angola. For individuals with 87Sr/86Sr values of >0.730, our modeling provides more refined predictions. Group 5 (n = 25) is most strongly associated with Angola, with lower probabilities in the Democratic Republic of the Congo (DRC). Group 6 (n = 11) is confined to a highly specific region of central Angola, whereas individuals in groups 7 to 9 (n = 10) likely originated from scattered inland areas across southern Africa, including present- day Angola, Namibia, Botswana,
Bight of Benin, place unspecified
Unspecified
Mayumba Loango
Quicombo Novo Redondo
Africa, port unspecified West-Central Africa and St Helena, port unspecified
Fig. 2. Geographic assignment modeling results. (A) Histogram of tooth enamel 87Sr/86Sr ratios from liberated Africans buried in Rupert’s Valley, St Helena, with kernel
density overlay and local bioavailable baseline from modern microfauna. (B) Normalized probability assignments for individuals across sub- Saharan Africa based on tooth
enamel 87Sr/86Sr measurements and the published Sr isoscape (19). One representative individual is shown for each of the 10 87Sr/86Sr groupings in (A). Maps focus on Central
Africa (full extent in fig. S3); higher- ratio groups (groups 7 to 10) extend into central and southeastern Africa. Orange dashed lines mark approximate distances of 200 and
400 km from the coast. Individuals marked with # symbol have both 87Sr/86Sr and aDNA data (7). Darker shading indicates higher relative likelihood of origin.
Zambia, Zimbabwe, and Malawi. Notably, an adolescent with the highest 87Sr/86Sr ratio (individual 476) points to areas in present- day Zimbabwe as their most likely place of origin.
Integrating historical, isotopic, and genetic evidence Integrating historical, isotopic, and genetic evidence provides a power- ful framework for refining the likely homelands of St Helena’s liberated Africans. Archival sources identify embarkation ports and associated ethnolinguistic groups, while strontium isotopes and aDNA offer in- dependent evidence to test and narrow these historical constraints. Of the 20 individuals with previously published aDNA data (7), 15 were also analyzed for 87Sr/86Sr in this study (fig. S1), enabling more specific geographic attribution.
Individual 289, an adult male with dental modification who died at ∼26 to 35 years of age, illustrates this approach (Fig. 3A). His 87Sr/86Sr value alone matches multiple regions across Africa, including West Africa, western Central Africa, and the Congo Basin, as well as South and East Africa. When we then constrain these isotope- based proba- bilities using historical evidence (1), we can exclude much of West and East Africa, substantially narrowing the range of plausible homelands. aDNA provides an additional independent constraint, further narrowing his likely origins to areas in present- day southern Gabon and northern Angola (Fig. 3A) (7).
For those with highly radiogenic 87Sr/86Sr values (groups 4 to 9), the combination of isotopic, genetic, and historical evidence enables pre- cise localization to specific regions within Angola, particularly for individuals in groups 6 to 9, whose likely origins can be narrowed to very small areas (Fig. 3B). For individuals with more common 87Sr/86Sr values (groups 2 and 3), we can exclude many regions across the con- tinent and restrict their most probable homelands to areas between Angola and Gabon (Figs. 2B and 3B). Collectively, these results dem- onstrate how integrating multiple lines of evidence systematically constrains uncertainty, yielding a more resolved picture of the geo- graphic origins and forced movements of individuals captured during the 19th- century slave trade.
Although aDNA is a powerful tool for reconstructing ancestry, it has some limitations for provenance (4, 7, 29–31). First, genetic affinities reflect ancestral origins and population history rather than an indi- vidual’s birthplace or childhood residence. Second, provenance infer- ence is complicated in sub- Saharan Africa, where exceptionally high genetic diversity and strong population substructure (32) intersect with uneven and incomplete reference datasets—especially for under- represented regions such as the Congo Basin (7, 30). Third, most analyses rely on present- day reference populations, which may not accurately capture population structure at the time of the transatlantic slave trade given long histories of mobility, conflict, forced displacement, and social reorganization (30, 31), and because many groups span modern national borders or remain mobile (30). In our dataset, these
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B
Fig. 3. Refining individual geographic origins by integrating 87Sr/86Sr, historical records, and aDNA evidence. (A) Individual 289 (group 2) illustrating progressive constraint of
origin estimates using (left) 87Sr/86Sr evidence alone, (middle) 87Sr/86Sr and historical evidence (1), and (right) combined 87Sr/86Sr, historical, and aDNA evidence (7). (B) Normalized
probability assignments for individuals with aDNA data across 87Sr/86Sr groups, applying the same sequential filtering framework. Darker shading indicates higher relative likelihood
of origin; gray areas were excluded by historical and/or genetic evidence. Orange dashed lines mark approximate distances of 200 and 400 km from the coast.
challenges are compounded by the limited number of individuals with published aDNA data, underscoring the need for broader sampling to build a more complete picture. Against this backdrop, adding strontium isotope evidence—especially when interpreted through isoscape- based assignment and triangulated with historical records—can help narrow likely regions of origin beyond what genetic data alone can resolve.
Slave trade reached deep into the African interior The strontium isotope results also indicate that although most of the individuals (groups 1 to 3) came from regions within a few hundred kilometers from the coast, several (within groups 4 to 10) likely origi- nated much farther inland in interior regions of Angola, Zimbabwe, or other parts of southern Africa (Fig. 2B). This is consistent with historical evidence that suggests that most liberated Africans who appear in slave registers from Cuba, Brazil, and Angola likely origi- nated from areas no more than 400 km from the coast (27) (fig. S4 and supplementary text S2). At the same time, these results echo eyewitness and autobiographical accounts suggesting that some cap- tives were forced to travel vast distances overland before reaching one of the coastal trading ports (25, 33). These results contribute to long- standing debates about the inland reach of the transatlantic slave trade (27). While some scholars have argued that most captives were sourced from areas relatively close to the coast (34), others have pointed out that the geographic reach of the slave trade expanded progressively into the interior as the trade intensified (35, 36). Taken together, our results suggest a more nuanced pattern at St Helena: While most likely originated from coastal or near- coastal regions,
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several individuals experienced substantially longer forced move- ments before embarkation.
Signals of early- life displacement Analysis of 87Sr/86Sr ratios in early- and late- forming teeth from 41 indi- viduals provides direct evidence for relocation during childhood, before embarkation and transportation to St Helena. For most individuals, similar 87Sr/86Sr ratios in paired teeth indicate residence in the same region through childhood and early adolescence (Fig. 4A), implying that any later relocation occurred after late- forming enamel had min- eralized (i.e., after ~13 to 14 years of age). However, 10 individuals display notable differences in 87Sr/86Sr ratios (>0.002) between their early- and late- forming teeth, indicating relocation during childhood or early adolescence. Comparable patterns of individual displacement have been documented in other enslaved populations—in the Caribbean (12, 14), for example—suggesting that forced movement often began well before reaching the coast. Among these individuals, five exhibit shifts in 87Sr/86Sr ratios exceeding 0.005, with late-forming teeth con- sistently showing lower ratios, perhaps reflecting movement toward coastal regions.
Human tooth enamel forms incrementally during childhood and is not remodeled (18). Consequently, enamel 87Sr/86Sr reflects the local environment during tooth formation, integrating dietary and water inputs over weeks to months rather than recording a single moment (18) (supplementary text S4). Bulk analyses therefore provide an aver- aged signal of childhood residence, whereas high- resolution laser- ablation sampling can detect shifts within a single tooth during growth
0.7420
0.7370
0.7320
87Sr/86Sr
87Sr/86Sr
0.7270
0.7220
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0.7120
Individuals with dental modifications Local bioavailable 87Sr/86Sr range Individuals without dental modifications
0.7070
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Rat
M1 M2 M3 Premolar Human remains Female Male Rabbit Rat Unidentified Animal remains
B C Ind. 242 ♂ adult
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0.7300
0.7250
0.7200
0.7150
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Laser ablation profile (from cusp to cervix)
Fig. 4. Evidence of childhood relocation. (A) Paired- tooth 87Sr/86Sr ratios for 41 liberated Africans from Rupert’s Valley, St Helena, comparing early- and late- forming teeth.
(B) Intratooth 87Sr/86Sr profiles from in situ LA- MC- ICP- MS (11 enamel transects from 10 individuals; individual 242 includes both M2 and M3; data S5). (C) Normalized probability
assignments for individual 242 based on the early- (M2) and late- forming (M3) teeth, which show the largest isotopic offset observed in the assemblage. Darker shading indicates
higher relative likelihood of origin; gray areas were excluded by historical evidence. Orange dashed lines mark approximate distances of 200 and 400 km from the coast.
(37–39). To better constrain timing, we performed in situ LA- MC- ICP- MS along the enamel growth axis in 11 teeth from 10 individuals. Six indi- viduals show near- constant values across the growth sequence, consistent with stable early- life residence (Fig. 4B). In contrast, three individuals (206, 316, and 343) show pronounced intratooth shifts, including peak changes consistent with one or more relocations during enamel forma- tion (Fig. 4B and fig. S5), providing higher- resolution insight into early- life displacement.
One adult male (242), who died between the ages of 19 and 25, illus- trates how combining inter- and intratooth isotopic approaches can help bracket when relocation occurred. His second and third molars (M2 and M3) differ in their “bulk” values (Fig. 4A), yet each tooth shows stable values within the crown during formation (Fig. 4B). This pattern is most consistent with a change in residence after M2 crown completion but before M3 crown formation began, corresponding to relocation at ∼7 to 9 years of age (40). Isoscape- based assignment further suggests an early childhood origin in inland Angola followed by residence in a lower- 87Sr/86Sr coastal region near the likely port of embarkation (Fig. 4C). Together, these results provide a rare constraint on the timing of child trafficking in the transatlantic slave trade and offer a more time- resolved window into forced displacement before Atlantic embarkation.
Implications for remembrance and repatriation Our study shows that strontium isotope analyses, when interpreted through isoscape- based assignment and combined with historical and
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genetic evidence, can substantially narrow the likely regions of origin for individuals displaced by the transatlantic slave trade. This ability to refine provenance has direct implications for ongoing discussions about whether, and how, human remains from diasporic contexts might be returned and what forms of evidence are most informative in guiding such decisions (41–43). Because the liberated Africans themselves could not give their consent to be included in this study, the ethical basis for this research rested on (i) formal custodial per- mission from the St Helena government, including elected representa- tives of the local community; (ii) community oversight as it developed through the LAAC; and (iii) sustained engagement with the local stakeholders.
At the same time, the wide range of origins we document high- lights a central challenge for repatriation in diaspora contexts: Even when provenance can be refined, individuals may derive from multiple and widely separated regions, making it difficult to identify a single destination for return. For the Rupert’s Valley assemblage, community consultation on St Helena therefore focused both on what science could contribute to provenance and on how best to ensure dignified care and commemoration. Although these individuals are referred to as “liberated Africans,” there is no evidence that they were ever able to return to their African homelands, and efforts to reach out to po- tential countries of origin did not lead to sustained engagement. The decision to rebury the remains on St Helena was therefore developed through a government- initiated process, led by the LAAC and guided
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by community consultation, and was formalized through the ap- proval of a memorialization master plan in 2020 (44). This process ultimately resulted in the respectful reinterment of the remains on the island in 2022.
More broadly, the St Helena case highlights how the decision to reinter the remains on the island, rather than treating return to the African continent as the only possible outcome, raises important questions about diasporic identity, community agency, and the repatriation and reburial of African diasporic remains. It shows that connections to Africa and concepts of “home”—and, by extension, preferences around return—are complex, varied, and context dependent (42, 45–47). In this context, our study demonstrates how integrating isotopic, genetic, and historical evi- dence can refine provenance beyond what any single line of evidence allows, while also acknowledging the remaining uncertainties. Rather than determining a single destination for return, these approaches pro- vide an empirical framework to support informed, community- led deci- sions about remembrance and potential repatriation.
Materials and methods Community engagement, consultation, and approvals Engagement around the Rupert’s Valley Liberated African assemblage took place over more than a decade and evolved alongside the research. Initial discussions were held in 2012 during a field visit conducted as part of the EUROTAST project (2011–2015), involving members of the local community, the St Helena National Trust, and representatives of the St Helena government. After these consultations, the St Helena Government granted permission for sampling, isotope analysis, and aDNA analysis (supplementary text S1).
Community engagement continued as local governance structures developed. The LAAC was established in late 2016 under the auspices of the St Helena National Trust to guide commemoration, ethical care, and decision- making regarding study and reburial of the remains. Members of the author team maintained dialogue with LAAC members and other local stakeholders as stewardship plans developed, including those set out in a memorialization master plan (44), which proposed a memorial at Rupert’s Valley, an on- site interpretation center, and the reburial of the excavated remains and associated grave goods.
In November 2020, we convened a workshop with local stakeholders and community members on St Helena to share interim findings from the EUROTAST project and to jointly consider next steps for the Rupert’s Valley remains. The workshop combined short presentations by the EUROTAST team on the aDNA and strontium isotope results with an open discussion led by local participants, who raised questions, offered interpretations, and articulated priorities for dignified care, com- memoration, and future handling of the remains—including reburial and the feasibility of repatriation. These locally guided discussions, to- gether with a wider public consultation process on St Helena, informed the decision to respectfully reinter the remains on the island during a public ceremony in 2022.
Historical estimates Demographic estimates were derived from the Transatlantic Slave Trade Database (www.slavevoyages.org/voyage/database; accessed 22 March 2025). Records were queried by setting St Helena as the prin- cipal place of landing and restricting the time period to 1840–1863; results were exported with individual years as the row grouping.
Age and sex estimation Osteological age and sex estimates were drawn from previously pub- lished assessments (9) based on pelvic and cranial morphology follow- ing established protocols (48, 49). For individuals with aDNA data, genetic sex determinations (7), inferred from X/Y read ratios (50), were used as an independent check and were fully concordant with the osteological assessments. Individuals lacking sufficient skeletal pres- ervation or genetic data were classified as unidentified.
Sampling strategy We selected 193 dental enamel samples from 152 individuals for 87Sr/86Sr analysis, including paired teeth from 41 individuals. The sampled in- dividuals comprised 96 males (84 definite; 12 probable), 23 females (10 definite; 13 probable), and 33 of unidentified sex, and were pre- dominantly adults (n = 111; ~18 to 45 years), with 41 individuals ≤18 years of age, and 114 individuals with dental modification (data S2). Local bioavailable 87Sr/86Sr range was estimated from three modern micro- fauna incisors (one rat, two rabbits) collected within ∼1 mile of the exca- vation area in Rupert’s Valley, St Helena.
Because enamel records childhood residence during tooth- specific formation windows (51), we preferentially sampled premolars (n = 106) and third molars (M3; n = 70), with fewer second molars (M2; n = 14) and first molars (M1; n = 2). Approximate enamel formation spans 0 to 3 years for M1, ~2.5 to 7/8 years for M2, ~2.5 to 6/8 years for premolars, and ~8/9 to 13/14 years for M3 (40, 52). For paired- tooth analyses, premolar- M3 combinations were used in most cases (34/41); alternative pairs (M1- M2, M2- M3, or premolar- M2) were analyzed when premolars or M3 were unavailable (n = 7). To assess intratooth variability, high- resolution in situ 87Sr/86Sr profiles were generated using LA- MC- ICP- MS for 11 teeth from 10 individuals.
Sampling was minimally destructive: For solution- based 87Sr/86Sr measurements, small enamel chips were removed from tooth crowns and fully dissolved during analysis; LA- MC- ICP- MS analyses were per- formed in situ on sectioned teeth. As a result, only minimal residual material remains, consisting of a few small enamel fragments, which will be returned to St Helena for reburial after the publication of this study, in accordance with the permissions granted by the St Helena government (supplementary text S1).
Sample preparation All teeth were photographed ahead of sampling. Tooth enamel sam- pling followed established protocols (53). Tools were ultrasonically cleaned between samples (5% Decon- 90, 5 min), rinsed with Milli- Q water, and dried. To minimize surface contamination, the outer ~100 μm of enamel was removed with a tungsten carbide burr. An enamel frag- ment was removed using two approximately parallel cuts (2 to 4 mm apart) oriented perpendicular to the cervical margin; in some cases, a third cut was required. Fragments were further cleaned to remove any adhering dentine and altered/crack- associated enamel until only compact core enamel remained; poorly preserved samples were ex- cluded. Cleaned enamel was transferred to precleaned, labeled micro- centrifuge tubes for digestion and strontium separation.
Enamel samples for LA- MC- ICP- MS analysis were prepared by cut- ting wedge- shaped sections from cusp to cervix using a rotary tool equipped with a diamond- embedded blade. Sections were oriented with the thin edge facing the dentine and the thick edge aligned with the external enamel surface. Owing to the inherent brittleness of enamel, some sections fractured during preparation, preventing the recovery of complete cusp- to- cervix transects in all cases.
Solution- based MC- ICP- MS analysis MC- ICP- MS analysis of strontium isotopes was performed in the clean laboratory in the Department of Earth Sciences, Durham University, UK. Tooth enamel was dissolved overnight in 500 μl 3 M HNO3 at 75° to 100°C, and Sr was purified using Sr- Spec resin following established protocols (54). Samples were prescreened to adjust Sr concentrations to a consistent beam intensity before measurement. 87Sr/86Sr ratios were measured on a Thermo Fisher Neptune MC- ICP- MS, with a ~30- s rinse in 3 M HNO3 between samples. Results were corrected for iso- baric interferences, mass fractionation, and instrumental drift. Average procedural blanks were 11 pg and negligible relative to the strontium concentrations of enamel samples. All results were normalized to an NIST SRM 987 87Sr/86Sr value of 0.710250 (54, 55), and analytical un- certainty did not exceed ±0.00002 (2σ).
High- resolution LA- MC- ICP- MS analysis In situ 87Sr/86Sr profiles were generated at the University of Southampton, UK, using a New Wave UP193FX laser coupled to a Thermo Fisher Neptune MC- ICP- MS. Although external precision is lower than for solution- based measurements (56, 57), LA- MC- ICP- MS provides sub- millimeter spatial resolution suitable for assessing intratooth isotopic variability and has been widely applied in mobility studies (37, 39, 58). Enamel was analyzed along cusp- to- cervix transects after preablation to remove surface material, avoiding dentine. Typical conditions were 8 to 10 Hz repetition rate, 90% laser energy, and a 150- μm spot size. Isotopic ratios were calibrated and corrected using NIST SRM 610 (59) together with a matrix- matched, in- house secondary standard consist- ing of ball- milled, ashed bovine long bone. For individuals analyzed by both approaches, LA- MC- ICP- MS 87Sr/86Sr values agreed well with solution- based MC- ICP- MS measurements, supporting the reliability of the intratooth profiles (fig. S6). In individuals 389 and 343, the final four or five points at the cervical margin were excluded from figures and interpretation because enamel in this region was less mineralized and more susceptible to mixing with altered dentine (60).
Geographic assignment modeling of human 87Sr/86Sr ratios To estimate geographic origin probabilities, we used a published stron- tium isoscape for sub- Saharan Africa that provides mean 87Sr/86Sr values and associated standard errors derived from random forest regression using the infinitesimal jackknife method (19). Geographic assignment was performed using the continuous- surface framework implemented in the R package “AssignR” (pdRaster function) (24). For each individual, resulting probability surfaces were normalized by dividing each cell value by the maximum probability, allowing com- parison among individuals.
ReFeReNces aND NOtes
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(2026); https://doi.org/10.5281/zenodo.19605943.
acKNOWleDGMeNts
We thank the community of St Helena, the St Helena government, the St Helena National
Trust, and the St Helena Research Institute for facilitating this study. We are particularly
grateful to R. Cairns- Wicks and members of the LAAC for their support and ongoing efforts to
commemorate and honor St Helena’s liberated Africans, who themselves could not give
their consent to have their remains analyzed as part of this study. We also thank M. T. P. Gilbert
and the three anonymous reviewers for their thoughtful and constructive comments on
earlier versions of this manuscript. Funding: This project was funded through the Marie
Skłodowska- Curie Actions (grant 290344) under the 7th European Framework Program (FP7)
and the Webster Foundation. Author contributions: H.S., H.B., K.R.B., and A.Pi. designed the
study and acquired funding. J.W., G.M.N., and J.P. generated the data. X.W. and J.W. analyzed
the data. X.W., J.W., H.B., A.Pe., J.L., V.M.O., H.S., and A.Pi. interpreted the data. K.R.B., A.Pe.,
V.M.O., H.S., and A.Pi. supervised the work. X.W., J.W., and H.S. wrote the manuscript, with
input from J.L., V.M.O., H.B., A.Pe., and the remaining authors. Competing interests: The
authors declare that they have no competing interests. Data, code, and materials
availability: All data supporting the findings of this study are included in the article and the
supplementary materials. No new materials were generated for this study. All analyses were
conducted using publicly available software. The R scripts used for data analysis and figure
generation have been archived on Zenodo (61) and are also available on GitHub (https://
github.com/XY2025- Archaeology/StHelena_isotope). Requests for access to associated
records and materials can be made to H.B. at the St Helena National Trust. License
information: Copyright © 2026 the authors, some rights reserved; exclusive licensee
American Association for the Advancement of Science. No claim to original US government
works. https://www.science.org/about/science- licenses- journal- article- reuse
sUPPleMeNtaRY MateRials science.org/doi/10.1126/science.aeb3661 Supplementary Text; Figs. S1 to S7; References (62–102); MDAR Reproducibility Checklist; Data S1 to S5
10.1126/science.aeb3661
Submitted 11 August 2025; accepted 27 May 2026
Dendritic cells control tertiary lymphoid structure development and maintenance in cancer
Raphaël Mattiuz et al.
INTRODUCTION: Lymphoid aggregates accumulate in chronic inflammatory lesions, including tumors. They consist of organized assemblies of innate and adaptive immune cells arising in nonlym- phoid tissues and are thought to operate as local hubs for lymphocyte recruitment, (re)activation, and maintenance. The most mature aggregates, which develop T and B cell zones with germinal centers, are referred to as tertiary lymphoid structures (TLSs). The presence of TLSs is associated with superior prognosis and response to immune checkpoint blockade (ICB) in cancer, which makes these structures attractive therapeutic targets.
RATIONALE: Previous studies have identified DC- LAMP, expressed by mature dendritic cells (DCs), as a specific marker of human TLSs. Studies have also identified that CD11c+ cells, which include DCs and other myeloid populations, are required for TLS persistence in mouse lung infection models. However, the precise contribution of major histocompatibility complex class I (MHC- I) and MHC- II antigen presentation, including cross- presentation by specific dendritic cell subsets, to TLS initiation, maintenance, and function in cancer remains unknown. Given the strong association of TLS presence with ICB response, defining the cellular and molecular drivers of TLSs in cancer is now a critical priority.
RESULTS: To address the role of DCs in TLS formation and mainte-
nance, we developed a mouse model of non–small cell lung cancer
(NSCLC) that forms mature TLSs (KP- HELLO- 2) containing B cell
follicles with germinal centers and T cell zones with T follicular
helper (TFH) cells and TCF1+PD- 1+ progenitor exhausted CD8+ T
(TPEX) cells. We show that, during early stages of tumor development,
TLS formation relies on interferon- γ (IFN- γ)–driven maturation
of type 1 conventional dendritic cells (cDC1s), migration of cDC1s to
tumor- draining lymph nodes (tdLNs), WDFY4- dependent cross-
presentation, and ultimately the recruitment of activated T cells to
the tumor site.
As tumors progress, TLS maintenance becomes independent of
T cell egress from tdLNs, coinciding with a significant reduction
of cDC1 migration to tdLNs. Instead, mature cDC1s accumulate
within intratumoral CCR7 ligand–enriched stromal hubs. Notably,
timed depletion of cDC1s or preventing their migration to these
stromal hubs after TLSs are formed disrupts TLS functional
architecture and maintenance. We found that cDC1- mediated
concomitant MHC- II and MHC- I antigen presentation to CD4+ and
CD8+ T cells and intact CD40 signaling are critical for the
maintenance of TLSs, the preservation of the TFH cell pool, germinal
center formation, tumor- specific immunoglobulin G (IgG) produc-
tion, and the differentiation of TPEX cells. Furthermore, expanding
or activating DCs with FLT3L-Fc or CD40 agonist expands TLSs.
Using spatial transcriptomics and multiplex imaging across
various human tumors, we confirmed that mature DCs expressing
high levels of CCR7 accumulate in TLSs close to CCL19+ stromal
hubs and interact with TFH cells, TPEX cells, and B cells. Moreover,
Mature cDC1s orchestrate TLS formation and maintenance through concomitant antigen presentation to CD4+ and CD8+ T cells. (1) TLS formation requires the maturation of cDC1s and their migration to tdLNs followed by (2) the recruitment of primed T cells into the tumor microenvironment. As tumors progress, (3) intratumoral migration of cDC1s into CCR7 ligand–enriched stromal hubs becomes essential for TLS maintenance. This process (4) depends on concomitant antigen presentation to both CD4+ and CD8+ T cells to sustain the TFH cell pool, drive TPEX cell differentiation, and (5) support germinal center (GC) formation and tumor- specific IgG production.
the presence of mature DCs or TLSs correlates with improved overall survival in NSCLC and disease- free survival in hepatocel- lular carcinoma.
CONCLUSION: These findings underscore the pivotal role of mature cDC1s in both establishing and maintaining functional TLSs, primarily through concomitant MHC- II and MHC- I antigen presentation to CD4+ and CD8+ T cells within tumor lesions. They further highlight the therapeutic potential of cDC1- targeted strategies to enhance TLS function and improve antitumor immu- nity in cancer patients.
Full article and list of author affiliations: https://doi.org/10.1126/ science.ady1678
Dendritic cells control tertiary lymphoid structure development and maintenance in cancer
Raphaël Mattiuz1,2, Jesse Boumelha1,2†, Emmanouil Aerakis1,2,3†,
Jessica Le Berichel1,2†, Pauline Hamon1,2†, Laszlo Halasz1,2,
Abishek Vaidya1,2,4, Brian Y. Soong1,2, Emir Radkevich1,2,5,
Hye Mi Kim6, Matthew D. Park1,2, Romain Donne1,2,7,8,
Leanna Troncoso1,2, Rachel A. Kaplan1,2, Clotilde Hennequin1,2,
Isaias Hernández- Verdin9, Lucía López10, Frederika Rentzeperis1,2,
Darwin D’Souza1,2,5, Medard Ernest Kaiza6, Ian P. MacFawn6,11,
Meriem Belabed1,2, Guillaume Mestrallet1,2,8,12, Etienne Humblin1,2,
Raphaël Merand1,2,5, Samarth Hegde1,2, Jean- Christophe Lone13,
Giorgio Ioannou1,2, Sinem Ozbey1,2, Igor Figueiredo1,2,
Alexander Tepper1,2,14, Hajer Merarda1,2, Nadine Serhan1,2,
Maximilian M. Schaefer1,2, Jinping An15, Ray A. Ohara16,
Erika Nemeth1,2, Simon Goldstein1,2, Amanda M. Reid1,2,
Moataz Noureddine4,17, Alexandra Tabachnikova1,2,
Giulia Maria Piperno10, Maria Tsoumakidou3, Jalal Ahmed1,2,
Alexandros D. Polydorides18, Nina Bhardwaj1,2,8,12,
Amaia Lujambio1,2,7,8, Zhihong Chen1,2,5, Edgar Gonzalez Kozlova1,2,
Seunghee Kim- Schulze1,2,5, Joshua D. Brody1,2,
Michael Schotsaert1,2,13,17, Christine Moussion19, Sacha Gnjatic1,2,
Vladimir Roudko1,2,5, Florent Ginhoux20, Kenneth M. Murphy16,
Catherine Sautès- Fridman9, Wolf Herman Fridman9,
Brian D. Brown1,2,14, Thomas U. Marron1,2,12,21, Federica Benvenuti10,
Jason G. Cyster15, Hélène Salmon22, Tullia C. Bruno6,
Nikhil S. Joshi23, Alice O. Kamphorst1,2,8,24,25, Miriam Merad1,2,5*
Tertiary lymphoid structures (TlSs) are associated with
immunotherapy response, yet the mechanisms controlling their
formation and maintenance remain unclear. using spatial
transcriptomics and multiplex imaging across human tumors, we
found that CCR7+ mature dendritic cells (DCs) accumulate in
TlSs. In a mouse non–small cell lung cancer model that forms
mature TlSs, we show that early TlS development requires
interferon- γ (IFN- γ)–driven type 1 conventional dendritic cell
(cDC1) maturation, migration to tumor- draining lymph nodes
(tdlNs), and T cell recruitment. As tumors progress, TlSs
persist independently of tdlN T cell egress, coinciding with cDC1
accumulation within intratumoral CCl19 stromal hubs. There,
cDC1–major histocompatibility complex class 1 (MHC- I) and
–MHC- II concomitant antigen presentation, along with CD40
signaling, sustain TlS, T follicular helper (TFH) cell pool, germinal
centers, and tumor- specific immunoglobulin G (IgG). These
findings highlight local mature cDC1s as key TlS orchestrators
and potential targets to enhance antitumor TlS function.
Tertiary lymphoid structures (TLSs) are organized immune aggregates that resemble canonical secondary lymphoid organs, containing naïve and antigen- experienced T and B cells organized in T cell zones and B cell follicles, respectively (1, 2). With few exceptions, patients with tumors enriched in TLSs have improved outcome and enhanced re- sponse to immune checkpoint blockade (ICB) (3–7), which suggests that TLSs may contribute to the priming of naïve T cells or enable the reactivation of effective T cell responses upon ICB treatment (8).
Previous findings have reported that TLSs in non–small cell lung can- cer (NSCLC) are associated with DC- LAMP+ mature dendritic cells (DCs) (5). However, the exact role for antigen presentation in the maintenance
and functionality of TLSs remains unclear (8). Conventional dendritic cells (cDCs) are specifically equipped to prime and educate T cells (9). Two subsets of cDCs have been identified in humans and mice, including type 1 cDCs (cDC1s), which excel in the (cross- )presentation of cell- associated antigens to CD8+ and CD4+ T cells, and cDC2s, which are most potent to present soluble protein antigens to CD4+ T cells (9, 10). Both cDC1s and cDC2s up- regulate a similar gene expression program upon capture of antigens, becoming mature DCs that are specialized to modulate T cells (11). Using spatial transcriptomics and multiplex imag- ing analysis of various human tumors, we found that pathology- annotated TLSs are composed of cDCs in a mature molecular state along with T follicular helper (TFH) cells, TCF1+PD- 1+ progenitor exhausted CD8+ T (TPEX) cells, and B cells. Together, these results prompted us to explore the contribution of cDCs to the formation and maintenance of TLSs in tumor lesions.
Given that cDCs can both prime T cells within tumor- draining lymph nodes (tdLNs) and reactivate T cells at the tumor site, it became essential to develop models that allow for the conditional manipulation of cDCs to dissect their specific contributions in these distinct tissue sites. To address this, we engineered a tumor model that reliably forms mature TLSs and developed strategies for constitutive or conditional depletion or genetic manipulation of cDCs at different time points after tumor development. In this work, we show that mature DCs, particularly mature cDC1s, are central to TLS formation, maintenance, and function in tumors.
Results Mature DCs are enriched in human TLSs, where they interact with TFH cells and B cells across several tumor types Mature DCs exhibit a discrete cellular program that is up- regulated in cDC1s and cDC2s upon capture of cell debris in tumor lesions and reflects the state in which cDCs interact with T cells (11, 12). To map the spatial distribution of cDC subsets and states within human tu- mors, we performed spatial transcriptomics (Visium SD, 10x Genomics) analysis of human NSCLC, hepatocellular carcinoma (HCC), colorectal cancer (CRC), and clear cell renal cell cancer (ccRCC) (13). We found a substantial enrichment of mature DC (CCR7, FSCN1, CD40, CD80, CCL17, and CCL22), cDC1 (XCR1, CLNK, and CADM1), TFH cell (CXCL13, TCF7, ICOS, CD40LG, and PDCD1), PD- 1+ CD8+ T cell (PDCD1, CD8A, and CD8B), naïve T cell (IL7R, CCR7, and TCF7), memory B cell (CD19 and BANK1), and germinal center B cell (LMO2, MEF2B, and RGS13) molecular programs in pathology- annotated intratumoral TLSs but de- enrichment at the tumor core (Fig. 1A and fig. S1, A to C; https:// rstudio-connect.hpc.mssm.edu/mattiuz_science2026_tls_spatial_data/). By contrast, monocyte and macrophage gene programs were distrib- uted both within and outside TLSs (fig. S1B). We also examined gene expression pathways associated with mature DCs, either by character- izing those found in mature DC- rich TLS spots from spatially mapped human tumor lesions (fig. S1D) or mature DCs identified in TLS- enriched NSCLC and HCC lesions by single- cell RNA sequencing (scRNA- seq) (14, 15) (table S1). In both analyses, we found that mature DCs in TLS- enriched lesions up- regulated major histocompatibility complex class 2 (MHC- II) and MHC- I antigen presentation machinery and CD40 signaling pathways (fig. S1, E and F).
To investigate mature DC cellular interactions within TLSs at the single- cell level in NSCLC and HCC, we used a targeted spatial transcriptomic technology (MERFISH) to map 500 gene probes that we had previously identified to be highly enriched in tumor lesions by scRNA- seq (14–16) (table S2). We confirmed that mature DCs were significantly enriched in TLSs within the tumor compared with their immature counterparts (cDC1s and cDC2s) (Fig. 1B and fig. S1G). Notably, tumor cDC1s displayed higher expression of ma- ture DC- associated genes compared with cDC2s (fig. S1H). Because DC maturation is linked to the uptake of cellular debris (11, 12), this suggests a greater accumulation of tumor antigen–loaded cDC1s within TLSs.
Proximity analysis revealed that within TLSs, mature DCs were closely located (within a 30- μm radius) to naïve B and T cells, germinal center B cells, and TFH and TPEX cells (Fig. 1C and fig. S1, G, I, and J). DC- LAMP, encoded by LAMP3, was found to be exclusively expressed by mature DCs within the immune compartment of NSCLC and HCC by scRNA- seq (fig. S1K). Using multiplex imaging, we confirmed at the protein level that DC- LAMP+ mature DCs and CLEC9A+ cDC1s were enriched in TLSs (Fig. 1D, fig. S1L, and table S3). Furthermore, we identified an intermediate state along the cDC1–to–mature DC transi- tion, enriched in TLSs, which coexpresses CLEC9A and DC- LAMP (fig. S1M). We also found that mature DCs were primarily located in the T cell zone or at the T- B zone border close to high endothelial venules (HEVs), similar to their positioning in lymph nodes (17) (Fig. 1E and fig. S1, N and O), and there was a similar density of mature DCs in TLSs with or without germinal centers (fig. S1P).
In patients with locally advanced or metastatic NSCLC who failed platinum therapy, a randomized phase 2 trial (POPLAR) comparing PD- L1 blockade (atezolizumab) with chemotherapy (docetaxel) re- ported a significant survival benefit of PD- L1 blockade over chemo- therapy (18). Bulk RNA- seq analysis of pretreatment biopsies within this cohort showed that those with higher TLS density, as annotated by a pathologist, exhibited a robust mature DC gene signature and superior survival outcomes (Fig. 1F and fig. S2A). Furthermore, in these patients, the mature DC signature correlated with signatures of com- ponents of TLSs, including TFH cells, TPEX cells, and naïve B and T cells (fig. S2B and table S4). These observations strongly suggest that en- richment in mature DCs correlates with TLS occurrence and can serve as a prognostic marker for improved survival (5). We confirmed the signature correlations in pretreatment biopsies from the BIONIKK trial, which included 199 metastatic kidney cancer patients treated with anti–PD- 1 (nivolumab), anti–PD- 1, and anti- CTLA4 (nivolumab and ipilimumab) or VEGFR tyrosine kinase inhibitors (19) (fig. S2C). Furthermore, in a cohort of HCC patients treated with neo- adjuvant anti–PD- 1 (cemiplimab) (20), patients enriched in TLSs in posttreat- ment tumor resections had improved disease- free survival, which was associated with increased tumor infiltration of mature DCs and local T cell clonal expansion (Fig. 1G and fig. S2, D and E). Collectively, these findings underscore the potential key role of mature DCs within TLSs in fostering the response to ICB in human tumors, which prompted our interest in understanding the contribution of mature DCs in TLS formation, maintenance, and function in tumors.
Mature cDC1s accumulate within TLSs in preclinical lung cancer tumors To study the role of cDCs in the formation and function of TLSs in cancer, we used a modified mouse lung adenocarcinoma (LUAD) line, named KP- HELLO- 2, derived from KRASLSL- G12D;Trp53fl/fl (KP) mice (21) expressing the model antigen HELLO (neoantigen fusion of the B cell antigen HEL, the CD8 epitope GP33, and the CD4 epitope GP66) (22) and the Thy- 1.1 antigen (CD90.1) (Fig. 2A). Intravenous injection of KP- HELLO- 2 cells led to the formation of orthotopic lung adenocarcinoma lesions with high numbers of intratumoral TLSs with defined T cell and
1Marc and Jennifer Lipschultz Precision Immunology Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, USA. 2Department of Immunology and Immunotherapy, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, USA. 3Institute for Bioinnovation, “Alexander Fleming” Biomedical Sciences Research Center, Vari, Greece. 4Graduate School of Biomedical Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, USA. 5Human Immune Monitoring Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, USA. 6Tumor Microenvironment Center, Department of Immunology, UPMC Hillman Cancer Center, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA, USA. 7Liver Cancer Program, Division of Liver Diseases, Department of Medicine, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, USA. 8Tisch Cancer Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, USA. 9Department of Immunology, Inflammation, Complement and Cancer, Centre de Recherche des Cordeliers, Sorbonne Université, INSERM, Université Paris Cité, Paris, France. 10Cellular Immunology, International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology, ICGEB, Trieste, Italy. 11Department of Biology, Grove City College, Grove City, PA, USA. 12Division of Hematology and Medical Oncology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, USA. 13GIMM, Gulbenkian Institute for Molecular Medicine and Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa, Lisbon, Portugal. 14Icahn Genomics Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, USA. 15Howard Hughes Medical Institute and Department of Microbiology and Immunology, University of California, San Francisco, San Francisco, CA, USA. 16Department of Pathology and Immunology, Washington University in St. Louis School of Medicine, St. Louis, MO, USA. 17Global Health and Emerging Pathogens Institute and Department of Microbiology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, USA. 18Henry D. Janowitz Division of Gastroenterology, Department of Medicine, and Department of Pathology, Molecular and Cell- Based Medicine, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, USA. 19Genentech, South San Francisco, CA, USA. 20Paris- Saclay University, Gustave Roussy, INSERM U1015, Villejuif, France. 21Institute for Thoracic Oncology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, USA. 22Institut Curie, Paris, France. 23Department of Immunobiology, Yale University School of Medicine, New Haven, CT, USA. 24Department of Oncological Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, USA. 25Department of Graduate Education, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, USA. *Corresponding author. Email: miriam. merad@ mssm. edu †These authors contributed equally to this work.
B cell zones (Fig. 2B; fig. S3, A to C; and movies S1 and S2), many of which displayed prominent germinal centers that harbored CD21+ stromal fol- licular dendritic cells (FDCs) adjacent to activation- induced cytidine de- aminase (AID)+ germinal center B cells (Fig. 2C). Consistent with what we observed in human tumor lesions, mouse TLSs were enriched in germinal center B cells (B220+BCL6+), TFH cells (CD4+PD- 1+TCF1+/BCL6+), and TPEX cells (CD8+TCF1+PD- 1+) located in close proximity (Fig. 2D, fig. S3D, and table S5) as well as tumor antigen–specific pretransferred CD4+ T cells (CD4+CD45.1- SMARTA+) and endogenous B cells (B220+HEL+) (Fig. 2E). Furthermore, DCs expressing high levels of CCR7, MHC- II, and CD86 ac- cumulated in TLSs, where they interacted with CD4+ T cells, CD8+ T cells, and B cells (Fig. 2F).
TLSs were inversely correlated with tumor burden, which suggests that these structures contributed to antitumor immunity (Fig. 2G). Imaging analysis of tumor lesions in Xcr1mCherry cDC1- reporter mice confirmed that cDC1s (CD11c+Xcr1- mCherry+) accumulated in TLSs in proximity to T and B cells (Fig. 2H), as observed in human cancer lesions, and most cDC1s charged with tumor antigens (mScarlet+) were in a mature state (CD40+CD86+) (Fig. 2I and fig. S3E). We confirmed by multiplex immu- nofluorescence that mature cDC1s (F4/80−CD11b−CD11c+CD86+) were enriched in TLSs (Fig. 2J), where they exhibited more cell- cell interactions compared with outside TLSs, particularly with cell types most enriched within TLSs, including TFH cells, TPEX cells, and germinal center B cells (fig. S3F). We confirmed using Ms4a3Cre;Rosa26lox−stop−lox- Tdt mice and inducible Ms4a3CreERT2; Rosa26lox−stop−lox- Tdt mice, which constitutively or conditionally trace monocyte- derived cells (23, 24), that cDCs accumulat- ing in TLSs were bona fide, lineage- committed cDC1s and cDC2s, rather than monocyte- derived DCs (fig. S3, G and H).
To probe whether cDCs or specific cDC subsets played a role in TLS formation, we injected KP- HELLO- 2 cells into Xcr1- DTA mice that spe- cifically lacked cDC1s (fig. S3I). We generated these mice by crossing Xcr1Cre mice (25) with Rosa26lox−stop−lox- DTA mice to enable constitutive depletion of XCR1+ cDC1s while sparing cDC2s (26, 27). Absence of cDC1s led to significantly reduced TLSs in both number and size and reduced TFH cells (CXCR5+PD- 1+ CD4+ T cells), interferon- γ (IFN- γ+) CD4+ T cells, CD8+ T cells, and germinal center B cells within tumors, which was accompanied by increased tumor burden (Fig. 2K and table S6). Similar results were obtained upon injection of KP- HELLO- 2 cells into cDC1- deficient Batf3−/− mice (fig. S3, I and J). cDC1 depletion also had a major effect on the functional architecture of remaining lym- phoid aggregates which were devoid of germinal center B cells, TFH cells, and TPEX cells (fig. S3K). Moreover, using Wdfy4−/− mice, deficient in cDC1- mediated cross- presentation (28), we observed a significant reduc- tion in TLS numbers and a decrease in PD- 1+ CD8+ T cells (fig. S3L), indicating impaired induction of tumor- specific CD8+ T cells. Given the role of cDC1 cross- presentation and their close interaction with both CD8+ and CD4+ T cells, we interrogated whether T cells were also re- quired for TLS formation. Depletion of either CD4+ or CD8+ T cells re- sulted in a significant reduction in TLS numbers (fig. S3M).
cDC1s were also required for intratumoral TLS formation in autoch- thonous lung adenocarcinomas in KP genetically engineered mouse model (GEMM), in mice challenged with orthotopic Hep- 53.4 liver
B C
D
F
Fig. 1. Mature DCs accumulate in TLSs across human cancers. (A) FFPE Visium SD spatial transcriptomics analysis of NSCLC tumors (n = 2 patients). Representative Visium
SD slide showing pathology- annotated TLS (left; scale bar, 1 mm); TLS and border spots (two layers of spots located outside the TLS); and hotspots for mature DC, cDC1, TFH
cell, PD- 1+ CD8+ T cell, and germinal center (GC) B cell gene signatures inferred from scRNA- seq references (right). (B and C) MERFISH spatial transcriptomics analysis of
NSCLC (n = 6 patients and slides) and HCC (n = 14 patients and 16 slides) tumors. In HCC, GC B cells were identified only in MERSCOPE panel 2 (n = 7 patients and slides).
(B) Fold change of mature DC, cDC1, and cDC2 populations in TLS versus non- TLS areas in NSCLC (top) and HCC (bottom). P < 0.05; P < 0.001; **P < 0.0001 (Wilcoxon
rank sum test); bars indicate the mean. (C) Cell proximity analysis showing enrichment score for immune populations within 30 μm of mature DCs in TLS areas; box- and- whisker
E
G
plots showing the median (center line), interquartile range (box), and minimum- to- maximum whiskers, with representative TLS area illustrating interactions between mature DCs, TFH cells, TPEX cells, and B cells in NSCLC [top; scale bars, 100 μm (left) and 10 μm (right)] and HCC [bottom; scale bars, 200 μm (left) and 10 μm (right)]. (D) Quantifica- tion of mature DC (DC- LAMP+) and cDC1 (CLEC9A+) densities in non- TLS versus TLS regions by multiplex IHC (MICSSS) in NSCLC patients (n = 23 patients); epithelial cells expressing DC- LAMP were excluded from the analysis. P < 0.001; *P < 0.0001 (paired t test); data indicate means ± SEMs. (E) Representative multiplex immunofluores- cence (IF) staining of a mature TLS (CD4, CD20, CD21, AID, Ki67, PNAd, DAPI), paired with consecutive DC- LAMP IHC staining of NSCLC tumors. Representative of 14 mature TLSs (tissue microarray from a cohort of 41 patients). Scale bars, 100 μm (overview) and 50 μm (zoom). (F) Bulk transcriptomes paired with TLS annotations in NSCLC (n = 168 patients, including 60 TLSHI patients, from Genentech POPLAR dataset). Kaplan- Meier analysis compares overall survival of TLS- positive versus TLS- negative patients, mature DC- high versus mature DC- low patients, and TLS- positive/mature DC- high patients versus all other patients. Statistics by log- rank (Mantel- Cox) test. (G) Kaplan- Meier analysis comparing disease- free survival of TLS- high versus TLS- low HCC patients (n = 18 patients) treated with neoadjuvant PD- 1 blockade [P = 0.0310, log- rank (Mantel- Cox) test].
tumors, and for peritumoral TLS formation in mice with orthotopic AKPS colon tumors (fig. S3, N and O). Notably, mature cDC1s gener- ated in vitro upon capture of apoptotic KP- HELLO- 2 tumor cells were also sufficient to drive the formation of immune aggregates ex vivo upon coculture with purified intratumoral T and B cells within tumor spheroids (fig. S3P).
CCR7 and IFN- γ receptor expression on cDCs is critical for TLS formation We next sought to investigate the cDC molecular signals that regulate TLS formation in tumors. Using the Visium SD spatial transcriptomics platform to quantify gene signature scores in mature DC–enriched TLS spots, we observed an enrichment in IFN- γ gene signature (fig. S3Q). IFN- γ receptor (IFN- γR) signaling promotes cDC immunogenic function and their ability to instruct effective antitumor T cell responses (11, 26, 29). To examine whether IFN- γ signaling in cDCs plays a role in TLS formation, we generated mice lacking IFN- γR specifically within the cDC compartment (Zbtb46Cre;Ifngr1fl/fl mice) (Fig. 2L). We found that absence of IFN- γR signaling prevented cDC maturation (CD40+), reduced TLS formation, and increased tumor burden, which was accompanied by a marked decrease in TFH cells, IFN- γ+ CD4+ T cells, and CD8+ T cells within tumors (Fig. 2L). This prompted us to identify the source of IFN- γ locally and in tdLNs. We found that IFN- γ is primarily produced by PD- 1+ CD8+ T cells and ICOS+ CD4+ T cells in tumor- bearing lungs and T helper 1 (TH1)–like (CXCR6+) and TFH- like (PD- 1+ICOS+) cells in tdLNs (fig. S3R). Furthermore, multiplex immunofluorescence revealed that IFN- γ was primarily secreted in TLSs by TFH cells and, to a lesser extent, TPEX cells (fig. S3S).
CCR7 up- regulation is required for cDC migration to the T zone of secondary lymphoid organs toward CCR7 ligands produced by the lymphatic endothelium and stromal cells that populate the T zone (30, 31), which helps position cDCs charged with tissue antigens in proximity to naïve T cells, thus enabling the priming of tumor- specific immunity. To probe whether cDC migration to secondary (or tertiary) lymphoid organs through CCR7 ligands contributed to TLS formation, we generated mice lacking Ccr7 specifically within the cDC compart- ment (Zbtb46Cre;Ccr7fl/fl mice) (Fig. 2M) and challenged these mice with KP- HELLO- 2 tumors. CCR7 deletion in cDCs significantly dis- rupted TLS development and increased tumor burden with a notable decrease in TFH cells, IFN- γ+ CD4+ T cells, CD8+ T cells, and germinal center B cells in tumors (Fig. 2M). Altogether, these results establish that IFN- γ–driven maturation and CCR7- dependent cDC migration to lymphoid structures contribute to the formation of TLSs in lung can- cer lesions.
cDC1s are required locally for TLS maintenance cDCs are required for T cell priming in tdLNs, and efficient priming of T cells may contribute to the formation of TLSs, but cDCs also in- teract with T cells within tumor tissues and may contribute to TLS maintenance locally. To examine whether TLS formation is dependent on cDCs within tdLNs or at the tumor site, we first explored the con- tribution of T cells primed in tdLNs to TLS formation using FTY720 to inhibit lymphoid egress from the tdLNs (32). We found that inhibi- tion of T cell egress during the first 9 days after tumor engraftment significantly reduced TLS formation, whereas inhibition of T cell egress
after day 9 had little effect on the number of TLSs in tumors (Fig. 3A). These results establish that T cell priming in the tdLNs is critical for TLS formation but not for TLS maintenance locally in tumor lesions, which prompted us to measure longitudinal changes in immune cell composition that were associated with TLS formation and mainte- nance in tumors.
Longitudinal profiling of tumor lesions revealed that intratumoral im- mature TLSs arise from or near the vasculature and progress toward ma- ture TLSs with the formation of B cell follicles and T cell zones at later time points (Fig. 3B). Specifically, we observed a marked increase in TLS number and size during tumor progression, and the increase in TLSs was particularly steep after day 8 (Fig. 3B). Notably, the number of mature cDC1s and cDC2s carrying tumor- associated antigens (mScarlet+) in- creased in the tdLNs until day 8 after tumor implantation, after which their accumulation in the tdLNs was strongly reduced while they instead started to accumulate locally at the tumor site (Fig. 3C). Tumor- specific CD4+, TFH cell, and TH1 cell populations were maintained over time (Fig. 3D), whereas there was a steady accumulation of antigen- experienced (PD- 1+) and terminally exhausted (CD39+TCF1–PD- 1+) CD8+ T cells during tumor progression (Fig. 3E). At later time points, coinciding with the greatest expansion of TLSs, we also observed a substantial expansion of TPEX cells (CD39–TCF1+PD- 1+) (Fig. 3E) accompanied by a significant increase in the frequency of germinal center B cells and class- switched tumor- specific immunoglobulin G (IgG) antibodies (Fig. 3F). Altogether, these observations reveal that the accumulation of mature cDC1s and cDC2s in tumors correlates with the accumulation of TPEX cells, germinal center B cells, IgG antibody production, and TLS expansion at the tumor site, which prompted us to explore the role of tumor- infiltrating cDCs in TLS maintenance locally.
To probe the role of cDCs in TLS maintenance, we generated two models to either deplete the entire cDC compartment or specifically cDC1s starting at day 8 after tumor implantation to allow for T cell priming, egress from the tdLNs, and accumulation in tumor tissues. We reconstituted wild- type (WT) mice with bone marrow cells isolated from mice expressing the diphtheria toxin receptor (DTR) within ZBTB46+ cDC (Zbtb46- DTR), which enables restricted cDC depletion after DT injection while sparing endothelial cells, which also express Zbtb46 (33) (fig. S4A). We also generated Xcr1- DTR mice by crossing Xcr1Cre mice with Rosa26lox−stop−lox- DTR mice to enable timed deletion of XCR1+ cDC1s and mature cDC1s that have expressed Xcr1 while sparing cDC2s (25–27) (fig. S4A). We found that the depletion of the entire cDC compartment, or specifically the cDC1 subset, at day 8 after tumor engraftment signifi- cantly reduced TLS numbers in tumor tissues at similar levels (Fig. 3G), so we subsequently focused on the role of cDC1s in TLS maintenance in tumor- bearing mice.
cDC1 depletion reduced the frequency of TFH cells in tumors (Fig. 3H), led to a disappearance of germinal centers (Fig. 3I), reduced the number of CD8+ T cells and proliferating cells within TLSs, and reduced the number of AID+ Ki67+ germinal center B cells (Fig. 3J) and tumor- specific IgM and class- switched IgG antibodies (Fig. 3K and fig. S4B). Altogether, these results established that cDC1s are required locally for the maintenance and function of TLSs.
To further confirm that cDC1s promote TLS maintenance through local interaction with tumor- infiltrating T cells, we blocked late- stage tdLN egress after priming occurred. We found that whereas blocking
B C
E F
G I H J
K
L
M
Fig. 2. Mature cDC1s control TLS formation. (A) Schematic representation of constructs used to generate KP- HELLO- 2. (B to H and J) Immunofluorescence analysis of representative KP- HELLO- 2 TLS at day 15 postengraftment in WT mice. (B) Staining of B cell and T cell zones with B220 and CD3. Scale bar, 100 μm. (C) GC+- TLS stained with AID, CD19, CD4, CD8, CD21, and Ki67. Representative of 7 mice. Scale bar, 50 μm. (D) Representative images (CyCIF) and density quantification of GC B cells (B220+ BCL6+), TFH cells (CD4+ PD- 1+ TCF1+/BCL6+), and TPEX cells (CD8+ PD- 1+ TCF1+) in TLS and non- TLS areas (TLS identified by CD4, CD8, PD- 1, B220, and DAPI staining). n = 6 mice. Scale bar, 100 μm. P < 0.05; P < 0.01; **P < 0.001 (paired t test); bars indicate the means. (E) Adoptively transferred antigen- specific CD4 T cells (SMARTA CD45.1) stained with CD45.1, PD- 1, and CD4; endogenous antigen- specific B cells stained with HEL antigen, B220, and GL7. Representative of 10 mice. Scale bar, 100 μm. (F) Mature DCs (CD11c+ MHC- II+ CCR7+ CD86+) within mature TLSs stained with B220, CD4, CD8, TCF1, BCL6, and Ki67. Representative of 8 mice (CyCIF). Scale bar, 100 μm. (G) Immunofluorescence analysis of TLS (stained for CD3, B220, and DAPI) and tumor area assessed by H&E on consecutive sections at day 15 postengraftment. Inverse correlation between TLS area and tumor area (percentage of lung area) in WT mice (n = 196, pooled from 27 independent experiments). Linear regression analysis, P = 0.0005. (H) Representative images of
D
TLS from Xcr1- mCherry- Cre mice showing CD3 and B220 immunofluorescence, paired with consecutive IHC staining for CD11c and mCherry, and quantification of cDC1 density in TLS and non- TLS areas (n = 5 mice). Scale bar, 100 μm. P < 0.01 (paired t test); bars indicate the means. (I) cDC1 maturation status (CD40 and CD86 expression in mScarlet+ cDC1s) at day 12 postengraftment (representative of 13 mice from two independent experiments). (J) Density quantification (CyCIF) of mature cDC1s (F4/80− CD11b− CD11c+ CD86+) in TLS and non- TLS areas (identified by CD4, CD8, PD- 1, B220, and DAPI staining). n = 6 mice. P < 0.01 (paired t test); bars indicate the means. (K to M) Immunofluorescence of TLS (CD3, B220, and DAPI; scale bar, 200 μm) number and mean size, tumor area assessed by H&E on consecutive sections (scale bar, 1 mm) and tumor- bearing lung quantification of TFH cells (PD- 1+ CXCR5+ CD4+), GC B cells (CD19+ IgD− IgM− GL7+), IFN- γ+ CD4+, and CD8+ T cells by flow cytometry on day 15 in Xcr1- DTA (n = 12 per group, representative of two independent experiments; data indicate means ± SEMs) (K), Zbtb46Cre; Ifngr1fl/fl (n = 10 to 11 per group, representative of two independent experiments; data indicate means ± SEMs) with flow cytometry quantification of CD40 expression on cDC1s in tumor- bearing lungs on day 15 (L), and Zbtb46Cre; Ccr7fl/fl mice (n = 13 to 20 per group, pooled from two independent experiments; data indicate means ± SEMs) (M) versus littermate controls. P < 0.05; P < 0.01; P < 0.001; **P < 0.0001 (unpaired t test).
T cell egress at day 8 after tumor implantation did not affect TLS number, concomitant cDC1 depletion at day 9 significantly reduced TLS maintenance in tumors (Fig. 3L). Accordingly, we found that ad- ministration of the DC growth factor FMS- like tyrosine kinase 3 ligand agonist fused to an Fc domain (FLT3L- Fc) on day 8 after tumor im- plantation significantly increased the number of cDCs and cDC1s (fig. S4C) and doubled TLS numbers in tumors (Fig. 3M). Additionally, administration of FLT3L in mice after implantation of parental KP- HELLO tumor cells, which do not form mature TLSs, tended to increase TLS formation (fig. S4D). Also, in metastatic breast cancer patients, we observed increased TLS formation in one out of six patients after FLT3L treatment as compared with their pretreatment biopsy (fig. S4E). Collectively, these results indicate that TLS maintenance and function in tumor tissues depended on tumor- infiltrating mature cDC1s, and therapeutic strategies boosting intratumoral DCs can pro- mote TLS formation. In line with the role of TLSs in antitumor im- munity and the requirement of cDC1s for TLS maintenance, depletion of cDC1s at day 8 after tumor implantation significantly reduced over- all survival of tumor- bearing mice (Fig. 3N).
cDC1 migration to CCR7 ligand–enriched stromal hubs locally control TLS maintenance The observation that cDCs significantly altered their migration trajec- tory to accumulate in tumor tissues rather than in the tdLNs after day 8 post–tumor engraftment suggested that they were actively recruited to a tissue hub. To explore the molecular signals that promoted cDC migration to specific tumor sites and their contribution to TLS mainte- nance locally, we generated a ligand- receptor analysis map across the different cellular compartments that populate TLSs in human NSCLC lesions using MERFISH (Fig. 4A). We found that mature DCs within TLSs expressed the highest levels of ligand- receptor pairs that interact with CD4+ T cells, including PD- L1 (CD274), PD- L2 (PDCD1LG2), ICOSLG, CD80/86, CCR4 ligands (CCL17 and CCL22), and CD40. Mature DCs expressed high CCR7 levels, whereas we have previously shown that one of the CCR7 ligands, namely CCL19, was highly expressed by ADH1B+ cancer- associated fibroblasts (CAFs) and perivascular cells (16). We sub- sequently validated the spatial proximity of ligand- receptor pairs using Visium HD (fig. S5A). Accordingly, spatial transcriptomic analysis of NSCLC revealed that CCL19- expressing perivascular cells and ADH1B+ CAFs were enriched in proximity to mature DCs within TLSs (fig. S5, B to E). We confirmed the close interaction within TLSs between CCL19- expressing cells, stromal cells, mature DCs, and T cells at single- cell resolution using Visium HD on three NSCLC patients (fig. S5F). Using multiplex imaging analysis, we confirmed that in human NSCLC, TLSs were enriched in CCL19- producing ADHB1+ CAFs and MYH11+ perivas- cular cells located in proximity to mature DCs (Fig. 4B). Similarly in mouse tumors, TLSs were enriched in CCL19, and cDCs accumulated in CCL19+ regions within TLSs (Fig. 4C). Because CCR7 is the main receptor for CCL19, we examined whether deletion of CCR7 in cDC1s after T cells are primed and recruited to tumor sites compromises TLS maintenance in tumor tissues. To enable the temporal deletion of CCR7 specifically in the cDC1 subset, we reconstituted CD45.1+ mice with 1:1 (Xcr1- DTR CD45.2+:Ccr7−/− CD45.1+/CD45.2+) mixed bone marrow cells (Fig. 4D). DT administration at day 8 after tumor engraftment resulted in the
depletion of the entire CCR7- proficient WT cDC1 compartment, whereas the remaining cDC1s lacked CCR7 (fig. S6A). Notably, CCR7 deletion from cDC1s at day 8 after tumor implantation significantly reduced the number and size of TLSs and reduced the number of TFH cells in lung tumors (Fig. 4E).
Similar findings were obtained upon CCR7 deletion from the whole cDC compartment using mice reconstituted with 1:1 (Zbtb46- DTR CD45.2+:Ccr7−/− CD45.1+/CD45.2+) mixed bone marrow (fig. S6, A and B). Temporal deletion of CCR7 from cDC1s prevented their ac- cumulation in TLSs and altered the functional architecture of re- maining lymphoid aggregates, which contained reduced germinal center B cells, TFH cells, TPEX cells, and naïve T cells (fig. S6, C and D). Furthermore, CCR7 deficiency reduced cellular interactions of mature cDC1s (fig. S6E) and prevented their migration toward CCL19- expressing cells (fig. S6F). Mature DCs also express CCL19 (Fig. 4A and fig. S5A); however, conditional deletion of CCL19 from cDC1s did not alter TLS maintenance in tumors (Fig. 4F) and did not affect the accumulation of CCR7+ cDC1s and T cells in tumor- bearing lungs (fig. S6G). These data strongly suggest that cDC1 migration to CCR7 ligand–enriched stromal hubs are required for TLS maintenance in tumor lesions.
cDC1s orchestrate TLS maintenance through local concomitant antigen presentation to CD4+ and CD8+ T cells A major role of mature cDC1s is to present tissue- associated antigens to T cells. Within the DC compartment, cDC1s are known to excel in the (cross- )presentation of cell- associated antigens to both CD4+ and CD8+ T cells in secondary lymphoid organs (34, 35). cDC1s have also been shown to provide a key scaffold to recruit CD4+ and CD8+ T cells, enabling CD4+ T cells to provide helper cytokines in the vicinity of CD8+ T cells, which promotes their differentiation into CD8+ effector T cells in a process that requires CD40 signaling in cDC1s (25, 34, 35). To investigate whether CD40 licensing of cDC1s by CD4+ T cells was required for TLS maintenance in tumors, we reconstituted mice with 1:1 (Xcr1- DTR:Cd40−/−) mixed bone marrow cells to enable temporal depletion of CD40+ cDC1s upon DT administration, sparing the re- maining cDC1s lacking CD40. DT administration 8 days after tumor implantation reduced TLS number and size as well as the number of CD8+ T cells (fig. S7A).
To assess whether cDC1 sustained antigen presentation to CD4+ T cells was required to maintain TLSs locally, we reconstituted mice with mixed bone marrow cells from Xcr1- DTR and MHC- II knockout (MHC- II–KO) mice and treated them with DT at day 8 postimplantation. Notably, MHC- II deletion from cDC1s 8 days after tumor implantation (fig. S7B) significantly reduced the number and size of TLSs, resulting in the dispersion of T cells and B cells within the tissue (Fig. 5A). This also reduced the number of TFH cells, CD8+ T cells, and PD- 1+ CD8+ T cells; increased the relative frequency of TPEX cells within this compart- ment; and reduced tumor- binding IgG antibodies (Fig. 5, B and C, and fig. S7C). Using the same strategy, we also abrogated MHC- I cross- presentation of tumor antigens through conditional deletion of B2m from cDC1s. Deletion of MHC- I+ cDC1s 8 days after tumor implantation (fig. S7B) significantly reduced the number and size of TLSs, albeit to a lesser extent than deletion of MHC- II+ cDC1s (Fig. 5A). Disruption of
B
D F E
G
J I
M L N
C
H
K
Fig. 3. Mature cDC1s are required locally for TLS maintenance and function. (A to C, G, I, J, L, and M) Immunofluorescence analysis of TLS (CD3, B220, and DAPI staining)
and quantification at day 15 or as indicated. (A) T cell egress from tdLNs blocked with FTY720 from day 1 to day 4, day 5 to day 9, or day 10 to day 15 after tumor engraftment.
TLS quantification was performed at day 15 (n = 5 to 6 per group, representative of two independent experiments; data indicate means ± SEMs). Scale bar, 200 μm. (B to F) TLS
formation kinetics (n = 6 to 7 per time point, representative of two independent experiments; data indicate means ± SEMs), with H&E staining on consecutive sections showing
vessels (scale bar, 100 μm) (left), TLS number, and mean size (right) (B), and kinetic analysis of immune populations in tumor and tdLNs by flow cytometry, including
percentages of DC uptaking tumor debris (mScarlet+) (left) and their maturation (CD40+ CD86+) (right) (C). (D) Tumor antigen–specific, T- bet+, and TFH (PD- 1+ CXCR5+) cells
among CD4+ T cells. (E) CD8+ PD- 1+ T cells, subdivided into CD39+ TCF1− and CD39− TCF1+ populations, among immune cells. (F) GC B cells among B cells (left) and kinetics of
serum IgG and IgM binding to tumor cells ex vivo at the indicated time points (right). (G to K) DC or cDC1 depletion using DT from day 8 to day 15 in DTR mice. (G) TLS
quantification in Zbtb46- DTR, Xcr1- DTR, and control mice treated or not with DT (n = 8 to 14 per group, pooled from two independent experiments; data indicate means ± SEMs).
Scale bar, 200 μm. (H) Quantification of tumor- bearing lung TFH cells among CD4+ T cells at day 15 in Xcr1- DTR mice treated with DT versus control mice (n = 14 to 25 per group,
pooled from four independent experiments; data indicate means ± SEMs). (I and J) GC+- TLS staining (AID, CD19, CD4, CD8, CD21, and Ki67) in Xcr1- DTR mice treated with DT
versus control mice, with zoom depicting follicular DCs (CD19− CD21+) within GC+- TLS and proportions of mice with ≥1 GC+- TLS (n = 3 to 7 per group, 196 TLS analyzed,
including 7 GC+- TLS) per whole lung slide (I). Scale bar, 100 μm. (J) AID, Ki67, and CD8 staining within TLS and quantification of CD8+ T cells, Ki67+ cells, and AID+ Ki67+ B cells
in TLS of Xcr1- DTR mice treated with DT versus control mice (n = 3 per group, 229 TLS analyzed; data indicate means ± SEMs). Scale bar, 100 μm. GC B cells coexpressing AID
(green) and Ki67 (orange) appear in yellow. (K) Serum IgG binding to tumor cells ex vivo from naïve, control, Batf3−/−, and Xcr1- DTR treated with DT mice (n = 8 to 14 per group,
pooled from two independent experiments; data indicate means ± SEMs). Sera were collected at day 15. (L) TLS quantification in Xcr1- DTR mice treated with FTY720 starting
at day 8 with or without DT starting at day 9 (n = 6 to 8 per group; data indicate means ± SEMs). Scale bar, 200 μm. (M) TLS quantification in WT mice treated or not with FLT3L-Fc
at day 8 (n = 7 to 8 per group, representative of two independent experiments; data indicate means ± SEMs). Scale bar, 200 μm. [(A), (G), (H), and (J) to (M)] P < 0.05; P <
0.01; P < 0.001; P < 0.0001 (unpaired t test). (N) Overall survival of Xcr1- DTR mice treated with DT (from day 8 to day 15) versus control mice (n = 21 to 29 per group,
pooled from three independent experiments), with all mice reaching the humane end point by day 15 postengraftment. **P < 0.0001 [log- rank (Mantel- Cox) test].
MHC- I cross- presentation did not affect the proportion of TFH cells (Fig. 5B) or tumor- binding IgG antibodies (Fig. 5C). However, similar to the results observed upon MHC- II deletion from cDC1s, abrogating MHC- I antigen presentation from cDC1s reduced the relative number of CD8+ T cells and antigen- experienced PD- 1+ CD8+ T cells and in- creased the relative frequency of TPEX cells within this compartment (Fig. 5B and fig. S7C). In line with a role of cDC1 antigen presentation to CD4+ T cells as a requirement for TLS maintenance, CD40 agonism has been shown to expand intratumor TLSs in patients and mice (36). To interrogate whether this effect of CD40 agonism is dependent on MHC- II presentation, we treated tumor- bearing control mice or Xcr1- DTR:MHC- II–KO that received DT with CD40 agonist (Fig. 5D). In con- trast to control mice, CD40 agonism was unable to expand TLSs when MHC- II presentation was abrogated on cDC1s, highlighting an essential role for MHC- II antigen presentation for TLS expansion. To determine whether cDC1 coexpression of MHC- I and MHC- II is required for local TLS maintenance, we reconstituted mice with mixed bone marrow—50% from Xcr1- DTR mice, 25% from MHC- II–KO mice, and 25% from B2m−/− mice—and administered DT on day 8 after tumor implantation (Fig. 5E). To ensure that 25% WT bone marrow was sufficient to generate func- tional cDC1s capable of maintaining TLSs, we reconstituted mice with 75% Xcr1- DTR and 25% WT bone marrow and observed no significant reduction in TLS numbers after DT administration (fig. S7D). Critically, selective depletion of MHC- I+ MHC- II+ cDC1s (fig. S7B) significantly reduced TLS numbers and size, which indicates that concomitant anti- gen presentation to both CD8+ and CD4+ T cells by cDC1s is essential to sustain TLSs locally (Fig. 5F and fig. S7D). We were unable to measure the effect on the tumor burden because these tumors progress fast and were quite advanced when we administrated DT.
Conditional deletion of interleukin- 12 (IL- 12) or IFN- γR from cDC1s did not alter TLS maintenance (fig. S7, E and F), which suggests that intact IFN- γR signaling in cDC1s is critical for efficient priming of T cells in the tdLNs and the formation of TLSs but is dispensable for the maintenance of TLSs in tumors. In line with these results, mature DCs within TLSs in human NSCLC and HCC tumor lesions showed a down- regulation of interferon- stimulated genes (ISGs) compared with cDC1s (fig. S7G), suggesting that IFN- γR signaling does not control DC–T cell interactions in TLSs once DCs mature. Taken together, our results reveal that in situ cDC1 migration to stromal hubs producing CCR7 ligands and sustained concomitant presentation of tumor anti- gens to CD4+ and CD8+ T cells at the tumor site control the quantity and quality of TLSs and enable the maintenance of TFH cells, the pro- duction of tumor- specific IgG antibodies, and the differentiation of TPEX cells.
Discussion By leveraging spatial transcriptomics and multiplex imaging analysis of various human tumors and a mouse model of NSCLC that forms mature TLSs, we identified a critical role for the DC subset, cDC1s, in the formation, maintenance, and function of TLSs. We show that within the first week after tumor implantation, TLS formation relied on IFN- γ–driven maturation of cDC1s, their migration to the tdLNs, and the subsequent recruitment of activated T cells to the tumor site. As tumors progressed, TLS maintenance became independent of tdLN T cell egress and instead depended on cDC1 migration to CCR7 ligand– enriched stromal hubs, sustained antigen presentation to intratu- moral CD4+ and CD8+ T cells, and CD40 signaling. These interactions were crucial for the maintenance of the TFH cell pool, the formation of germinal centers, and the production of tumor- specific antibodies, collectively sustaining TLS functionality and adaptive immune re- sponses within the tumor microenvironment.
These results extend previous research indicating that DCs present antigens to tumor- specific T cells within tumor- associated TLSs (37) and that DCs control TLS maintenance in homeostatic conditions in the gut (38) and in virally infected lungs (39, 40). Our findings are in line with the recent observation that neoadjuvant intratumoral poly- ICLC, a DC activator, induces TLSs and clinical response in prostate cancer (41).
cDC1s ability to present antigens to both CD4+ and CD8+ T cells and to be licensed by CD4+ T cells through CD40 signaling for cross- priming of CD8+ T cells in tdLNs has been shown to be required for optimal antitumor immunity (25) and antiviral immune response (34, 35). By depleting cDC1s at a stage when TLSs are no longer reliant on T cell recruitment from the tdLNs, we demonstrate that local cDC1- mediated concomitant antigen presentation to intratumoral CD4+ and CD8+ T cells, along with CD40 signaling, is essential for maintaining TLS struc- ture and functionality. We confirmed that CD40 agonism expands TLSs (36) and further show that this expansion critically depends on cDC1 antigen presentation. Therapies aimed at boosting intratumoral DC abundance and promoting their activation represent an optimal strategy to promote TLS response.
Much like in lymph nodes, DCs within TLSs are strategically posi- tioned in the T cell zone or at the interface between the T and B zones. We found that TFH cells are present in TLSs before germinal center formation, whereas depletion of cDC1s significantly reduced germinal center B cells in TLSs, suggesting that interactions between mature DCs and TFH cells contribute to the germinal center response. Additionally, similar to chronic viral infection where cDC1s preserve TPEX cells through MHC- I–dependent interactions within splenic niches (42), we
E
Fig. 4. Local cDC1 migration to CCR7 ligand hubs controls TLS maintenance. (A) Heatmap showing relative expression of ligand- receptor pairs by MERFISH between
ADH1B+ CAF, CCL19 perivascular cells, DCs, and T cell populations within TLSs in NSCLC patients (n = 6 patients). (B) Representative multiplex IHC staining of a TLS from an
NSCLC tumor (stained for ADH1B, CCL19, CD3, CD20, DC- LAMP, and MYH11), representative of three patients. Panel 1 shows CCL19 with both ADH1B+ and MYH11+ cells,
panel 2 shows CCL19 colocalizing with ADH1B+ cells, and panel 3 shows CCL19 around MYH11+ cells. Scale bars, 200 μm (overview) and 50 μm (zoom). (C) TLS from WT mice at
day 15 postengraftment showing CD11c, CCL19, and DAPI immunofluorescence, paired with consecutive staining for CD3, B220, and DAPI. Representative of four mice.
Scale bar, 100 μm. (D) Schematic of Xcr1- DTR: KO 1:1 mixed bone marrow chimeras experiments; DT administration starting at day 8 after tumor engraftment resulted in the
depletion of the entire WT cDC1 compartment, leaving only cDC1s that are KO for the genes of interest. (E and F) Immunofluorescence analysis of TLS (stained for CD3, B220,
and DAPI) with quantification of TLS number and mean area at day 15. (E) Comparison of Xcr1- DTR controls versus DT- treated Xcr1- DTR:Ccr7−/− CD45.1.2 mice (n = 5 per group,
representative of two independent experiments; data indicate means ± SEMs). Scale bar, 200 μm. Tumor- bearing lung quantification of TFH cells among CD4+ T cells by flow
cytometry at day 15. (F) Comparison of control bone marrow chimera versus DT- treated Xcr1- DTR:Ccl19−/− mice (n = 7 to 8 per group; data indicate means ± SEMs). P < 0.05;
*P < 0.01 (unpaired t test).
D
F
found that depletion of MHC- II and MHC- I from cDC1s promoted the accumulation of TPEX cells, which suggests that cDC1s within tumor- associated TLSs contribute to TPEX cell differentiation into effector CD8+ T cells through direct MHC- I interaction and by offering proxi- mal CD4+ help through MHC- II antigen presentation. This physical interaction may promote TFH cell help to TPEX cells, including through IL- 21 as previously suggested (15, 22). Supporting this, our findings demonstrate that cDC1s engage in cognate interactions with both CD4+ and CD8+ T cells simultaneously within the TLSs rather than in distinct spatiotemporal niches. Consistent with this view, recent work has demonstrated that cDC1s interact simultaneously with CD4+
and CD8+ T cells in tumors after immunotherapy (43). The impor- tance of MHC- II presentation in antitumor immunity corroborates evidence that ICB response relies on both MHC- I and MHC- II pre- sentation of tumor neoantigens in preclinical tumor models (44) and that the DC ability to present antigens to both CD4+ and CD8+ T cells is required for efficient tumor response to adoptive T cell therapy (45). Furthermore, clonal expansion of TFH cells and effector CD8+ T cells strongly correlate with ICB response in patients with HCC (15). Similarly, our finding that alteration of TLS maintenance affect tumor antibody formation reinforces the importance of TLSs in the produc- tion of tumor- specific antibodies (13).
E F
Fig. 5. Local cDC1 concomitant MHC- I and MHC- II antigen presentation controls TLS maintenance. (A, D, and F) Immunofluorescence analysis of TLS (stained for CD3,
B220, and DAPI) with quantification of TLS number at day 15. (A and B) Comparison of DT- treated Xcr1- DTR:WT versus Xcr1- DTR:MHC- II–KO and Xcr1- DTR:B2m−/− mice (n = 4
to 8 per group, representative of two independent experiments; data indicate means ± SEMs). (A) Panels 1 and 2 depict B cell and T cell dispersion (right). Scale bars, 200 μm
(overview) and 100 μm (zoom). TLS number and mean area are from day 15. (B) Tumor- bearing lung quantification by flow cytometry at day 15 includes TFH cells among CD4+ T cells,
CD8+ PD- 1+ T cells among immune cells, and TCF1+ cells among CD8+ PD- 1+ T cells. (C) Serum IgG binding to tumor cells ex vivo from naïve, Xcr1- DTR:WT, Xcr1- DTR:MHC- II–KO,
and Xcr1- DTR:B2m−/− treated with DT mice (n = 4 to 6 per group, representative of two independent experiments; data indicate means ± SEMs). Sera were collected at day 15.
(D) Comparison of WT treated with isotype control or anti- CD40 and DT- treated Xcr1- DTR:WT treated with isotype control versus Xcr1- DTR:MHC- II–KO treated with anti- CD40 (n = 5 to
9 per group; data indicate means ± SEMs). (E) Schematic of (1)Xcr1- DTR:(0.5)MHC- II–KO:(0.5)B2m−/− mixed bone marrow chimeras experiments; DT administration starting at
day 8 after tumor engraftment resulted in the depletion of the entire WT MHC- Ipos MHC- IIpos cDC1 compartment, leaving only cDC1 that are MHC- Ineg MHC- IIpos or MHC- Ipos
MHC- IIneg. (F) Comparison of DT- treated (1)Xcr1- DTR:(1)WT chimeras versus (1)Xcr1- DTR:(0.5)MHC- II–KO:(0.5)B2m−/− chimeras (n = 8 to 9 per group, representative of two
independent experiments; data indicate means ± SEMs). TLS number and mean area are from day 15. [(A) and (C)] P < 0.05; P < 0.01 (Mann- Whitney U test). [(B) and (F)]
P < 0.05; P < 0.01; P < 0.0001 (unpaired t test). (D) P < 0.05; **P < 0.01; *P < 0.0001 (one- way ANOVA followed by Tukey’s multiple comparisons test).
Conditional targeting of DC function after priming did not signifi- cantly alter tumor burden at end point, even though TLS maintenance was compromised. This could be due to the rapid progression of the tumor model, which may not allow enough time to observe a more pronounced effect. Using less aggressive GEMMs may be better suited to studying the effect of TLS function on tumor progression.
We observed that TLS- associated DCs exhibit a distinct mature mo- lecular state, referred to as “mregDC” (11). The mregDC program is driven by tumor debris uptake and cholesterol mobilization (12) and leads to expression of CCR7, enabling the migration of mature DCs to CCR7 ligand–enriched sites and efficient T cell priming. The enrichment of mature DCs in TLSs suggests that antigen capture is a prerequisite for their migration and accumulation. We further identified CCL19- producing fibroblasts and perivascular cells as potential pivotal TLS organizers forming chemokine- rich hubs that guide the recruitment and interaction of CCR7+ mature DCs, T cells, and B cells (46). The positioning of CCR7+ DCs in CCL19+ perivascular niches may also con- tribute to antitumor immunity (47) and could precede the development of mature TLSs. Future lineage- tracing and time- stamping studies will examine the fate of cDC1s in tdLNs compared with TLSs, including their migration and half- life. Notably, fibroblast reticular cells producing CCL19 were recently shown to promote T cell aggregates, including
B C D
TLSs, in NSCLC (48) and CRC liver metastasis (49). Chronic microbial exposure in the lungs promotes CCL19 in stromal cells and drives the formation of TLSs in the lung (50), and similar CCL19 hubs have been observed in chronic inflammatory psoriasis skin lesions (51). These ob- servations emphasize the potential key role of CCL19 in the formation of TLSs, although the distinct contributions of CCL19 and the other CCR7 ligand CCL21 to TLS maintenance in tumors remain to be ad- dressed. Like many chemokine receptors, CCR7 can be desensitized or down- regulated after prolonged exposure to its ligands. This phenom- enon may reconcile our observations with previous findings showing that MHC- II+ CCR7− cDC1s were able to cross- present antigen to CD8+ T cells (52). In addition to stromal hubs, DCs and TFH cells are also likely key organizers of TLSs (15, 53). Mature DCs produce CCL17 and CCL22, two chemokine ligands known to recruit CCR4+ CD4+ T cells (11, 54), whereas TFH cells express high levels of cholesterol 25- hydroxylase (CH25H), an enzyme that generates oxysterol gradients known to recruit Ebi2+ cells (55), which include both DCs and TPEX cells (15). Furthermore, cDC1s specifically express XCR1 chemokine receptor, whereas its ligand, XCL1, is produced by TPEX cells (56). The exact contribution of these molecules to TLS dynamics remains to be examined.
and maintenance within tumors, emphasizing the importance of cDC1s in coordinating TLS functionality. The interplay between TLSs and tdLNs in mediating tumor- specific immunity likely shifts through- out tumor progression, with TLSs emerging as key contributors in more advanced tumors. In this setting, TLSs may provide essential hubs to support the survival of antigen- experienced lymphocytes and to amplify the efficiency of adaptive immune responses against tumor antigens. Our findings provide a potential foundation for therapeutic strategies aimed at enhancing effective antitumor T cell and B cell responses in cancer patients.
Materials and methods TLS spatial data An interactive website for exploring TLS spatial data (Visium SD/HD, MERFISH, and CyCIF) is available at https://rstudio-connect.hpc.mssm. edu/mattiuz_science2026_tls_spatial_data/.
Mouse strains C57BL/6, B6.Cg- Zbtb46tm3.1(cre)Mnz/J (strain no. 028538), B6.129P2(C)- Ccr7tm1Rfor/J (no. 006621), C57BL/6N- Ifngr1tm1.1Rds/J (no. 025394), B6.129S(C)- Batf3tm1Kmm/J (no. 013755), C57BL/6- Gt(ROSA)26Sortm1(HBEGF)Awai/ J (no. 007900), B6.129P2- Gt(ROSA)26Sortm1(DTA)Lky/J Strain (no. 009669), B6.Cg- Gt(ROSA)26Sortm14(CAG- tdTomato)Hze/J (no. 007914), B6(129S4)- Xcr1tm1.1(cre)Kmm/J (no. 035435), SMARTA (H2- I- Ab- restricted LCMV GP61- 80 epitope, B6.Cg- Ptprca Pepcb Tg(TcrLCMV)1Aox/PpmJ) CD45.1 (no. 030450) mice were purchased from JAX, Ccr7 floxed mice were donated by M. Bogunovic and I. Aifantis and C57BL/6J- Ms4a3em2(cre)Fgnx/J (no. 036382) and Ms4a3CreERT2 were donated by F. Ginhoux. For bone marrow transplant experiments, CD45.1, B6.129P2- Cd40tm1Kik/J (strain no. 002928), B6.129P2- B2mtm1Unc/DcrJ (no. 002087), B6.129S2- H2dlAb1- Ea/J (no. 003584), B6(Cg)- Zbtb46tm1(HBEGF)Mnz/ J (no. 019506), B6.129S1- Il12btm1Jm/J (no. 002693) mice were also purchased from JAX, Ccl19−/− mice were donated by J. G. Cyster and C57BL/6NF- Wdfy4em1(IMPC)J/J (no. 029334 and MMRRC no. 051082- JAX) were donated by K. M. Murphy. All animal experiments per- formed in this study were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee at the Icahn School of Medicine at Mount Sinai (IACUC no. LA10- 00021 and no. 04- 0274). Mice within experiments were age and sex- matched. Tumor implantations were conducted in mice between 7 and 15 weeks of age. Mice were housed in individu- ally ventilated cages at the Mount Sinai specific pathogen–free (SPF) facilities, provided food and water ad libitum, with conditions main- tained at 21° to 23°C and 39 to 50% humidity and 12 hour–12 hour dark- light cycle.
B6.129P2- Trp53tm1Brn/J (p53LoxP, Trp53fl/fl) and B6.129S4- Krastm4Tyj/ J(KrasLSL- G12D) were obtained from JAX (no. 008462 and no. 008179, respectively) and crossed to generate the KP GEMM inducible mouse line (KrasLSL- G12D/+; Trp53fl/fl). KP- GEMM- Xcr1- Venus strain was established by crossing the KP GEMM with Xcr1- Venus mice (57) (provided by W. Kastenmüller, University of Würzburg, Germany). KP- GEMM- Batf3−/− were generated by crossing the KP GEMM and the Batf3−/− mice (donated by C. Lehmann, Erlangen University hospital). Experiments with KP- GEMM lines were performed at the International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology, ICGEB, Trieste, Italy by Benvenuti laboratory.
Bone marrow transplantation Bone marrow (BM) chimeras were generated by retro- orbitally inject- ing 1 to 10 × 106 total donor cells (fresh or cryopreserved BM) into sub- lethally irradiated 6- week- old recipient mice (two doses of 5.5 Gy administered 6 hours apart). A period of 9 to 12 weeks was granted to ensure engraftment.
Recipients were supplemented with sulfamethoxazole/trimethoprim for 3 weeks. At 9 weeks, successful reconstitution (minimum 90%) was assessed by flow cytometry analysis of peripheral blood.
Generation of KP- HELLO- 2 tumor model KP- HELLO- 2 cells were originally derived from the KP- HELLO cells (provided by N. S. Joshi) (22) and modified in house. MSCV- IRES- Thy1.1 DEST was a gift from A. Rao (Addgene cat. no. 17442), and gamma- retrovirus encoding Thy1.1 was produced by transfecting HEK 293T cells with Thy1.1 vector along with gamma retroviral packaging plasmids. Briefly, KP- HELLO cells were expanded on a tissue culture- coated plate. Upon reaching 60% confluence, they were transduced with retroviral particles by spinfection with polybrene (final concentration of 8 μg/ml). Cells were expanded in RPMI supplemented with 10% fetal bovine se- rum (FBS) and 1% Pen- strep, Glutamax and HEPES and Thy1.1+ cells (stained with anti–Thy- 1.1 PE- Cy7, clone: OX- 7, BioLegend cat. no. 202518) were sorted twice over 10 passages on a CytoFLEX SRT Cell Sorter (Beckman).
Cell lines KP- HELLO- 2, KP- HELLO, and KPAR1.3 [provided by J. Downward (58)] cells were derived from a KrasLSL- G12D/+;p53fl/fl background, AKPS colorectal tumor organoids from a Apcfl/fl;KrasLSL- G12D/+;p53fl/fl;Smad4fl/fl background [provided by Ö. H. Yilmaz (59)], and Hep- 53.4 HCC cells from a carcinogen- induced liver model [(60) Cellosaurus CVCL_5765] were provided by J. Llovet and originally obtained from Cytion (product no. 400200). All cell lines were grown in complete cell culture medium [Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) + 10% FBS + 1% P/S].
Orthotopic tumor models For orthotopic lung tumors, 1.5 × 105 KP- HELLO- 2, KP- HELLO, or KPAR1.3 cells were intravenously injected into the tail vein. Tumor- bearing lungs and tumor- draining lymph nodes were analyzed 15 days postinjection, unless otherwise specified in the figure legends. For KPAR1.3, tumors were harvested 21 days postinjection. To assess tumor burden, the left lung lobe was fixed in paraformaldehyde (PFA), em- bedded in paraffin, and examined as 5 μm cross- sections. Upon hema- toxylin and eosin (H&E) staining, lung tissue sections were scanned on slides using an Olympus digital scanner and analyzed using the Panoramic viewer and QuPath software. For orthotopic CRC tumors, mice received intra- ceacum injection of 1.5 × 105 AKPS cells in 10 μl basement- membrane extract (BME) (R&D Systems cat. no. 35- 330- 0502) and tumors were analyzed 6 weeks postinjection. For orthotopic HCC tumors, mice were injected orthotopically into the left- lateral lobe of the liver with 1 × 106 Hep53- 4 cells in 10 μl phosphate- buffered saline (PBS) and tumors were harvested 2 weeks postinjection.
Autochthonous tumor induction Lung tumors were initiated in KP- GEMM- Xcr1- Venus and KP- GEMM- Batf3−/− mice via intratracheal administration of 2.5 × 107 infec- tious particles of a replication- deficient adenoviral vector encoding Cre recombinase (Ad- CMV- iCre, Vector Biolab, cat. no. 1045). Mice were euthanized 5 to 8 weeks postinoculation, and tumor- bearing lungs were collected for analysis.
In vivo treatments For prolonged and effective conditional depletion of cDCs or cDC1s, Zbtb46- hDTR and Xcr1Cre/wt; Rosa26DTR/wt mice received an initial dose of DT (32 ng per g body weight, List Biological Laboratories cat. no. 150), followed by injections of 20 ng per g every 60 hours. To inhibit lymphoid cell egress from peripheral lymphoid organs, mice were ad- ministered 20 μg of FTY720 (Cayman Chemical, cat. no. 10006292) daily over the indicated time periods. To increase DC numbers, mice received 75 μg of FLT3L-Fc (Gilead) on day 8 after tumor engraftment. FLT3L (30 μg; Celldex, cat. no. CDX- 301) was administered once daily for 9 consecutive days starting at day 7. To provide exogenous licensing signal to DCs, mice were treated with 100 μg of anti- CD40 agonist antibody (clone FGK4.5, BioXCell, cat. no. BE0016- 2) on days 7 and 11 after tumor engraftment. To deplete CD4+ T cells, mice received 500 μg
of anti- CD4 antibody (clone GK1.5, BioXCell, cat. no. BE0003- 1) on days 5 and 10 after tumor engraftment. To deplete CD8+ T cells, mice received 200 μg of anti- CD8β (clone Lyt 3.2, BioXCell, cat. no. BE0223) antibody on the same days. Control mice received the corresponding isotype con- trol antibody at the same dose and schedule. To labeled GMP- derived cells, Ms4a3CreERT2;RosaTdT mice received 2.5 mg of tamoxifen dissolved in corn oil daily from day 10 to day 15 after tumor engraftment (Sigma- Aldrich, cat. no. T5648). To block cytokine secretion, mice were pretreated with 125 μg of Brefeldin A (Sigma- Aldrich, cat. no. B7651) for 12 hours (61). All treatments were administered intraperitoneally.
Adoptive cell transfer In experiments analyzing tumor- specific CD4 T cells (SMARTA; CD4+ T cells specific for the LCMV GP66–77 epitope) by imaging, CD4+ T cells were isolated from blood of naïve SMARTA CD45.1 transgenic mice with the EasySep Mouse CD4+ T Cell Isolation Kit (StemCell, cat. no. 19852). Between 20 and 50 × 103 naïve SMARTA CD4+ T cells were transferred intravenously into C57BL/6 recipient mice 1 day before tumor injection.
Flow cytometry Single- cell suspensions were obtained from tumor bearing lung and tumor draining lymph nodes by digestion with 0.25 mg/ml collagenase IV (Sigma, cat. no. C5138- 1G) at 37°C for 30 min (lung) or 25 min (lymph nodes) fol- lowed by passing through a 70- μm cell strainer and red blood cell lysis (RBC lysis buffer, BioLegend, cat. no. 420301) for 2 min at room tem- perature (RT). For T cell cytokine assessment, cells were incubated with 1 μg/ml brefeldin A, 1 μg/ml ionomycin, and 50 ng/ml phorbol 12- myristate 13- acetate (PMA) (all from Sigma, cat. nos. B7651, I0634, P1585) for 4 hours at 37°C. Cells were stained in fluorescence- activated cell sorting (FACS) buffer [PBS supplemented with 10% bovine serum albumin (BSA) and 2 mM EDTA] for 25 min at 4°C. For CCR7 and CXCR5 staining, cells were incu- bated for 30 min at 37°C. To assess tumor- specific CD4+ T cells, cells were stained at 37°C for 2 hours with an APC- conjugated MHC- II LCMV Gp66 tetramer (generated from I- Ab LCMV GP 66- 77 DIYKGVYQFKSV Mono- mers produced by the NIH Tetramer Core Facility and provided by A. O. Kamphorst) used at a 1:100 dilution. Cytokines and transcription factors were stained after fixation and permeabilization using the Foxp3/ Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience, cat. no. 00- 5523- 00). Samples Cells were analyzed with BD LSR Fortessa or BD FACSymphony analyzers (BD Biosciences). Flow cytometry data were acquired using FACS Diva software v.9 (BD), and the data obtained were analyzed using FlowJo (LLC). Antibodies used are listed in table S3. Gating strategies are shown in table S6.
Tumor- specific antibody binding assay To measure tumor- binding antibodies, serum was collected from tumor- bearing mice at end point and heat- inactivated at 56°C for 10 min. KP- HELLO- 2 cells were stained with serum (1:50) for 40 min at 4°C followed by a secondary staining with anti- mouse IgG (1:200, Poly4053- PE- Cy7, Biolegend, cat. no. 405315) or anti- mouse IgM (1:200, II/41- PerCP- eFluor710, eBioscience, cat. no. 46- 5790- 82) for 40 min at 4°C.
Immune aggregate formation using KP- HELLO- 2 spheroids cocultured with mutuDCs and TILs KP- HELLO- 2 spheroids were cultured for 7 days as previously described (62) with 10,000 KP- HELLO- 2 cells expressing mScarlet per spheroid, using the Spherotribe kit (Idylle). In parallel, mutuDCs were cultured with KP- HELLO- 2 cell debris to induce maturation which was con- firmed by flow cytometry (12, 63). Separately, TILs were harvested and sorted from KP- HELLO- 2 tumors 7 days postinjection, maintaining the endogenous T cell/B cell ratio, and labeled with DeepRed cell tracker for 30 min. Mature mutuDCs were added to KP- HELLO- 2 spheroids for 4 hours, followed by the addition of TILs (30,000 mutuDCs and 30,000 TILs per spheroid). After 5 days, KP- HELLO- 2 spheroid size and subsequent im- mune attraction were assessed by microscopy and ImageJ. Spheroid
infiltration by TILs and three- dimensional (3D) aggregate formation in the presence of mutuDCs were measured by BiPhoton micros- copy and analyzed with QuPath. The total number of TILs in KP- HELLO- 2 spheroids cocultured with mutuDCs was also measured by flow cytometry.
Immunofluorescence imaging for TLS assessment The left lung lobe was fixed overnight in 4% PFA and subsequently stored in 70% ethanol until further processing. The lungs were sectioned into 5 μm thick slices from formalin- fixed paraffin- embedded (FFPE) tissue. 5 μm FFPE slides were baked at 60°C for 2 hours before deparaf- finization. Slides were deparaffinized in xylene (two treatments) and rehydrated through a series of ethanol solutions of decreasing concen- trations (from 100% to 70%), followed by PBS rinses. For antigen re- trieval, slides were immersed in prewarmed DAKO pH 9 solution (with or without 10% glycerol) at 95°C, then allowed to cool to RT and washed in PBS. Blocking was performed in a humidified chamber with a block- ing buffer (1× TBS, 10% BSA, 0.1% Triton X- 100). Autofluorescence was quenched with TrueBlack solution, followed by a PBS wash. Slides were incubated with primary antibody (1:200) in blocking buffer overnight at 4°C. After PBS washes, slides were incubated with secondary anti- body, diluted 1:500 in PBS and containing 2% serum from the host species, and counterstained with 4′,6- diamidino- 2- phenylindole (DAPI). Finally, slides were mounted with ProLong Gold Antifade Mountant (Invitrogen, cat. no. P36930), coverslipped, and stored at 4°C. Whole stained slides were scanned on a CyteFinder HT II fluorescence scanner (RareCyte) equipped with a 20× lens. Images were corrected for optical distortion, stitched and processed locally using the on- board CyteHub software. Alternatively, whole- slide images were captured using a Leica DMi8 microscope. Antibodies used are listed in table S3.
Machine learning TLS detection using Qupath To detect TLSs in the entire left lung lobe at a whole- slide level, Random Trees pixel classifiers were applied in QuPath (64) with a resolution setting of 5.20 μm/pixel, selecting three channels (Alexa 488, Alexa 647, and DAPI) at scales of 2.0 and 4.0, using Gaussian features without normalization. Classifiers were trained on at least five manu- ally annotated TLS regions (aggregates of B220+ cells, CD3+ cells, and DAPI+ cells) and five non- TLS regions. The output classifications were then segmented into individual annotations with areas exceeding 1500 μm2. Immune aggregate classifications were reviewed and vali- dated by a trained pathologist.
Tumor antigen–specific B and T cell imaging Before immunofluorescence staining, 10 μm OCT slides were fixed in acetone at −20°C for 10 to 15 min and dried. To detect tumor antigen– specific B cells targeting hen egg lysozyme (HEL), HEL protein (Sigma, cat. no. 10837059001) was conjugated to Alexa Fluor 488 using the Alexa Fluor 488 Protein Labeling Kit (ThermoFisher) according to the 20 to 50 kDa protein protocol. OCT- embedded slides were stained with HEL- Alexa488 (1:500) and costained with B220, GL7, and DAPI. To detect tumor antigen–specific CD4+ T cells recognizing the LCMV GP66–77 epitope, OCT- embedded slides from adoptively transferred SMARTA CD45.1 mice were stained with CD45.1 and costained with CD4, PD- 1, and DAPI (table S3).
Multispectral imaging for TLS maturity assessment For multispectral staining, every cycle of antigen staining was pro- cessed as follows. The tissues were subjected to HIER either in AR6 or AR9 citrate buffers (Akoya Biosciences). After antigen retrieval, slides were blocked with 1× antibody diluent/block (Akoya Biosciences) for 10 min, followed by staining with primary antibody for 30 min. Every staining step took place in a humidified chamber at RT. After the wash with 1× TBS- Tween (TBST) buffer (3 times 2 min each), the slides were stained with HRP- conjugated secondary antibody, either anti- rabbit IgG
(Fisher, cat. no. MP740150) or anti- Rat IgG (Biocare, cat. no. RT517L) for 30 min. Then after the wash with 1× TBST, separate opal detector fluo- rophores were used for each marker. TLS maturity panel was as follows: CD4 (1:200)/Opal 480, CD8 (1:400)/Opal 780, CD19 (1:1000)/Opal 520, Ki67 (Clone SP6, ThermoFisher, 1:100, cat. no. MA5- 14520)/Opal 570, CD21 (Clone SP186, Abcam, 1:50, cat. no. ab227662)/Opal 620, and AID (Clone mAID- 2, ThermoFisher, 1:800, cat. no. 14- 5959- 82)/Opal 690. The last round of staining was carried out with additional antigen retrieval and DAPI nuclear staining. The staining was performed either manually or on automated machine (Opal 6- Plex Detection Kit, Akoya Biosciences, cat. no. NEL871001KT). Then the stained tissue sections were mounted with Diamond Anti- fade mounting media and were imaged as whole slides scans on the Vectra (Perkin Elmer). Images were unmixed and were analyzed on QuPath.
QuPath tissue analysis for TLS maturity assessment QuPath software was used for quantification analysis. Cell detection and segmentation was carried out using StarDist extension based on DAPI nuclear stains (65) For phenotyping of individual cells, machine learning approach was used to generate an object classifier for each marker. In the case of markers that are mutually exclusive, we gener- ated a group object classifier that includes all those markers. Then, these individual classifiers were compiled together and applied onto multispectral images to phenotype cells. For annotations of TLS, ma- chine learning approach was once again used to generate a pixel clas- sification with the annotation size greater than 1500 μm2 (66, 67).
Cyclic immunofluorescence (CyCIF) Staining and imaging: FFPE sections were prepared and stained using a 20- plex antibody panel following previously described CyCIF method- ologies. For sample preparation, slides were automatically baked at 60°C for 30 min and dewaxed at 72°C using BOND Dewax Solution. Antigen retrieval was carried out at 100°C for 20 min in BOND Epitope Retrieval Solution 2 (ER2) using a Leica Bond RX system. To minimize autofluorescence, slides were treated with a bleaching solution (4.5% H2O2, 20 mM NaOH in PBS) and exposed to light- emitting diode (LED) light for 2 cycles of 45 min. To reduce nonspecific antibody interac- tions, slides were rinsed in PBS for 3 × 5 min and incubated overnight at 4°C with secondary antibodies diluted 1:1000 in 150 μl of Odyssey Blocking Buffer, protected from light. Slides were then washed three times with PBS and bleached again for 2 × 45 min. For each round of CyCIF, samples were incubated overnight at 4°C in the dark with Hoechst 33342 (1:10,000; Thermo Fisher Scientific, cat. no. H3570) for nuclear staining, alongside either primary conjugated antibodies or primary unconjugated antibodies diluted as specified (table S3) in 150 μl of Odyssey Blocking Buffer (LI- Cor). When using primary uncon- jugated antibodies, incubation was followed by a 2- hour RT incubation with secondary antibodies in the dark. Subsequently, slides were washed 3 × 5 min and mounted with 200 μl of 70% glycerol. Imaging was per- formed automatically on a RareCyte Cytefinder II HT system, with ex- posure settings optimized per channel to prevent signal saturation while remaining consistent across samples. After imaging, coverslips were removed by placing slides in 1× PBS and heating them in a water bath for 1 hour. Between cycles, slides were photobleached for 2 × 45 min and washed 3 × 5 min in PBS (68–70).
Image preprocessing and quality control: The entire preanalytical CyCIF image processing workflow, including stitching, registration, illumina- tion correction, segmentation, and single- cell feature extraction, was carried out using the MCMICRO pipeline, an open- source multiple- choice microscopy platform (full code available at GitHub: https:// github.com/labsyspharm/mcmicro). For probability map generation, a pretrained U- Net model, UnMicst v2, was applied, followed by a marker- controlled watershed algorithm for single- cell segmentation. Nuclear detection was performed within a diameter range of 3 to 60 pixels.
Probability maps generated by UnMicst were subsequently processed with S3segmenter to produce nuclear segmentation masks, and the cy- toplasmic regions were defined by expanding the nuclear mask by 3 pixels. After segmentation masks were created, mean fluorescence intensities for each marker were computed for each cell, resulting in a single- cell data table corresponding to each acquired whole- slide CyCIF image. Annotated histologic regions on the whole- slide image were used to extract quantified single- cell data for cells located within the specified ROI range (TLS were identified by CD4, CD8, PD- 1, B220, and DAPI staining using QuPath). Multiple strategies were used to ensure the ac- curacy and reliability of the single- cell data. At the image level, cross- cycle image registration and tissue integrity were reviewed, and poorly registered regions or areas with deformed tissues or artifacts were identified and excluded from the analysis. Antibodies exhibiting low- confidence staining patterns, as determined through visual inspection, were also removed from the analysis. Segmentation quality was rig- orously assessed, and segmentation parameters were refined iteratively to enhance the precision of the segmentation masks. At the single- cell data level, correlations of DNA staining intensities across different cy- cles were evaluated to filter out cells lost during the cyclic process, using a correlation coefficient threshold of less than 0.8 for exclusion (71).
Single- cell phenotyping: To perform phenotype- driven gating, we used the open- source software Gater (https://github.com/labsyspharm/ minerva_analysis), which allows definition of gating thresholds, cutoff values used to separate marker- positive from marker- negative cells. This gating process was independently applied to each individual image.
In summary, cells were assigned to specific phenotype categories based on the presence or absence of marker expression, as defined in a relational logic table (see CyCIF gating strategy, table S5). Cells that did not satisfy any of the Boolean logic rules defined in the phenotyp- ing worksheet were labeled as “unknown.” The logical operators AND, OR, ANY, and ALL were used in conjunction with POS (positive) and NEG (negative) expression criteria to characterize cell types identified through unsupervised clustering and manual review of tissue images. Once cell identities were determined, we validated these annotations by superimposing phenotype labels onto the original images using Napari via the image_viewer function embedded in scimap (https:// napari.org/stable/).
Neighborhood analysis: Spatial neighborhoods were defined by calculat- ing the Euclidean distance between cell centroids. For each reference cell type, neighboring cells within a 30 μm radius were identified. Interaction tables were generated recording each reference- neighbor cell pair, their cell types, and distance. Interactions were summarized as absolute counts and relative fractions per reference cell. TLS association was assigned by spatial overlap with TLS polygons (TLS were identified by CD4, CD8, PD- 1, B220, and DAPI staining using QuPath), allowing comparisons of interactions within TLS versus non- TLS regions.
Multiplex immunohistochemistry (IHC) imaging FFPE sections (4 μm) were stained using the multiplexed immunohis- tochemical consecutive staining on a single slide (MICSSS) protocol as previously described (72). Briefly, slides were baked at 50°C over- night, deparaffinized in xylene and rehydrated in decreasing concen- tration of ethanol (100%, 90%, 70%, 50% and dH2O). Sample slides were incubated in pH6 or pH9 buffers at 95°C for 30 min for antigen retrieval, then in 3% hydrogen peroxide for 15 min and in serum- free protein block solution (Dako, cat. no. X090930- 2) for 30 min. Primary antibody staining was performed using the optimized dilution during 1 hour at RT or at 4°C overnight followed by signal amplification using associated secondary antibody conjugated to horseradish peroxidase during 30 min. Chromogenic revelation was performed using AEC (Vector, cat. no. SK- 4200). Tissue sections were counterstained with hematoxylin, mounted with a glycerol- based mounting medium and
finally scanned to obtain digital images (Aperio AT2, Leica). After scanning, slide coverslips were removed in hot water (~50°C). Primary antibodies are presented in table S3.
To quantitatively analyze localization and coexpression patterns, tissue annotation was first done by pathologists using QuPath software. For the analysis, we used the svs multiresolution, pyramidal images obtained per marker after staining. Both the AEC chromogen stain and the hematoxylin nuclear counterstain were extracted from each image via a dynamically determined deconvolution matrix. Then, each image was split into smaller tiles to permit computational analysis. Each tile from the first stained image was matched to the respective tile from the sequential stained images and then elastically registered using the extracted hematoxylin nuclear stain and SimpleElastix open- source software. Then, by using an iterative nuclear masking via STARDIST, we produced a composite semantic segmentation for nuclei residing in the series of tiles. Each nucleus was artificially expanded by a num- ber of pixels to simulate a cytoplasm per cell and that was coherent with membrane marker staining. Finally, cellular- resolution metadata was acquired for all cells in the final cell mask. To unbiasedly deter- mine positive and negative cells per marker, we used an unsupervised classification technique to cluster cell populations, followed by a su- pervised approach where we would evaluate each cluster as positive or negative per marker. First, the metadata aggregated per sample was collected, transformed to z- scores, randomized, and split into sub- samples per batch. Each batch was processed in parallel: data for each marker were transformed, clustered and collapsed into multiple groups by principal components analysis (PCA) and uniform manifold ap- proximation and projection (UMAP). Then, we performed the final quality control to manually attribute which clusters were positive or negative. This produced a final cellular- resolution data frame contain- ing binary marker classification that was used for downstream localiza- tion, marker coexpression, tissue annotation and reconciliation and statistical analyses (73).
TLS 3D imaging using Lightsheet Mice were euthanized by CO2 and perfused transcardially with 10 ml 1× PBS. The post- caval lobe was collected from each mouse and placed in 4% PFA overnight at 4°C. Lungs were then prepared with LifeCanvas epoxy- based fixatives: samples were shaken for 1 day in fresh 50% SHIELD Epoxy/25% SHIELD buffer/25% water, then overnight in 7:1 SHIELD ON/ SHIED Epoxy at 4°C. Subsequently, samples were moved to 100% SHIELD ON at 37°C for 2 days. Next, samples were passively delipidated by shaking at 37°C in LifeCanvas Delipidation Buffer for 11 days. Samples were permeabilized in blocking buffer—PBSTN (1% TritonX, 0.02% Sodium Azide, 1× PBS) with 5% donkey serum—at 37°C for 2 days, and then incubated in primary antibody (1:200) in blocking buffer for 4 days at 37°C. Samples were washed in PBSTN for 6 hours at 37°C and fixed overnight in 4% PFA at RT. After 4 hours of PBSTN washes, samples were incubated in secondary antibodies (1:500) in blocking buffer for 4 days at 37°C. As with the primary antibody, samples were washed in PBSTN for 6 hours, fixed in 4% PFA overnight, and washed again in PBSTN for 4 hours. To clear the samples, they were moved to 50% LifeCanvas EasyIndex (Refractive Index 1.52)/50% water overnight at 37°C, then to 100% LifeCanvas EasyIndex overnight at RT. Samples were mounted in low melting point agarose in 100% EasyIndex before imaging with the 9× objective in EasyIndex Matched Immersion Oil on the SmartSPIM light sheet microscope.
Experimental study design for in vivo studies Sample size determination: No statistical method was used to prede- termine sample size. Sample sizes were instead chosen based on field standards and previous experience with similar models. Sample sizes are consistent with those commonly used in in vivo tumor immunol- ogy experiments and were deemed sufficient to detect robust and bio- logically meaningful effects.
Randomization: Animals were randomly assigned to treatment or con- trol groups to minimize bias when possible. This was achieved by al- ternating mice from different cages into different groups. No formal randomization software was used.
Blinding: Blinding was applied where possible. Investigators conduct- ing histological quantification and flow cytometry gating were blind- ed to the treatment/genetic group during analysis.
Inclusion- exclusion criteria: Mice were included based on correct gen- otype, sexmatching, and absence of signs of illness or poor health at the time of tumor injection. No mice were excluded postrandomiza- tion unless they showed unrelated health issues or experimental er- ror (e.g., tumor injection failure).
Human subjects Samples of tumor were obtained from patients undergoing surgical re- section at Mount Sinai Hospital (New York, NY) after obtaining informed consent in accordance with a protocol reviewed and approved by the Institutional Review Board at the Icahn School of Medicine at Mount Sinai (IRB Human Subjects Electronic Research Application 18- 00407 for HCC samples, 10- 00472 and 10- 00135 for NSCLC samples and 18- 00407 and 18- 00855 for CRC samples) and in collaboration with the Biorepository and Department of Pathology. For multiplex imaging of patient TLS maturity conducted at the University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA, the studies were performed under IRB protocols STUDY19060269 (NSCLC patients) and PRO17080326 (HGSOC patients).
The single- arm, open- label, phase 2 trial of HCC patients with resectable tumors was registered on ClinicalTrials.gov (NCT03916627, Cohort B). Twenty patients were enrolled and received two cycles of Cemiplimab before surgical resection as described in (20). Response to treatment was defined as more than 50% (partial response) or more than 70% (complete response) necrosis of resected tumor by pathologists. Similarly, TLSHi versus TLSLo status was determined based on pathologist annotation and H&E scoring, with patients classified as TLSHi when three or more TLS were identified in the resected tissue, and TLSLo when zero to two TLS were observed.
Postoperatively, patients underwent standard- of- care screening every 6 months; recurrence was defined as development of imaging consistent with recurrent HCC using the Liver Imaging Reporting and Data Systems (LIRADS) score of 5 for an intrahepatic lesion (the most com- mon site of HCC recurrence) or arterial enhancing new extrahepatic metastatic foci consistent with metastatic disease (74). Detailed clinical information for the NSCLC POPLAR cohort (18) and the ccRCC BIONIKK cohort (19) are provided in the corresponding publications.
Metastatic breast cancer (MBC) tissue is from a clinical trial of an in situ vaccine for lymphoma, breast cancer and head and neck cancer (NCT03789097, Marron et al., SITC 2022). A patient with cutaneous involvement of her MBC was enrolled on a clinical trial of an in situ vaccine, composed of intratumoral daily injections of FLT3L for 2 weeks to recruit DCs to the tumor microenvironment and dLNs, followed by low- dose radiation to the injected lesion to release tumor antigen, and then intratumoral poly- ICLC, the TLR3 ligand, to activate cDC1s. Patients underwent biopsies before and after FLT3L administration to assess effect on the tumor microenvironment.
The patient clinical metadata can be found in table S1.
10x Visium SD spatial transcriptomics 10x Visium spatial sequencing library preparation: Before processing Visium gene expression samples, DV200 was measured on RNA isolat- ed from FFPE blocks to assess RNA integrity. Samples with a DV200 greater than 50% were selected for subsequent steps. After quality con- trol, blocks were trimmed and 5- μm tissue sections were cut and placed on the capture area of a Visium Spatial Gene Expression for FFPE slide (10x Genomics). The slide was incubated in a thermal cycler
at 42°C for 3 hours and then placed in a desiccator overnight at RT. Subsequent steps covering tissue staining and library preparation were performed according to the manufacturer’s instructions (CG000407_ VisiumSpatialGeneExpressionforFFPE_RevC). The quality of the li- braries was assessed using an Agilent 4200 TapeStation. Libraries were sequenced using the NovaSeq 6000 platform with 150 paired- end con- figuration on a NovaSeq SP flowcell.
Tested Visium FFPE samples with immune aggregates: The tested sam- ples included in- house generated data for lung (n = 3), liver (n = 3) and colorectal (n = 6) human cancers and third- party dataset for renal (n = 6; GSE175540) human cancer. All the tested samples were stained using H&E. Visium transcriptome data were obtained using standard proce- dure provided by 10x Genomics for FFPE tissue sections. Reads were processed and mapped to the human reference genome GRCh38 using the 10x Genomics Space Ranger pipeline (10x Genomics). Filtering and analysis of the samples were performed in python using scanpy (v1.9.1), with default parameters. In the downstream analysis, samples retained for further study were those containing at least one TLS per tissue area, as confirmed by a pathologist.
Deconvolution of Visium spots for spatial cell type mapping: For the de- convolution step we used Cell2location algorithm (75) yielding propor- tions of the deconvoluted cells in each Visium spot. We also performed H&E- based cell segmentation to quantify the number of cells per each Visium spot using StarDist (65). Then, we multiplied deconvoluted pro- portions of cells by the absolute number of segmented cells in each spot, thus getting the absolute number of deconvoluted cells in each Visium spot.
Spatial enrichment in TLS regions: For each Visium sample, we used the histopathological annotations of TLS as base to test the enrichment or depletion of inferred cell types. First, the inferred cell type abundance values are binarized based on their spatial autocorrelation using Voyager https://pachterlab.github.io/voyager/index.html (76). Univariate lo- cal statistics are calculated with the runUnivariate function (Getis- Ord GI* with permutation testing; type = “localG_perm”) and spots were called if value > 2. Enrichment fold changes and statistics were calculated using LotOfCells (77). Correlation and hierarchical trees were calculated by cor and hclust functions. Visualizations were gen- erated in R.
Gradient analysis: Gradient analysis consists of two steps. First, it identifies Visium spots positioned equidistantly from a selected struc- tural boundary, whether they are inside the structure (internal layers) or moving away from it (outer layers). Then, it regresses gene expres- sion or cellular counts across these layers and thus can explore the microenvironment of a selected tissue region (78).
Radial distance analysis from TLS regions: For each Visium sample, we used the TLS annotations to extract the radial distances, d, using the RadialDistance function in semla (convert_to_microns = T; v1.1.6; cit) (79). Distances of 0 μm represent the outer line of spots immediately exterior to the TLS- labeled spots. Distances >1000 μm were discarded to exclude distant tissue areas. In ggplot2, geom_smooth with the lo- cally estimated scatterplot smoothing method (“loess,” span = 0.45) was used for visualization of cell density data.
Pathway enrichment analysis of Visium samples: We used GSEApy (80) implementation of gene set enrichment analysis. Used databases of pathways: GO Cellular Component (https://geneontology.org/), KEGG (https://www.genome.jp/kegg/), LINCS (https://lincsproject.org/), MSigDB (https://www.gsea- msigdb.org/gsea/msigdb), and Reactome (https:// reactome.org/).
Code sharing statement for analysis of Visium samples: All the code used for cell segmentation in Visium samples is available at the Human Immune Monitoring Center (HIMC) GitHub page https://github.com/ ismms- himc/visium_segmentation. The code for gradient analysis is deposited in the HIMC GitHub page, https://github.com/ismms- himc/ Visium_analysis.
Other packages used for Visium analysis: Seurat (81), Simple features (82), Tidyverse (83), Scran (84), and Scater (85).
10x Visium HD spatial transcriptomics Nuclear segmentation and neighborhood analysis: Space Ranger outputs of Human lung Visium HD datasets were obtained from 10x Genomics website. Full- resolution tissue images (TIFF) were read alongside the corresponding 2 mm spatial transcriptomics outputs for each sample and processed with sopa (86) and spatialdata (87) packages. Nuclei seg- mentation was performed using the stardist (88) algorithm, with the FFPEIF_Experiment1 sample processed using the 2D versatile fluores- cence model and all other samples using the default 2D versatile HE model (probability threshold 0.2, non- maximum suppression 0.6, mini- mum area 30). Segmented cell boundaries were exported as GeoPackage files, and per- cell features were aggregated with a radius expansion of one cell diameter. Gene expression tables were filtered to retain genes expressed in ≥10 cells and cells with ≥3 counts, normalized and log- transformed using scanpy (89). All processed data, including segmented images, polygon files, and AnnData objects (90), were saved for down- stream analyses and visualization in R. Cell type annotations were as- signed by implementing a K- Nearest Neighbors (KNN) classification approach using the RunKNNPredict function from scop package in R (https://github.com/mengxu98/scop) using combined human reference model of GSE154826, GSE206325, GSE183219 and of human CRC dataset (unpuplished). Spatial neighborhoods were defined by calculating the Euclidean distance between cell centroids. For each reference cell type, neighboring cells within a 30 μm radius were identified. Interaction ta- bles were generated recording each reference- neighbor cell pair, their cell types, and distance. Interactions were summarized as absolute counts and relative fractions per reference cell (82). TLS association was assigned by spatial overlap with TLS polygons (previously identified us- ing QuPath), allowing comparisons of interactions within TLS versus non- TLS regions.
scRNA- seq and single- cell T cell receptor sequencing (scTCR- seq) analyses Previously published NSCLC and HCC scRNA- seq datasets (GSE154826, GSE206325) were analyzed. Differentially expressed genes were deter- mined using Seurat. Imputed mean UMI counts were used to calculate logarithmic fold changes in expression between cell states to further analyze markers of interest. Gene set enrichment analysis was con- ducted using the Enrichr database. Additional R packages used include scDissector v1.0.0, shiny v1.7.0, ShinyTree v0.2.7, heatmaply v1.3.0, plotly v4.10.0, ggvis v0.4.7, ggplot2 v3.3.5, dplyr v1.0.7, Matrix v0.9.8, and seria- tion v1.3.5. The preprocessed raw count matrices were normalized and log1p- transformed before scoring for mature DC signature with sc.tl. score_genes() in Scanpy (89, 90). Patients with <10 cells per cluster were removed from subsequent analysis. Additional Python libraries used include: Scanpy v1.9.8, anndata v0.10.5.post1, umapv0.5.5, numpyv1.26.4, scipy v1.12.0, pandas v2.2.3, scikit- learn v1.4.0, statsmodels v0.14.1, igraphv0.11.3, pynndescent v0.5.11. scTCR- seq was performed as de- scribed previously (15).
MERFISH To identify transcriptionally distinct cell population with MERFISH, we used two panels of genes as previously described (15) (table S2). FFPE or fresh frozen samples from HCC and NSCLC patients were
processed as previously described and tissue sections were incubated with a custom designed MERSCOPE Gene Panel Mix for 36 to 48 hours at 37°C. Samples were gel embedded and underwent tissue clearing as previously described. Tissue slides were prepared for imaging as previously described and loaded onto the MERSCOPE system (Vizgen 10000001). Samples were initially imaged at low- resolution using 10× magnification to select regions of interest which were imaged at high- resolution using 60× magnification.
Images were visualized using MERSCOPE Vizualizer (v2.1.2593.1) and single- cell analysis was conducted using the the scanpy (v1.9.1) Python package as previously described. Briefly, cells with <10 and >750 counts or with <10 unique genes expressed were removed. Furthermore, cells with a high fraction of blank counts (top 5th percentile) or with high or low spot density or polyT signaling staining intensity (top and bottom 0.0005 percentile) were filtered to remove debris, apoptotic cells, and suspected doublets. Label transfer was performed using TACCO (v0.2.2) from annotated single- cell data to the MERFISH data using the MERFISH raw counts as inputs and default parameters for label transfer. For HCC samples, a previously published single- cell reference was used (15). For NSCLC samples, a mixture of the liver tumor single- cell reference and a prior lung adenocarcinoma atlas (14) was used due to the increased resolu- tion of desired immune cell subtypes in the liver data. Specifically, clus- ters labeled as T, NK, DC, B memory, and B naïve from the HCC dataset replaced respective cell types in the NSCLC dataset. Resulting labels were compared against scanpy- based Leiden clustering of MERFISH data for concordance of broad cell type compartments. After label trans- fer, tissue regions were drawn using Shapely (v2.0.1) and GeoPandas (v0.14.0) around cells labeled naïve B and memory B cells, which were annotated as “immune aggregates.” In HCC samples, regions were drawn around tumor, endothelial, and hepatic stellate cells, which were an- notated as “stromal.” In NSCLC sections, similar “stromal” regions were created around epithelial, endothelial, and fibroblast cell types. Regions were drawn as alpha shapes around cells, using the centroid x and y loca- tions of each cell as inputs. To smooth regions of sparse cells, all regions were buffered by 30 μm. Overlapping areas of regions were resolved such that immune aggregate regions were prioritized first before stro- mal. Co- occurrence analysis was performed separately for cells of inter- est in stromal and immune aggregate regions using squidpy (v1.5.0) (91) using the squidpy.gr.co_occurrence() function at regular intervals from 0 to 500 μm and the TACCO assigned cell type labels as inputs. Enrichment values for each cell type at 30 μm were normalized for visualization by ln(1 + x), where x is the co- occurrence enrichment value as derived from squidpy. Co- occurrence results were also checked for agreement with permutation- based neighborhood enrichment, calculated through the squidpy.gr.nhood_enrichment() function. Gene module scores were calculated using sc.tl.score_genes() in a similar fashion to scRNA- seq scores. All MERFISH downstream processing and analysis was con- ducted on a distributed high performance computer cluster. This work was supported in part through the computational resources and staff expertise provided by Scientific Computing at the Icahn School of Medicine at Mount Sinai and supported by the Clinical and Translational Science Awards (CTSA) grant UL1TR004419 from the National Center for Advancing Translational Sciences.
POPLAR cohort Survival analysis: Overall survival analyses of the POPLAR cohort (18, 92, 93) was performed using a Kaplan- Meier estimator and Cox regression upon stratifying patients by presence of TLS or lymphoid aggregates (LAs). TLS or LA annotations were determined by histological imaging. R packages used include: survival, survminer, and gtsummary.
Immune cell scores and pathway analyses: Gene signatures for different immune cell types were generated from prior literature (14, 15) (table S4). Scores for each signature were computed as the mean of z- scores for each gene across patient samples. To determine correlations between
immune cell scores, Pearson correlation coefficients were computed (two- tailed, 95% confidence interval). These signatures were also used to determine significant cell signaling pathways via gene set enrichment analysis (94).
Statistics Parametric statistical tests, such as the two- tailed Student’s t test (for unpaired comparisons) and paired t test (for paired comparisons), were used to assess differences between two groups when the data met normality assumptions. For nonparametric comparisons, normal- ity was first evaluated using the Kolmogorov- Smirnov test (for un- paired data) or the Shapiro- Wilk test (for paired data). If the data significantly deviated from normality, a Mann- Whitney U test was used for unpaired comparisons, and a Wilcoxon signed- rank test was performed for paired samples. For comparisons involving more than two groups, one- way analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey’s multiple comparisons test was applied when normality assumptions were met. Kaplan- Meier curves were compared using the log- rank (Mantel- Cox) test.
ReFeReNces aND NOtes
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doi: 10.1002/cpz1.90; pmid: 33780170
acKNOWleDGMeNts
We thank members of the Merad, Kamphorst, and Brown laboratories at the Marc and
Jennifer Lipschultz Precision Immunology Institute at Mount Sinai for insightful discussions and
feedback. We thank the Mount Sinai Flow Cytometry Core, the Microscopy and Advanced Bioimaging
CoRE, | the Human Immune Monitoring Center (HIMC), the Center for Comparative Medicine and
Surgery for animal husbandry, and the Biorepository and Pathology CoRE Laboratory
(notably A. Soto and S. El Naggar) at the Icahn School of Medicine at Mount Sinai for support. We
thank the NIH Tetramer Core Facility (NIH contract 75N93020D00005 and RRID:SCR_026557) for
providing I- Ab LCMV GP 66- 77 DIYKGVYQFKSV monomer. We thank the patients and their
families for participating in the clinical studies. We recognize the invaluable assistance of B. Y. Nabet
(Genentech), M. Dalod, R. Akyol, E. Tomasello (Centre d’Immunologie de Marseille- Luminy),
A. R. Sanchez- Paulete, J. A. Grout, M. Buckup, D. Feng, A. Lozano, C. M. Wilk, A. Saffon, N. Yatim,
C. Azimi, L. Montégut, T. Chin, C. Noel, E. Katzin, C. Falcomatà, S. Balan, S. S. Nair (Icahn School of
Medicine at Mount Sinai), Z. Yin (Yale University School of Medicine), A. V. Tumanov (UT Health
San Antonio), and M. Meylan (Dana- Farber Cancer Institute). The summary figure was created with
BioRender under academic license. This work was supported in part through the computational
resources and staff expertise provided by Scientific Computing at the Icahn School of Medicine at
Mount Sinai. We are grateful to Boehringer Ingelheim, Inc., for their sponsorship and support in
providing resources for CRC sample collection. We acknowledge Vizgen, Inc., for their sponsorship
and support for MERFISH data generation in this study. Genentech/Roche funded the POPLAR trial.
Funding: R.Ma. was supported by the 2021 AACR- AstraZeneca Immuno- oncology Research
Fellowship, grant no. 21- 40- 12- MATT, and with J.- C.L. by the FCT - Fundação para a Ciência e
Tecnologia, I.P. (grant nos. 2023.15874.PEX and 2024.17879.PEX). J.B. was supported by the CRI
2025 Irvington Postdoctoral Fellowship (CRI12960). E.A. was supported by the Scholarship
Programme for Visiting Research Scientists from the Bodossaki Foundation (grant no. 9755). B.Y.S.
was supported by the National Institutes of Health (NIH) Medical Scientist Training (T32GM146636)
and a National Cancer Institute predoctoral fellowship (F30CA301790). M.D.P. was supported by
the American Federation for Aging Research (2021 Diana Jacobs Kalman Scholarship for Research
in the Biology of Aging). S.H. was supported by the National Cancer Institute (K00CA223043 and
K99CA293148). M.T. was supported by a European Research Council (ERC) CoG grant (artFibro, 101088596). A.L. was supported by NIH/NCI R37CA230636, NIH/NCI R01CA251155, and the Damon Runyon- Rachleff Innovator Award. S.K.- S. was supported by grants from the NIH (U24 CA224319, R01 DK1222853, U2C ES030859, DA055434, 1R01 HL166720- 01A1, and U01OH012621) and funding from Caribou Biosciences, Inc. M.S. was supported by grants R21AI180874, R21AI176069, R01AI160706, and R01DK130425. S.Gn. was partially supported by NIH grants CA224319, DK124165, CA263705, and CA196521. A.O.K. and T.U.M. were supported in part by the Tisch Cancer Institute Cancer Center Support Grant (P30 CA196521). M.M. was partially supported by NIH grants CA257195, CA254104, and CA154947. Author contributions: R.Ma. and M.M. conceptualized and obtained funding for the project. R.Ma. and J.L.B. performed experiments with the help of J.B., E.A., P.H., A.V., M.D.P., C.H., L.L., M.B., E.H., R.Me., S.H., J.An, R.A.O., E.N., and G.M.P. L.H., B.Y.S., E.R., M.D.P., I.H.- V., D.D., J.- C.L., I.F., M.M.S., E.G.K., and V.R. performed the computational analysis. P.H. designed the MERFISH libraries. R.Ma. and M.D.P. designed the gene lists for bulk sequencing analysis. A.V., R.D., and J.B. modified the KP- HELLO cell line. R.Ma., E.A., P.H., A.V., H.M.K., L.T., R.A.K., C.H., L.L., F.R., M.E.K., I.P.M., G.I., S.O., A.Te., H.M., N.S., E.N., S.Go., A.M.R., A.Ta., and H.S. performed multiplex imaging experiments and analyses. F.R. and R.Ma. performed the light- sheet experiments. M.B., G.M., and R.Ma. did the spheroid experiments. R.Ma., P.H., L.T., and S.H. processed the human samples. C.H. coordinated the clinical and research teams and managed clinical specimens. S.O. and A.D.P. provided pathological expertise for tissue annotation. M.N., M.T., J.Ah., N.B., A.L., Z.C., S.K.- S., J.D.B., M.S., C.M., S.Gn., F.G., K.M.M., C.S.- F., W.H.F., B.D.B., T.U.M., F.B., J.G.C., H.S., T.C.B., N.S.J., and A.O.K. provided intellectual input, essential reagents, and datasets. M.M. supervised the study. R.Ma. wrote the original draft. R.Ma., J.B., and M.M. wrote, reviewed, and edited the manuscript. All authors provided feedback on the manuscript draft. Competing interests: M.M. serves on the scientific advisory board and holds stock from Dren Bio Inc., Owkin Inc., Larkspur Inc., and Myeloid therapeutics Inc.; serves on the scientific advisory board of OSE Inc.; and receives funding for contracted research from Regeneron Inc. and Boehringer Ingelheim Inc. T.C.B. is a consultant for Galvanize Therapeutics, Mestag Therapeutics, Tallac Therapeutics, Attivare Therapeutics, and Kalivir Therapeutics and serves on the scientific advisory board of Tabby Therapeutics. T.U.M. has served on advisory and/or data safety monitoring boards for Rockefeller University, Regeneron Pharmaceuticals, Abbvie, Bristol- Meyers Squibb, Boehringer Ingelheim, Atara, AstraZeneca, Genentech, Celldex, Chimeric, Glenmark, Simcere, Surface, G1 Therapeutics, NGMbio, DBV Technologies, Arcus, and Astellas and has research grants from Regeneron, Bristol- Myers Squibb, Merck, and Boehringer Ingelheim. The M.S. laboratory has received unrelated funding support in sponsored research agreements from Phio Pharmaceuticals, 7Hills Pharma, ArgenX NV, Ziphius, and Moderna. S.Gn. reports past consultancy or advisory roles for Merck and OncoMed and research funding from Regeneron Pharmaceuticals, Boehringer Ingelheim, Bristol Myers Squibb, Celgene, Genentech, EMD Serono, Pfizer and Takeda, unrelated to the current work. S.Gn. and M.M. are named coinventors on an issued patent (US20190120845A1) for multiplex IHC to characterize tumors and treatment responses. The technology is filed through Icahn School of Medicine at Mount Sinai (ISMMS) and is currently unlicensed. This technology was used to evaluate tissue in this study, and the results could affect the value of this technology. C.M. was a Genentech Inc. employee when this work was performed and owned company stocks. C.M. is an inventor on the patent US20230279067A1 held by Genentech, Inc., that covers “Ligand fusion proteins for FLT3 and methods of use.” N.B. is an extramural member of the Parker Institute for Cancer Immunotherapy (PICI), holds stock options in BreakBio, serves as an advisor and/or board member and holds stock options in Genotwin and DC Prime, serves as an advisor and/or board member and holds equity in Cell BioEngines, holds stock in Barinthus, is a consultant for and has received grant support from Merck Research Laboratories, has received drug product from Oncovir, and serves on the scientific advisory board of Aikium (stock options) and Epitopea. I.P.M. is a paid consultant for Galvanize Therapeutics, Inc. The remaining authors declare no competing interests. Data, code, and materials availability: An interactive website for exploring TLS spatial data (Visium SD/HD, MERFISH, and CyCIF) is available at https://rstudio- connect.hpc.mssm.edu/mattiuz_science2026_tls_spatial_data/. No new software pipelines were used in the study beyond those described in the relevant Materials and methods sections and in (78). All data analysis scripts use existing methods and are provided in a GitHub repository provided with this paper (https://github.com/Merad- Lab/Mattiuz2026_ Manuscript_Code/). Processed matrix files and metadata for the human cancer FFPE Visium SD dataset and human HCC and NSCLC MERFISH datasets generated in this study are available under accession nos. GSE322553 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?&acc=GSE322553) and GSE327192 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?&acc=GSE327192). Accession nos. for reanalyzed published datasets include the human renal cancer FFPE Visium SD dataset (GSE175540), external NSCLC bulk RNA- seq dataset (EGAS00001005013), and NSCLC and HCC scRNA- seq datasets (GSE154826, GSE206325, and GSE183219). Public 10x Genomics Visium HD NSCLC datasets are available at these links: lunghd_1, https://www.10xgenomics.com/datasets/ visium- hd- cytassist- gene- expression- human- lung- cancer- post- xenium- expt; lunghd_2, https:// www.10xgenomics.com/datasets/visium- hd- cytassist- gene- expression- human- lung- cancer- post- xenium- expt; lunghd_3, https://www.10xgenomics.com/datasets/visium- hd- cytassist- gene- expression- libraries- of- human- lung- cancer- if; and lunghd_4, https://www.10xgenomics.com/ datasets/visium- hd- cytassist- gene- expression- human- lung- cancer- fixed- frozen. Xcr1- Venus mice are available from T. Kaisho under an MTA with Wakayama Medical University. KP- HELLO- 2 cells can be obtained for research use under a material transfer agreement from R.Ma. and M.M. through the Icahn School of Medicine at Mount Sinai. Any additional information required to interpret data reported in this paper is available from the corresponding author M.M. on request. License information: Copyright © 2026 the authors, some rights reserved; exclusive licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original US government works. https:// www.science.org/about/science- licenses- journal- article- reuse. This research was funded in whole or in part by the ERC (artFibro, 101088596); as required the author will make the Author Accepted Manuscript (AAM) version available under a CC BY public copyright license.
sUPPleMeNtaRY MateRials science.org/doi/10.1126/science.ady1678 Figs. S1 to S7; Tables S1 to S6; MDAR Reproducibility Checklist; Movies S1 and S2
Restored clearance of senescent neutrophils
by tissue- resident macrophages limits organ aging
Yuting Jessy Tan, Travis E. Conley, Fuwen Yao, Fernando J. García- Marqués, Damilola E. Akinyemi, Van Vuong Dinh,
Qian Wang, Abel Bermudez, Jieun Kim, Julia A. Belk, Oliver Soehnlein, Sharon J. Pitteri, Katrin I. Andreasson*
INTRODUCTION: Aging is accompanied by parallel functional decline
across organs, but the cellular drivers remain unclear. Tissue- resident
macrophages (TRMs), long- lived cells that comprise 60 to 90% of
macrophages in major organs, maintain homeostasis through
efferocytosis of apoptotic and senescent cells. Neutrophils, the most
abundantly produced and shortest- lived leukocytes (more than
100 billion generated daily in humans), require continuous TRM
clearance; uncleared aged neutrophils release proteases and extracel-
lular traps that damage tissues and propagate aging. TRMs express
the prostaglandin E2 (PGE2) receptor EP2, which suppresses
macrophage metabolism and phagocytosis in aging. Whether
impaired TRM efferocytosis drives the accumulation of senescent
neutrophils that promote organ aging and whether inhibition of EP2
signaling can restore this process, remain unknown.
RATIONALE: We studied aged mice in which EP2 signaling on TRMs was selectively reduced, either genetically (TRM- specific EP2 deletion) or pharmacologically, to define how TRM dysfunction shapes organ- wide aging. TRMs are long- lived gatekeepers of tissue homeo- stasis, and EP2 offers a tractable target because its activity increases in aged macrophages and suppresses their metabolic and phagocytic function. Using complementary genetic and pharmacological approaches, we tested whether restoring TRM function reverses organ aging and identified which efferocytic substrate is most affected. The same design also defined the molecular step at which EP2 acts within TRMs and extended our findings to aged human tissues.
RESULTS: In aged mice, TRM- specific EP2 deletion restored mitochondrial fitness and immune homeostasis, and reversed cognitive decline, frailty, sarcopenia, adiposity, and cardiac dysfunc- tion toward youthful states. Plasma proteomics identified the liver as a major source of age- associated immune changes. Single- cell RNA- seq of mouse liver and multiorgan flow cytometry revealed accumulation of senescent CXCR4⁺ neutrophils across efferocytic organs in aging. These cells exhibited the senescence- associated secretory phenotype (SASP), DNA damage response activation, cell cycle inhibitor induction, NETosis, and anti- apoptosis programs, and were efficiently cleared following EP2 deletion. Liver multiplex imaging localized paracrine stress to parenchymal cells neighboring senescent neutrophils. Ex vivo efferocytosis assays showed that aged TRMs were most impaired in clearing senescent neutrophils relative to apoptotic substrates, with both functions restored by EP2 deletion or pharmacologic antagonism. Mechanistically, EP2 signaling suppressed integrin- dependent stabilization of senescent neutrophils on TRMs and downstream engulfment. Analyses of human liver and heart datasets revealed conserved EP2 up-regulation in aged TRMs, enrichment of senescent neutrophils, and reduced TRM–neutrophil interactions.
Tissue- resident macrophage (TRM) clearance of senescent neutrophils is restored by EP2 deletion or inhibition to limit organ aging. (Top) In aged TRMs, EP2 signaling suppresses (1) integrin engagement with senescent neutrophil (Neu) ligands required for clearance and (2) engulfment of senescent neutrophils into phagolysosomes, allowing senescent neutrophils to accumulate, (3) undergo degranulation and NETosis, and (4) exert paracrine stress on neighboring parenchy- mal cells, (5) collectively driving organ aging. (Bottom) EP2 deletion or inhibition restores (1) integrin- mediated interaction and (2) phagolysosomal engulfment, limiting (3) degranulation and NETosis, (4) paracrine stress, and (5) organ aging. NETosis, neutrophil extracellular trap (NET) formation; AC, adenylyl cyclase; PKA, protein kinase A; TFs, transcription factors.
senescent neutrophil clearance, reframing aging as a failure of active cellular clearance rather than passive degeneration. With age, neutrophils acquire senescence- associated features, and their accumulation drives tissue injury through two converging mecha- nisms: intrinsic degranulation and NETosis, and extrinsic paracrine stress on neighboring parenchymal cells. Pharmacological inhibition of EP2 restores TRM efferocytic capacity and promotes clearance of senescent neutrophils, positioning EP2 antagonism as a tractable therapeutic strategy for age- related organ and functional decline.
Full article and list of author affiliations: https://doi.org/10.1126/ science.aea3075
Restored clearance of senescent neutrophils by tissue- resident macrophages limits organ aging
Yuting Jessy Tan1, Travis E. Conley1, Fuwen Yao1,
Fernando J. García- Marqués2, Damilola E. Akinyemi3,
Van Vuong Dinh3, Qian Wang1, Abel Bermudez2, Jieun Kim4,
Julia A. Belk5, Oliver Soehnlein3, Sharon J. Pitteri2,
Katrin I. Andreasson1,6,7,8*
Aging disrupts tissue homeostasis across organ systems. Here,
we identify tissue- resident macrophages (TRMs) as central
coordinators of age- related organ decline through impaired
clearance of senescent neutrophils, a process regulated by the
immunomodulatory prostaglandin E2 (PGE2) receptor EP2.
Reducing TRM EP2 signaling in aged mice preserved youthful
mitochondrial fitness and prevented cognitive decline, frailty,
sarcopenia, adiposity, cardiac impairment, and systemic
inflammation. Plasma proteomics implicated the liver as a
major source of age- associated immune change, in which
reduced TRM EP2 signaling rescued neutrophil efferocytosis
and prevented paracrine stress in neighboring cells. Elevated
TRM EP2 expression and senescent neutrophils were also
observed in aged and diseased human tissues. Pharmacologic
EP2 inhibition restored youthful neutrophil clearance,
establishing impaired TRM efferocytosis as a reversible driver
of organ decline in aging.
Aging is marked by the progressive breakdown of tissue integrity, re- generative capacity, and immune equilibrium (1, 2). This decline is tightly associated with development of systemic inflammation and multiple chronic disorders of aging, including cognitive decline, vas- cular disease, frailty, sarcopenia, and metabolic syndrome. Although molecular hallmarks of aging have been identified, the cellular events that initiate and propel tissue decline remain poorly defined (3).
Macrophages are central regulators of tissue homeostasis, inflam- mation, and repair (4). In aging, macrophage phenotypes shift toward chronic inflammation and phagocytic dysfunction, but whether these changes are causal or compensatory remains unresolved (5). Among mac- rophage subtypes, tissue- resident macrophages (TRMs) have drawn increasing attention as potential initiators of aging due to their early de- velopmental origin, longevity, and integration into tissue niches (6, 7). TRMs arise largely from yolk sac progenitors and fetal liver monocytes, self- renew, and persist throughout life, with tissue- dependent postna- tal contribution from monocyte- derived macrophages (MDMs), which are themselves short- lived with limited self- renewal (7–12).
TRMs comprise 60 to 90% of macrophages in the brain, liver, lungs, heart, and kidneys (7–9, 13, 14), and their long lifespan makes them particularly vulnerable to aging, as they accumulate metabolic, oxida- tive, and inflammatory injury over years to decades (15, 16). The brain contains almost exclusively TRMs, with an estimated 10 to 20 billion
1Department of Neurology and Neurological Sciences, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA. 2Department of Radiology, Stanford University School of Medicine, Palo Alto, CA, USA. 3Institute for Experimental Pathology (ExPat), Centre for Molecular Biology of Inflammation (ZMBE), University of Münster, Münster, NRW, Germany. 4Neurosciences Preclinical Imaging Laboratory, Wu Tsai Neurosciences Institute, Stanford University, Stanford, CA, USA. 5Department of Pathology, Stanford University, Stanford, CA, USA. 6Wu Tsai Neurosciences Institute, Stanford University, Stanford, CA, USA. 7The Phil and Penny Knight Initiative for Brain Resilience at the Wu Tsai Neurosciences Institute, Stanford University, CA, USA. 8Chan Zuckerberg Biohub, San Francisco, CA, USA. *Corresponding author: kandreas@ stanford. edu
microglia, while peripheral tissues collectively harbor approximately 200 billion TRMs (17, 18). Given their abundance and ubiquitous pres- ence across organs, age- related changes in TRMs may represent an important cellular driver of organ dysfunction and systemic aging.
A core TRM function is efferocytosis, the clearance of apoptotic, senescent, and damaged cells that is essential for preventing chronic inflammation (19). Among primary TRM targets are neutrophils, the most abundantly produced immune cell, with more than 10 billion and 100 billion generated daily in mice and humans, respectively (20, 21). Neutrophils are among the shortest- lived immune cells, ag- ing within hours in the circulation and requiring continuous clear- ance (22, 23). Uncleared aged neutrophils release proteases and extracellular traps that damage tissues, propagate inflammation, and promote aging (24–26), and are normally removed efficiently by TRMs in the liver, spleen, and bone marrow (27–30).
TRMs also express receptors for immunomodulatory signals, includ- ing those for the lipid messenger prostaglandin E2 (PGE2), a down- stream product of the inflammatory cyclooxygenase- 2 (COX- 2) pathway. PGE2 elicits pro- or anti- inflammatory effects through four G protein– coupled receptors (EP1 to EP4). In aged macrophages, PGE2- EP2 sig- naling suppresses glycolysis and mitochondrial respiration, disrupting phagocytosis and inflammation resolution (31). Here, we identify TRM clearance of senescent neutrophils as a critical driver of organ aging and show that this process is regulated by the PGE2 receptor EP2.
Results EP2 deficiency in aging TRMs preserves mitochondrial fitness and organ immune homeostasis TRMs largely arise prenatally from yolk sac–derived erythro- myeloid progenitors (EMPs) and self- renew locally throughout life, whereas MDMs arise postnatally from bone marrow hematopoietic stem cells (HSCs) and are continuously replenished from the circulation, with tissue- dependent conversion of MDMs into long- tenured TRM- like cells (Fig. 1A) (8, 11, 12). CX3CR1 is highly expressed in TRMs but lower in MDMs, making it a practical marker for biased TRM targeting, which we further refined with residency- specific readouts. To examine EP2 signaling in TRMs, we crossed Cx3cr1CreER mice with Ptger2lox/lox mice to conditionally delete EP2 in CX3CR1+ cells after tamoxifen treatment (EP2 cKO; Fig. 1B).
We validated TRM- selective EP2 deletion in young (6 to 8 months old) wild- type (WT), (Cx3cr1CreER), and EP2 cKO mice given tamoxifen 2 months earlier. In the liver, lungs, and heart, TRMs comprised 65 to 80% of tissue macrophages and expressed EP2 at >95%, with ~50 to 60% deletion in cKO mice. MDM EP2, detected only in the liver and lungs, was minimally reduced (<10%), due to low CX3CR1 expression and continuous MDM replenishment from CX3CR1− HSCs (32, 33) that dilutes Cre- mediated deletion, whereas TRM self- renewal keeps their deletion stable (fig. S1). Overall, the EP2+ macrophage fraction fell from ~80 to ~40% in cKO mice, driven almost entirely by TRMs.
Because CX3CR1 is expressed in both TRMs and MDMs, Cre- mediated deletion could in principle act on either population irrespective of tissue tenure. We therefore tested whether residency, rather than on- togeny, predicts EP2 deletion by stratifying liver and lung macrophages by TIM4, a canonical residency marker independent of ontogeny (34, 35). TIM4 was expressed in ~80 to 90% of liver and lung macro- phages across young and aged mice of both genotypes, and TIM4+ cells coexpressed Clec4f (liver) and SiglecF (lungs) at ~85 to 95%, whereas TIM4− cells expressed these markers at <10%, establishing TIM4+ mac- rophages as bona fide TRMs. TIM4+ TRMs expressed EP2 at ~90 to 95% in WT and ~45 to 50% in cKO mice, whereas TIM4− macrophages maintained EP2 at ~25% regardless of genotype, with patterns pre- served in aged mice (fig. S2). Thus, Cx3cr1CreER- driven EP2 deletion segregates with residency: TIM4+ TRMs preferentially lose EP2, whereas TIM4− nonresident macrophages do not, indicating TRM- biased dele- tion independent of developmental origin.
We next compared young and aged (23 to 25 months old) WT and EP2 cKO mice across the liver, lungs, and brain. In the brain, we fur- ther distinguished microglia (TRMs), damage- associated macrophages (DAMs), border- associated macrophages (BAMs), and MDMs (36, 37) (fig. S3A). TRMs predominated in lungs (~70 to 80%) and brain (>90%) regardless of age, whereas aged liver contained considerably fewer TRMs (~55%) than young liver (~75 to 80%), and this deficit was re- stored in aged EP2 cKO mice (Fig. 1C). CX3CR1 remained stably high in TRMs (~70 to 90%) and low in MDMs (~10 to 30%) across organs and ages (Fig. 1D). EP2 was most highly expressed in TRMs across all organs, with aged TRM deletion efficiency (~50 to 60%) matching that in young mice (Fig. 1E); in the brain, EP2 was also detected in DAMs (~70%), BAMs (~80%), and MDMs (~50%), with cKO reducing EP2 in TRMs, DAMs, and BAMs by ~40 to 50%, whereas MDM deletion re- mained negligible. Lymphoid EP2 was low in the liver and lungs (<5%) but elevated in meningeal innate lymphoid cells (ILCs), natural killer (NK) cells, and CD4 T cells (>40%), reflecting the distinct meningeal immune milieu (38). Because TRMs accounted for >95% of total EP2 loss, the overall fraction of EP2+ cells declined by ~50% across organs (Fig. 1, F and G), confirming that robust, TRM- biased EP2 deletion is maintained with aging.
To compare aging effects on TRMs versus MDMs, we examined the peritoneal cavity using established markers to distinguish TRMs (CD45+CD11bhiF4/80+) from MDMs (CD45+CD11bintF4/80−CCR2+) (39) (fig. S3B). In contrast to MDMs, TRM abundance declined considerably with age and this loss was prevented in aged EP2 cKO mice (Fig. 1H). This selective protection prompted us to examine mitochondrial func- tion, a key determinant of TRM survival and phagocytic capacity (40). Aged TRMs showed reduced mitochondrial mass and membrane po- tential along with elevated superoxide, all of which were largely re- stored to youthful amounts in aged EP2 cKO mice (Fig. 1, I to K, and fig. S3, C to E). MDMs showed only increased superoxide with no changes in proportion, mass, or membrane potential.
Aging is accompanied by low- grade systemic inflammation underly- ing vascular, metabolic, and neurodegenerative disorders. We tested whether TRM EP2 deletion reverses this inflammatory state across plasma and major organs. In aged mice, TRM EP2 deletion reverted inflammatory profiles to youthful states across plasma, liver, colon, heart, kidneys, and hippocampus (Fig. 1, L to Q, and fig. S4, A to F). Plasma endotoxin was restored to near- youthful concentrations in aged EP2 cKO mice (Fig. 1R), reflecting improved gut barrier integrity or en- hanced blood endotoxin clearance. Thus, TRMs drive systemic and organ- wide age- associated inflammation through PGE2- EP2 signaling.
TRM EP2 deletion limits age- associated declines in organ function Because TRM EP2 deletion restored youthful immune signatures across multiple organs and blood (Fig. 1), we tested whether these changes were accompanied by improvements in organ function.
Microglia, the TRMs of the brain, are yolk sac–derived and strongly express Cx3cr1 (41). To test whether microglia affect cognitive function, we examined young (6 to 8 months old) and aged (23 to 25 months old) male EP2 cKO and WT mice in the Barnes maze (hippocampal- dependent spatial memory) and novel object recognition (cortical- dependent rec- ognition memory) tasks. Both short- and long- term spatial memory (days 4 and 14) were considerably improved in aged EP2 cKO relative to aged WT mice (Fig. 2A, and fig. S4, G and H). Aged EP2 cKO mice also regained object- based episodic memory, performing comparably to young mice (Fig. 2B). Thus, microglial EP2 signaling is an important driver of age- associated memory decline.
During routine handling, aged EP2 cKO mice appeared leaner and more physically fit than WT littermates. Whole- body MRI confirmed increased limb muscle volume and reduced visceral fat in aged EP2 cKO mice, approaching those of young mice (Fig. 2, C to E). These changes, along with decreased subcutaneous fat (fig. S4I), were associated with improved frailty scores (Fig. 2F), greater forelimb strength (Fig. 2G
and fig. S4I), and preserved muscle fiber composition and architec- ture (Fig. 2, H and I). MHCIIa+ fibers, which confer endurance through oxidative metabolism (42), were substantially depleted in aged WT but restored in aged EP2 cKO mice. Aberrant myonuclear positioning, a hallmark of sarcopenia and impaired muscle regenera- tion (43), was also largely normalized toward a youthful pattern (Fig. 2J and fig. S4J).
We then tested whether the attenuation of skeletal muscle aging in aged EP2 cKO mice extends to the heart, a highly vascularized, mitochondria- rich organ whose function also deteriorates with age (44). Cardiac MRI revealed that TRM EP2 deletion preserved youthful left ventricular ejection fraction, septal wall thickness, and left ventricle (LV)/right ventricle (RV) ratio, consistent with improved systolic function (Fig. 2, K and L). Given the heart’s high energy demands, we examined mito- chondrial integrity in cardiomyocytes using transmission electron microscopy (TEM). Aged WT hearts had more lucent mitochondria with disrupted cristae; by contrast, EP2 cKO hearts showed more electron- dense mitochondria, similar to those of young hearts (Fig. 2, M and N, and fig. S4K). We also measured myocardial stiffness, which increases in aging and is driven in part by extracellular matrix deposition, particularly collagen. Trichrome staining revealed collagen accumu- lation in the ventricular wall in aged WT mice that was reduced to near- youthful amounts in aged EP2 cKO mice. Collagen- extracted and fiber- isolated views confirmed a reduction in fibrosis with pre- served muscle fiber integrity in aged EP2 cKO mice (Fig. 2, O and P). Together, these findings indicate that TRM EP2 deletion limits det- rimental structural and functional remodeling of the aging heart, and that selective targeting of EP2 in CX3CR1+ TRMs can broadly ameliorate age- associated declines in cognition, skeletal muscle, adi- posity, and cardiac function.
The aging plasma proteome remains in a youthful state with TRM EP2 deletion Given the broad, multiorgan improvements observed with TRM- specific EP2 deletion, we sought to identify systemic mediators of these changes. Because the blood circulation integrates immune and meta- bolic signals across tissues, we performed quantitative plasma proteomic profiling using tandem mass tag (TMT)–based liquid chromatography- tandem mass spectrometry (LC- MS/MS) in young and aged WT and EP2 cKO mice (Fig. 3A). After depleting high- abundance plasma pro- teins, 138 proteins were confidently quantified (>2 unique peptides). Of those, 71 were substantially altered with aging, and 59 were restored toward youthful amounts in aged EP2 cKO mice (Fig. 3B). Principal component analysis (PCA) revealed a clear separation of aged WT plasma from both aged EP2 cKO and young groups (Fig. 3C). Pathway enrichment of rescued proteins identified broad immune remodeling, including the acute phase response, IL- 12 signaling, integrin signaling, IL- 10 signaling, and neutrophil degranulation (Fig. 3, D to F).
To identify tissue sources driving these age- related plasma changes, we performed cell type enrichment analysis using tissue- specific pro- teomic signatures. This analysis revealed that hepatocytes, Kupffer cells (KCs), and cholangiocytes were the most enriched cellular sources (Fig. 3G), pointing to the liver as a major contributor to aging- related changes in blood. Although classically viewed as a metabolic hub, the liver is also one of the most TRM- rich organs (17), serving to filter portal and circulating blood while maintaining both hepatic and sys- temic immune homeostasis (45). Consistent with this, aging was as- sociated with elevated serum biomarkers of liver inflammation and injury, including aspartate aminotransferase (AST), alanine amino- transferase (ALT), gamma- glutamyl transferase (GGT), alkaline phos- phatase, and C- reactive protein, all of which were restored toward youthful amounts in aged EP2 cKO mice (Fig. 3H). These findings support a central role for the liver, and likely liver TRMs, in driving age- associated systemic immune changes that are largely prevented by TRM EP2 deletion.
Fig. 1. TRM- selective EP2 deletion restores mitochondrial and immune homeostasis in aging. Data are mean ± SEM Statistical tests: two- way analysis of variance (ANOVA) with Tukey post hoc tests for (C) and (H to R); unpaired two- tailed t tests for (D and E). P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001, **P < 0.0001. Young (yng) (6 to 8 months) and aged (23 to 25 months) C57BL/6J male Cx3cr1CreER (WT) and Cx3cr1CreER;EP2lox/lox (EP2 cKO) mice were examined. (A) Origin of tissue- resident macrophages (MΦ). TRMs arise largely from yolk sac–derived EMPs, express CX3CR1hi, and self- renew throughout life. MDMs arise postnatally from HSC–derived monocytes, express CX3CR1low, and are continuously replenished from the circulation. Dashed arrow indicates tissue- dependent conversion of MDMs into TRM- like cells. In the resident MΦ chart, cell size approximates
relative abundance. LPM, large peritoneal macrophage; RPM, red pulp macrophage. (B) Generation of TRM- selective EP2 conditional knockout (EP2 cKO) mice. Tamoxifen was administered at 4 to 6 months of age to both genotypes. Young and aged mice were evaluated at 6 to 8 months and 23 to 25 months, respectively. i.p., intraperitoneal injection. (C) Mean TRM and MDM proportions within the macrophage pool in liver, lungs, and brain. n = 8 to 10 mice per group. (D) CX3CR1 expression percentage in TRM and MDM subsets across liver, lungs, and brain. n =18 mice per age group (WT and cKO are combined). (E) EP2 expression percentage across immune cell subsets in the liver, lungs, and brain. Lowercase letters (a and b) denote significant differences between the wild type and cKO within each age group. Neu, neutrophil; ILC, innate lymphoid cell; DAM, damage- associated macrophage; BAM, border- associated macrophage. n = 8 to 10 mice per group. (F) Mean immune cell percentages per million CD45+ cells in the liver, lungs, and brain. Cell types are color coded as indicated. Data are averaged across all age and genotype groups. N = 36 mice per organ. (G) Mean EP2+ and EP2− cell percentages per million CD45+ cells by immune subset in liver, lungs, and brain. Solid bars, EP2+; hatched bars, EP2−. Lymphoid (Lymph.) cells include ILC, NK, CD4 T, CD8 T, and B cells. Data are averaged within each genotype group combining young and aged mice. n = 18 mice per genotype. (H) Peritoneal TRM and MDM percentages within CD45+CD11b+ cells. PTM, peritoneal MΦ; n = 6 to 12 mice per group. (I) to (K) Mitochondrial features of peritoneal TRMs and MDMs: mitochondrial mass (MitoGreen MFI) (I), inner membrane potential (ΔΨm; MitoRed MFI) (J), and percentage of superoxide- producing MΦ (MitoSOX+) (K). MFI, mean fluorescence intensity. n = 6 to 12 mice per group. (L to Q) Unsupervised hierarchical clustering of significantly regulated immune factors (*P < 0.05, two- way ANOVA) in the plasma, liver, colon, heart, kidneys, and hippocampus by Luminex across young and aged WT and EP2 cKO mice. Each heatmap value represents the average of two technical replicates. n = 7 to 13 mice per group. (R) Plasma endotoxin in young and aged WT and EP2 cKO mice. n = 7 to 13 mice per group.
Senescent neutrophil accumulation across efferocytic organs in aging is reversed by TRM EP2 deletion Given the liver’s central role in shaping the aging immune landscape (Fig. 3), we performed single- cell RNA sequencing (scRNA- seq) of the liver, enriching for CD45+ leukocytes along with hepatocytes and en- dothelial cells (fig. S5A). Uniform manifold approximation and projec- tion (UMAP) clustering (Fig. 4A and fig. S5, B and C) revealed a marked shift in neutrophils from aged WT mice compared with the other three groups (Fig. 4B). Subclustering with pseudotime analysis identified four neutrophil states ordered along a Neu1- to- Neu4 trajectory, with aged WT neutrophils skewed toward Neu2 and Neu3 states (Fig. 4, C and D). Neu2 and Neu3 expanded from near- absence in young and aged cKO mice to ~50 and ~30% of neutrophils, respectively, in aged WT mice (Fig. 4E).
Differential expression showed that Neu1 and Neu4 carried acute immune response and tissue- interaction programs and were unaf- fected by TRM EP2 deletion. By contrast, Neu2 and Neu3 signatures peaked in aged WT mice and reverted toward youthful expression in aged EP2 cKO mice (Fig. 4F). Neu2 was enriched for proinflammatory alarmins, cyclin- dependent kinase (CDK) inhibitors, and antiapoptotic factors, consistent with senescence- associated secretory (SASP) and cell cycle arrest (CCA) programs, whereas Neu3 showed enrichment for DNA damage response (DDR) genes, proapoptotic factors, and granule protein genes linked to neutrophil extracellular trap (NET) formation. Together, these programs indicate a senescent neutrophil state, incorporating SASP, DDR, ap o pto sis resistance, and CCA, despite the absence of consensus frameworks for neutrophil senescence and the limited applicability of existing SASP- focused panels to murine immune cells (46–48).
Although neutrophils are considered terminally differentiated, they retain cell cycle machinery (CDK4/6, cyclins, lamin kinases) that is repurposed for nonproliferative functions, including nuclear envelope breakdown during NETosis (CDK4/6), degranulation (CDK5), and con- trol of apoptotic timing (CDK7/9) (49–51). Because existing senescence frameworks may not be designed for neutrophils, in which cell cycle components are coopted for unconventional effector roles, we curated a 57- gene panel detected in >20% of neutrophils to further characterize the senescence and ap o pto sis programs associated with the Neu2 and Neu3 subclusters. The panel was organized into MICSE- aligned catego- ries (CCA, anti- apoptosis, DDR) with additional modules for pro- apoptosis and NETosis to distinguish apoptotic from senescent states and capture hallmarks of aged neutrophils (fig. S5, D to I). Neu2 scored highest for CCA, SASP, and anti- apoptosis, whereas Neu3 showed the strongest DDR, NETosis, and pro- apoptosis signatures, with aged WT exhibiting the highest scores across categories (Fig. 4G). Composite senescence (CCA + SASP + anti- apoptosis) and stress (DDR + NETosis + pro- apoptosis) scores placed Neu2 in a high- senescence quadrant, with a subset of Neu3 forming a transitional population that pro- gressed toward a high- stress quadrant, consistent with progressive
stress acquisition by senescent neutrophils culminating in ap o pto sis (Fig. 4H). Thus, Neu2 defines senescent, apoptosis- resistant neutro- phils, whereas Neu3 represents stressed neutrophils transitioning toward ap o pto sis.
Neutrophils age rapidly in circulation, acquiring a CXCR4hiCD62Llo phenotype within 8 to 12 hours (22, 52), making clearance by TRMs in the bone marrow, liver, and spleen essential for immune homeostasis (Fig. 4I). Upon tissue accumulation, aged neutrophils preferentially undergo degranulation and NET formation, amplifying sterile inflam- mation (53). Flow cytometry of the liver from Cx3cr1CreER mice con- firmed that aged WT mice accumulated CXCR4+ and annexin V+ neutrophils despite unchanged total neutrophil numbers, a phenotype reversed in aged cKO mice (Fig. 4, J and K). These data link the tran- scriptomic Neu2 (senescent) and Neu3 (pro- apoptotic) states to surface phenotype; hereafter, we refer to CXCR4hi neutrophils as senescent neutrophils. Blood neutrophil markers of diapedesis (CXCR2+), aging (CXCR4+, CD62L−), degranulation (CD63+), and ap o pto sis (annexin V+) similarly reverted toward youthful amounts in aged EP2 cKO mice (fig. S6, A and B). Liver myeloperoxidase (MPO), a marker of neutrophil burden and NET formation (53), was elevated in aged WT and restored close to youthful amounts in aged EP2 cKO mice (fig. S6C). This phe- notype was recapitulated in a second genetic model, the Rosa26CreER- inducible global EP2 deletion model with tamoxifen administered at 4 to 6 months of age (fig. S6, D and E). This genetic model overlaps with the Cx3cr1CreER model as EP2 is predominantly expressed in mac- rophages, with minimal basal expression in neutrophils and highest expression in TRMs (fig. S7A).
Liver and plasma abundance of CXCL1 and CXCL2, key CXCR2 li- gands driving neutrophil recruitment, were unchanged with aging (Fig. 1, L and M), arguing against increased recruitment as the cause of neutrophil accumulation. We therefore investigated whether ac- cumulation reflected impaired efferocytosis, the process by which pro- fessional phagocytes engulf senescent and apoptotic cells. Senescent neutrophils up- regulate phosphatidylserine, annexin A1, and CXCR4 to facilitate macrophage recognition (52, 54), and efferocytosis proceeds through three steps (55): (i) recognition, (ii) ligand- receptor stabilization, and (iii) engulfment (Fig. 4L), followed by lysosomal digestion (56). Different organ TRMs express distinct ligand- receptor pairs across these steps (57).
We examined efferocytosis in young and aged Rosa26CreER (WT) and Rosa26CreER;ptger2lox/lox (EP2 global cKO) mice by flow cytometry across liver, spleen, and bone marrow, the three tissues responsible for clearing up to 90% of neutrophils undergoing turnover (27–29) (Fig. 4, M to P, and fig. S7, B and C). In the aged WT liver, F4/80+ KCs, the primary efferocytes, were substantially reduced; although total neu- trophil numbers were unchanged, CXCR4+ senescent and annexin V+ apoptotic neutrophils accumulated alongside elevated LFA- 1 expres- sion on KCs, consistent with impaired clearance and compensatory stabilization. All changes were largely reversed in aged EP2 cKO mice
Fig. 2. TRM EP2 deletion prevents age- associated cognitive decline, sarcopenia, adiposity, and decline in cardiac function. Data are mean ± SEM and analyzed using
two- way ANOVA with Tukey post hoc tests, unless otherwise stated: P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001, and **P < 0.0001. Young (yng; 6 to 8 months) and aged (23 to
25 months) C57BL/6J male Cx3cr1CreER (WT) and Cx3cr1CreER;EP2lox/lox (EP2 cKO) mice were examined. (A) Barnes maze assessment of spatial memory. (Left) Representative day-4
test traces after habituation (day 1) and training (days 2 to 3). Escape hole, green; sealed holes, gray. n = 6 to 10 mice per group. (B) Novel object recognition (NOR) assessment
of object- based episodic memory. (Left) Schematic of training and testing phases. (Right) Novel object preference scores across groups. Paired t test, training (day 1) versus
testing (day 2). n = 6 to 10 mice per group. (C) MRI of limb muscle and abdominal adipose tissue. (Left) Body positioning and scan regions (pink) in coronal and transverse
planes for muscle mass and adipose tissue, respectively. (Right) Representative images from matched anatomical planes, with dashed lines and arrows highlighting limb muscle
(top) and adipose tissue (bottom). (D and E) MRI quantification of limb muscle volume (D) and adipose tissue volume (E). n = 4 mice per group. (F) Frailty assessment using the
mouse frailty index (see methods), which assesses eight categories scored as 0 = absent, 0.5 = mild, or 1 = severe. n = 6 to 10 mice per group. (G) Grip strength measurements
averaged over 10 trials per mouse; force is reported in Newtons (N). n = 6 to 10 mice per group. (H) Immunofluorescence of calf muscle cross sections. Large panels show
merged channels; small panels show individual 4′,6- diamidino- 2- phenylindole (DAPI) (nuclei, white), MHC IIa (muscle fibers, green), and Laminin (basal lamina, red). (I and
J) Quantification of muscle fiber area (I) and nucleus localization (J); each data point represents the average of three fields of view (FOVS) per animal. n = 3 mice per group.
(K) Cardiac MRI in coronal (left) and transverse views at end- diastole (ED; middle) and end- systole (ES; right). Yellow plane and red arrow in coronal view indicate transverse
imaging position at the widest ventricular width. Yellow dashed lines outline LV and RV; blue bars indicate septal wall thickness (T) at ED (T1) and ES (T2). (L) Quantification of
LV ejection fraction (EF), septal wall thickness, and LV/RV ratio from (K): LVEF = (ED volume – ES volume)/ED volume; wall thickening = (T2–T1)/T1; LV/RV volume ratio at ED
phase. n = 4 to 6 mice per group. (M) Representative TEM images of cardiomyocytes in LV heart muscle, positioned at comparable regions across subjects, acquired at 4000×
magnification. Arrows indicate mitochondria. The TEM images shown in this panel are also presented in fig. S4K (first column), where they are displayed alongside additional
processing and magnifications used for related quantifications. (N) Quantification of mitochondrial features from heart TEM. Mean mitochondrial grayscale intensity (AU, arbitrary
units) reflects the brightness of extracted mitochondria on a scale of 0 (dark) to 255 (white). The proportion of abnormal lucent mitochondria (percent) is measured from images
taken at 1000× magnification, with lucency defined as grayscale intensity >80 AU. Each data point represents the average of four FOVs per animal. n = 4 mice per group. (O) Representative
trichrome staining of heart tissue to assess collagen deposition and cardiomyocyte structure. Sections were taken along the longitudinal axis of the LV from a similar region
across subjects. Images were acquired at 2.5× magnification. Image deconvolution of trichrome stain (left column) identifies collagen (blue; middle column) and muscle (red;
right column). (P) Quantification of heart tissue composition from trichrome staining in (O). Collagen- positive area is quantified from collagen- extracted images, and nonmuscle
area from muscle fiber–extracted images. Each datapoint represents the average from three FOVs per animal. n = 4 mice per group.
(Fig. 4, M and N). In the spleen, where EP2 was highly expressed in TRMs but minimal in neutrophils (fig. S7B), aged WT mice showed increased total neutrophils and accumulation of CXCR4+ senescent and annexin V+ apoptotic neutrophils alongside elevated LFA- 1 on splenic TRMs, all restored in aged EP2 cKO mice (Fig. 4O). Bone marrow showed the same pattern: CXCR4+ senescent neutrophil accumulation and elevated LFA- 1 on TRMs, both reversed in aged EP2 cKO mice (Fig. 4P). As in the liver and spleen, EP2 expression in the bone marrow was largely restricted to macrophages (fig. S7C). Mer tyrosine kinase (MerTK), which mediates engulfment of phosphatidylserine- exposing cells by bone marrow macrophages (58), was elevated in aged WT TRMs and restored in aged cKO mice. Across all clearance organs, elevated inte- grin expression accompanied senescent neutrophil accumulation, sug- gesting a compensatory response to chronic efferocytic failure. Together, aging drives senescent neutrophil accumulation across all major ef- ferocytic organs alongside compensatory up- regulation of stabilization receptors, both of which are prevented by TRM EP2 deletion.
TRM- specific EP2 deletion restores efferocytosis and limits senescent neutrophil–driven tissue injury To directly test whether TRM EP2 deletion restores efferocytic capacity, we examined liver KCs and splenic red pulp macrophages (RPMs) from young and aged Cx3cr1CreER and Cx3cr1CreER;EP2lox/lox mice, in which EP2 deletion is largely TRM- restricted (Fig. 1G). TRMs were coincubated ex vivo with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)–labeled target cells, with 4°C incubation to distinguish adhesion from uptake (fig. S8). KCs were challenged with senescent neutrophils or dexamethasone- induced apoptotic thymocytes (59), whereas RPMs were challenged with apoptotic RBCs (60) or lymphocytes (61), with >95% labeling efficiency across substrates (fig. S8).
Aged WT TRMs from both organs showed considerably reduced efferocytosis of all target cells, restored by TRM EP2 deletion (Fig. 5A). The defect was most pronounced for senescent neutrophils (~10- fold reduction versus young, ~sixfold reduction versus cKO), compared with ~2.5- fold reduction for apoptotic substrates. Because senescent and apoptotic cells share phosphatidylserine- dependent recognition path- ways (TIM4 and MerTK) (62), age- associated defects in recognition likely contribute broadly to the clearance deficit, consistent with re- ported MerTK cleavage in aging (63). However, the selective severity for senescent neutrophils suggests an additional failure at the stabili- zation step, supported by compensatory up- regulation of the integrin LFA- 1 on aged WT TRMs across efferocytic organs (Fig. 4, M to P).
To examine age- associated efferocytic deficits in situ, we used MACSima multiplexed immunohistochemistry (mIHC) (64) to map KCs, neutrophils, and degranulation markers in liver from young and aged Cx3cr1CreER and EP2 cKO mice. KCs were identified by CD169 (Siglec- 1), a sialoadhesin marking TRMs with high specificity (65), and neutrophils were stained with Ly6G, the senescence marker CXCR4, and myeloperoxidase (MPO), a neutrophil granule enzyme elevated during degranulation and NETosis that promotes oxidative tissue in- jury (66) (Fig. 5B). The aged WT liver showed reduced CD169+ KC area alongside increased CXCR4+ and MPO+ neutrophil burden; all three measures were restored toward youthful states in aged EP2 cKO mice (Fig. 5, B and C). Spatial colocalization of CD169+ KCs with Ly6G+ neu- trophils, a proxy for efferocytic engagement, was reduced in aged WT but restored in aged EP2 cKO mice, as was the elevated CXCR4+Ly6G+ neutrophil pool (Fig. 5, B and C). The increase in MPO is consistent with enhanced NET- associated sterile inflammation (66). Consistent with the periportal enrichment of KCs (67), conventional immunohis- tochemistry (IHC) using the macrophage marker F4/80 confirmed portal localization across groups with no zonal redistribution, whereas Ly6G+ neutrophils were distributed across both portal and central hepatic zones without zonal preference (fig. S9, A and B). Larger- area conventional IHC similarly showed elevated MPO and elastase in aged WT liver, restored in aged EP2 cKO mice (fig. S9C).
Parallel conventional IHC of spleen showed reduced colocalization of Ly6G+ neutrophils with the lysosomal phagocyte marker CD68, in- dicating impaired degradation of senescent neutrophils. CD68+ mac- rophage area was also diminished in the aged WT spleen, with both defects restored in aged EP2 cKO mice. Aged WT spleens accumulated total and CXCR4+ senescent neutrophils and showed increased MPO and elastase staining indicating neutrophil- driven tissue injury, all prevented in aged EP2 cKO mice (fig. S9, D and E). These findings demonstrate that impaired clearance in aging extends across effero- cytic organs and is enabled by TRM EP2 signaling.
Senescent cells can exert deleterious effects on neighboring cells through SASP- mediated paracrine signaling (68). To investigate para- crine consequences of senescent neutrophil accumulation, we used mIHC to examine hepatic parenchymal cells. In the aged WT liver, hepatocytes (E- cadherin+) up- regulated CD54 (ICAM- 1), an adhesion molecule in- duced on hepatocytes during inflammatory stress (69); sinusoidal en- dothelial cells (CD31+) showed elevated CD106 (VCAM- 1), a marker of endothelial activation (70); and stellate cells (CD206+), the principal source of hepatic fibronectin (FN) (71), increased FN deposition (Fig. 5D).
Fig. 3. TRM EP2 deletion prevents age- associated changes in the plasma proteome. Data are mean ± SEM and analyzed using two- way ANOVA with Tukey post hoc tests,
unless otherwise stated: P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001, and **P < 0.0001. Young (yng; 6 to 8 months) and aged (23 to 25 months) C57BL/6J male Cx3cr1CreER
(WT) and Cx3cr1CreER;EP2lox/lox (EP2 cKO) mice were examined. (A) Plasma TMT–based shotgun proteomics workflow. After depletion of albumin, immunoglobulins, and
transferrin, and subsequent protein digestion, peptides were labeled with 10 isobaric TMT tags (m/z 126 to 131), with label assignments color coded for visualization, corre-
sponding to reporter ion positions on the MS2 m/z spectrum used for protein quantification. (B) Venn diagram showing the overlap among protein groups for the 138 proteins
detected with number of peptides (Np) > 2. n = 4 to 6 mice per group. (C) PCA of plasma proteomes for 138 proteins. Each point represents a technical replicate from one
biological sample. n = 4 to 6 mice per group, with three technical replicates per sample. (D) Pathway enrichment analysis of plasma proteins that were restored to youthful
amounts in aged EP2 cKO mice. Bar length indicates the number of differentially expressed proteins per pathway, with red and blue denoting up- and down- regulated proteins,
respectively. Bubble position along the top axis indicates pathway significance [−log(P- value)]. Bubble size represents the ratio of detected proteins in this dataset to the total
number of proteins associated with that pathway in Ingenuity Pathway Analysis (IPA). (E) Differentially expressed plasma proteins between aged WT and aged EP2 cKO mice.
Red and blue dots represent proteins meeting significance thresholds (FDR < 0.05, foldchange > 1.23). Selected annotated proteins are color coded by protein pathway (right).
(F) Heatmap of representative plasma proteins restored to youthful amounts with TRM EP2 cKO. Proteins are grouped by pathway and color coded by functional category on the
right. Values represent the average of three technical replicates per sample. n = 4 to 6 mice per group. (G) Cell type enrichment of age- associated plasma proteins restored to
youthful amounts with TRM EP2 cKO. Bar length indicates the number of mapped proteins; bubble position reflects −log(P- value); the dashed red line marks the P- value = 0.1
threshold; blue bars indicate significant enrichment, gray indicates nonsignificant. (H) Liver enzymes and biomarkers measured in serum. AST, aspartate aminotransferase;
ALT, alanine aminotransferase; GGT, gamma- glutamyltransferase; ALP, alkaline phosphatase; CRP, C- reactive protein. n = 6 to 8 mice per group.
Fig. 4. TRM EP2 deletion reduces senescent neutrophil burden and restores efferocytic machinery across aged efferocytic organs. Young (yng; 6 to 8 months) and aged (23 to 25 months) male Cx3cr1CreER (WT) and Cx3cr1CreER;EP2lox/lox (EP2 cKO) mice were examined (A to K). (M to P) show data from Rosa26CreER (WT) and Rosa26CreER;EP2lox/lox (EP2 cKO) mice of the same age groups. Data were analyzed using two- way ANOVA with Tukey post hoc tests, except for (G) (Wilcoxon rank- sum test): P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001, **P < 0.0001. (A) UMAP visualization of liver scRNA- seq integrating all four groups. Major cell populations are annotated using color coded labels matching their corresponding clusters. DCs, dendritic cells; plasmaC, plasma cells; endothelialC, endothelial cells; Kupffer cells, KCs. n = 8 mice total. (B) UMAP visualization of liver
scRNA- seq by experimental group. Arrows highlight the neutrophil cluster. n = 2 mice per group. (C) Pseudotime trajectory of Neu (neutrophils) integrating all four experimental groups. (D) UMAP visualization of neutrophil subclusters (Neu1 to 4) split by experimental groups, showing condition- dependent shifts in subcluster distribution. (E) Mean percentage of each neutrophil subcluster (Neu1 to 4) within total neutrophils across experimental groups. (F) Heatmap of top differentially expressed genes across neutrophil subclusters (Neu1 to 4) and age/genotype conditions. Scale bar indicates z- scored expression. (G) Module scores for CCA, SASP, anti- apoptosis, DDR, NETosis, and pro- apoptosis gene categories across neutrophil subclusters (Neu1 to 4) and experimental groups. Each data point represents a single cell. The y- axis represents per- cell mean expression of genes in each category, adjusted for background expression. Box plots show median (thick line), interquartile range (box), and whiskers (1.5× IQR). Significance lines compare subclusters (long) or experimental groups within a subcluster (short). CCA, cell cycle arrest; SASP, senescence- associated secretory phenotype; Apop, ap o pto sis; DDR, DNA damage response. (H) Composite senescence (CCA + SASP + anti- apoptosis) versus stress (DDR + NETosis + pro- apoptosis) scores for Neu2 and Neu3 cells. Arrow indicates the cell state transition trajectory. Each data point represents a single cell. (I) Schematic of the neutrophil life cycle illustrating stages from bone marrow maturation to circulation, diapedesis into tissues, activation, and clearance by macrophages. Blue and red arrows indicate the trafficking and fate of young and aged neutrophils, respectively. (J) Representative flow cytometry plots of CXCR4 (top) and annexin V (bottom) expression within liver neutrophils (Neu) across experimental groups. n = 8 to 10 mice per group. (K) Quantification of total neutrophil percentage within CD11b+ cells, and CXCR4+ and annexin V+ percentages within neutrophils, from (J). n = 8 to 10 per group. (L) Schematic of the three steps of neutrophil (Neu) efferocytosis by resident macrophages (rMΦ): recognition, stabilization, and engulfment. Dashed boxes highlight ligand–receptor interactions at each step, such as efferocyte TIM4–neutrophil PtdSer (recognition), efferocyte integrin–neutrophil ICAM- 1/VCAM- 1 (stabilization), and efferocyte FPR2–neutro- phil annexin A1 (engulfment). Sen, senescent; Apop, apoptotic. (M) Flow cytometry strategy with representative plots of liver neutrophils and KCs, showing cell abundance, neutrophil ap o pto sis and senescence, and expression of ligand–receptor pairs involved in senescent neutrophil clearance, corresponding to efferocytosis stages outlined in (L). The parent population for each marker is indicated in the upper left of each plot row. (N) Quantification of neutrophil (left) and KC (right) marker percentages from (M). Neutrophil markers are within Ly6G+ cells; KC markers are within CD11b+ cells. n = 6 to 9 per group. (O) to (P) Quantification of neutrophil and TRM marker percentages in spleen (O) and bone marrow (P). Experimental group annotations (yng WT, yng cKO, aged WT, aged cKO) follow the color legend shown in (N). n = 6 to 9 mice per group.
Colocalization of E- cadherin with CD54, CD31 with CD106, and CD206 with FN was substantially increased with age but restored to youthful amounts in aged EP2 cKO mice (Fig. 5, D and E). Spatial analysis re- vealed reduced distances between stressed parenchymal cells and Ly6G+CXCR4+ senescent neutrophils in aged WT mice, which was normalized in aged EP2 cKO mice, supporting proximity- dependent paracrine signaling. Collectively, EP2- mediated impairment of TRM efferocytosis in aging promotes senescent neutrophil accumulation, NET- mediated tissue injury, and paracrine inflammatory and fibrotic stress, all of which are prevented by TRM EP2 deletion.
TRM EP2 deletion restores integrin activation and efferocytic programs in aging Given the impaired efferocytosis observed across liver, spleen, and bone marrow (Figs. 4 and 5), we interrogated TRM- neutrophil interac- tions at single- cell resolution. CellChat analysis (72) of liver scRNA- seq from young and aged WT and EP2 cKO mice identified integrins as the dominant receptor class in KCs, with cognate ligands (e.g., Icam1, Thbs1) enriched in neutrophils, forming extensive ligand- receptor net- works (Fig. 6A and fig. S10, A and B). Flow cytometry confirmed ele- vated LFA- 1 (CD11a/CD18; Itgal/Itgb2) on aged TRMs across tissues (Fig. 4), implicating dysregulation of the β2 integrin subunit (Itgb2), which is shared by all major leukocyte integrin heterodimers (73), as a common feature of age- associated efferocytic failure.
We therefore investigated how β2 integrins are activated during efferocytosis. As illustrated in Fig. 6B, activation proceeds through four stages: (i) resting (bent, inactive); (ii) ligand binding, where Rac1 and RhoA engage the β2 tail to initiate cytoskeletal remodeling (74); (iii) membrane protrusion, where Skap1 facilitates membrane exten- sion and transitions integrins to an extended- closed state; and (iv) stabilization, where Tln2 and Fermt3 induce the fully extended, high- affinity conformation enabling stable neutrophil engagement (74, 75). Although most integrin subunits were reduced in aged KCs, Itgb2 was increased, consistent with compensatory up- regulation in the setting of impaired activation. By contrast, all five key coactivators (Rac1, RhoA, Skap1, Tln2, Fermt3) were reduced with aging but restored in aged EP2 cKO mice (Fig. 6C), with pathway analysis confirming sup- pression of integrin activation in aged WT KCs (Fig. 6D).
Because integrin stabilization is required for engulfment and down- stream clearance, we next examined post-engulfment programs (fig. S10C): Immediate early genes (Jun, Egr1) initiate the transcrip- tional response; post- engulfment regulators (Arg1, Il1rn) coordinate anti- inflammatory signaling; nuclear receptors (Lxr, Pparg) mediate lipid degradation; and efflux transporters (Abca1, Abcg1) export lipid
contents (76–78). All of these effectors were dysregulated in aged WT KCs, with activators down- regulated and suppressors elevated, a pattern reversed in aged EP2 cKO mice (fig. S10D). Pathway analysis confirmed broad suppression of phagocytic programs in aged WT KCs (Fig. 6E). Among 1227 age- dysregulated genes rescued with EP2 deletion (fig. S10E), efferocytosis- related pathways, including integrin signaling, liver X receptor (LXR)/RXR activation, and coordinated lysosomal expres- sion and regulation (CLEAR) network signaling, were among the most restored programs (fig. S10F). Additional age- associated disruptions of immune regulation, homeostasis, and stress adaptation were also normalized (fig. S10G), supporting the metabolic demands of efficient clearance.
Upstream transcription factor (TF) analysis revealed coordinated regulation of efferocytosis- associated TFs (Fig. 6F). Aging was associ- ated with suppression of JUNB, STAT3, and RELA, TFs that promote phagocytic clearance (79–85), and induction of CREB1 that impairs efferocytosis (81, 85), a pattern reversed in aged EP2 cKO mice (Fig. 6G). Together, these data demonstrate that EP2 signaling disrupts efferocytosis in aging TRMs by impairing transcriptional control, integrin activation, and post- engulfment clearance, defects that are restored by TRM- specific EP2 deletion.
Pharmacologic EP2 antagonism restores neutrophil clearance in aged mice To validate our genetic findings, we treated 22- month- old male mice with the selective EP2 antagonist PF- 04418948 (PF) (86) for 2 months (Fig. 6H). PF normalized circulating total, CXCR4+ senescent, and CD62L− aged neutrophils toward youthful amounts (Fig. 6I and fig. S11A). In the liver, PF similarly reduced total and CXCR4+ neutrophils, partially re- stored KC abundance, and decreased the proportion of LFA- 1+ KCs, suggesting a partial reversal of the age- associated integrin- stabilization defect (Fig. 6J and fig. S11, B and C). Other efferocytic ligand- receptor pairs on neutrophils and KCs were unchanged (fig. S11C), reinforcing β2 integrin dysregulation as the dominant EP2- dependent defect.
PF treatment also reduced age- associated senescent neutrophil ac- cumulation in spleen and bone marrow. In spleen, total Ly6G+ neutro- phils and annexin V+ apoptotic neutrophils were elevated with aging and substantially reduced by PF, with a trend toward normalization of CXCR4+ neutrophils (Fig. 6K and fig. S11, D and F). In bone marrow, PF normalized CXCR4+ senescent neutrophils and rescued age- related loss of VCAM- 1+ neutrophils, suggesting that EP2 inhibition reestab- lishes normal neutrophil retention in the bone marrow niche (Fig. 6L and fig. S11, E and G). LFA- 1+ TRM proportions outside the liver were not substantially restored, indicating that integrin normalization may
Fig. 5. TRM EP2 deletion restores clearance of senescent and apoptotic cells and reduces senescent neutrophil–driven damage and paracrine stress in aged tissues.
Young (yng; 6 to 8 months) and aged (23 to 25 months) male Cx3cr1CreER (WT) and Cx3cr1CreER;EP2lox/lox (EP2 cKO) mice were examined. Data are mean ± SEM. (A) was
analyzed using two- way ANOVA with Tukey post hoc tests; (C and E) were analyzed using one- way ANOVA with Tukey post hoc tests: P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001, **P <
0.0001. For (B) to (E), colocalization (co- loc) was defined as overlapping signals or proximity of <1 μm between detected signal centers, and images across groups were
acquired from comparable anatomical regions using identical settings for each stain panel. (A) Ex vivo efferocytosis assays. CFSE- labeled target cells were co- incubated
(co- incu.) with liver or spleen cell preparations; CFSE uptake was gated on TRMs (liver KCs; splenic RPMs). (Left) Experimental schematics; (middle); representative flow plots. (Right) Quantification. Target cells: aged blood neutrophils (Neu), dexamethasone- induced apoptotic (Dex- Apop) thymocytes (Thy), heat- treated apoptotic RBCs, or Dex- Apop T/B cells. Representative plots for KC–Neu and KC–Thy assays (first two rows) are the 37°C condition from the full control series shown in fig. S8A, which includes matched w/o target cell and 4°C negative controls. Analogous control series for the RPM–RBC and RPM–T/B assays are shown separately in fig. S8B. Kupffer cells, KCs; RPMs, red pulp macrophages. n = 8 to 10 mice per group. (B) Representative MACSima multiplexed immunohistochemistry (mIHC) of liver sections stained for CD169 (KCs), Ly6G (neutrophils), CXCR4 (senescence), and MPO (degranulation/NETosis). (Top row) merged channels; (middle and bottom rows) each individual channel of the merged image above, displayed separately. Arrows indicate Ly6G and CXCR4 colocalization in aged WT. Scale bars, 20 μm. (C) Quantification of imaging data from (B): marker- positive area (CD169, CXCR4, MPO) and colocalization frequency (CD169&Ly6G, CXCR4&Ly6G). Each data point represents the average of three FOVs per animal. FOV, field of view. n = 4 mice per group. (D) Representative MACSima mIHC of liver sections showing paracrine stress markers in three parenchymal cell populations: hepatocytes (E- Cadherin/CD54), sinusoidal endothelial cells (CD31/CD106), and stellate cells (FN/CD206), each costained with Ly6G and CXCR4 to mark senescent neutrophils. Dashed boxes indicate magnified insets; top insets show Ly6G (L) and CXCR4 (C) channels; bottom insets show individual parenchymal marker pairs, labeled by first letter and color- matched to their respective channels in the merged image. Yellow arrows highlight proximity of stressed parenchymal cells to CXCR4+ neutrophils. Scale bars, 30 μm (main) and 15 μm (insets). (E) Quantification of paracrine stress from (D). (Top) Colocalization frequency of parenchymal cell–stress marker pairs (E- Cad&CD54, CD31&CD106, FN&CD206). (Bottom) Mean spatial distance of each stressed parenchymal marker pair to Ly6G+CXCR4+ senescent neutrophils. Each data point represents the average of three FOVs per animal. n = 4 mice per group.
require longer or earlier treatment (Fig. 6, K and L). Other efferocytic ligand- receptor pairs on neutrophils and TRMs in spleen and bone marrow were similarly unchanged (fig. S11, F and G).
To directly assess neutrophil efferocytosis by TRMs, we performed ex vivo coculture assays using senescent blood neutrophils and freshly enriched liver KCs, as in Fig. 5A (Fig. 6M). KCs from PF- treated aged mice showed considerably increased neutrophil uptake compared with vehicle controls, restoring efferocytic capacity to near- youthful states (Fig. 6, M and N, and fig. S11H). Together, these results demonstrate that pharmacologic EP2 inhibition partially reverses age- associated TRM dysfunction and senescent neutrophil accumulation, with stron- gest rescue in the liver.
TRM- neutrophil dysregulation in human aging and disease We next investigated whether similar TRM- neutrophil alterations oc- cur in human aging and disease. Analysis of scRNA- seq data from the Guilliams Human Liver Cell Atlas (67) revealed that aged healthy livers showed reduced TRM proportions and expanded neutrophil popula- tions relative to younger subjects, with MDMs largely unchanged (Fig. 6, O and P). A similar pattern, with loss of TRMs and neutrophil expansion, was observed in diseased livers (Fig. 6P). PTGER2 expres- sion was selectively increased in TRMs from both aged and diseased human livers, with smaller increases in neutrophils and MDMs (Fig. 6Q and fig. S12A).
Human liver neutrophils also exhibited age- and disease- associated shifts toward senescent- like states. We used orthologous gene sets for SASP, anti- apoptosis, and DDR gene sets, three hallmark categories with sufficient expression in the scRNA- seq data to assess senescence features (fig. S12, B to D). In the aged liver, neutrophils transitioned from Neu1+2 clusters toward Neu3+4 clusters (Fig. 6R). Neu3+4 neu- trophils displayed considerably higher SASP (P = 4.7 × 10−7) and anti- apoptosis (P = 7.2 × 10−5) module scores compared with Neu1+2 neutrophils, consistent with a senescent- like phenotype (Fig. 6S). CellChat analysis revealed reduced TRM- neutrophil efferocytic interac- tions in the aged liver, with losses in integrin, galectin- 9, annexin A1, and NAMPT signaling that were accompanied by a gain in MHC- II antigen presentation pathways (Fig. 6T and table S1). These changes suggested a shift from tolerogenic neutrophil clearance to immunos- timulatory signaling, in line with precedent that defective efferocytosis enhances macrophage MHC- II signaling and CD4+ T cell activation in age- associated inflammation (87).
Similar changes were observed in the diseased liver, where neutro- phils showed a more pronounced senescent transcriptional signature, shifting from Neu1+5 toward Neu2+3+4 populations (Fig. 6U), with elevated SASP (P = 5.7 × 10−78), anti- apoptosis (P = 9.8 × 10−48), and DDR (P = 1.5 × 10−5) scores (Fig. 6V). TRM- neutrophil communication showed comparable reductions in interaction number and strength (Fig. 6W and table S1). Analysis of a second organ, the heart, using the
Tabula Sapiens heart atlas (88) also revealed age- associated loss of TRMs and selective up- regulation of PTGER2 in TRMs, however with- out expansion of neutrophils, consistent with the heart not being a primary efferocytic site for neutrophils (fig. S12, E to G). These cross- organ findings in humans, although correlative, are consistent with the relationships observed in our mouse models. Future studies in hu- man samples will be needed to directly test whether aged TRMs show reduced efferocytic capacity against senescent neutrophils and whether EP2 antagonism can restore this function.
As a complementary genetic approach, we examined whether EP2 or PGE2 pathway genes are associated with human longevity in pub- lished genome- wide association studies (GWAS). Across six GWAS studies of longevity and healthspan (89–93), PTGER2 and related PGE2 pathway genes showed no significant associations (fig. S12H). A Manhattan plot of the Timmers 2020 healthspan GWAS revealed no significant loci on chromosome 14 where PTGER2 resides (fig. S12I). The top longevity loci mapped to APOE, LPA, CDKN2B- AS1, ATXN2, and related genes within pathways including lipid metabolism, neu- rodegeneration, cell cycle and senescence, cardiovascular function, immune function, DNA repair, insulin/IGF signaling, and proteostasis (fig. S12, I and J). Notably, several of these pathways, particularly cell cycle and senescence and immune function, are directly relevant to the TRM- neutrophil clearance mechanism identified in our study, sug- gesting that existing GWAS may not yet capture the full spectrum of genes contributing to these biological processes. Consistent with this, epidemiological studies have widely reported associations between PTGER2 and aging- related diseases including Alzheimer’s disease, im- mune disorders, and cancer (94).
Discussion We identify TRMs as central regulators of multiorgan aging through PGE2- EP2 signaling. EP2 deficiency in aging TRMs restored mitochon- drial fitness and reduced systemic and organ- level phenotypes of aging, including inflammation, cognitive decline, sarcopenia, frailty, adipos- ity, and cardiac fibrosis. Mechanistically, TRMs drive aging through EP2- dependent suppression of efferocytosis of senescent neutrophils. In aging TRMs, EP2 signaling disrupts transcriptional programs re- quired for integrin activation and phagocytic clearance, leading to senescent neutrophil accumulation, persistent degranulation, NETosis, and propagation of sterile inflammation. EP2 inhibition preserves TRM efferocytic capacity and mitigates neutrophil- driven tissue aging.
Senescent neutrophils, defined here by features including CCA, SASP, and ap o pto sis resistance, represent an understudied state of neutro- phil dysfunction in aging. Classical senescence frameworks have focused on proliferative cells (46, 48); however, neutrophils retain cyclin- dependent kinases (CDK4/6, CDK5, and CDK7/9) that are repurposed for NETosis, degranulation, and apoptotic timing (49–51). In aged neu- trophils, increased expression of CDK inhibitors appears to constrain
Fig. 6. EP2 impairs efferocytic stabilization and post-engulfment programs in aged KCs and pharmacological EP2 inhibition restores neutrophil clearance in aged
mice and TRM- neutrophil alterations occur in aged and diseased human organs. (A to G) scRNA- seq from young (6 to 8 months) and aged (23 to 25 months) male
Cx3cr1CreER (WT) and Cx3cr1CreER;EP2lox/lox (EP2 cKO) mice. (H to N) young (yng; 7 months) and aged (24 months) male C57BL/6J mice treated with vehicle (veh) or
PF- 04418948 (PF). (O to W) human liver scRNA- seq data (Guilliams et al., PMID: 35021063). Data are mean ± SEM (I) to (N) were analyzed using one- way ANOVA with
Tukey post hoc tests; (O) to (W) were analyzed using Wilcoxon rank- sum test: P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001, **P < 0.0001. (A) Ligand–integrin mapping between
neutrophils and KCs using CellChat, filtered for biologically relevant expression and communication strength. (B) Schematic of integrin activation stages during efferocytosis.
Integrins function as α/β heterodimers transitioning from a low- affinity (bent) to high- affinity (extended, open) state. Coactivators Rac1, RhoA, Skap1, Tln2, and Fermt3 bind the
cytoplasmic tail of β- subunits to promote cytoskeletal remodeling, membrane protrusion, and integrin unbending. Neu, neutrophils. (C) Expression of integrins and integrin-
activating genes in KCs. Expression values represent per- sample averages across single cells. Colored dots next to each integrin activator correspond to the color used for that
factor in the schematic in (B). (D) Enrichment analysis of integrin and integrin- activating pathways in KCs. Negative values indicate decreased enrichment in aged WT compared
with aged EP2 cKO mice. P < 0.01, P < 0.001. (E) Enrichment analysis of KC downstream phagocytic pathways regulated by TRM EP2. Pathway enrichment was calculated
based on genes associated with post stabilization phases of efferocytosis. Negative enrichment scores indicate reduced pathway activity in aged WT compared with aged EP2
cKO. P < 0.05; **P < 0.01. (F) Top predicted TFs regulating integrin- and efferocytosis- related phagocytic program genes. Genes from (C) to (E) were jointly analyzed.
Significance is shown as –log10(P- value); red dashed line indicates P = 0.05. (G) EP2- regulated TFs differentially expressed between aged WT and aged EP2 cKO KCs. Bar
direction reflects expression change; leftward bars indicate reduced TF expression in aged WT and restoration in aged EP2 cKO. Bar length represents log2 fold change. Bar color
indicates each TF’s reported role in efferocytosis: blue for activators, orange for suppressors. (H) Schematic of pharmacological EP2 inhibition through oral gavage in young
(5 months) and aged (22 months) male C57BL/6J mice. (I) Quantification of blood neutrophil (CD11b+Ly6G+) marker percentages across treatment groups. n = 6 mice per
group. (J) Quantification of liver neutrophil (CD11b+Ly6G+) and KC (CD11b+F4/80+) marker percentages across treatment groups. n = 6 mice per group. (K) to (L) Quantifica-
tion of neutrophil and TRM marker percentages in the spleen (K) and bone marrow (L). n = 6 mice per group. (M) Ex vivo efferocytosis assay. CellTracker red–labeled aged blood
neutrophils were coincubated with liver cell preparations; uptake was gated on KCs (CD11b+F4/80+). Representative flow plots of CellTracker Red+ KCs are shown, with 4°C
incubation controls. (N) Quantification of CellTracker Red+ KCs (left), Ly6G+ KCs (middle), and CellTracker Red+ frequency within Ly6G+ KCs (right) from (M). Representative
flow plots for Ly6G+ KCs and CellTracker Red+ Ly6G+ KCs are shown in fig. S11H. n = 6 mice per group. (O) UMAP of human liver myeloid cells from human scRNA- seq data
(Guilliams et al., PMID: 35021063) integrating all donors. This dataset is used for (O) to (W). (P) Myeloid cell composition in human liver. (Left) Young (ages 49, 53; n = 2 donors)
versus aged (ages 73 to 75; n = 2 donors) in healthy livers (cholecystolithiasis). (Right) Healthy (cholecystolithiasis; n = 4 donors) versus diseased (n = 10 donors; hepatocel-
lular carcinoma, hepatocellular adenoma, colorectal cancer with liver metastases, liver injury, morbid obesity). The same donor groupings apply to (Q) to (W). (Q) PTGER2
expression in human liver TRMs. (Top) Young versus aged (healthy donors). (Bottom) Healthy versus diseased. Each data point represents a single cell expressing PTGER2. (R)
Neutrophil subclustering in healthy donors. (Left) UMAP of neutrophil subclusters (Neu1 to 4) split by young and aged, with pseudotime trajectory (arrows). (Right) Neutrophil
subcluster composition by age group. (S) Senescence module scores (SASP, anti- apoptosis, DDR) comparing Neu1+2 (young- enriched) versus Neu3+4 (aged- enriched)
subclusters in healthy donors. Each data point represents a single cell. Black lines indicate median. (T) CellChat analysis of TRM–neutrophil efferocytosis- associated signaling in
young versus aged healthy donors. (Top left) Number of interactions. (Top right) Interaction (Int.) strength. (Bottom) ΔStrength (Young − Aged) for the top differentially altered
signaling pathways; pathway abbreviations, key molecules, and efferocytosis roles are provided in table S1. (U) to (W) As in (R) to (T) but comparing healthy versus diseased
donors. Neutrophil subclustering identifies five subclusters (Neu1 to 5) (U), with senescence module scores comparing Neu1+5 (healthy- enriched) versus Neu2+3+4
(diseased- enriched) (V), and CellChat analysis of healthy versus diseased TRM–neutrophil communication (W).
this functional reserve, consistent with CCA programs in a noncanoni- cal context. We link these transcriptomic features to surface CXCR4 expression, enabling prospective identification by flow cytometry, and demonstrate a senescence- to- apoptosis transition (Neu2 to Neu3) that accounts for CXCR4 and annexin V copositivity in aging tissues. Together, these findings extend current models of senescence- related immune dysfunction and suggest that targeting these dysfunctional neutrophil states may have therapeutic relevance.
Aging broadly impaired TRM efferocytosis of multiple cellular sub- strates, including senescent neutrophils and apoptotic thymocytes, lymphocytes, and erythrocytes, indicating a generalized decline in TRM clearance machinery. However, impairment was disproportion- ately severe for senescent neutrophils, reflecting their additional require- ment for integrin- mediated stabilization beyond shared recognition defects. This two- hit vulnerability positions senescent neutrophils as a particularly pathogenic substrate and suggests that targeting their clearance may yield outsized therapeutic benefit.
When clearance fails, senescent neutrophils exert paracrine stress on surrounding parenchymal cells. In the liver, hepatocytes up- regulated ICAM- 1, sinusoidal endothelial cells increased VCAM- 1, and stellate cells deposited fibronectin in close spatial proximity to CXCR4+ neutrophils. Thus, impaired efferocytosis generates a local inflamma- tory microenvironment that propagates dysfunction beyond the im- mune compartment, linking neutrophil accumulation to inflammatory, vascular, and fibrotic features of tissue aging in a feed- forward cycle.
Mechanistically, integrin- mediated stabilization emerged as the dominant disrupted step. Although LFA- 1 was counteractively up- regulated across all three efferocytic organs, transcriptional suppres- sion of key conformational activators (Tln2, Fermt3, Skap1, Rac1, RhoA) locked integrins in a low- affinity state. Downstream post- engulfment programs were similarly suppressed through EP2- driven TF dysregulation, with reduced pro- phagocytic JUNB, STAT3, and RELA and enhanced anti- phagocytic CREB1. EP2 signaling therefore acts as a central regulator of efferocytosis by impairing both integrin activation and downstream cargo processing.
Pharmacological EP2 inhibition demonstrated the reversibility of defective TRM efferocytosis. PF- 04418948 treatment reduced senes- cent neutrophil burden across the liver, spleen, and bone marrow and restored KC efferocytosis ex vivo. Rescue was most complete in the liver, potentially due to greater drug accessibility through the portal circulation, whereas the spleen and bone marrow may require longer or earlier inhibition.
In the aged and diseased human liver, TRM proportions declined, PTGER2 expression was selectively elevated in TRMs, neutrophils shifted toward senescent- like transcriptional states, and TRM- neutrophil com- munication was reduced, paralleling our findings in mice. The aged hu- man heart similarly exhibited TRM loss and selective PTGER2 elevation, pointing to a conserved change in TRM biology across organs in aging. Although PTGER2 did not reach genome- wide significance in longevity GWAS, its association with age- related diseases, cancer, and immune dysfunction underscores its translational relevance (94) and highlights limitations of current GWAS in capturing cell- state- dependent mecha- nisms. These human findings, while correlative, position the TRM EP2- efferocytosis axis as a candidate mechanism in human aging that warrants further functional testing. Specifically, future studies should assess whether the impaired clearance of senescent neutrophils also occurs in human TRMs and whether pharmacological EP2 blockade can restore this defect.
Several limitations merit consideration. Our flow cytometric analyses sampled selected ligand- receptor pairs, and would not have captured all efferocytic axes, including MerTK- Gas6 signaling in liver, which can be functionally impaired by proteolytic cleavage without reduced surface abundance (63). Human scRNA- seq analyses were constrained by the limited availability of well- powered, age- stratified datasets.
Future studies should test whether disrupting neutrophil- driven paracrine stress prevents parenchymal injury across additional organs and whether EP2 antagonism might synergize with senolytic or seno- morphic therapies. Given the outsized role of TRMs in driving organ- wide inflammation and functional decline, restoring TRM health, for ex ample through pharmacologic EP2 inhibition, may limit the development of
age- associated disorders including frailty and sarcopenia, cardiovas- cular and liver disease, and neurodegeneration, with CXCR4+ neutro- phil burden serving as a potential pharmacodynamic biomarker.
Methods summary A full description of the methods can be found in the supplementary materials. The supplementary materials and methods section in- cludes descriptions of mouse models and behavioral assessments (Barnes maze, novel object recognition); frailty and grip strength evaluation; cardiac imaging and histology (MRI, TEM, trichrome staining); Luminex cytokine profiling and TMT- based plasma proteomics; se- rum liver biomarker measurements; single- cell RNA- seq library preparation and bioinformatic analysis of mouse liver; Western blot; peritoneal macrophage isolation and mitochondrial function assess- ment by flow cytometry; multiorgan flow cytometry for macrophage and neutrophil characterization; ex vivo efferocytosis assays; im- munohistochemistry of muscle, liver, and spleen tissues; MACSima multiplex immunofluorescence imaging and QuPath- based quantifi- cation; reanalysis of published human liver and heart scRNA- seq datasets; MAGMA- based human longevity GWAS analysis; and sta- tistical methods.
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neutrophils limits organ-wide aging. Dryad (2026); https://doi.org/10.5061/ dryad.0vt4b8hck.
acKNOWleDGMeNts We thank the Stanford Shared FACS Facility for instrument support and troubleshooting during flow cytometry acquisition; J. Perrino for TEM training and assistance; the Diagnostic Laboratory for experimental consultation; C. Wang for guidance on scRNA- seq library preparation and instrumentation; A. Seng at the Chan Zuckerberg Biohub Genomics Platform, UCSF, for advice on Illumina sequencing; J. Brook for suggesting the inclusion of lung tissue in immune cell analyses; and P. Minhas, H. Ennerfelt, and M. Xie for critical reading of the manuscript. Funding: This work was supported by NIH grants 1RF1AG080742, 1RF1AG070839, and P30 AG066515, the American Heart Association 19PABH1345800, the Phil and Penny Knight Initiative for Brain Resilience at the Wu Tsai Neurosciences Institute, Stanford University, and the Arc Institute Ignite Award (to K.I.A); the Glenn Foundation for Medical Research Postdoctoral Fellowship in Aging Research, the 2025 Glenn Foundation for Medical Research Postdoctoral Fellowship Continuation Award, and the Wu Tsai Neurosciences Institute NPIL Pilot Award (to Y.J.T.) K.I.A. is a Chan Zuckerberg–
San Francisco Biohub Investigator. O.S. receives funding from the Deutsche
Forschungsgemeinschaft (TRR332 projects A2 & Z1, SO876/16- 1, CFU342 P1) and the Else
Kröner Fresenius Stiftung (2023_EKSE.212). J.A.B. is supported by an HHMI Hanna Gray
Fellowship. The Stanford Shared FACS Facility was supported by NIH 1S10OD026831-01,
S10RR025518-01, and the Parker Institute for Cancer Immunotherapy. The Cell Sciences Imaging
Facility was supported by NIH 1S10OD028536. The Wu Tsai Neurosciences Preclinical Imaging
Laboratory was supported by NIH S10OD025176. The MACSima platform was supported by the
core facility Biology in Context (BIC) at the IZKF in Münster and the DFG (project 502158695).
Author contributions: Y.J.T., O.S., S.J.P., and K.I.A. designed the experiments. Y.J.T. coordinated
all collaborative workflows, performed all experiments, data analysis, data interpretation, and
figure generation unless otherwise noted. T.E.C. performed the Barnes maze, novel object
recognition, grip strength, and muscle fiber staining experiments and analyzed the data;
processed spleen and bone marrow samples for flow cytometry for PF- treated mice; processed
spleen samples for efferocytosis assays in Cx3cr1CreER- EP2 mice; and assisted with frailty scoring
and PF- 04418948 dosing. F.Y. processed mouse liver scRNA- seq data, processed human liver and
heart scRNA- seq data, generated Seurat objects, and generated Fig. 4, A to D, and fig. S5, B and C.
F.J.G.- M. processed TMT mass spectrometry raw data, performed quality control, and generated
analyzed matrices under the supervision of S.J.P. D.E.A. and V.V.D. performed MACSima multiplex
imaging data acquisition under the supervision of O.S. Q.W. maintained and bred Cx3cr1CreER- EP2
and Rosa26CreER- EP2 mouse colonies. A.B. assisted with TMT mass spectrometry sample
preparation and loaded samples onto the mass spectrometer under the supervision of S.J.P. J.K.
performed mouse MRI scanning and data acquisition. J.A.B. assisted with mouse liver scRNA- seq
data quality control and performed human GWAS MAGMA analysis across six longevity datasets.
Y.J.T. and K.I.A. conceived and supervised the project, designed the experiments, interpreted the data, and wrote the manuscript. Competing interests: K.I.A. is a cofounder of Willow Neuroscience Inc. All other authors declare no competing interests. Data, code, and materials availability: The data that support the findings of this study are available in the main figures, supplementary figures and tables; additional data files are available at Dryad (95); The mouse liver scRNA- seq data have been deposited in the Gene Expression Omnibus (GEO) under accession number GSE319489. Published human liver scRNA- seq data were obtained from Guilliams et al. [(67); GEO: GSE192742]. Published human heart scRNA- seq data were obtained from the Tabula Sapiens Consortium (88). Human longevity GWAS summary statistics were obtained from the respective published studies 89–93). All custom R scripts for human data reanalysis and GWAS analysis are available on Dryad (67). License information: Copyright © 2026 the authors, some rights reserved; exclusive licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original US government works. https://www.science.org/content/page/science- licenses- journal- article- reuse
sUPPleMeNtaRY MateRials
science.org/doi/10.1126/science.aea3075
Materials and Methods; Figs. S1 to S12; Table S1; References (96–102);
MDAR Reproducibility Checklist
10.1126/science.aea3075
Submitted 3 July 2025; accepted 11 May 2026
Performance trade- offs define a fundamental dental dichotomy in mammals
Narimane Chatar1,2*, Melvin Vankelst3, Alejandro Pérez-Ramos2,
Tahlia I. Pollock4,5, Davide Tamagnini6, Margot Michaud3,7,8,
Levi Yoder Raskin9, Z. Jack Tseng1
Teeth define mammalian evolution, and one of many adaptive dental breakthroughs in crown mammals is the tribosphenic molar: a tooth with a dual shearing- crushing function, often considered a key adaptation in crown mammals. However, we do not know how potential trade- offs between these antagonistic functions may influence the macroevolutionary outcomes of mammalian lineages. Here, we show that predatory mammals evolved dichotomized performance in their tribosphenic carnassial teeth, with slicing constrained to a narrow set of optimal phenotypes and crushing exhibiting redundant solutions. less than 1% of predators evolved optimized shearing and crushing. The fundamental trade- off in functions of the tribosphenic architecture promoted divergent macroevolutionary specializations rather than functional duality. These results highlight how key innovations can drive early evolutionary success while simultaneously constraining subsequent diversification.
Teeth are the primary interface between most vertebrates and their food, making them central to understanding ecological adaptations and interactions (1, 2). Their exceptional preservation in the fossil record and close relationship with both diet and biomechanical de- mands of food processing have long made them essential sources in the study of mammalian evolution (3, 4). Teeth also record develop- mental stress and provide insight into evolutionary dynamics across extinct communities (5, 6). A key element in understanding the eco- logical versatility of mammals lies in heterodont dentition (the devel- opment of distinct tooth types within the toothrow of an individual), which contrasts with the homodonty of most other vertebrate animals, particularly predators such as crocodiles or theropod dinosaurs (7, 8). Although heterodonty originated earlier in nonmammalian synapsids (9), the emergence of the tribosphenic molar within crown mammals marked the beginning of a modern radiation of diversity in tooth structure that is unmatched by other living vertebrates (10). In this architecture, the trigonid (for slicing) and talonid (for crushing) re- gions of the lower molars work in concert with the upper protocone, offering dual- function occlusion (11, 12) (Fig. 1). The evolution of this architecture enabled both shearing and grinding in one stroke and established a blueprint for modern mammalian dental and ecological
1Functional Anatomy and Vertebrate Evolution Lab, Department of Integrative Biology University of California, Berkeley, Berkeley, CA, USA. 2Departamento de Ecología y Geología, Universidad de Málaga, Málaga, Spain. 3Evolution and Diversity Dynamics Lab, UR Geology, Université de Liège, Liège, Belgium. 4Palaeobiology Research Group, University of Bristol, Bristol, UK. 5School of Biological Sciences, Monash University, Monash, Australia. 6Department of Biology and Biotechnologies “Charles Darwin,” Sapienza University of Rome, Rome, Italy. 7Institut Polytechnique UniLaSalle, Université d’Artois, Mont- Saint- Aignan, France. 8Departement Formation et Recherché Sciences et Technologie, Université de Guyane, Cayenne, Guyane. 9Huelsenbeck Lab, Department of Integrative Biology University of California, Berkeley, Berkeley, CA, USA. *Corresponding author. Email: narimane. chatar@ berkeley. edu
diversity (10) (Fig. 1), which likely expanded dietary and ecological versatility and have therefore often been considered a key adaptation (feature that imparted an evolutionary advantage) underlying the evolutionary success and diversification of mammals. However, the evolutionary implications and consequences of potential trade- offs between the two antagonistic functions are unclear. Morphological traits that favor slicing (tall, sharp cusps and aligned crests) maxi- mize shear efficiency at the expense of high surface area and com- plexity for crushing. By contrast, traits reinforcing crushing abilities (broad, low talonid basins, thick and blunt cusps) tend to reduce slicing efficiency and are more prominent in herbivory. These op- posing functions underlie both therian origins and also the subse- quent explosive radiation of crown mammals after the end- Cretaceous mass extinction (13, 14).
Among placental mammals, multiple lineages independently evolved highly specialized teeth, called “carnassials,” demonstrating recurring solutions to a predominantly meat- based diet (15, 16). Although many of these lineages are now extinct, living Carnivora remain highly diverse in both ecology and geographic distribution. With about 300 species occupying a range of dietary niches from large hypercanivorous predators to small herbivores (17, 18), carnivorans share the presence of a single carnassial pair, with many taxa still featuring the tribosphenic condition with a developed talonid for crushing and trigonid for slicing (11, 19). The lower carnassials of car- nivorans show the widest range of talonid morphologies among extant mammals (16, 20, 21). Furthermore, their high ecological breadth sug- gests evolutionary flexibility that may relate to the potential functional optimization of their dentition. Hypercarnivorous taxa tend to exhibit reduced talonids or blade- like and enhanced slicing crests whereas omnivores retain broader, more robust talonids for processing varied foods, and herbivores tend to exhibit the most developed talonids (22). This general pattern emerged after the end- Cretaceous extinction and continues to the present day.
Multiple placental mammal groups evolved carnassial teeth inde- pendently over the last 66 million years. Notably, Hyaenodonta and Oxyaenodonta, two extinct lineages historically referred to as “creo- donts,” evolved multiple pairs of carnassials that highlight alternative evolutionary solutions to those seen in Carnivora (11, 16). These re- peated evolutionary events across distant predator lineages underscore a deep evolutionary trend toward convergent morphologies that are specialized for carnivory. However, despite initial success, these other lineages eventually disappeared, raising the broader question of whether the tribosphenic molar, although opening evolutionary op- portunities, also channels evolution along a limited set of functional pathways. To evaluate this evolutionary scenario, we developed an approach that integrates high- density three- dimensional (3D) geomet- ric morphometric data with mechanical performance testing in a func- tional landscape framework across extinct and extant species.
Evolutionary canalization in the lower carnassial of carnivorous mammals We quantified lower carnassial dental shape in 250 Feliformia (cats and their relatives), Caniformia (dogs and their relatives), “creodonts” (Hyaenodonta and Oxyaenodonta, extinct carnivorous mammals), and early- diverging carnivoramorphans by digitizing each tooth with 2000 3D point coordinates (pseudolandmarks) using a semiautomated pro- tocol (supplementary text and fig. S1). We developed a morphospace (Fig. 2) that mainly captures the extent of talonid development with lower values corresponding to a reduced or absent talonid and higher values indicating a more developed talonid (PC1), representing a spec- trum from obligate carnivores to omnivorous- herbivorous species (Fig. 2A). PC2 reflects crown aspect ratio, ranging from tall, com- pact teeth of insectivores to elongate, low- cusp morphologies of hard- food specialists (Fig. 2A). Density contour peaks in the morphospace highlight two main recurring carnassial morphologies that define major
Fig. 1. Tooth efficiency for slicing and/or crushing is driven by the development of the two original regions of the tribosphenic architecture: the talonid basin and trigonid. (A) Evolution of PC1 values (capturing the development of the talonid basin), crushing and slicing efficiency in our dataset, showing that teeth with a developed talonid tend to be better at crushing than at slicing. (B) Subset of extant taxa and their diet, linking the dental efficiency metrics to observed diet.
specialized, hypercarnassialized bicuspid form with a reduced tal- onid [negative PC1, average PC2; e.g., hypercarnivorous cats (23) and hyenas (24)], and a more developed talonid morphotype corresponding to broader dietary breadth [positive PC1, negative PC2; e.g., omnivo- rous dogs and bears (25)]. These results align with previous develop- mental studies showing that whereas trigonid structures on teeth are relatively stable, minor shifts in genetic signaling can produce sub- stantial changes in talonid morphology, including cusp height and number (21). Other studies further underscore strong constraints at the molecular and genetic level, suggesting that subtle molecular shifts (heterotopy) and iterative growth rules generate the vast diversity of cusp arrangements seen in mammalian teeth (26, 27).
mance by 3D printing a subset of teeth and testing them in two ex- perimental setups: one using multimaterial medical- grade gelatins mimicking living tissues to measure slicing performance, and another using 3D- printed bone models to measure crushing performance (supplementary text and figs. S1 to S4). We then used an interpolated performance landscape integrating actual teeth and theoretical shapes spanning the variation present in the morphospace (Fig. 3), and a Pareto front analysis to identify optimized morphofunctional configu- rations (Fig. 4B). Optimal Pareto solutions range from specializations favoring slicing over crushing, to balanced performance in both func- tions, to adaptations prioritizing crushing at the expense of slicing. We found that functional optimization in the carnassials often comes at the cost of versatility: Efficient slicers are rarely efficient crushers and vice versa. Further, the two recurring morphotypes are optimized for different biting performances. In addition to soft materials (e.g., ani- mal muscle and viscera but also fleshy fruits), slicing may also involve mechanically resistant tissues such as tendons, which can represent
ciency peaked in hypercarnivorous forms with low PC1 and mid PC2 values (Fig. 3A). These taxa required low force to create deep punc- ture marks in the gelatin models. By contrast, forms with more devel- oped talonids (higher PC1) required two to three times more force and often failed to penetrate all gelatin layers. Caniforms (bears, dogs, raccoons, and relatives) exhibited the lowest slicing capabilities over- all. The bicuspid carnassial of hypercarnivorous taxa was shown to be very close in shape to an “ideal” theoretical slicing object, suggesting these teeth have the best shape for their function and that those shapes are not substantially limited by developmental constraints (28). Car- nassialized molars appeared independently, across an extreme body size spectrum (16, 28, 29), indicating that slicing constraints are not as size- dependent as other constraints on the dentition (28).
herbivorous taxa or smaller species), we employed the bone models within a comparative framework to evaluate relative crushing abilities against a material with fully characterized material properties ap- proximating the structural properties of natural hard tissues encoun- tered by at least some taxa in our dataset. Studies have suggested that other biological hard tissues (e.g., bamboo) can present similar me- chanical challenges from a dietary point of view, resulting in conver- gence in durophagous species despite different diets (30). The crushing experiments produced a more rugged landscape than that of slicing (Fig. 3, E and F), suggesting multiple mechanically equivalent pheno- typic configurations (Fig. 3B). Most efficient crushers had well- developed talonids, relied less on carnivory, and occupied high PC1, low PC2 regions. Our results capture what appears to be a mammalia- wide phenomenon, showing that the talonid is the principal structure enabling effective crushing (31). The talonid was also shown to exhibit greater morphological variability (31) and appears more responsive to
© Flag Staf Fotos
Vertebrate tissues
© Panoramic Images/Getty
Bamboo shoots and leaves
© Bryan Faust
Insects, small vertebrates, eggs, plant matter
© NatureTTL
Hard-shelled invertebrates
© Katherine Johns via www.listal.com
0.2
−0.2
0.1
−0.1
PC2 = 13.04%
0.0
B
Feliformia & stem Caniformia
Fig. 2. Shape variation in the lower carnassial. (A) Global morphospace obtained from a PCA of 250 specimens with density contours. (B) Morphospace per clade (Feliformia & stem, Caniformia, early- diverging carnivoramorphans and Hyaenodonta). (C) Simplified plot highlighting the two recurring morphologies in the lower carnassial of carnivorous mammals: a morphotype with reduced or absent talonid corresponding to hypercarnivorous taxa (secodont; fig. S12), and a morphotype with a more developed talonid, corresponding to taxa with a greater dietary breadth.
−0.2 0.0 0.2 PC1 = 52.37%
Early diverging carnivoramorphans & Hyaenodonta
D
B Crushing landscape
Fig. 3. Performance landscapes for each function and 3D phenogram showing their distribution in the phylogeny. (A) Landscape for slicing and (B) crushing data. Detailed legend in fig. S7; black circles with crosses represent theoretical shapes. (C) Distribution of slicing efficiency in the phylogeny and (D) distribution of crushing efficiency in the phylogeny. 3D surfaces show the peaks and valleys in the (E) slicing and (F) crushing landscape.
selective pressures linked to food hardness (ability to resist local- ized deformation, e.g., from indentation or scratching) rather than toughness (ability to absorb energy and plastically deform without fracturing) (28), which altogether could explain the numerous solu- tions for efficient crushing that we observed. By contrast, hypercar- nivorous species are tightly constrained: Their bicuspid teeth occupy a narrow region of the morphospace and exhibit catastrophic failure even under modest loads. Small structural refinements in dental shape can considerably affect performance: Optimal slicing aligns with bi- cuspid morphology but crushing efficiency varies and can be decou- pled through subtle anatomical modifications (fig. S12C). We find that not all bicuspid forms performed poorly in crushing.
Among those bicuspid teeth withstanding the crushing simulations, some bore a carnassial notch, a keyhole- shaped notch between the two main cusps (paracone and protocone, fig. S12A). This feature has been hypothesized to help dissipate stress during compressive and shear loading (32), similar to notches in circular saws. Contactless, in- plane strain measurements obtained using digital image correlation analyses confirm that this notch helped dissipate strain across the blade. By
Slicing efficiency gathered around bicuspid morphologies Ancestral condition
Crushing efficiency more spread in the morphospace
contrast, taxa lacking the notch showed pooled stress near the protocone- paracone interface, a frequent failure zone where crack propagation initiated (supplementary text). The morphofunctional solution for slicing relies on precise occlusal alignment and high cusp penetration efficiency, determined by both cusp length and orientation (fig. S12, A to C). This configuration focuses bite pressure onto a small, highly localized area of the occlusal plane (fig. S12C), efficiently slicing soft tissues.
Our combined landscape of slicing and crushing metrics revealed a rugged adaptive landscape with two major ridges (Fig. 4A), indicat- ing the presence of tooth phenotypes that exhibit the best trade- off between slicing versus crushing performance. Only two living taxa, the spotted hyena (Crocuta crocuta, with a combined slicing index of 0.75 and a combined crushing index of 0.65) and the Asian palm civet (Paradoxurus hermaphroditus, with a combined slicing index of 0.58 and a combined crushing index of 0.78), are aligned with the Pareto front of optimality, representing <1% of our dataset (Fig. 4B). Neither approaches a theoretical value of 1 for both functions simultaneously, which appears mechanically impossible, especially given the structural
F More rugged surface
Efficiency A All variables combined
Fig. 4. Performance surfaces obtained for the slicing/crushing trade- off. Landscape obtained when (A) combining all five variables (two for slicing and three for crushing) in a single landscape and (B) the Pareto landscape obtained when combining all variables from a given aspect into a single one and estimating the trade- off between those two combined slicing and crushing variables.
Feliformia & stem Caniformia Early diverging carnivoramorphans & Hyaenodonta
constraints of the tribosphenic molar. It is possible that few species actu- ally require simultaneous optimization of both functions, C. crocuta being a notable exception: A bone- cracking species that also consumes flesh (33). This is consistent with the idea that strong material property constraints (softer versus harder food items) limit the scope for true dual optimization. As critiqued by Gould and Lewontin (33), functional analyses tend to focus on parts within a complex system, at times interpreting those parts as a direct product of adaptive fine- tuning. Rather, phenotypes emerge from the interplay of adaptive trade- offs with selective pressure, fabrication noise resulting from material constraints, and/or modes of growth (sensu Seilacher’s concept of morphodynam- ics) (34). The prevalence of taxa occupying suboptimal regions of the performance landscape may reflect constraints of structural and historical contingencies of evolution beyond what was measured in this study. These patterns also resonate with recent frameworks em- phasizing the interplay between evolutionary trajectories and ecoevo- lutionary drivers shaping phenotypic diversification across adaptive landscapes (35). Apparent dental suboptimization additionally may be offset by alternative functional strategies, including complex jaw move- ments (36), behavioral adaptations such as food manipulation [e.g., tool use in Enhydra lutris (37)] or hunting tactics, and ecological fac- tors such as reduced competition. Unoccupied valleys in morphospace corresponded to theoretical shapes with poor performance in both functions, suggesting strong functional constraints (Figs. 1 to 3). These results provide direct experimental validation of prevailing hypotheses positing “adaptive valleys” in the dental morphospace (22). However, note that our study focused on the lower carnassial, and that including the action of the upper dentition (P4 and M1, notably) or even different biting points in taxa with multiple carnassialized molars (e.g., genus Hyaenodon) might result in a slightly different landscape.
Slicing efficiency is more phylogenetically restrained than crushing efficiency Slicing and crushing evolution exhibit substantially different phyloge- netic patterns. The earliest- diverging taxa (high PC1/high PC2, cor- responding to the most tribosphenic- shaped region of the dental morphospace), although not peak performers, clustered near the main adaptive ridges (Fig. 4). Those results suggest that the evolution of carnassial shape follows performance- driven trajectories along two primary functional axes: one toward enhanced slicing, the other to- ward improved crushing (fig. S16). Slicing adaptations appear both structurally and evolutionarily constrained. Taxa achieving high slicing efficiency share specialized bicuspid morphology (Figs. 1 to 3) and exhibit strong phylogenetic signals. By contrast, crushing appears more flexible, emerging across a broader range of tooth shapes, with low phylogenetic clustering, and reflects the greater plasticity of the talonid compared with the trigonid (31). The dichotomy between slic- ing and crushing is supported by results showing slicing traits with a consistent strong phylogenetic signal [K > 0.5, λ > 0.5, per (38), Table 1], whereas crushing traits show much weaker phylogenetic structure overall (supplementary text and Table 1). These results suggest that slicing ability is more evolutionarily conserved, consistent with an
Table 1. Result of the phylogenetic signal tests.
Aspect Trait Blomberg’s K P- value Pagel’s λ P- value Interpretation
Slicing Maximum force 0.871 0.009 0.818 0.0006 High phylogenetic signal
Maximum length 0.662 0.009 0.820 0.003 High phylogenetic signal
Combined slicing 0.850 0.012 0.921 0.003 High phylogenetic signal
Crushing Adj Peak load 0.408 0.194 0.156 0.843 Low phylogenetic signal
Adj distance to peak load 0.375 0.363 0.023 0.922 Low phylogenetic signal
ancestral slicing function requiring precise occlusal alignment and limited morphological variance with very localized bursts in the trees (figs. S13 and S14). By contrast, crushing performance shows higher evolutionary rate variation, evolving repeatedly in lineages with tougher or more variable diets (figs. S15 to S17). These observations further highlight how the previously described dual- function architecture of the tribosphenic molar continues to structure patterns of functional diversification across lineages. In other words, the tribosphenic blue- print provided the boundary conditions of a structural framework within which differential functional specialization repeatedly emerged. This dichotomy persists despite wide- ranging morphological diver- gence from the ancestral condition (Figs. 1 and 2).
Functional versatility and evolutionary success Understanding why some lineages persist longer than others remains a central question in evolutionary biology. One area of focus has been the comparison of groups exhibiting convergent functional traits, as some traits have been identified as potential correlates of extinction risk (39, 40). Despite convergent evolution of slicing- specialized dentitions across several placental clades (e.g., hyaenodonts and oxyaenodonts), only carnivorans survive today, and mechanistic explanations underly- ing their evolutionary success are still debated (15, 19, 22, 29, 41). The less specialized dentition observed in living predator clades has been hypothesized to constitute an evolutionary advantage (16, 22, 29). Con- sistent with this thesis, it has been suggested that the success of car- nivorans could be linked to the retention of more generalist features in some lineages, such as genets (Viverridae), mongooses (Herpestidae), or dogs and their relatives (Caniformia) (11). By contrast, previous work has suggested that in some extinct clades that emphasized shearing at the cost of crushing tooth morphology, hypercarnivory may have acted as a macroevolutionary ratchet; once the crushing talonid is lost, reversibility can become constrained, potentially contributing to reduced long- term evolutionary persistence in those lineages (41). Generalist taxa are expected to maintain moderate performance in multiple func- tional aspects rather than maximizing in one or the other, potentially resulting in optimized trade- offs in a Pareto framework. However, our findings do not unambiguously support this hypothesis. Notably, the two species situated on the Pareto front do not represent classic dietary generalists. The Asian palm civet (P. hermaphroditus), a relatively spe- cialized frugivore (Fig. 4), exhibits some of the highest crushing per- formance values while maintaining moderate slicing abilities. Detailed quantitative data on its diet in the wild remain scarce due to its elusive behavior, but available evidence suggests a strong reliance on fleshy fruit (42). In this case, the developed talonid might also be efficient at ex- tracting nutrients from fruit through crushing. Similarly, hyena teeth, despite their highly specialized hypercarnivorous carnassials, perform exceptionally well in both slicing soft tissue and crushing hard tissue. Together, these findings suggest that achieving a high- performance compromise between slicing and crushing is not simply a matter of retaining primitive traits. Instead, optimal morphofunctional solutions appear to have been realized selectively in a very low number of taxa. A true mechanical optimum (excelling in both functions at once) is
structurally difficult to achieve, at least when considering the lower carnassial tooth. This limitation likely reflects both dietary pressures (few species require maximal efficiency in both functions) but also deeper architectural constraints. The tribosphenic molar division into distinct slicing and crushing regions (Fig. 1) may inherently restrict the potential for integrated optimization, channeling mammalian den- tal evolution along divergent pathways rather than enabling conver- gence on a single multifunctional peak.
The morphofunctional evolution of the tribosphenic- derived carnas- sial tooth thus follows two fundamental, mutually exclusive paths: slicing (more constrained) versus crushing (more labile). Whereas some lineages exploit crushing flexibility to expand dietary breadth, others may optimize slicing at the cost of evolutionary reversibility. Both theoretical and experimental studies indicate that mammalian teeth evolved within a narrow set of physical and developmental pos- sibilities (28, 43) with geometric and material constraints shaping the ways in which form accommodates function. Idealized models identify only a few mechanically optimal tooth architectures, such as the tri- bosphenic and carnassial morphotypes (28), whereas other aspects such as microstructural analyses show how features such as enamel prism decussation and self- healing tufts enhance durability within these constraints (44). Evolutionary modeling shows that the emer- gence of multicusped and modular molars represents a strategy to distribute stress and mitigate competing fracture modes (45). This is a pattern also mirrored in morphometric studies linking mechanical compromises to dietary diversification across mammals (46). In this context, the tribosphenic blueprint represents both an enabling in- novation and a structural constraint: an evolutionary design space that allows for two sets of dental performances but one that is difficult to transcend. The duality of this mammal- specific tooth may be rec- onciled by observations showing that trade- offs are not an obstacle to change but a driver of innovation (47). The original tribosphenic ar- chitecture, with its two structurally distinct and functionally special- ized regions, likely introduced inherent structural constraints (sensu 34) that contributed to the observed trade- offs. These results highlight how key innovations can drive evolutionary success while simultane- ously constraining subsequent diversification.
REFERENCES AND NOTES
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ACKNOWLEDGMENTS
We thank the curators, collection managers, and staff, whose help and support was fundamental to
collect all the scans we needed to perform this study. Particularly, we would like to thank: V. Fischer
(ULiège, Liège, Belgium), O. Pauwels, A. Folie and T. Smith (RBINS, Brussels, Belgium), E. Gilissen
(RMCA, Tervuren, Belgium), G. Véron and G. Billet (MNHN, Paris, France), D. Kalthoff and T. Mörs
(NRM, Stockholm, Sweden), B. Kear (PMU, Uppsala, Sweden), E. Amson (SMNS, Stuttgart,
Germany), S. Fraile and J. Morales (MNCN, Madrid, Spain), R. Pappa and P. Brewer (NHMUK,
London, UK), P. Holroyd (UCMP, Berkeley, CA, USA), C. J. Conroy (MVZ, Berkeley, CA, USA),
S.A. McLeod and X. Wang (NHMLA, Los Angeles, CA, USA), D. Berthet and F. Vigouroux
(Musée des confluences, Lyon, France), B. Roussel (Musée de Valence, Valence, France), L. Costeur
(NMBS, Basel, Switzerland), D. Brinkman and V. R. Rhue (YPM, New Haven, CT, USA), J. Meng,
J. Galkin and R. O’Leary (AMNH, New York, NY, USA), and finally N. Pyenson, A. Millhouse, and
M. Miller (NMNH, Washington, DC, USA).For providing us additional scans, we would like to thank all
the institutions and individuals who made scans available on various platform, more precisely the
University of Wyoming, the Field Museum of Natural History, the University of Florida, Idaho
Museum of Natural History, Museu de Ciències Naturals de Barcelona, University of California, Los
Angeles, Blaire Van Valkenburgh, Denis Geraads, as well as all the staff behind MorphoSource,
Sketchfab, and Digimorph. We are also grateful to all the colleagues who shared the PhyloPic
silhouettes we used for our figures: T. M. Keesey, L. Ancillotto, A. Farke. Funding: This work was
supported by the following: Belgian American Educational Foundation (BAEF) Fellowship (to N.C.);
European Union’s Marie Skłodowska- Curie Actions (MSCA) Postdoctoral Fellowships 2024
(HORIZON- MSCA- 2024- PF- 01) grant agreement 101207039 https://doi.org/10.3030/101207039
(to N.C.); National Science Foundation grant NSF DBI- 2128146 (to N.C. and Z.J.T.); Fonds de la
Recherche Scientifique F.R.S.–FNRS grant FRIA FC 63999 (to M.V.); Labex BCDiv 10- LABX- 0003
and Fondation Fyssen (to M.M.); Doctoral school ED 227 “Sciences de la nature et de l’homme:
évolution et écologie” (to M.M.); Italian Ministry of University and Research, PNRR, Missione 4
Componente 2, “Dalla ricerca all’impresa,” Investimento 1.4, Project CN00000033 (to D.T.);
John Templeton Foundation Grant (JTF 62574) (awarded to E. J. Rayfield and P.C.J. Donoghue
to hire T.I.P. while writing this article) (the opinions expressed in this article are those of the
author and do not necessarily reflect the views of the John Templeton Foundation) (to T.I.P.);
Leverhulme Early Career Research Fellowship Grant (ECF- 2025- 468) awarded by the Leverhulme
Trust (to T.I.P.). Author contributions: Conceptualization: N.C., M.V., and Z.J.T.; Methodology:
N.C., M.V., A.P.R., T.I.P., Z.J.T.; Investigation: N.C., M.V., A.P.R., Z.J.T.; Formal analysis: N.C.
L.Y.R.; Software: N.C. L.Y.R.; Visualization: N.C.; Funding acquisition: N.C. Z.J.T.; Project
administration: N.C. Z.J.T.; Supervision: N.C. Z.J.T.; Writing – original draft: N.C., M.V., Z.J.T.;
Writing – review & editing: N.C., M.V., A.P.R., T.I.P., DT, M.M., L.Y.R., Z.J.T. Competing interests:
Authors declare that they have no competing interests. Data, code, and materials
availability: All data are available in the main text or the supplementary materials. All fossil
specimens described in this study are cataloged and deposited in various institutions, more
details can be found in the ‘Material provenance’ section in the supplementary material: a
complete list of the specimens used along with their metadata (including specimen numbers
and institution) can be found in Data S1. License information: Copyright © 2026 the
authors, some rights reserved; exclusive licensee American Association for the Advancement
of Science. No claim to original US government works. https://www.science.org/content/
page/science- licenses- journal- article- reuse
SUPPLEMENTARY MATERIALS
science.org/doi/10.1126/science.aee3453
Materials and Methods; Supplementary Text; Figs. S1 to S17; Tables S1 to S4;
References (48–95); Movies S1 to S8; Data S1 to S4
Surface- dominant transport in Weyl semimetal NbAs nanowires for next- generation interconnects
Yeryun Cheon1, Mehrdad T. Kiani2†, Yi- Hsin Tu3, Sushant Kumar4,
Nghiep Khoan Duong1, Jiyoung Kim5, Lingcheng Kong5,
Quynh P. Sam2, Han Wang2, Satya K. Kushwaha6, Nicholas Ng6,
Seng Huat Lee7, Sam Kielar5, Chen Li5, Amelia Schaeffer8,
Jack D. Coyle2, Dimitrios Koumoulis9, Saif Siddique2,
Zhiqiang Mao7, Gangtae Jin10, Zhiting Tian5,
Ravishankar Sundararaman11, Hsin Lin12, Gengchiau Liang3,
Ching- Tzu Chen13, Judy J. Cha2*
Ongoing demands for smaller and more energy- efficient
electronic devices necessitate alternative interconnect
materials with lower electrical resistivity at reduced dimensions.
We report the synthesis of Weyl semimetal niobium arsenide
(NbAs) nanowires through thermomechanical nanomolding
with single crystallinity and controlled diameters down to
40 nanometers. The resistivity of NbAs nanowires decreases
with decreasing diameter, and 40- nanometer- diameter
nanowires exhibited a room- temperature resistivity of 10.5 ±
1.9 microhm·centimeters, which is ~70% lower than their
bulk counterpart. Calculations attribute this resistivity
reduction to surface- dominant conduction with a long carrier
lifetime at finite temperatures. Further characterization of
nanowires and bulk crystals revealed high breakdown current
density, stability, and thermal conductivity. These properties
highlight the potential of NbAs nanowires as next- generation
interconnects that could surpass the limitations of current
copper- based interconnects.
With the continued downsizing of electronic components in modern integrated circuits (ICs), current copper (Cu)–based interconnects are reaching their physical limit (1–4). At the extremely scaled dimensions below the electron mean free path, the electrical resistivity of Cu in- creases substantially because of the electron scattering at surfaces and grain boundaries. The high resistance of current narrow interconnect lines introduces non- negligible resistance- capacitance signal delay and elevates dynamic power consumption, limiting the overall com- puting performance of IC chips (3, 4). As such, addressing these chal- lenges in advanced technology nodes requires alternative conductive materials with lower resistivity than current Cu interconnects at re- duced dimensions.
Although recent studies have focused on elemental metals, such as cobalt (Co) and ruthenium (Ru), which exhibit a less pronounced re- sistivity scaling effect in the sub- 10- nm regime because of their small electron mean free path (3, 4), topological semimetals have emerged as a promising candidate (5–8). Topological semimetals have topologi- cally protected conducting surface states that are predicted to con- tribute substantially to total conductivity even in large dimensions (9). At small feature sizes with large surface- to- volume ratios, surface
1Department of Physics, Cornell University, Ithaca, NY, USA. 2Department of Materials Science and Engineering, Cornell University, Ithaca, NY, USA. 3Industry Academia Innovation School, National Yang Ming Chiao Tung University, Hsinchu, Taiwan. 4IBM Research, Albany, NY, USA. 5Sibley School of Mechanical and Aerospace Engineering, Cornell University, Ithaca, NY, USA. 6Platform for the Accelerated Realization, Analysis, and Discovery of Interface Materials (PARADIM), The Johns Hopkins University, Baltimore, MD, USA. 7Department of Physics, The Pennsylvania State University, University Park, PA, USA. 8School of Applied and Engineering Physics, Cornell University, Ithaca, NY, USA. 9Cornell Center for Materials Research, Cornell University, Ithaca, NY, USA. 10Department of Electronic Engineering, Gachon University, Seongnam, South Korea. 11Department of Materials Science and Engineering, Rensselaer Polytechnic Institute, Troy, NY, USA. 12Institute of Physics, Academia Sinica, Taipei, Taiwan. 13IBM Thomas J. Watson Research Center, Yorktown Heights, NY, USA. *Corresponding author. Email: jc476@ cornell. edu †Present address: Department of Materials Science and Engineering, Florida State University, Tallahassee, FL, USA.
contributions to electrical conduction may dominate over bulk con- tributions, and certain topological semimetals show, even at room temperature, decreasing resistivity as their dimensions shrink (10–12). Theoretical studies on Weyl semimetals and multifold- fermion semi- metals have indeed demonstrated appreciable surface- state contribu- tions to electrical conduction at the nanoscale (5, 9, 13, 14). Despite these encouraging theoretical predictions and a few thin- film studies (15–17), there remains a noticeable lack of experimental evidence that confirms the superior resistivity scaling of such material systems at dimensions relevant to practical interconnect applications.
Niobium arsenide (NbAs) is a type I Weyl semimetal that has been extensively studied since its experimental discovery in 2015 (18). Al- though a few bottom- up and top- down approaches have been applied to synthesize NbAs nanostructures, they have been limited in terms of achievable sizes or crystal quality. For example, chemical vapor deposition (CVD) growth of NbAs nanobelts with thicknesses of ~200 nm has been reported, and these nanobelts showed an order- of- magnitude reduc- tion in electrical resistivity compared with bulk crystals, demonstrat- ing the high mobility of surface electrons (11). However, CVD synthesis lacks fine control over morphology and size; the cross-sectional area of the nanobelts is restricted to ~105 nm2, which is much larger than the area needed for advanced- node interconnects. Although NbAs thin films have been grown on gallium arsenide substrates with molecular beam epitaxy, the films are textured with nanometer- sized grains (15). As a top- down method, focused ion beam (FIB) milling can produce micro- and nanostructures of NbAs with controlled sizes, but the Ga ion beam leaves Nb residues on their surfaces because there is a large difference in surface binding energies between Nb and As (19).
In this work, we successfully synthesized single- crystal NbAs nano- wires with diameters as small as 40 nm using thermomechanical nano- molding (TMNM). TMNM is a recently developed fabrication method by which single- crystal nanowires can be obtained from polycrystalline bulk feedstocks through lattice and interfacial diffusion in porous molds (20–23). Electrical transport measurements on these NbAs nanowires revealed a desirable resistivity scaling: For 40- nm- diameter nanowires, the room- temperature resistivity (10.5 ± 1.9 microhm·cm) is ~70% lower than that of bulk single crystals and comparable to Cu interconnects in advanced nodes (24). Magneto- transport measure- ments at low temperature show clear Shubnikov–de Haas (SdH) oscil- lations in NbAs nanowires, indicating their high carrier mobility. First- principles calculations and SdH oscillation analysis indicate a negligible chemical potential shift in the NbAs nanowires, ruling out variations in bulk carrier density as the cause of the observed reduc- tion in room- temperature resistivity and thereby suggesting substan- tial contributions from topological surface states. Furthermore, simulations of the electron- phonon resistivity scaling indicate that the surface- state lifetime must exceed the bulk- state lifetime by roughly two orders of magnitude to explain the observed resistivity reduction. Finally, we report the breakdown current density, air sensitivity, and thermal conductivity of NbAs to showcase how NbAs could outperform other candidate materials for future interconnect applications.
Theoretical prediction of electrical transport and resistivity scaling in NbAs Figure 1A shows the crystal structure of NbAs, which belongs to the transition- metal monopnictide (TmPn) family (Tm = Ta/Nb; Pn = P/As) with space group I41md (No. 109) (18). This TmPn family lacks inversion symmetry, thereby allowing it to host Weyl fermions. We
c
a b
-1
×1020
1.0
0.2
E F D
Electron Hole
Carrier density (cm–3)
0.5
-0.5
100 50 0 -50 -100 400 200 0 -200 -400
0.4
0.0
0 10
E – EF (meV)
E – EF (meV)
As
Fig. 1. Theoretical calculations on Weyl semimetal NbAs. (A) Crystal structure of NbAs. (B) Calculated electronic band structure of NbAs with finite spin- orbit coupling.
(C) Schematic illustration of the Weyl nodes in the three- dimensional BZ of NbAs and their projections onto the (001) surface BZ. Red and blue denote the opposite chirality of
the nodes, while cyan denotes the high-symmetry points in the BZ. Fermi arcs (light green) connect the projected Weyl nodes that are oppositely charged. (D) Electron (red) and
hole (blue) carrier densities at 300 K as a function of the chemical potential. (E) Calculated bulk electron- phonon resistivity versus chemical potential at 300 K. (F) Simulated
room- temperature resistivity ρ/ρ0 (where ρ0 is the bulk resistivity) as a function of critical dimension (CD), for surface- to- bulk- state lifetime ratio, τs/τb = 1, 10, and 100 (red,
blue, and green traces, respectively). Here, τs and τb denote the surface- and bulk- state lifetime, respectively. For thin films, CD refers to the thickness; for nanowires, CD refers
to the diameter. The open circles are the calculated ρ values in 16- to 56- AL films, in increments of 8 ALs. The dashed lines were obtained by fitting eq. S5 to each dataset for thin
films, and the solid lines are the approximated resistivity scaling for nanowires.
τs/τb = 1
performed first- principles calculations of the electronic band struc- ture, phonon band structure, and electron- phonon coupling in NbAs (see materials and methods). Figure 1B presents the calculated NbAs electronic band structure with finite spin- orbit coupling. NbAs has 12 pairs of Weyl nodes (the discrete linear band crossings near the Fermi level) with topological Fermi arc surface states connecting the projection of two oppositely charged Weyl nodes in the surface Brillouin zone (BZ).
1.2
Figure 1C schematically illustrates the distribution of these Weyl nodes in the three- dimensional BZ and the topologically protected Fermi arcs in the (001) surface–projected two- dimensional BZ (18, 25). The Fermi surface calculations of NbAs thin slabs indicate that the surface states should remain unperturbed down to ~2 nm (figs. S1 and S2), suggesting that surface- state transport should be preserved at sub- 10- nm dimensions. Theory predicts the numerous Weyl nodes and surface states yield a comparatively high surface density of states (DOS), leading to substantial surface contributions to the total conduc- tion at reduced dimensions (13). We calculated the bulk- to- surface DOS ratio for different slab thicknesses and showed that the surface- state contribution was sizable even at 40 nm in NbAs (see the supplemen- tary text, fig. S3, and tables S1 to S3).
Figure 1D shows the calculated bulk carrier density as a function of the chemical potential at 300 K. The red and blue curves represent the electron and hole contributions, respectively, highlighting the semimetallic nature of NbAs, meaning that the electron and hole car- riers almost perfectly compensate for each other at the Fermi level. Figure 1E shows how the bulk electron- phonon resistivity at 300 K
Energy (eV)
XY Σ Σ' Г Г N P Z Y' Z
T = 300 K T = 300 K
Resistivity (µΩ∙cm)
20 30 40 0
varies with the chemical potential. The elevated resistivity near zero doping primarily stems from the low bulk carrier density. Note that, although carrier doping (for example, caused by vacancies) can reduce the bulk electron- phonon resistivity in NbAs, the chemical potential must shift by ~200 meV for a ≳75% reduction in the resistivity.
Figure 1F plots the scaling of the room- temperature resistivity in NbAs films and the estimation for NbAs nanowires as a function of the effective surface- to- bulk- state lifetime ratio (τs/τb) (see the supple- mentary text and fig. S4 for details). The red, blue, and green traces correspond to τs/τb = 1, 10, and 100, respectively. The open circles denote the calculated ρ values in 16–atomic layer (AL) to 56- AL films, in increments of 8 ALs; one unit cell is 8- AL- thick along the [001] direction in NbAs. Assuming that bulk and surface states conduct in parallel, we fitted each calculated ρ dataset (corresponding to a fixed τs/τb) using a single fitting parameter α that denotes the ratio of the surface conductance to bulk conductivity (13) (see eq. S5 in the supple- mentary text) and extrapolated the film resistivity to ~40 nm critical dimension (Fig. 1F, dashed lines). We then estimated the correspond- ing nanowire resistivity scaling by doubling the α values to account for the surface- conductance contribution from the sidewalls besides the top and bottom surfaces (Fig. 1F, solid lines). The resulting sample resistivity reduced with decreasing dimensions because of increasing surface contributions to total conduction. The extent of this reduction increased with the τs/τb ratio, as the higher the τs/τb ratio, the larger the contribution of each surface state. For a ~40- nm- diameter NbAs nanowire, a ≳75% reduction from the bulk resistivity implied τs/τb ~ 100 (Fig. 1F, solid green line).
τs/τb = 10
τs/τb = 100
0.8
0.6
Critical dimension (nm)
Polycrystalline bulk feedstock
TMNM synthesis of NbAs nanowires We prepared polycrystalline bulk feedstocks of NbAs by spark plasma sintering (see materials and methods). X- ray diffraction confirmed the dominant NbAs phase in the bulk feedstocks, and their electron back- scatter diffraction maps showed micrometer- sized crystal domains (fig. S5). From these polycrystalline bulk feedstocks, we used TMNM to synthesize single- crystal NbAs nanowires (Fig. 2A) in which a bulk feedstock of the target material was pressed into a porous mold at an elevated temperature. Nanowires grew in specific orientations with energetically favorable surfaces through grain reorientation so that single- crystal nanowires could be fabricated from polycrystalline bulk feedstocks (23, 26). We conducted TMNM at 700°C and 200 MPa for 3 hours, using anodic aluminum oxide (AAO) molds with 40- or 80- nm- diameter pores. Molds with different pore sizes were used to control the morphology and size of the nanowires. Scanning electron microscopy (SEM) imaging of NbAs nanowires after etching the AAO mold with 40- nm- diameter pores (Fig. 2B; and see materials and meth- ods) confirmed a uniform wire diameter of ~40 nm. These nanowires were released from the bulk feedstock by sonication in isopropyl al- cohol, which resulted in typical wire lengths of 2 to 3 μm.
T = 700 °C
Single crystal nanowire
Low- and high- magnification high- angle annular dark- field scan- ning transmission electron microscopy (HAADF- STEM) images of a NbAs nanowire (Fig. 2, C and D, respectively; see fig. S6 for additional NbAs nanowires) revealed that the nanowires were single crystalline with no noticeable defects, such as stacking faults or dislocations. A thin oxide layer of ~3 nm on the surface (fig. S7A) was consistent with previous reports on NbAs thin films (15). Crystallographic analysis using the STEM images and their fast Fourier transform (FFT) re- vealed that NbAs nanowire growth was predominantly along the [100] crystal orientation, although the [101] growth orientation was also observed (fig. S6, E and F).
For comparison, we also characterized single crystals grown by chemical vapor transport with selected- area electron diffraction (SAED) pattern and atomic- resolution HAADF- STEM image of an electron- transparent thin lift- out (Fig. 2, E and F, respectively; see
A AAO mold
Fig. 2. Thermomechanical nanomolding and structural characterization of NbAs nanowires. (A) Schematic illustration of the TMNM process. (B) SEM image of NbAs nanowires still attached to a bulk feedstock. (C) Low- magnification HAADF- STEM image of a NbAs nanowire. (D) Atomic- resolution HAADF- STEM image of the region outlined by the red square in (C). The inset shows the corresponding FFT with the [100] growth orientation indicated. (E) SAED pattern of a lift- out from a bulk single crystal of NbAs. The inset shows an optical photograph of the single crystal (black scale bar: 1 mm). (F) Atomic- resolution HAADF- STEM image of the same lift- out shown in (E). (G) Normalized STEM- EDX spectra of the nanowire (red) and the bulk single crystal (blue). a.u., arbitrary units.
P = 200 MPa
1 nm [100]
fig. S8 for a different crystal orientation). The lattice constants of the nanowires were a = 3.48 Å and c = 11.73 Å, which agreed with our single crystals (a = 3.45 Å and c = 11.51 Å) and previous studies (18). Figure 2G compares the normalized energy- dispersive x- ray spectros- copy (EDX) data of the nanowire and the single crystal. The relative peak intensities of Nb and As indicate that the Nb- to- As ratio was near 1:1 for the nanowires, with ~0.1 atomic % (at %) As vacancies (table S4). At molding temperatures >700°C, we observed As- deficient phases, such as niobium oxides or metastable Nb7As4 resulting from the facile vaporization of arsenic.
Electrical transport properties of NbAs nanowires and evidence of surface conduction We fabricated four- terminal devices using standard e- beam lithography (see materials and methods) to perform electrical transport measure- ments on NbAs nanowires. The nanowires were dispersed on SiNx/Si substrates and treated with dilute hydrofluoric acid (HF) to remove the thin oxide layer and any residual mold materials (SiNx/Si sub- strates were used because of their slow etch rate in HF). Figure 3, A and B, shows a schematic diagram and an SEM image of a representa- tive NbAs nanowire device, respectively. Two- terminal electrical mea- surements with varied channel lengths (Fig. 3C) revealed linear current- voltage (I- V) characteristics at low applied voltages, indicating well- defined ohmic contacts of the devices. The temperature- dependent electrical resistivity of two 40- nm- diameter NbAs nanowires and two bulk single crystals all showed metallic behavior (Fig. 3D). At 300 K, the four- terminal nanowire devices showed lower resistivities (~8.1 and ~12.7 microhm·cm) than the bulk (≳49 microhm·cm). Further more, the measured nanowires exhibited weak temperature dependence, with low residual- resistivity ratios (RRRs) compared with the single crystals (~1.8 and ~1.6 versus ~10 and ~5.6).
The small electron- phonon resistivity of the nanowires in contrast to that of the bulk single crystals cannot be explained by doping- induced bulk resistivity reduction. An ~70% reduction in resistivity by doping would require varying the chemical potential by ±200 meV
Nanowire Bulk As L
Nb L
Intensity (a.u.)
As K
As K
Nb K
Nb K
10 12 14 16 18 20 1 2
Energy (keV)
B
G
J (MA cm–2)
-5
-10
1 2 3 4 0
d = 40 nm
Fig. 3. Electrical properties of NbAs nanowires and additional materials characterizations for interconnect applications. (A) Schematic diagram of a four- terminal NbAs
nanowire device. (B) Representative SEM image of a four- terminal NbAs nanowire device (scale bar: 1 μm). (C) Two- terminal I- V curves for different channel lengths (Lch).
(D) Temperature- dependent four- terminal electrical resistivity for bulk single crystals (black and gray) and 40- nm- diameter nanowires (red and orange). (E) Room- temperature
resistivities of polycrystalline bulk feedstocks (blue triangles), bulk single crystals [black rhombuses; solid symbols from this work and open symbols from previous studies
(11, 29, 30)], and nanowires (red stars for ~40 nm diameter, light red stars for >50 nm diameter). (F) Current density versus applied voltage for six different two- terminal
nanowire devices with ~40 nm diameters. The inset shows a representative SEM image of a failed device (scale bar: 100 nm). (G) Thermal conductivity of various materials,
including NbAs from this work (where sc and pc denote single crystals and polycrystals, respectively), conventional metals (Cu, Ru, and Co) (40), a Cu/TaN multilayer stack
(47), and other representative topological semimetals [NbP (41), MoP (42), TaAs (43), WTe2 (44), CoSi (45), and Cd3As2 (46)]. (H) Normalized resistance changes (ΔR/R0)
versus air exposure time for a 40- nm- diameter NbAs nanowire (red dots) and a 40- nm- thick Cu film (black dots). (I) Room- temperature resistivity as a function of diameter
for conventional metal nanowires and NbAs nanowires. The fitted curves for Cu (black), Ru (blue), and Co (green) are from previously reported experimental data (24, 48, 49),
while NbAs nanowires are plotted as red stars.
E
d = 40 nm
Polycrystalline
Single crystal
Lch
50 nm
~40 nm
I
NbAs
MoP
NbP
TaAs
Cu/TaN
WTe2
Cd3As2
CoSi
Cu
Ru
Co
Ru
H
Co
R/R0 (%)
Cu
Bulk
(Fig. 1E), which is unlikely given the near 1:1 stoichiometric ratio of the molded NbAs nanowires (Fig. 2G). Our density functional theory (DFT) calculations showed that 0.78 at % As vacancies shifted the Fermi level by only ~20 meV (figs. S9 and S10). As discussed below, quantum oscillation measurements of our samples showed that the chemical potential difference between a nanowire and a bulk single crystal is small, further precluding bulk- carrier doping as the cause of the resistivity reduction in our nanowires. Thus, low resistivity in NbAs nanowires must result from contributions from surface- state conduction.
Typically, a low RRR results from impurities or disorder in poor- quality crystals. However, the residual electrical resistivity of the nanowires remains low and is comparable to that of our bulk single crystals at 2 K (~5 microhm·cm), so the origin may be weak electron- phonon coupling in topological surface states. Indeed, previous studies on topological insulators Bi2Se3 and Bi2Te3 with first- principles calcu- lations and angle- resolved photoemission spectroscopy have revealed weak surface- state electron- phonon coupling (27, 28).
The room- temperature resistivities of molded nanowires, polycrys- talline bulk feedstocks, and bulk single crystals of NbAs are shown in Fig. 3E. Our measured resistivity values for bulk crystals are in good
IDS (µA)
300 nm 350 nm 420 nm
1 2 3 4 0 -1 -2 -3 -4
VDS (mV)
in-plane
(W m–1 K–1)
c-axis
NbAs NW Cu film
1 10 100 800 1400 1600
VDS (V)
Exposure time (h)
Bulk 1
Bulk 2 Nanowire 1 Nanowire 2 (40 nm)
Resistivity (µΩ∙cm)
Resistivity (µΩ∙cm)
Resistivity (µΩ∙cm)
0 50 100 150 200 250 300
T (K)
NbAs (sc)
NbAs (pc)
agreement with previously reported values (11, 29, 30). Hall measure- ments for bulk crystals showed room- temperature carrier densities and mobilities consistent with previous studies (29, 30) (see the sup- plementary text and fig. S11 for details). At room temperature, our NbAs nanowires exhibited lower resistivities than bulk single crystals. In particular, ~40- nm- diameter nanowires had an average resistivity of 10.5 ± 1.9 microhm·cm, which is ~70% lower than that of best bulk single crystals, and an order of magnitude lower than polycrystalline bulk feedstocks from which the nanowires were grown.
We attributed the much higher resistivity of polycrystalline bulk feedstocks compared with bulk single crystals to grain boundary scattering. Furthermore, by comparing the experimental nanowire- to- bulk resistivity ratio (~0.25 to ~0.33) with the theoretical result (Fig. 1F), we estimated that the average surface- carrier lifetime was roughly two orders of magnitude longer than the bulk- carrier lifetime (see the supplementary text), consistent with the weak electron- phonon coupling manifested in the temperature- dependent resistivity. From this estimated lifetime ratio, we expect the surface- carrier mobility to be two orders of magnitude higher than that of bulk carriers at room temperature, although further experimental validation is needed.
Nanowire Bulk
20 40 60 80 0
Diameter (nm)
We note that the wire diameters used for resistivity calculations were taken either from the nominal pore size of the AAO molds or from low- magnification SEM images. The actual wire diameters are smaller than these nominal values. For example, a previous study on nanomolded Mo4P3 showed that the actual wire diameter can be 15 to 20% smaller than the nominal mold diameter (31). Therefore, the re- sistivity values reported here represent an upper bound and could be up to ~35% lower in reality.
Additional materials properties and comparison to current interconnect technologies For interconnect applications, other materials properties, such as breakdown current density, thermal conductivity, and resistance to oxidation and electromigration, are as important as low resistivity. For studies of the breakdown current density of NbAs nanowires, two- terminal 40- nm- diameter NbAs nanowire devices were fabricated, and the applied voltage was gradually increased until device failure. The measured breakdown current density was 46.3 ± 20.3 MA cm–2, aver- aged over six devices (Fig. 3F). This value is comparable to the break- down current density of Cu nanowires (~100 MA cm–2) (32, 33) and other previously reported nanostructures with high breakdown cur- rent density, such as tantalum triselenide (TaSe3) nanowires and tungsten ditelluride (WTe2) nanobelts (table S5) (34–37). The inset of Fig. 3F shows a SEM image of a failed device. Notably, the breakdown locations were not at the cathode side but rather appeared at random positions, suggesting that device breakdown was likely the result of Joule heating, not electromigration- induced void formation (38, 39).
We characterized heat dissipation by measuring the thermal con- ductivity of bulk single crystals and polycrystals of NbAs using the laser- induced transient thermal grating method. We obtained in- plane thermal diffusivities at room temperature and converted them to ther- mal conductivities with the measured specific heat (see materials and methods). The in- plane thermal conductivities of single crystals and polycrystals were 109.68 ± 1.28 and 51.74 ± 5.57 W m–1 K–1, respec- tively (see the supplementary text and fig. S12 for details). For single- crystal NbAs, the in- plane thermal conductivity was fairly isotropic (fig. S13). Because our NbAs nanowires predominantly grow along the [100] direction, this in- plane thermal conductivity provides the most relevant bulk reference. For completeness, we also measured the cross- plane thermal conductivity along the [001] direction using the frequency- domain thermoreflectance method and obtained a value of 23.30 ± 1.60 W m–1 K–1 (see the supplementary text, fig. S14, and table S6).
The in- plane thermal conductivity of single- crystal NbAs was com- parable to that of conventional metals such as Ru and Co (40) and higher than or comparable to those of other topological semimetals (Fig. 3G; see table S7 for details) (41–46). Although bulk Cu exhibits higher thermal conductivity (401 W m–1 K–1) (40) than NbAs, Cu inter- connects require barrier layers such as tantalum nitride (TaN), which reduce the effective thermal conductivity. For example, the effective thermal conductivity of a Cu/TaN (10 nm/3.5 nm) multilayer stack is only 12.8 W m–1 K–1 (47). We could not measure the thermal conductiv- ity of NbAs nanowires because of their small sample volume relative to the beam size. However, their high electrical conductivity sug- gests that the thermal conductivity and heat- transfer capability may not degrade appreciably at reduced dimensions. For the overall heat dissipation in interconnect stacks, the thermal conductivity of the surrounding low- k dielectric layers must also be considered. These di- electric layers typically exhibit thermal conductivities of <~1 W m–1 K–1 (table S8), which are much lower than those of interconnect metals. In this context, the thermal conductivity of NbAs is sufficiently high and not a limiting factor for interconnect downscaling.
To test air stability, we monitored the electrical resistivity of a NbAs nanowire device after exposing it to ambient air (Fig. 3H). The resistiv- ity of the NbAs nanowire increased by ~100% and plateaued after 1 day
of air exposure, suggesting the formation of a self- passivating oxide layer on the nanowire surface. A 40- nm- thick Cu film, sputtered onto a sapphire substrate, was tested as a reference under the same condi- tions. Although it showed better stability than our NbAs nanowire, such thin films expose less surface area than nanowires, thereby miti- gating the effects of air exposure.
For more direct comparison with Cu in terms of stability, we mea- sured the resistivity of our NbAs nanowire and Cu nanowires up to 100°C in vacuum and found that the NbAs nanowire exhibited a lower temperature coefficient of resistance than the Cu nanowires (fig. S15). To further investigate the surface oxidation of NbAs, we performed x- ray photoelectron spectroscopy measurements on bulk NbAs crystals annealed in ambient air or an argon (Ar) environment at temperatures up to 450°C. Under an Ar environment, we observed negligible surface oxidation up to 200°C, whereas gradual surface oxidation began at
100°C in ambient air (see fig. S16 for details). These results indicate the high stability of NbAs in controlled environments at elevated back- end- of- line–compatible temperatures and the need for encapsulation in practical applications. STEM characterization of the surface oxida- tion in both nanowires and bulk crystals is presented in fig. S7.
Figure 3I displays the dimensional scaling of room- temperature resistivity of NbAs nanowires and leading alternative metal nanowires for interconnects, including latest Cu (damascene lines with a Co/TaN liner/barrier layer), Ru, and Co (24, 48, 49). In contrast to these con- ventional metals, which show increasing resistivity with decreasing dimensions, NbAs exhibited the opposite trend. The NbAs nanowires showed lower resistivity than Ru and Co at 40 nm dimensions. Al- though the 40- nm- diameter NbAs nanowires did not yet surpass the state- of- the- art Cu interconnect technology, we expect the advantages of NbAs to become more pronounced in the sub- 10- nm regime, as the surface contribution to the electrical conduction exceeds the bulk con- tribution (13).
Quantum oscillations of NbAs nanowires and chemical potential estimation We performed magneto- transport measurements on both a bulk single crystal and a nanowire of NbAs at 2 K and compared their perpen- dicular magnetoresistance (MR) (Fig. 4, A and B). At 2 K, the bulk crystal exhibited a large MR of up to ~13,000% at 9 T with the mag- netic field applied along the crystallographic c axis. In contrast, the nanowire showed a much lower MR of up to ~2.5% at 9 T. This de- creased MR response is commonly observed in nanowires and thin films because of confinement and scattering effects (50, 51). We at- tributed the reduced MR of our nanowires to enhanced surface scat- tering of bulk carriers, which suppressed their contribution to the large MR observed in bulk crystals, together with surface- dominant trans- port. In NbAs, bulk carriers have mean free paths of several microm- eters at 2 K (29), making them susceptible to surface scattering in ~40- nm- diameter nanowires.
Despite the lower MR, the NbAs nanowire displayed SdH oscilla- tions similar to those observed in bulk crystals. The oscillatory com- ponent of the resistivity was obtained by subtracting a polynomial background and is plotted as a function of 1/B in Fig. 4C. From the FFT of these background- subtracted resistivities, two dominant oscil- lation frequencies were identified for each sample: 13.8 and 24.2 T for the bulk crystal, and 8.8 and 29.4 T for the nanowire (Fig. 4, D and E). These SdH oscillation frequencies were consistent with previous re- ports on NbAs bulk crystals (29, 52, 53). The frequency range corre- sponding to the surface states was at least an order of magnitude higher than our experimental data (11). Thus, the measured SdH oscillations originated from the bulk Fermi surfaces. The absence of SdH oscillations associated with the surface states can be attributed to large cyclotron radii that exceed the nanowire diameters, along with destructive interference of Weyl orbits caused by thickness variations arising from the circular cross sections of the nanowires.
I+
I V+
I-
V-
MR (%)
B (T)
E
Fα
Fα
Fβ
Fβ
Fα + Fβ
F (T)
Fig. 4. Magneto- transport properties of a NbAs nanowire and a bulk crystal. (A and B) Perpendicular MR of (A) a bulk single crystal and (B) a nanowire device measured at 2 K. (C) Oscillatory component of the resistivity, obtained by subtracting a polynomial background from the data shown in (A) and (B). (D and E) FFT of the oscillations for (D) the bulk crystal and (E) the nanowire, with two frequencies (Fα and Fβ) marked. Fα + Fβ indicates the higher harmonic frequency of Fα and Fβ. (F) Calculated SdH oscillation frequencies for the electron (red) and hole (blue) pockets of the bulk states as a function of the chemical potential. Experimental values are indicated for comparison. The solid black line denotes the SdH oscillation frequencies of the bulk single crystal; the dashed black line denotes those of the nanowire.
Nanowire
B (T)
F
F (T)
F (T)
Figure 4F shows the calculated SdH oscillation frequencies as a function of chemical potential with the magnetic field oriented along the c axis (see the supplementary text). These frequencies were derived from the extremal cross- sectional areas of electron and hole pockets in the computed bulk band structures. We also calculated the SdH oscillation frequencies as a function of the tilting angle of the magnetic field from the c axis (fig. S17F), which showed that the SdH oscillation frequencies increased with the tilting angle in all directions.
1.0
0.5
We found, comparing the calculation with the experimental data, that the chemical potential of the bulk single crystal lies ~10 ± 5 meV above the undoped Fermi level, whereas that of the nanowire device lies ~17 ± 6 meV above (assuming magnetic fields parallel to the c axis). We attributed the spread in the estimated hole- and electron- chemical po- tential values to the misalignment between the magnetic field and the c axis of the samples, the difference between DFT- optimized lattice pa- rameters and the actual values, and the intrinsic limitations of DFT cal- culations (see the supplementary text for more detailed explanations).
-10
On the basis of the above analysis, the chemical potential difference between the nanowire and the bulk crystal was small, even considering the uncertainty in the field orientation. Our earlier analysis (Fig. 1E) showed that a Fermi level shift of ~200 meV would be required to explain an ~70% resistivity reduction solely through bulk conduction. Furthermore, all measured NbAs nanowires exhibited much- reduced room- temperature resistivity compared with the bulk, even though the Fermi level for each likely may vary. Combining the quantum oscil- lation analyses above, we demonstrate that bulk resistivity variation alone led to a negligible resistivity reduction in our nanowire samples. Hence, the low room- temperature resistivity of our nanowires must predominantly come from the Fermi arc surface states with a longer scattering lifetime than the bulk states (Fig. 1F). We note that the SdH oscillations remained visible in the nanowire device after 2 months of air exposure, which highlights the exceptional stability of NbAs at
0.2
-0.2
B A
Bulk Nanowire
Bulk Nanowire
MR (×104 %)
T = 2 K T = 2 K
0 3 9 6 -9 -3 -6
0 3 9 6 -9 -3 -6
FFT Amplitude (a.u.)
FFT Amplitude (a.u.)
0 50 100 150
0.1
-0.1
0 50 100 150 0 10 20 -20 -10 0
the nanoscale. Because these quantum oscillations originated from the coherent motion of quasiparticles near the Fermi surface and were therefore highly sensitive to defects, their persistence further verified the preserved crystalline quality of our NbAs nanowires.
Benchmark comparison of NbAs among promising topological semimetals for interconnects Figure 5A compares the room- temperature electrical resistivities of NbAs nanowires with those of other promising topological semimetals in nanowire geometry [cobalt monosilicide (CoSi), molybdenum phos- phide (MoP), tungsten phosphide (WP), cadmium arsenide (Cd3As2), molybdenum diphosphide (MoP2), and tantalum diarsenide (TaAs2)] (10, 42, 54–58). At sub- 100- nm dimensions, NbAs nanowires exhibited the lowest room- temperature resistivity among the reported topologi- cal semimetal nanowires. To gauge the surface- state contributions to electrical conduction, we also compared the nanowire resistivity scaled by the respective bulk resistivity, defined as ρ(nanowire)/ρ(bulk) (Fig. 5B). The NbAs and the multifold- fermion semimetal CoSi nanow- ires exhibited surface- dominant electrical conduction at reduced di- mensions. In Fig. 5, A and B, we focus only on experimental results from nanowires and do not include other geometries. In general, thin films tend to exhibit lower resistivity than nanowires, even at similar crystal quality, and our work targets extremely scaled interconnect lines whose morphology takes on the nanowire geometry.
In Fig. 5, C and D, we summarize the room- temperature resistivity scaling in topological semimetal thin films [NbAs, niobium phosphide (NbP), tantalum arsenide (TaAs), CoSi, and cobalt tin sulfide (Co3Sn2S2)] (12, 15, 16, 59, 60), thin flakes, and nanobelts [NbAs, WTe2, zirconium pentatelluride (ZrTe5), platinum bismuthide (PtBi2), and tin tantalum sulfide (SnTaS2)] (11, 61–64). Among the presented nanostructures, thin films of amorphous NbP on epitaxial Nb seed layers and thin flakes of SnTaS2 showed a desirable trend of decreasing resistivity with reducing
0.1 0.2 0.3 0.4
1/B (T–1)
Electron band Hole band
E – EF (meV)
Exp. Bulk Exp. NW
A
Nanowire
Nanowire
MoP
Cu
MoP2
MoP
TaAs2
CoSi
TaAs2
Cu
C
WTe2
ZrTe5
WTe2
TaAs
ZrTe5
TaAs
NbP
SnTaS2
NbP
SnTaS2
Fig. 5. Benchmarking NbAs nanowires against other promising topological semimetal nanostructures. (A) Room- temperature electrical resistivity as a function of diameter (cross- sectional area) for NbAs nanowires and various topological semimetal nanowires [CoSi (10), MoP (42), WP (54), Cd3As2 (55, 56), MoP2 (57), and TaAs2 (58)]. For comparison with current interconnect technologies, the resistivity of Cu damascene lines with a Co/TaN liner/barrier layer is also plotted (24). (B) Room- temperature resistivities from (A), scaled by their respective bulk values, defined as ρ(nanowire)/ρ(bulk). (C) Room- temperature electrical resistivity versus thickness for various topological semimetal thin films and thin flakes or nanobelts. Thin films [NbAs (15), NbP (12), TaAs (16), CoSi (59), and Co3Sn2S2 (60)] and thin flakes or nanobelts [NbAs (11), WTe2 (61), ZrTe5 (62), PtBi2 (63), and SnTaS2 (64)] are plotted as open symbols and half- solid symbols, respectively. (D) Room- temperature resistivities from (C), scaled by their respective bulk values, defined as ρ(nanostructure)/ρ(bulk).
0.1
0.1
NbAs nanobelt
thickness (12, 64). The resistivity of our NbAs nanowires is higher than the previously reported value of ~3 microhm·cm for CVD- grown NbAs nanobelts at ~200 nm thickness (Fig. 5, C and D) (11). This discrepancy may arise from differences in sample geometry (nanowires versus nanobelts). Compared with CVD- grown nanobelts, nanowires have a smaller fraction of the (001) surface that hosts the topologically pro- tected Fermi arcs.
For practical interconnect applications, we further compared the line resistance of NbAs nanowires with industry projections for Cu and Ru lines assuming the current liner/barrier layers (fig. S18) (24). NbAs nanowires with cross- sectional areas of 1250 to 1400 nm2 are expected to exhibit similar line resistance to Ru lines but higher than Cu lines. The NbAs nanowires showed a smaller increase in line resis- tance with decreasing cross- sectional area, indicating superior scaling behavior. Given this trend, we expect that NbAs could outperform the current Cu damascene lines at cross- sectional areas of less than ~400 to 500 nm2, which corresponds to the 2 and 3 nm technology nodes. This favorable scaling should persist down to ~100 to 200 nm2,
Cd3As2 Cd3As2
Resistivity (µΩ∙cm) Resistivity (µΩ∙cm)
CoSi MoP2
NbAs (this work)
NbAs (this work)
1000 100 10 1000
100 10 1
100 10 1
Diameter (nm) Diameter (nm)
Co3Sn2S2 Co3Sn2S2
CoSi CoSi
PtBi2 PtBi2
NbAs nanobelt Cu
NbAs NW (this work) NbAs NW (this work)
Thin film Thin flake/Nanobelt
Thin film Thin flake/Nanobelt
Thickness (nm)
Thickness (nm)
T = 300 K T = 300 K
WP WP
Cu T = 300 K T = 300 K
NbAs thin film NbAs thin film
corre sponding to 7- to 8- nm linewidths with width- to- height aspect ratios of ~1:3, which are industry- projected target dimensions for post- elemental- metal interconnects.
We emphasize that line resistance, a key metric for practical inter- connect applications, can only be considered in nanowire geometries. The controlled synthesis of high- quality nanowires with sub- 100- nm diameters is generally challenging. In the present work, this is achieved using the TMNM method, which produces single- crystal nanowires with diameters as small as 40 nm and aspect ratios exceeding 100. Such small- diameter nanowires are difficult to obtain using conventional CVD or vapor- liquid- solid growth for binary compounds. The success- ful synthesis of high- quality NbAs nanowires thereby enables reliable transport measurements and the evaluation of their feasibility for interconnect applications at technologically relevant dimensions. Thus, our work demonstrates the proof of principle that the physics of topological semimetals can be realized in nanowires despite the presence of surface oxidation and roughness, representing the linear dimensions and realistic conditions of the latest technology nodes.
Conclusions Nearly two decades have passed since the first experimental discovery of topological materials, which has yielded numerous groundbreaking insights into their fundamental properties. Yet realistic applications of these materials remain elusive. As demonstrated here with Weyl semimetal NbAs nanowires, low- resistance next- generation intercon- nects may be among the first realizations of such applications. To fully capitalize on this potential, however, further investigations are war- ranted, including more in- depth transport studies with smaller nano- wire diameters and refined theoretical frameworks that account for electron- phonon interactions in topological surface states within nanowire geometries. Furthermore, wafer- scale synthesis and scalable fabrication schemes for on- chip integration of NbAs with smaller di- mensions must be explored. Two industry- viable schemes are subtrac- tive etch and damascene processes (3, 65, 66). Nevertheless, our results mark a critical step forward in bridging the gap between fundamental discoveries and practical applications, ultimately realizing the long- anticipated promise of topological semimetals.
REFERENCES AND NOTES
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Metallization Conference (IITC/AMC), San Jose, CA, USA (2016), pp. 34–36. 49. E. Yoo et al., Mater. Charact. 166, 110451 (2020). 50. J. Heremans, C. M. Thrush, Y.- M. Lin, S. B. Cronin, M. S. Dresselhaus, Phys. Rev. B 63,
085406 (2001). 51. S. Oyarzún et al., Appl. Surf. Sci. 289, 167–172 (2014). 52. M. Komada et al., Phys. Rev. B 101, 045135 (2020). 53. M. Naumann et al., Phys. Status Solidi B 259, 2100165 (2021). 54. G. Jin et al., Nat. Commun. 15, 5889 (2024). 55. C. Z. Li et al., Nat. Commun. 6, 10137 (2015). 56. L. X. Wang et al., J. Phys. Condens. Matter 29, 044003 (2017). 57. G. Jin et al., Appl. Phys. Lett. 121, 113105 (2022). 58. A. Roy et al., Adv. Mater. 37, e2418279 (2025). 59. L. Rocchino et al., Sci. Rep. 14, 20608 (2024). 60. J. Ikeda et al., Commun. Mater. 2, 18 (2021). 61. J. Na et al., Nanoscale 8, 18703–18709 (2016). 62. J. Niu et al., Phys. Rev. B 95, 035420 (2017). 63. A. Zhu et al., Appl. Phys. Lett. 122, 113101 (2023). 64. W. Gao et al., ACS Nano 17, 4913–4921 (2023). 65. M. T. Kiani et al., Newton 1, 100133 (2025). 66. H. Kim et al., Nat. Rev. Electr. Eng. 2, 835–845 (2025).
ACKNOWLEDGMENTS
First- principles electron transport calculations were performed at the Center for
Computational Innovations at Rensselaer Polytechnic Institute. This work made use of
the Cornell Center for Materials Research shared instrumentation facility. Funding:
Nanowire synthesis was in part supported by the Gordon and Betty Moore Foundation’s EPiQS
Initiative, grant GBMF9062.01. Electrical transport measurements were supported by the
Semiconductor Research Corporation JUMP 2.0 SUPREME. S.Ku. and R.S. acknowledge
funding from Semiconductor Research Corporation under task no. 2966.002. H.L.
acknowledges support by the National Science and Technology Council (NSTC) in Taiwan
under grant number NSTC 114-2112-M-001-055-MY3. Y.C. was supported by an ILJU Graduate
Fellowship. Q.P.S. was supported by the National Science Foundation (NSF) GRFP under grant
2139899. Thermo- Fisher Helios G4 UX FIB and Kraken STEM acquisition was supported by the
NSF (DMR- 2039380). Device fabrication was performed in part at the Cornell NanoScale
Facility, a member of the National Nanotechnology Coordinated Infrastructure (NNCI), which
is supported by the NSF (grant NNCI- 2025233). Thermal transport measurements were
supported by the SRC JUMP 2.0 SUPREME Seed Grant, the SRC JUMP 2.0 CHIMES, and
DARPA YFA (D23AP00159- 00). Support for single crystal growth was provided by the NSF
through the Penn State 2D Crystal Consortium- Materials Innovation Platform (2DCC- MIP)
under NSF cooperative agreement DMR- 2039351. Bulk feedstock preparation made use of
the synthesis facility of the Platform for the Accelerated Realization, Analysis, and Discovery
of Interface Materials (PARADIM), which is supported by the NSF under cooperative
agreement no. DMR- 2039380. G.L. and Y.- H.T. are supported by the National Science and
Technology Council (NSTC) under grant number NSTC 112- 2112- M- A49 - 047 - MY3. Author
contributions: Y.C. synthesized the NbAs nanowires, fabricated the devices, and performed
electrical and magneto- transport measurements. Y.- H.T., S.Ku., R.S., H.L., G.L., and C.- T.C.
conducted theoretical analyses. M.T.K. prepared lift- outs of the single crystals for STEM
characterization. M.T.K., N.K.D., Q.P.S., and S.S. performed STEM characterization. J.K., L.K.,
S.Ki., C.L., A.S., and Z.T. performed thermal conductivity measurements and modeling. M.T.K.,
G.J., S.K.K., and N.N. synthesized the bulk feedstocks. S.H.L. and Z.M. provided the NbAs
single crystals. H.W., J.D.C., and G.J. assisted with device fabrication and electrical transport
measurements. Y.C. and D.K. performed heat capacity measurements. J.J.C. supervised the
project. Y.C., Y.- H.T., S.Ku., C.- T.C., and J.J.C. wrote the manuscript, with input from all authors.
All authors reviewed and approved the final version of the manuscript. Competing interests:
The authors declare that they have no competing interests. Data, code, and materials
availability: All data as well as all details of materials synthesis needed to evaluate the
conclusions in this paper are present in the main text or the supplementary materials.
License information: Copyright © 2026 the authors, some rights reserved; exclusive
licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original US
government works. https://www.science.org/about/science- licenses- journal- article- reuse
SUPPLEMENTARY MATERIALS
science.org/doi/10.1126/science.adx3027
Materials and Methods; Supplementary Text; Figs. S1 to S18; Tables S1 to S8;
References (67–95)
10.1126/science.adx3027
Submitted 7 March 2025; resubmitted 30 March 2026; accepted 21 May 2026
Geometrically driven reversible
solid- liquid phase transition
at the atomic scale
Wenjun Cui1,2,3,4†, Cheng Qian5†, Weixiao Lin1,3, Zefan Xue1,3, Zhencui Ge6, Wen Zhao6, Gustaaf Van Tendeloo1,3,7, Jinsong Wu1,3, Feng Ding5, Xiahan Sang1,2,3, Zhengyi Fu1,2
Atomic- resolution observation of the liquid- solid phase transition within a geometrically confined nanocluster provides fundamental insights into heterogeneous nucleation mechanisms. In this work, using in situ transmission electron microscopy, we directly control and observe a single critical- sized bismuth nanocluster within a tunable nanoscale gap, driving it through a reversible cycle from quasi- amorphous nanodisc, to crystalline nanowire, to liquid nanodroplet. The cluster’s aspect ratio, rather than its volume, is the primary descriptor governing these phase transitions, determined by the interplay between intrinsic surface anisotropy and interfacial energetics. Confinement also imposes texture, forcing the nanowire to adopt a preferred [2110] orientation that is absent in unconfined nanoparticles. These results provide the mechanistic foundation for geometry- driven phase and orientation selection, which enables the rational design of nanomaterials through engineered confinement.
Achieving deterministic control over the liquid- solid phase transition at the nanoscale is a fundamental pursuit in materials science (1–4). Classical nucleation theory (CNT) models this process as a competition between the reduction in bulk Gibbs free energy and the energy pen- alty of creating a solid- liquid interface (5–8). However, this classical view is insufficient for many critical processes in both nature and technology that occur under geometric confinement (9–14). In con- fined systems, from biomineralization to nanomaterial synthesis (6, 15), the nascent solid phase interacts directly with surrounding surfaces, fundamentally altering the energetic landscape of nucleation. This alteration has been shown to stabilize specific solid phases, favor certain polymorphs, and generate texture (11, 16–18). Yet, understand- ing the dynamic structural evolution of a geometrically confined criti- cal nucleus with anisotropic surface energy remains elusive.
Directly observing and manipulating the behavior of a critical- sized cluster has been a long- standing experimental challenge. The first hurdle stems from the difficulty of isolating and stabilizing a nanometer- sized cluster for sustained observation because the nucleus is a thermodynamically unstable transition state at the peak of the free energy barrier (Fig. 1A) (6, 19). A second challenge involves impos- ing meaningful geometric confinement, which requires manipulating surfaces with nanometer- level precision to dynamically control the confinement space (20, 21). A final requirement is to integrate this mechanical control within an environment that allows for the capture
1State Key Laboratory of Advanced Technology for Materials Synthesis and Processing, Wuhan University of Technology, Wuhan, China. 2Hubei Longzhong Laboratory, Wuhan University of Technology Xiangyang Demonstration Zone, Xiangyang, China. 3Nanostructure Research Center, Wuhan University of Technology, Wuhan, China. 4Laboratory of Opto- Electronic Information Acquisition and Protection Technology, Institutes of Physical Science and Information Technology, Anhui University, Hefei, China. 5Suzhou Laboratory, Suzhou, China. 6School of Materials Science and Engineering, China University of Petroleum (East China), Qingdao, China. 7EMAT (Electron Microscopy for Materials Science), University of Antwerp, Antwerp, Belgium. *Corresponding author. Email: dingf@ szlab. ac. cn (F.D.); xhsang@ whut. edu. cn (X.S.) †These authors contributed equally to this work.
of structural evolution, particularly the transitions between amor- phous, liquid, and crystalline states, through direct, real- time observa- tion with atomic resolution (22–25).
In this study, using in situ transmission electron microscopy (TEM), we generate a bismuth (Bi) subcritical cluster on a tungsten (W) tip using an applied voltage, precisely control its confinement by mechani- cally manipulating the tip, and subsequently observe its reversible phase transition between a quasi- amorphous nanodisc, a crystalline nanowire (NW), and a liquid nanodroplet (ND). The confinement strongly stabilizes the formation of a [2110]- oriented NW with an aniso- tropic lateral surface energy lower than that of the liquid phase, es- sentially removing the classical liquid- solid transition energy barrier. The aspect ratio of the NW naturally emerges as the primary phase descriptor that reflects the competition between anisotropic surface free energy and interfacial free energy from the confinement. This work provides direct, real- time, and atomic- resolution visualization of a geometrically controlled solid- liquid phase transition in a subcritical nucleus, demonstrating the decisive role of confinement geometry and surface anisotropy in governing both phase stability and crystal- lographic orientation at the nanoscale.
Controlled generation of a manipulable critical- sized nucleus The experiment was conducted inside a transmission electron micro- scope using an in situ biasing holder (PicoFemto TEM- STM, Zeptools Co.) equipped with a piezo- controlled (26–28), Mn- coated W tip (Fig. 1B and figs. S1 to S3). We use focused ion beam to expose the (0110) surface of the Bi2Te3 samples, a strategic preparation that ori-
ents the van der Waals (vdW) gaps perpendicular to the surface to serve as natural pathways for Bi cation diffusion (Fig. 1B, black arrow) (2, 29–31). On establishing contact and applying a 3- V bias, Bi cations migrate along these vdW gaps toward the tip- sample interface, leading to a localized Bi accumulation at the interface (Fig. 1, B and C), as confirmed by energy- dispersive x- ray spectroscopy (fig. S4). This ac- cumulated Bi forms a pure, crystalline layer that grows epitaxially on the Bi2Te3 substrate, adopting a rhombohedral structure (space group R3m) with an orientation relationship of Bi2Te3- [2110] ‖ Bi- [2110] and Bi2Te3- (0001) ‖ Bi- (0001) (Fig. 1C) (32). The Mn coating on the W tip forms a MnO surface layer that acts as a diffusion barrier to prevent Bi from alloying with the tip (fig. S2).
As the Bi layer continues to grow at the interface, the applied voltage drives excess Bi to diffuse laterally across the MnO surface, forming isolated nanoscale clusters (Fig. 1D, green arrows, and figs. S5 to S7). These clusters initially appear as liquid Bi NDs, exhibiting a charac- teristic spherical morphology in high- resolution TEM (HRTEM) im- ages and a diffuse fast Fourier transform (FFT) pattern lacking sharp diffraction spots (Fig. 1D, bottom panel) (33–35). On reaching a critical radius of ~3 to 4 nm, they solidify into faceted crystalline nanopar- ticles (NPs) on the MnO surface (Fig. 1E, movie S1, and figs. S8 and S9). Marked by the emergence of distinct lattice fringes and FFT diffraction spots corresponding to the [0110] zone axis, this volume- dependent transition is consistent with CNT (3). The nucleation oc- curs well below the bulk melting point of Bi (544 K) owing to a combination of size- dependent melting point (Tm) depression and localized electron beam heating (36). This voltage- driven, in situ growth provides a reliable mechanism to generate and isolate a single critical- sized Bi cluster directly on the movable tip, setting the stage for subsequent geometric confinement experiments.
Reversible phase transitions of Bi nanoclusters under geometric confinement To impose geometric confinement, we drive the W tip carrying the Bi ND toward an opposing amorphous C substrate, trapping the ND within a tunable nanoscale gap (figs. S6 and S10). On contact, the confined ND immediately transforms into a Bi nanodisc with an axial length (l; equivalent to its thickness) of 1.5 nm, a diameter (d) of 5.5 nm,
Fig. 1. In situ TEM observation of reversible phase transitions in a confined Bi nanocluster. (A) Schematic of CNT, where the total Gibbs free energy (ΔG) change is a
sum of the negative bulk term (ΔGV) and positive surface term (ΔGS). A critical radius (r) and energy barrier (G) must be overcome for solidification. (B) Schematic
of the experimental setup. A piezo- controlled, Mn- coated W tip contacts the (0110) surface of a Bi2Te3 crystal. An applied voltage drives Bi ion migration along the vdW
gaps to the tip (black arrow). (Inset) Low- magnification scanning transmission electron microscopy (STEM) image of the setup. Scale bar, 500 nm. (C) Atomic- resolution
high- angle annular dark- field (HAADF) STEM image of the interface showing the epitaxial growth of the Bi layer on Bi2Te3. (D) HRTEM image of Bi liquid NDs on the
Mn- coated W tip surface at 35 s (top). Enlarged ND at 97 s and corresponding FFT (bottom) indicate the liquid state. (E) HRTEM image (top) and corresponding FFT
pattern (bottom) of a crystalline Bi NP with [0110] orientation formed on the MnO surface. (F) Time- lapse HRTEM images (top) and corresponding FFT patterns (bottom)
showing the transition of a Bi nanocluster from a quasi- amorphous nanodisc to a crystalline NW, marked by the emergence of sharp diffraction spots from initial diffuse
arcs. Shaded regions highlight ordered atomic bridges and chains. (G) Time- lapse HRTEM images (top) and FFT patterns (bottom) demonstrating the reversible transition
between a crystalline Bi NW and a liquid Bi ND. The crystalline NW is elongated (188.5 s → 294 s) until it reaches a critical aspect ratio, detaches, and transforms into a
liquid ND (312 s). Pushing the ND back into contact with the substrate induces immediate resolidification into a crystalline NW (361 s). Key crystallographic orientations
and the angle of the (2110) plane relative to the substrate are indicated.
and an aspect ratio (l/d) of 0.27. The corresponding FFT (Fig. 1F, 143 s, and movie S2) indicates that the nanodisc is generally disordered (dif- fuse ring) but retains ordering along the compression direction (two white arcs). We therefore identify this as a quasi- amorphous state
kinetically trapped by geometric frustration, similar to confined bi- layer amorphous ice (37). Under extremely narrow confinement, the large interfacial area and atomic- scale surface roughness force the Bi atoms at the two interfaces to rearrange into structurally compliant
amorphous layers. This structural adaptation minimizes the massive elastic strain and interfacial energy penalties that would otherwise arise from a rigid crystalline lattice (see supplementary text and figs. S11 and S12). The amorphization in this case is partial, as evi- denced by the narrow ordered chains and bridges observed in real space (shaded regions) that span the gap between the C substrate and the tip.
)
δGS
(1)
Retracting the tip from the C substrate increases the aspect ratio (l/d) of the Bi nanocluster. Initially, the nanocluster maintains the quasi- amorphous state with strong diffraction arcs along the compres- sion direction (figs. S11 and S12). As retraction continues (t = 168.5 s; Fig. 1F), partial crystallization begins, evidenced by distinct lattice fringes emerging in the upper left region. The corresponding FFT confirms this phase coexistence, displaying sharp diffraction spots [in- dexed to the (1210) plane of pure Bi] alongside shortened diffraction arcs. Further retraction to an l/d ratio of 0.41 at t = 172.5 s triggers the complete transformation of the cluster into a single- crystalline NW. Quantitative radial and azimuthal intensity profiles verify this full crystallization, confirming that discrete diffraction spots have completely replaced the initial diffuse arcs in the FFT pattern (figs. S11 and S12).
As l/d further increases, the nanocluster remains anchored nearly perpendicular to both substrates, maintaining a single- crystalline Bi NW morphology that accommodates >50% elongation (from ~3.2 to ~4.9 nm; Fig. 1G, 188.5 to 294 s). Concurrently, the NW undergoes dynamic crystallographic reorientation, frequently adopting [0111] (Fig. 1G, 188.5 s), [0001] (240 s), and [0221] (294 s) zone axes. The crys talline state persists until reaching a critical aspect ratio of l/ds→l ≈ 1.5 (movie S2, 310.5 s). At this threshold, the NW detaches from the C surface and spontaneously transforms into a liquid ND with a spherical cap morphology (Fig. 1G, 312 s) to minimize total surface energy. This transition is confirmed by the featureless, diffuse contrast in the corresponding FFT.
δd =0
(l∕d)∗= −γS
2 (2)
Notably, this process is reversible. Repositioning the tip to bring the ND back into contact with the C surface induces its instantaneous resolidification into a crystalline NW (361 s). This newly formed NW can once again be elongated until it melts back into a liquid ND (471 s). This entire sequence was repeated up to 11 times (figs. S13 to S16), which demonstrates that geometric confinement can be used to control the phase of a critical- sized nucleus through its quasi- amorphous, crystalline, and liquid states. Similar experiments were repeated across a range of dose rate (3433 to 11300 e−/Å2s) and applied bias (0 to −5 V) under parallel confinement (figs. S17 to S26). In this open, driven system, the electron beam acts as a thermal back- ground, the applied bias regulates the Bi mass source (figs. S27 to S31), and the movable tip enables precise mechanical manipulation, providing a platform to isolate and study the influence of confine- ment geometry on the phase transition.
Aspect ratio as the determinant of phase stability Analysis of geometric parameters (l and d) measured from quasi- amorphous nanodiscs and crystalline NWs in movies S2 and S3 reveals a correlation between the aspect ratio (l/d) and the phase state (Fig. 2A). Crystalline NWs (purple squares) are stable within the range of 0.4 < l/d < 1.5. The NW transitions into a quasi- amorphous state (gray circles) when compressed to l/d < 0.4 and melts into a liquid ND (green circles) when elongated beyond l/d ≈ 1.5. This observation marks a notable departure from CNT, in which volume is the sole parameter determining the liquid- solid transition (figs. S32 to S40 and table S1). To build a thermodynamic model for these transitions, we first establish that the confined nanocluster maintains a cylindri- cal geometry by comparing the experimental intensity profile across the NW, which shows a smooth contrast decay from the edge to the center (Fig. 2B), with HRTEM simulations of various cross sections (Fig. 2C). Only the circular model matched the experimental data,
whereas square and rhombic models yielded decay rates that were too abrupt or gradual. This finding holds for both quasi- amorphous and crystalline states (Fig. 2D and fig. S41), confirming a cylindrical shape driven by the thermodynamic imperative to minimize lateral surface area.
Using the confirmed cylindrical geometry to calculate the nano- cluster volume (V), we replot data from Fig. 2A as a phase map of V versus l/d (Fig. 2E). The amorphous- solid (gray line) and solid- liquid (green line) phase boundaries are vertical, which indicates that they depend mainly on l/d with no discernible volume dependence. This contrasts with unconfined, heterogeneous nucleation of Bi clusters on the MnO substrate (Fig. 2F and fig. S8), which is clearly volume driven and features a liquid- solid coexistence regime near the critical size (30 to 60 nm3). Within this coexistence range, phase selection is highly sensitive to minor thermodynamic or kinetic fluctuations, which makes the outcome difficult to predict (5, 19, 35, 36, 38). Under geometric confinement, this unpredictable volume- dependent regime is suppressed. The system instead resolves into distinct phases cleanly separated by l/d (Fig. 2E), establishing l/d as the primary descriptor. Extensive statistical analysis across multiple independent nanoclusters confirms that these l/d- defined phase boundaries are highly reproducible across a broad and dynamic volume range (20 to 120 nm3) within our bounded experimental conditions (dose rate, 3433 to 11,300 e−/Å2s; bias, 0 to −5 V) (figs. S17 to S26, S42, and S43). Notably, the l/d boundaries remain stable despite temperature un- certainties arising from local microstructural and dose rate varia- tions (fig. S42).
To provide a thermodynamic basis, we model the total surface- interface free energy, GS, of the confined Bi NW. For a cylinder of fixed volume V, GS is determined by the interplay between the Bi surface energy of the lateral facets (γS,lat) and the energy penalty for creating Bi/MnO and Bi/C interfaces (fig. S44)
γS,lat
GS = ASγS,lat + AI
Here, AI = 1
4πd2 represents the area of each circular end- cap interface (Bi/MnO and Bi/C), and AS = πdl is the lateral surface area. By applying Young’s equation, the total effective interfacial energy term can be substituted with contact angles, simplifying to −γS(cosθ1 + cosθ2), where θ1 and θ2 are the contact angles for the Bi/MnO and Bi/C inter- faces, respectively, and γS is the average solid surface energy of Bi. By minimizing GS with respect to the diameter at a constant volume (
cosθ1 + cosθ2
, we derive the expression for the optimal aspect ratio (l/d)*
that minimizes the NW free energy
This derivation reveals that (l/d)* is governed by two competing com- ponents, a mechanism different from CNT (figs. S32 to S40). The first
factor, γS
γS,lat, represents the intrinsic surface energy anisotropy. Because
the lateral facets have very low energy, this ratio is >1, acting as the stabilizing force for the NW. The second factor, −cosθ1 + cosθ2
2 , represents the extrinsic influence of the contact with the confining interfaces, which causes (l/d) to increase as the dewetting behavior becomes stronger (θ1 or θ2 > 90°). Therefore, (l/d) is jointly determined by intrinsic surface anisotropy and the effective wetting state of the con- fining interfaces. This equation indicates that the phase boundaries should remain stable if the MnO and amorphous C surface structures are stable over repeated cycling. This is generally the case (fig. S45), although prolonged contact can leave trace residual Bi, which modifies the local wetting behavior and disrupts further reversible phase transi- tions (figs. S46 and S47). Furthermore, because these surface and
[(γBi∕MnO −γMnO
)+(γBi∕C −γC
)]
Fig. 2. Aspect ratio (l/d) as the determinant of phase stability under geometric confinement. (A) Time evolution of the nanocluster l/d during cyclic phase transitions, revealing sharp thresholds for amorphous- to- crystalline (l/d ≈ 0.4, pink dashed line) and crystalline- to- liquid (l/d ≈ 1.5, green dashed line) transformations. (Insets) TEM images showing the cluster at key points in a cycle. (B) An experimental intensity line profile across a crystalline NW. Scale bar, 2 nm. a.u., arbitrary units. (C) Comparison of the experimental profile from (B) with simulated profiles for NWs with circular, square, and rhombic cross sections. (D) Time evolution (x axis) of the intensity line profile for a single NW (left) and simulated intensity profile (right) of circular cross section. (E) Phase state of a confined nanocluster as a function of volume (V) and l/d. Gray and green vertical lines denote the amorphous- solid and solid- liquid phase boundaries, respectively. (F) For comparison, the volume- radius relationship for unconfined Bi clusters nucleating on MnO substrate. This volume- dependent liquid- to- solid transition occurs at a critical radius of ~3 nm. (G) A thermodynamic model of the total free energy (G) for a confined, constant- volume nanocluster (V = 70 nm3) as a function of l/d. The energy is minimized for a crystalline NW at (l/d)* = 0.75.
interfacial free energies generally exhibit weak temperature depen- dence (39), this equation helps explain why the phase boundaries remain robust against temperature uncertainty.
As illustrated in a schematic free energy landscape (GS versus l/d) (Fig. 2G), elongation [l/d > (l/d)] increases the lateral surface energy penalty, eventually triggering a solid- to- liquid transition into a ND. Conversely, compression [l/d < (l/d)] makes the interfacial energy dominant and induces the quasi- amorphous transition, which aligns with our in situ observations.
Unifying melting behavior in a simulated phase map We then use machine learning force field–molecular dynamics (MLFF- MD) simulations to construct phase maps detailing phase sta- bility as a function of l/d and temperature. This is achieved by system- atically heating confined Bi nanoclusters at various fixed l/d ratios and recording their phase transition temperatures between various
interfaces (graphene, amorphous C, and MnO; Fig. 3 and figs. S48 to S56). We use a representative model of a 56.5- nm3 nanocluster con- fined between two graphene layers to illustrate this behavior because this idealized and symmetric confinement yields sharp potential en- ergy curves that delineate each phase transition.
For a highly compressed nanocluster (l/d = 0.33; Fig. 3A and movie S4), the evolution of its potential energy upon heating (Fig. 3C) reveals a distinct two- stage transition from crystalline (300 K) to liquid (>510 K). At ~410 K, the energy curve displays a small, sharp peak, marking the onset of surface amorphization at a temperature that we define as Tsa. We characterize this as amorphization rather than melting because the energy increase is minor, corresponding to a structural disordering of atoms at the cluster’s edge (black arrows) into a solid- like amor- phous shell while the core remains crystalline. This core- shell structure persists until 510 K, at which point the potential energy shows a sec- ond, much larger jump. This marks the complete melting of the core
Fig. 3. Aspect ratio–dependent phase transition behavior of Bi nanoclusters from MLFF- MD simulations. (A) Atomic snapshots from simulations of a low–aspect ratio (l/d = 0.33) nanocluster (V = 56.5 nm3) confined between graphene sheets, showing a two- stage melting process on heating. Surface amorphization begins at Tsa ≈ 410 K (black arrow) followed by core melting at Tcm ≈ 510 K. (B) Snapshots of a high–aspect ratio (l/d = 1.68) nanocluster of the same volume, which undergoes a direct, single- stage transition to a liquid droplet at Tm ≈ 440 K. (C) Potential energy versus temperature curves for nanoclusters with various aspect ratios. Sharp jumps in energy define the transition temperatures (Tsa, Tcm, or Tm). (D) Simulated phase map for a constant volume (V = 56.5 nm3), plotting transition temperature versus aspect ratio. The map reveals three distinct regions: stable crystalline, an intermediate surface- amorphous phase, and liquid. The crystalline phase shows maximum thermal stability at l/d ≈ 1. The black arrow illustrates the isothermal pathway from the experiment, where increasing the aspect ratio drives the nanocluster from quasi- amorphous to crystalline and finally to liquid. (Insets) Representative images of the nanoclusters with distinct l/d ratios. Scale bar, 2 nm.
at temperature Tcm, as the entire nanocluster abruptly transitions into a fully disordered liquid. Consequently, at low l/d ratios, the narrow confinement energetically favors a stable, mixed amorphous- crystalline configuration, which serves as the physical analog to the experimen- tally observed quasi- amorphous state.
This two- stage pathway to liquid is replaced by a single- stage pro- cess at higher aspect ratios (l/d > 0.7). For example, the Bi NW with l/d = 1.68 (Fig. 3B and movie S5) undergoes a rapid, unified melting. Shortly after surface disordering initiates at 420 K, the entire core becomes liquid at 440 K, causing the nanocluster to detach from one surface and form a liquid droplet. This effective merger of the surface amorphization and core melting events into a single transition is con- firmed by the potential energy curves (Fig. 3C). For nanoclusters with
l/d > 0.7, these curves exhibit only a single sharp jump, defining a unified melting temperature Tm. We propose that as the NW becomes thinner, it lacks the lateral volume required to maintain a stable crys- talline core once surface amorphization begins.
Mapping the transition temperatures (Tsa and Tcm for l/d < 0.7, and Tm for l/d > 0.7) as a function of aspect ratio yields a computational phase map (Fig. 3D) divided into three regions: the crystalline NW, liquid ND, and quasi- amorphous nanodisc. The onset of solid- state instability (the Tsa and Tm curves) displays a parabolic trend, peaking at an optimal l/d ≈ 1. The existence of this optimal ratio, representing the most thermodynamically stable crystalline state, agrees well with the free- energy model (Fig. 2G). Additional phase maps across different cluster volumes (56.5 and 84.8 nm3) and various surfaces confirm that
Fig. 4. Confinement- induced crystallographic texture in Bi NWs. (A) Time- lapse HRTEM images comparing the dynamic orientations of an unconfined Bi NP (top row) and a
confined Bi NW (bottom row). The NP tumbles freely, whereas the NW maintains its (2110) planes (dashed lines) nearly parallel to the substrate. (B and C) Histograms
quantifying the angular deviation (δ) of the (2110) plane relative to the substrate. Whereas the unconfined NP (B) exhibits a broad, random distribution, the confined NW (C)
shows a sharp peak around 0°, confirming strong preferential alignment. (D and E) Stereographic projections of the observed zone axes and corresponding frequency viewed
along the [2110] pole. The size of each data point is proportional to the number of frames the corresponding zone axis was observed. The zone axes of the unconfined NP (D) are
scattered across the projection, indicating 3D tumbling. For the confined NW (E), all observed zone axes lie on a single great circle, proving that its motion is restricted to rotation
around a fixed [2110] axis. (F) Calculated surface energies (γs) for various Bi crystallographic planes. (G) Atomic models of Bi NWs with different growth directions: [0001]
(left), [2110] (middle), and [0221] (right). The exposed surface planes are highlighted with different colors. (Insets) Atomic arrangements using a pseudo- cubic lattice.
Confinement- induced crystallographic texture Direct in situ TEM observation reveals the rapid crystallographic re- orientations of both confined NWs and unconfined NPs, with frequent transitions between zone axes occurring within seconds (Fig. 4A and movies S1 to S3). To reveal the influence of confinement on orientation selection, we statistically analyze the angular deviation (δ) between the frequently observed (2110) crystallographic planes (located using FFT) relative to the substrate (defined in Fig. 4A and figs. S57 and S58). For the unconfined NP, these planes show a broad angular distribution where only 13% (12 of the 94 frames) exhibits δ < 10° (Fig. 4B). Instead, for the confined NW, the (2110) planes appear in all indexable frames and are preferentially parallel to the substrate interfaces, with 77% (48 of the 62 frames) showing δ < 10° (Fig. 4C).
the solid phase is maximally stabilized at an optimized l/d ratio (figs. S49 to S56). As illustrated by the horizontal black arrow, an isother- mal increase in the aspect ratio drives the nanocluster across these boundaries through the sequence of amorphous to solid to liquid, qualitatively explaining the observed confinement- induced phase tran- sitions. Furthermore, MD simulations reveal that for interfaces with substantially mismatched wetting behaviors [e.g., graphene paired with a MnO(100) surface], the nanocluster can develop asymmetric wetting. Experimentally, however, this asymmetry is rarely observed. Because the experimental MnO and amorphous C surfaces exhibit similar dewetting behaviors, there is insufficient driving force to over- come the kinetic barrier of exposing new, high- energy lateral facets to break the energy- minimizing cylindrical shape.
To visualize this confinement- induced orientation in NW, we plot the frequency of observable zone axes on stereographic projections centered on the [2110] pole (Fig. 4, D and E, and table S2). For the un- confined NP, the zone axes are randomly scattered, indicating free three- dimensional (3D) tumbling (Fig. 4D). By contrast, all observed zone axes for the NWs of an extended dataset (279 frames), including [0221], [0111], [0111], [0110], and [0001], lie exclusively on a single great
circle perpendicular to the [2110] central pole (Fig. 4E). Such a dis- tribution reveals that confinement restricts the NW’s complex tum- bling motion to a simple spin around a fixed [2110] growth axis. This preferred longitudinal orientation is consistent with the reported growth direction for Bi NWs (table S3). Furthermore, the observa- tion of continuous rotational mobility, coupled with the NW’s ability to slide laterally to relax shear forces (fig. S59), serves as direct evidence that this perpendicular alignment is not mechani- cally enforced.
Instead, the observed preference for the [2110] growth direction is driven by the minimization of lateral surface energy (γS,lat), as quanti- fied by density functional theory (DFT) (Fig. 4F and table S4) (40, 41). Our calculations identify (0001), (0112), and (0111) as the lowest- energy surfaces for Bi. As shown in the atomic model (Fig. 4G), a NW growing along [2110] naturally exposes these stable facets as its primary lateral surfaces. To confirm the stability of this configura- tion, we model NWs growing along alternative low- index directions in the Bi pseudo- cubic (pc) lattice, [0001] and [0221] (Fig. 4G) (42). In both cases, the geometry forces the exposure of higher- energy facets, such as (2110) and (0110) facets for the [0001] orientation and (2110), (1012), and (0114) facets for [0221]. Consequently, the calculated
area- weighted average surface energy for the [2110] growth direction (0.26 J/m2) is markedly lower than for both [0001] (0.47 J/m2) and [0221] (0.33 J/m2). This γS,lat = 0.26 J/m2 is lower than that of liquid
Bi [0.378 J/m2 (43)], which fundamentally inverts the classical surface energy penalty into a thermodynamic driving force (figs. S32 to S40). This inversion effectively removes the nucleation barrier and drives the selection for the strong [2110] crystallographic texture observed in the confined NWs.
Therefore, the difference in orientational stability reflects a funda- mental shift in the energy landscape. An unconfined NP minimizes its energy by adopting a near- hemispherical shape composed of numer- ous small facets (9, 33). This structural averaging creates negligible energetic penalties for reorientation, allowing the particle to tumble freely driven by thermal fluctuations. Conversely, the confined NW is a highly anisotropic, faceted object with stability that is governed by the few, specific low- energy planes that form its large lateral surfaces. The low surface energy of the [2110] lateral facets traps the NW in a deep, highly stable thermodynamic potential well. Any rotation to an alternative orientation requires overcoming a steep barrier that far exceeds available thermal energy, suppressing transverse rotational degrees of freedom. These results provide direct, atomic- resolution evidence that confinement induces texture by coupling geometric con- straints with intrinsic surface anisotropy.
In this study, we move beyond the classical competition between surface and bulk energy during heterogeneous nucleation to demon- strate that surface free energy anisotropy and interfacial energetics reshape the energy landscape. For a geometrically confined Bi nano- cluster, this interplay dictates its phase stability, shape, and crystal- lographic orientation, establishing aspect ratio, rather than volume, as the primary phase descriptor. Because surface energy anisotropy is an inherent property of most crystalline solids, we hypothesize that this mechanism may extend beyond Bi and could be used to harness geometric confinement for the rational design of advanced materials.
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Funding: This work was mainly supported by the Fundamental and Interdisciplinary
Disciplines Breakthrough Plan of the Ministry of Education of China (JYB2025XDXM408), the
National Natural Science Foundation of China (52272235, 12474020, 52503284, and
52573254), the National Science and Technology Major Project (2026ZD062500), the
Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2024A1515010965), the New
Generation Artificial Intelligence–National Science and Technology Major Project
(2025ZD0121802), the National Key R&D Program of China (2021YFA0715700 and
2025YFE0200800), the Research Program from Suzhou Laboratory (SK- 1502- 2024- 055),
and the China Postdoctoral Science Foundation (2025M78003 and 2025M781003). Author
contributions: Conceptualization: X.S., J.W.; Methodology: X.S., F.D., W.C., C.Q.; Validation:
X.S., F.D., W.C., C.Q.; Formal analysis: X.S., W.C., C.Q.; Investigation: W.C., C.Q., W.L., Z.X., Z.G.,
W.Z.; Resources: X.S., F.D., J.W., G.V.T., Z.F.; Data curation: W.C., C.Q.; Writing – original draft:
W.C., C.Q.; Writing – review & editing: X.S., F.D., J.W., G.V.T., Z.F.; Visualization: W.C., C.Q.;
Supervision: X.S., F.D., G.V.T., J.W.; Project administration: X.S., F.D., J.W., Z.F.; Funding
acquisition: X.S., F.D., J.W., Z.F. Competing interests: The authors declare that they have no
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Materials and Methods; Supplementary Text; Figs. S1 to S60; Tables S1 to S8;
References (44–66); Movies S1 to S5
10.1126/science.aed6019
Submitted 3 November 2025; accepted 3 June 2026
Spatiotemporally homogeneous crystallization for ambient scalable perovskite photovoltaics
Binlou Gao1†, Yang Zhong1†, Xiao Luo1, Jiacheng He1, Junxi Guo1, Xueying Wang1, Yikun Liu1, Licheng Tan1, Yiwang Chen1,2,3
Commercializing perovskite solar cells (PSCs) will likely require the scalable deposition of homogeneous perovskite films under ambient conditions. However, the spatially heterogeneous degradation of metastable perovskites during prolonged coating leads to nonuniformity. Here, we demonstrate spatiotemporally homogeneous crystallization of α- phase FAPbI3 (where FA is formamidinium) enabled by a phase- locking strategy that establishes a dynamically evolving, moisture- buffering intergranular network during large- area printing. This method prevents the premature degradation caused by ambient humidity, eliminating directional inhomogeneity. Blade- coated PSCs achieved a 26.7% power conversion efficiency (PCE; 26.1% certified), and rigid and flexible 100- square- centimeter modules reached 21.5 and 19.5%, respectively. Improved morphological homogeneity mitigated localized degradation and suppressed self- amplifying aging pathways. Encapsulated devices retained more than 90% of their initial PCE after 1500 hours of 85°C maximum power point tracking in ambient air.
Laboratory- scale perovskite solar cells (PSCs), which are typically fabricated by spin- coating precursors within an inert atmosphere, have achieved certified power conversion efficiencies (PCEs) of >27% (1–3). However, spin coating is intrinsically incompatible with high- throughput, factory- scale manufacturing in that centrifugal forces create film inhomogeneity and inert atmospheres increase process complexity and cost (4).
Printing methods benefit from high material utilization and cost- effective processing and enable the production of large perovskite solar modules (PSMs) (5, 6). However, the deposition time increases with substrate area for printing processes and leaves the unannealed pe- rovskite intermediate in a metastable state (7). Specifically, water mol- ecules form hydrogen bonds with organic cations, inducing local lattice strain and lowering the energy barrier for transition to the photoinac- tive yellow δ- FAPbI3 phase, where FA is formamidinium (8). This in- stability triggers spatially heterogeneous degradation, wherein initially coated perovskites begin to decompose before the entire deposition process is complete.
To address such inhomogeneity, a high- humidity process has been used for complete δ- phase formation to improve uniformity, followed by thermal conversion to photoactive black α- FAPbI3 (8) that has an ideal optical bandgap and high thermal stability (9–11). However, this approach compromises microstructural integrity because the subse- quent solid- phase transition induces heterogeneous nucleation and strain accumulation (12). Alternatively, direct α- phase crystallization
1College of Chemistry and Chemical Engineering/Film Energy Chemistry for Jiangxi Provincial Key Laboratory (FEC), Nanchang University, Nanchang, China. 2Key Laboratory of Fluorine and Silicon for Energy Materials and Chemistry of Ministry of Education, Jiangxi Normal University, Nanchang, China. 3College of Chemistry and Materials Science, Gannan Normal University, Ganzhou, China. *Corresponding author. Email: ywchen@ ncu. edu. cn (Y.C.); tanlicheng@ ncu. edu. cn (L.T.) †These authors contributed equally to this work.
Although many crystallization regulation strategies enable direct α- phase printing (13–17), they primarily address thermodynamic stability and leave the α- phase susceptible to moisture during the extended processing window. As a result, this predegradation manifests as spatial heterogeneity after annealing, causing current mismatch among series- connected subcells and degrading the per- formance of PSMs (18). Localized degradation in an inhomogeneous perovskite film triggers a self- amplifying aging process in which defect hotspots accelerate decomposition and propagate failure across the module.
Herein, we have achieved spatiotemporally homogeneous crystal- lization of α- phase perovskites through a phase- locking strategy that coordinates crystallization with the formation of a dynamically evolv- ing moisture- buffering intergranular network, ensuring stable α- phase formation during ambient scalable printing. This method effectively prevented early- deposited perovskites from degrading prematurely spatiotemporal uniformity. Blade- coated PSCs (0.08 cm2) achieved a PCE of 26.7% (26.1% certified), whereas rigid and flexible modules (100 cm2; 78.96 cm2 aperture area) achieved PCEs of 21.5 and 19.5%, respectively. This strategy also exhibited excellent compatibility with carbon electrodes and achieved 16.0% PCE in a carbon- based hole- transport layer–free module (100 cm2). Moreover, the encapsulated module retained >90% of its initial performance after 2300 hours under 85°C and 85% relative humidity (RH) or ISOS- D- 3 damp- heat testing, demonstrating industrial- relevant operational stability en- abled by enhanced morphological homogeneity that suppressed local- ized degradation by defect propagation.
α- Phase perovskite stabilization during scalable blade coating in ambient air We used a blade- coating method for scaled α- phase fabrication that first deposited PbI2 solution and then FAI solution, followed by ther- mal annealing (fig. S1 and note S1). However, the hydration of dimethyl sulfoxide in the PbI2 film led to incomplete conversion from inter- mediate complexes to perovskites and accelerated the transformation to the δ- phase in humid air (4, 19). To mitigate hydration, we added 3- ureidopropyltrimethoxysilane (TMPU) to the PbI2 precursor solution (Fig. 1A). During annealing, simultaneous TMPU cross- linking and interaction with perovskite intermediate led to a dynamically evolving intergranular network that blocked moisture intrusion (figs. S2 to S9 and notes S2 and S3).
Analysis of the deposition process across different RH values from 15 to 75% showed that this phase- locking strategy facilitated direct α- phase formation and stabilization by suppressing hydration and reducing the formation energy barrier for α- FAPbI3 (Fig. 1B and fig. S10). Consistent (100)- oriented α- phase diffraction patterns after an- nealing confirmed enhanced crystal quality (larger grains and reduced voids) (Fig. 1C and fig. S11). Control unannealed films progressively showed more δ- phase formation (2θ = 11.7°) at higher RH and com- plete δ- phase formation above 60% RH (figs. S12 and S13). We also investigated hydrophobic trimethoxysilane and functional urea as a comparison. We found that the advantages of TMPU were not confined to integration of moisture blocking and crystallization regulation, but rather derived from the combination of covalent siloxane network and terminal urea- mediated dynamic hydrogen bonding, which enabled α- phase locking. (figs. S14 and S15, note S4, and table S1).
At a given blading speed, the process window (total time) depended on FAI solution deposition time, transfer time, and annealing time (7) (figs. S16 and S17). At 45% RH, control perovskite films exhibited α- phase disappearance and the persistence of the δ- phase within 30 s, whereas the target counterparts formed the α- phase in 60 s (Fig. 1D). This TMPU- involved phase- locking strategy enabled a uniform stable α- FAPbI3 perovskite film (100 cm2) (Fig. 1E and movie S2).
Fig. 1. α- Phase perovskite stabilization during scalable blade coating in ambient air. (A) Schematic illustration of the conventional strategy (left) and our phase- locking strategy (right), which enabled α- phase stabilization and morphological homogeneity during the blade- coating process. (B and C) XRD patterns (B) and SEM images (C) of annealed control and target perovskites fabricated at different RH. (D) Semi–in situ XRD patterns of control and target perovskite films during the process window in ~45% RH. (E) Blade- coating process of FAI solution on control and target PbI2 films (10 × 13 cm2). Photographs are captured in movie S2.
Spatiotemporally homogeneous crystallization dynamics during upscaling The process window varied across the substrate, from the leading edge experiencing the full blade traversal time (10 s) to essentially zero at the trailing edge (fig. S13). This position- dependent processing time directly compromised film homogeneity because of the instability of the initially formed α- phase. (figs. S18 and S19 and note S5). We used in situ ultraviolet- visible (UV- vis) absorption spectroscopy to monitor crystallization dynamics across the films (Fig. 2A). The target pe rov- skite film exhibited stable absorption at wavelengths >550 nm throughout the process window, indicating excellent stability of the α- phase (20). During annealing, the absorption at all positions
(
n)
Fig. 2. Spatiotemporally homogeneous crystallization dynamics during the blade- coating process. (A) In situ UV- vis absorption spectra evolution over time in different positions. (B and C) Time evolution of the absorbance at 690 nm during annealing of control (B) and target (C) perovskites. (D) The extracted crystallization rate constant (K) from the Avrami model for different perovskite films. (E) Schematic representation of a 10 cm by 10 cm perovskite film divided into 16 regions. (F and G) PCE mapping of control (F) and target (G) device segments from 10 cm by 10 cm perovskite films fabricated by an extended process window (40 s).
To amplify the regional differences in crystallization rate, we applied the Avrami model to analyze the evolution of the UV absorption at 690 nm (21) (Fig. 2, B and C). The model is described by
where Y (t) is the conversion fraction of the crystalline phase at time t and t0 is the onset time for the appearance of the perovskite signal. The crystallization rate constant K reflects the growth speed of perovskite crystals, and the Avrami exponent n reflects the effective
−K(t−t0)
Y(t) = 1 −e
nucleation- growth mode, including contributions from nucleation behavior and growth dimensionality. K varied from 0.048 s−1 at the leading edge, to 0.026 s−1 at the midpoint, and further declined to 0.008 s−1 near the trailing edge (Fig. 2D, fig. S20, and table S2). This pronounced gradient originates from position- dependent delays in phase transformation initiation during annealing driven by different processing window before annealing. For the phase- locked, stabilized α- phase perovskite, the crystallization rates of the corresponding posi- tions became statistically indistinguishable (0.005, 0.004, and 0.003 s−1), resulting in high spatial uniformity (22).
Industrial- scale fabrication requires extended deposition time as substrate area increases (23, 24). By extending the process window for untreated films for an additional 40 s, which exceeds operational limits (Fig. 1D), we observed a progressive decline in PCE along the coating direction (Fig. 2, E to G, and figs. S21 and S22) that reflected perovskite degradation. By comparison, devices fabricated using a phase- locking strategy maintained narrower and higher distribution of PCE through different process windows. Optical microscopy confirmed uniform optical characteristics across the film (fig. S23), whereas scanning electron microscope (SEM) and x- ray diffraction (XRD) analyses of 16 selected regions revealed a 149% increase in average grain size with reduced dispersion (SD = 0.077 versus 0.112 in controls) (figs. S24 to S26 and table S3) and suppressed residual PbI2 (peak intensity ratio: 0.060) with enhanced α- FAPbI3 crystallographic alignment (13, 25) (fig. S27 and table S4).
Device photovoltaic performance and reproducibility The performance of PSCs depends of the structural integrity of octa- hedral [PbI6]4– frameworks. In high- quality perovskite crystals, Pb–I bonds exhibit minimal variation in lengths and angles, which reduces structural defect density. With the phase- locking strategy, blade- coated 10 cm by 10 cm perovskite film was more homogeneous and showed stronger photoluminescence (PL) intensity than the control film (Fig. 3A), indicating a decreased density of trap states, as also confirmed by the trap density of states spectra (26) (fig. S28A). Linear fitting of the peaks of deep- level transient spectroscopy (DLTS) in Arrhenius plots yielded the trap depth (effective energy) (Fig. 3B and note S6) (27, 28). The control device had a shallow trap D1 trap of 0.376 eV and two deeper p- type trap states, D2 at 0.421 eV and D3 at 0.582 eV above the valence band maximum, whereas the target device exhibited only one single p- type shallow trap at 0.225 eV. The capture cross- sections of the con- trol were 2.09 × 10−15 cm2 (D1), 4.82 × 10−15 (D2), and 1.08 × 10−12 cm2 (D3) compared with 1.53 × 10−19 cm2 for D1 of the target. Deeper D2 and D3 traps in the control device contributed to the degradation by ambient scalable processing. The D1, D2, and D3 traps in the control device reached defect densities of 8.35 × 1016, 2.07 × 1014, and 4.03 × 1015 cm−3, respectively, whereas the target device only showed 1.07 × 1011 cm−3 (Fig. 3E).
Reduced leakage currents in dark current density–voltage (J–V) characteristics and near- ideal behavior in the target devices showed that nonradiative recombination was mitigated (29). Light- dependent open- circuit voltage (VOC) slopes decreased from 1.73 to 1.26 kBT/q (where kB is the Boltzmann constant, T is the temperature in Kelvin, and q is the elementary charge) and short- circuit current density (JSC) linearity improved from 0.995 to 0.985 (fig. S28, B to D, and note S7). Time- resolved PL revealed extended carrier lifetimes (1022 to 13234 ns), and transient photovoltage/transient photocurrent decays showed enhanced recombination lifetimes and accelerated extraction kinetics (30, 31) (fig. S28, E to G, and table S5). Electrochemical impedance spectroscopy and Mott- Schottky measurements further corroborated reduced recombination resistance and enhanced built- in electric field (Vbi) (25, 32) (fig. S28, H and I).
Blade- coated single cells and modules were fabricated (photovoltaic characterizations of champion devices are shown in fig. S29A, and distribution characteristics are shown in fig. S29, B to E, and tables S6
and S7). For small- area devices (≤0.08 cm2), champion target cells achieved a PCE of 26.7% (Fig. 3F, fig. S30, and table S8) with a certified value of 26.10% (fig. S31). This device also demonstrated a stabilized power output of 26.57% and exhibited excellent agreement between the integrated current density and external quantum efficiency mea- surements (fig. S32). When scaled to 1.01 cm2, the PSCs maintained a champion PCE of 24.5% (fig. S33), representing low- efficiency loss compared with the 0.08- cm2 device.
Furthermore, the phase- locking strategy ensured homogeneous perovskite morphology across large areas, thus mitigating current mismatch among individual cells that compromise PSM performance (18). We fabricated 25- cm2 (16.8 cm2 of aperture area) and 100- cm2 (79.0 cm2 of aperture area) rigid modules that exhibited champion PCE values of 23.2 and 21.5%, respectively (Fig. 3G, figs. S34 to S36A, and table S8). A flexible PSM achieved 19.5% PCE at 100 cm2 with 91.29% retention after 10,000 bending cycles (figs. S36B and S37 and table S8). In addition, this strategy exhibited excellent compatibility with carbon electrodes and yielded 16.04% PCE in a 100- cm2 carbon- based hole- transport layer–free module (Fig. 3H, figs. S36C and S38, and table S8). These results compare favorably with other two- step scalable perovskite photovoltaics (Fig. 3I and table S9) and with the one- step strategy in terms of PCE (fig. S39 and table S10).
An average VOC contribution of 1.168 V per subcell for the modified module (Fig. 3, J and K, and table S11) closely matched the 1.20 V obtained from small- area blade–coated PSCs (0.08 cm2), indicating minimal voltage loss during scaling. Notably, the module achieved a high JSC of 201 mA, reflecting uniform current extraction across all subcells. By contrast, the control module with inferior film homogene- ity suffered from pronounced voltage loss as the number of subcells increased.
Reproducible PSCs fabricated under varying high RH ambient condi- tions are a prerequisite for their commercialization (33). Here, for con- ventional two- step processing, average PCE declined by >51% (1.01- cm2 cells) and >63% (16.8- cm2 modules) with widened performance distri- butions as the RH increased from 20 to 60% (fig. S40 and table S12). Complete performance failure occurred at 75% RH due to inhibited α- phase formation (Fig. 1B). The phase- locking strategy enabled con- sistent device performance between 15 and 75% RH: maintaining 20.15% PCE (1.01- cm2 cells) and 18.1% PCE (16.8- cm2 modules) up to 75% RH.
Effect of homogeneity on the stability of large- area perovskite films For practical applications, ambient temperature variations induce se- vere ion migration and phase transitions in perovskites, whereas mis- matched thermal expansion generates cyclic thermomechanical stress, ultimately causing lattice degradation and deterioration of device performance (34). After annealing, TMPU formed an intergranular network (fig. S41) that improved intrinsic stability under damp- heat conditions (figs. S42 to S44) and suppressed ion migration (35–37) (fig. S45). Moreover, XRD analysis revealed progressive decomposition in control films, characterized by an increase in PbI2 diffraction at 12.6° alongside a diminished perovskite signal at 13.9° (Fig. 4A). By contrast, target perovskite films demonstrated exceptional structural stability over 35 thermal cycles (–40° to 85°C) and maintained α- phase crystallinity with minimal phase degradation (Fig. 4B, fig. S46, and note S8).
The PCE of encapsulated devices followed a similar trend. Five con- trol devices maintained an average of 72.2% of their initial perfor- mance after 550 cycles between –40° and 85°C. By contrast, target devices under thermal cycling tests maintained 97.3% of their ini- tial PCE and exceeded the IEC 61215 requirement of a 5% drop after 200 cycles (fig. S47, A to C, and table S13). Optical images further re- vealed a pronounced degradation gradient along the coating direction in control perovskite films, in which initially coated regions degraded
Fig. 3. Photovoltaic performance of perovskite devices. (A) PL mapping images of 10 cm by 10 cm perovskite films. (B) Arrhenius plots were used to identify traps in control and target devices. Data points were obtained by calculating the internal transients included in the DLTS signal using discrete Laplace transform. (C) Corresponding capture cross- section of defects representing the probability of energy levels capturing electrons. (D) Trap density obtained by the fitted DLTS spectra. (E) Schematic illustration of deep- level traps within the bandgap. The position and height of the peaks correspond to the depth and density of the D1, D2, and D3 traps, respectively. EC denotes the conduction band minimum, and EV denotes the valence band maximum. (F) J–V curves for the champion small- area PSCs (0.08 cm2). (G and H) J–V curves of the champion rigid, flexible modules (G) and carbon- based modules (H) (79.0 cm2). (I) PCE comparison of rigid devices as a function of the area from this work and recent representative reports (table S8) using a two- step scalable deposition method. (J and K) J–V characteristics with different subcells for control (J) and target (K) modules.
Fig. 4. Stability of large- area perovskite films and modules. (A and B) XRD patterns for control (A) and target (B) perovskites during thermal cycling (–40° to 85°C).
(C) Schematic of monolithic and segmented aging in large- area perovskite films. (D and E) Corresponding PL mappings (D) and PCE evolution (E) for encapsulated devices
(1.01 cm2) under 1- sun maximum power point tracking following the ISOS- L- 2 (85°C, ambient air) protocol. (F) Damp- heat stability (85°C/85% RH, dark) of encapsulated PSMs
and recent representative reports (table S15). Data points represent mean ± SD (n = 5; this work).
faster than the later- coated regions (fig. S47D). Such heterogeneity originated from the process window inherent to this printing tech- nique. Specifically, the prolonged process window in early- coated re- gions generated higher defect densities and inferior crystal quality after annealing (proved in figs. S24 to S27), creating preferential deg- radation pathways. Critically, degraded regions with PbI2 accumula- tion function as catalytic centers that spread decomposition to adjacent areas, ultimately establishing an autocatalytic aging mecha- nism across the nonuniform films (38–41).
To confirm this hypothesis here, two aging protocols were per- formed for blade- coated perovskite films: monolithic aging, in which intact perovskite films were subjected to continuous aging, and seg- mented aging, in which perovskite films were presegmented into isolated regions before aging (Fig. 4C). PL mappings at three repre- sentative positions (early- , center- , and late- coated, corresponding to positions 1, 5, and 9, respectively, in Fig. 4C) were used to track the aging progression and revealed fundamentally different degrada- tion pathways between protocols (Fig. 4D). Under monolithic aging at 60°C, the control films exhibited rapid PL intensity quenching at
all monitored locations, with peak intensity dropping by >40% within 38 days (figs. S48 and S49). Notably, a disparity in degradation rate was observed along the coating direction, with position 1 degrading 1.47 times faster than position 9. Under segmented aging at 60°C, al- though similar overall PL intensity decrease occurred, positions 5 and 9 showed slower degradation compared with their monolithic coun- terparts. This spatial heterogeneity originated from the extended pro- cess window at position 1 during blade coating, which yielded inferior crystal quality and more PbI2 residue. These PbI2- rich regions served as catalytic sites that promoted perovskite decomposition and facili- tated ion migration.
Corresponding PCE evaluation confirmed these trends (fig. S50). Under monolithic aging, control devices showed severe position- dependent degradation, with PCE retention rates of only 34.46, 42.3, and 50.44% at positions 1, 5, and 9, respectively. This positional depen- dence persisted under segmented aging, with retention rates of 36.1, 50.9, and 64.8% at the same locations. By contrast, phase- locked films maintained >84% of their initial PL intensity across all regions under both aging protocols, with consistent degradation kinetics (figs. S48 and
To validate the practical efficacy of our approach, devices were evaluated under the ISOS- L- 2 protocol. The target device exhibited simi- larly high stability, preserving >90% of its initial PCE after 1500 hours of maximum power point tracking (42) (Fig. 4E and fig. S51). In addition, we subjected n- i- p devices to the ISOS- D- 3 industrial standard damp- heat test (85°C and 85% RH). The target cells demonstrated excep- tional operational stability, retaining 90.73% of their initial efficiency after 2000 hours of continuous aging (fig. S52 and tables S14 and S15). To further enhance stability by suppressing ion migration from the transport layer and Ag electrode (43–45), the corresponding hole- transport layer–free carbon electrode module was encapsulated. The encapsulated module retained 90.05% of its initial efficiency after 2300 hours of aging (Fig. 4F, fig. S53, and table S16). These findings confirm the effectiveness of our phase- locking strategy for stabilizing perovskite optoelectronics under demanding conditions, representing a critical advancement from laboratory- scale devices toward industri- ally viable modules.
Discussion We have demonstrated spatiotemporally uniform α- phase perovskite crystallization through an ambient scalable fabrication enabled by a phase- locking strategy. This approach directly links crystallization kinetics with both environmental robustness and large- area homoge- neity. By simultaneously suppressing hydration- driven phase transforma- tions and establishing a dynamic intergranular network, our method effectively prevents premature degradation in early- deposited pe- rovskites while also eliminating directional inhomogeneity across a large- area substrate (100 cm2). Therefore, this two- step scalable pro- cess yields high- PCE PSCs and modules and has outstanding opera- tional stability. This breakthrough establishes a reliable pathway for advancing perovskite photovoltaics toward commercially viable, high- performance applications.
REFERENCES AND NOTES
National Laboratory of the Rockies, “Best research- cell efficiency chart” (NREL, 2026);
L. Lang et al., Adv. Energy Mater. 15, 2405423 (2025).
ACKNOWLEDGMENTS Funding: This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (grant 52373186 to L.T. and grant 52527804 to Y.C.). Author contributions: B.G., Y.Z., and L.T. conceived the idea. B.G. designed the experimental protocol, fabricated the devices, and conducted relevant characterizations. X.L. conducted the in situ characterization of perovskite films. Y.Z., J.H. J.G., and Y.L. provided helpful suggestions on the optimization of PSCs and PSMs. X.L. and J.H. characterized the various photoelectric properties for the perovskite devices. X.W. conducted the stability characterization and application demonstration experiments. L.T. and Y.C. supervised the project. B.G. and Y.Z. drafted the original manuscript. L.T. and Y.C. finalized the manuscript. All authors discussed the results and contributed to the writing of the manuscript. Competing interests: B.G., Y.Z., J.G., L.T., and Y.C. are inventors on a patent application related to this work filed by Nanchang University. The remaining authors declare no competing interests. Data, code, and materials availability: All data needed to evaluate the conclusions in the study are available in the main text or the supplementary materials. Source data and key quantitative analyses are available at Zenodo (46). License information: Copyright © 2026 the authors, some rights reserved; exclusive licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original US government works. https://www.science.org/about/science- licenses- journal- article- reuse
SUPPLEMENTARY MATERIALS science.org/doi/10.1126/science.aef1969 Materials and Methods; Notes S1 to S8; Figs. S1 to S53; Tables S1 to S16; References (47–88); Movies S1 and S2
10.1126/science.aef1969
Submitted 6 January 2026; accepted 2 June 2026
Robust single- electron memory with quantum states manipulation
Chunsen Liu1†, Yutong Xiang1†, Chong Wang1, Peng Zhou1,2
The ultimate goal of information storage is single- electron memory. Quantum mechanics predicts that two distinguishable quantum states can be realized by confining a single electron within an ultrasmall space. However, scaling down such devices paradoxically amplifies fringe capacitance effects, which hinders the experimental observation of single- electron memory. We report a two- dimensional single- electron memory device based on a coplanar drain- channel- source structure that suppressed fringe capacitance, exhibiting a nonvolatile threshold voltage shift of 0.5 volts after the change of a single electron. Two intriguing quantum behaviors have also been verified regarding the programming voltage. Additionally, we have predicted and observed a distinctive quantum memory effect: A quantum state is cut off by density of states scissors.
The electron storage constitutes the foundation of information storage in modern electronic systems (1), and its principle is the precise spatial control of electrons. The ultimate goal of electron storage is to achieve single- electron memory, which can only be realized in an ultrasmall device (2, 3). The mainstream semiconductor nonvolatile electronic memory uses a transistor structure that inserts a storage layer (SL) into the dielectric, known as flash memory (4), whose stored electrons are expressed as Q = Cox × ΔVth, where Cox is the capacitance between the SL and the gate, and ΔVth is the threshold voltage shift caused by the stored electrons (5). The underlying mechanism of single- electron memory can be explained by quantum mechanics (6, 7): Because Q is an integer multiple of the elementary charge (e) (8), ΔVth should also be an integer multiple of the minimum ΔVth value between adjacent quantum states (denoted as ΔVth quantum). According to the above theory, the value of ΔVth quantum is ±V* = ±e/Cox, and the sign indi- cates that a single electron is removed from (negative) or moved into (positive) the SL. However, for a large- size device, the large capacitance results in an extremely small ΔVth quantum, and only continuous states can be observed (9, 10). When in a small size, the capacitance is re- duced to a magnitude comparable with the elementary charge, and the value of ΔVth quantum can be effectively increased, exhibiting quantized ΔVth. Although the physical image of single- electron mem- ory is clear in theory, it remains challenging to experimentally realize stable, distinguishable quantum memory.
The fundamental physics of single- electron memory is the reduction of capacitance through miniaturization. In the late 20th century, much research was aimed at achieving this, such as using silicon nanocrystals or quantum dots as the SL (11–14). These nanomaterials provide techni- cal pathways for observing single- electron memory. A great advance- ment was realized with the introduction of a nanoscale polysilicon dot, which enabled the observation of a small ΔVth quantum of 55 mV at room temperature (15). However, to avoid the impact of the large gate- channel fringe capacitance caused by the thickness of the silicon chan- nel, an ultrathin tunneling layer (1 nm) was used, resulting in only a 5- s retention time. Therefore, the gate- channel fringe capacitance remains
1State Key Laboratory of Integrated Chips and Systems, College of Integrated Circuits and Micro- Nano Electronics, Frontier Institute of Chip and System, Fudan University, Shanghai, China. 2Shaoxin Laboratory, Zhejiang, China. *Corresponding author. Email: chunsen_liu@ fudan. edu. cn (C.L.); pengzhou@ fudan. edu. cn (P.Z.) †These authors contributed equally to this work.
a limitation for single- electron memory, reducing the value of ΔVth quantum and rendering quantum states indistinguishable and unstable. According to Heisenberg’s indeterminacy principle in quantum mechan- ics, when space or time is compressed to an extremely small scale, the energy and momentum of matter begin to fluctuate substantially (16, 17), enhancing the observability of quantum behavior. Owing to atomic- thin thickness, two- dimensional (2D) materials naturally provide the ulti- mate spatial dimension confinement in thickness (18, 19), offering a promising platform for exploring quantum phenomena.
In this study, we produced a 2D single- electron memory device based on a coplanar drain- channel- source (DCS) structure with a self- aligned gate- SL- channel and edge contact, suppressing the fringe capacitance. It exhibited a nonvolatile ΔVth quantum of 0.5 V at room temperature (where the thermal energy is around 0.0259 eV). Furthermore, it showed two intriguing quantum behaviors that are entirely different from mac- roscopic memory behaviors: (i) The minimum programming voltage required to reach each state was quantized, with an interval of ±Vth* between adjacent states, and (ii) the ΔVth was irrelevant to the program- ming voltage pulse duration. Additionally, we developed a density- of- states scissors (DOS- scissors) theory that predicted the vanishing of quantum state, subsequently verified with experiments in a self- aligned dual- Dirac structure. To our knowledge, it is a quantum memory effect that has never before been reported.
Results and discussion Single- electron memory theory and fringe capacitance effect An example of single- electron removal is discussed here. In an ideal single- electron memory device (Fig. 1A), when a negative programming gate- source voltage (VGS) was applied to the gate, and the source and drain were grounded, electrons could be removed from the SL by means of the Fowler- Nordheim (FN) tunneling mechanism (5, 20). This con- figuration contained the gate- SL capacitance (Cox) and the SL- channel capacitance (Ctunnel), and fringe capacitances between any two terminals (gate, drain, source, and channel) were absent. Specifically, when the programming VGS decreased to –VGS0, the removal of the first electron resulted in the decreased ΔVth value of V*, determined by
e Cox. As the programming VGS became more negative, the ΔVth remained unchanged until the programming voltage reached –(VGS0 + V), at which point the next electron was removed, resulting in a further decrease in the ΔVth with a value of V. In this process, the ΔVth value is an integer multiple of –V, and the minimum programming voltage required to reach each state is quantized in steps of –V. A detailed analysis is provided in the supplementary materials (SM). The single- electron memory exhibited a staircase- like variation in ΔVth when different programming VGS am- plitudes were applied.
The physical process of single- electron memory is shown in Fig. 1B. As the programming VGS decreased, the storage layer potential (VSL) decreased linearly with a slope of
Cox Cox + Ctunnel [gate coupling ratio (GCR)]. Once the programming VGS and VSL reached sufficiently negative volt- ages (denoted as –VGS0 and –VSL0) to trigger the first FN tunneling, the removal of an electron led to an abrupt jump in the VSL by e
CΣ, where CΣ is the total capacitance (Cox + Ctunnel). If the small CΣ approached the value of e, the large increase in VSL would notably reduce the strength of the electric field within the tunneling layer, which prevented the removal of the next electron, which is known as the Coulomb blockade (21). Only when the programming VGS further decreased to –(VGS0 + V*) and VSL returned to –VSL0 did the electric field strength meet the thresh- old for FN tunneling again, triggering the removal of the next electron (fig. S1). Consequently, the VSL exhibited a sawtooth- shaped variation with the programming VGS variation.
To investigate the underlying constraints in experimentally realizing quantum memory, we analyzed a single- electron memory model with bulk channel materials (Fig. 1C). In this structure, there was an inevi- table fringe capacitance (Cfrg) between the gate and channel sidewalls because of the thickness of the bulk channel. Consequently, the absolute
Fig. 1. Single- electron memory theory and fringe capacitance effect. (A) ΔVth versus programming VGS amplitudes in a single- electron memory device. (Inset) Schematic diagram of this device, showing the capacitances between the gate and SL (Cox) and between the SL and channel (Ctunnel). There is no fringe capacitance between any two terminals (gate, drain, source, and channel). (B) Storage layer potential (VSL) versus programming VGS amplitudes. The red arrow indicates that when the VSL reaches the critical voltage required to remove an electron from the SL, there is an abrupt increase in the VSL (the increased value is e
C D
CΣ, where CΣ = Cox + Ctunnel).
The orange line indicates the critical voltage
required to remove an electron from the SL.
(Inset) The removal of one, two, and three
electrons from the SL, respectively (right to left).
(C) Schematic diagram of a silicon single-
electron memory device. The fringe capacitance
(Cfrg) between the gate and channel leads to
the value of ΔVth quantum being much smaller
than V. (D) The ratio of ΔVth quantum to V
versus SL areas. As the device area scales down,
the fringe capacitance effect is intensified.
Reducing the channel thickness (tch) drives the
value of ΔVth quantum closer to V*, suppressing
the fringe capacitance effect. The black dashed
line indicates the ratio where Cfrg = 0.
value of ΔVth quantum was given by e
illustrated that the introduction of Cfrg reduced the ΔVth quantum to a much smaller value than Vth*. Generally, scaling down the SL area could lead to a larger ΔVth quantum (fig. S2). However, our findings indicated that the fringe capacitance effect was simultaneously strengthened as the device area shrank (Fig. 1D). Consequently, reducing the device area alone was insufficient to achieve a large ΔVth quantum, and the intrinsic channel thickness (tch) was the hidden yet decisive factor. The specific simulation parameters are detailed in the SM. Consequently, 2D materi- als, typically with a thickness below 1 nm, emerge as suitable candidates for studying single- electron memory.
A 2D single- electron memory device based on a coplanar DCS structure Considering the distinguishing quantum memory measurement, 2D semiconductors are typically susceptible to edge scattering in an extremely small space (22), and graphene with high carrier mobility exhibits more stable transport. We demonstrated that a graphene transistor with a 20- nm channel width produced smooth transfer curves and maintained a low ΔVth noise of about ±0.05 V (fig. S3A), providing the stability required for distinguishing quantum mem- ory measurement. Other 2D semiconductor devices, such as MoS2 transistors, suffered from more fluctuations in transfer curves when the channel width decreased below 50 nm (fig. S3B), a trend that was consistent with previous reports (23, 24). Therefore, we have fabricated a 2D single- electron memory device using a graphene channel instead of 2D semiconductors. The schematic structure design of our device is shown in Fig. 2A. We adopted a coplanar DCS design to eliminate any parasitic capacitance between the gate, drain, source, and channel. In this coplanar DCS structure, the channel region was self- aligned to the gate region, and the remain- ing graphene regions were defined as the 2D drain/source regions on the same plane. To avoid introducing the metal contact sidewalls,
Cox + CΣ Ctunnel Cfrg (2). This result clearly
the drain/source electrodes were implemented by means of edge contacts positioned far from the 2D channel region. Because of the self- aligned gate- SL- channel structure and the 2D drain/source design, the influence of Cfrg was reduced to only around 2.4%, ren- dering it negligible (fig. S4). To further improve the stability of the memory window, the memory stack should be carefully designed. Hexagonal boron nitride (hBN) has been demonstrated to be a good encapsulation material (25), and its low dielectric constant can also facilitate FN tunneling (26). Therefore, we used bottom hBN encap- sulation to improve the stability of electron transport in ultrasmall dimensions and used top hBN as the tunneling layer. The Al2O3 was used as the blocking layer, and the interface between the Al2O3 and the top hBN acted as the SL. The specific device fabrication processes and characterizations are detailed in figs. S5 and S6. The transmission electron microscopy images confirmed our device design and showed an atomically flat interface in the heterostructure.
The energy band diagram for single- electron removal is shown in Fig. 2B. When a negative programming gate voltage VGS,prog was ap- plied, it was distributed across the blocking layer, tunneling layer, and graphene channel, resulting in respective voltage drops of Vox, Vtunnel, and Vch; μini was the initial chemical potential of graphene. The flat- band condition is provided in fig. S7. In Fig. 2, C and D, we illustrate the quan- tum behavior of the 2D single- electron memory device at room tempera- ture. Each programming process began from the original state, and electrons were removed from the SL under negative programming gate voltages, with the drain and source grounded (Fig. 2C). Because the area of our designed SL was approximately 400 nm2 and the Cox was about 0.32 aF (fig. S8B), the removal of one electron was expected to generate a memory window of –0.5 V (–V*), which supported robust quantum observation at room temperature. As the programming VGS decreased from –28.6 V to –30 V in steps of –0.1 V, one, two, and three electrons were removed at programming VGS ranges of –28.8 to –29.2 V, –29.3 to –29.7 V, and –29.8 to –30 V, resulting in the ΔVth values of approximately –0.5, –1, and –1.5 V, respectively. The relationship between ΔVth and
Fig. 2. Room- temperature 2D single- electron
memory device. (A) Schematic diagram of the 2D
single- electron memory device based on a coplanar
DCS structure. The transmission electron
microscopy images show the self- aligned gate-
SL- channel structure and edge contact. Scale bars,
5 nm. The gate length is around 20 nm, and the
thickness of top hBN, graphene, and bottom hBN
are 5 nm, bilayer, and 11 nm, respectively. (B) Energy
band diagram of removing electrons in the 2D
single- electron memory device. The left and right
graphene represent the initial state and the state
under an applied gate voltage (VGS,prog), respec-
tively. The red area within the graphene indicates
the electron- occupied states, and the green area of
the tunneling layer indicates where the electric field
reaches the threshold for FN tunneling. Vch, Vtunnel,
and Vox are the voltage drops across the channel,
tunneling layer, and blocking layer, respectively;
μini is the initial chemical potential of graphene.
(C) Transfer curves before and after applying
different programming VGS amplitudes in the 2D
single- electron memory device. The device was
programmed from its original state (black dashed
line) by using a 30- ns programming pulse duration,
with the grounded drain and source, and at room
temperature (RT). (D) ΔVth versus programming
VGS amplitudes, including (left) the removal of single
electrons from the SL [extracted from (C)] and
(right) the movement of single electrons into the SL.
Different colored spheres indicate different ΔVth
quantum numbers (Nth), and the dashed line
indicates the average ΔVth values for each quantum
state. The device was measured at RT and
programmed with a 30- ns pulse duration.
B
differ ent programming VGS amplitudes is shown in Fig. 2D. To label each quantum state, we defined the ΔVth quantum number (Nth) as an integer multiple of ΔVth quantum, which was estimated by
V ∗ , where Vth,prog is the Vth of the programmed quantum state, and Vth,ref is the Vth of the reference state. We found that the value of ΔVth quantum was around –0.5 V (–V) for removing single electrons, and the interval of the minimum programming voltage between adjacent states exhib- ited the same value, demonstrating that the Cfrg was suppressed in this structure. Furthermore, we also observed the quantized ΔVth of 0.5 V (V) after a single electron moved into the SL, showing similar quantum be- havior (Fig. 2D, right). To confirm the robustness of these findings, we also demonstrated the reproducibility of our 2D single- electron memory (figs. S9 to S12). And for a large- size memory device (SL area = 2 μm2), the ΔVth showed a continuous change at different programming voltages (fig. S13).
Another intriguing quantum phenomenon is shown in Fig. 3A. When the programming VGS amplitude was set to remove zero, one, or two electrons [Nth (0), Nth (–1), Nth (–2), respectively], the ΔVth values re- mained almost the same when the programming pulse duration varied from 20 to 90 ns at room temperature. The pulse duration was defined by the full width at half maximum as measured with an oscilloscope (fig. S14). It demonstrated the quantum phenomenon of self- limiting programming, in which the ΔVth showed no dependence on the
Vth,prog −Vth,ref
programming pulse duration. It was different from the positive cor- relation between ΔVth and programming pulse duration in large- size flash memory (27, 28). As shown in Fig. 3B, we confirmed the non- volatile data retention capacity of the 2D single- electron memory device. The stability of quantum states was evaluated at room temperature. Transfer curves were measured at different time intervals, and ΔVth was extracted to demonstrate that the device remains stable even after 5000 s (fig. S15, C to F).
We then made a comparison of the absolute value of ΔVth quantum across various room- temperature single- electron memory devices (Fig. 3B), including industrial products (29, 30), academic research that used quantum dots (13), and nanoscale polysilicon (15, 31) as the SL. Our 2D single- electron memory device exhibited a large ΔVth quantum of 0.5 V, supporting the robust observation of quantum states.
Amending single- electron memory theory for graphene- channel device The existing single- electron memory theory is based on the traditional semiconductor channel. However, it is well known that graphene has a linear band dispersion and zero DOS at the Dirac point, which renders graphene incapable of accepting or providing electrons under spe- cific conditions. Therefore, the single- electron memory theory should be amended to predict emerging phenomena. According to previous work, the capacitance of graphene channel (Cch) could be estimated as
B
Fig. 3. Robustness and nonvolatility of 2D
single- electron memory device. (A) ΔVth
versus programming VGS duration in the 2D
single- electron memory device. The three
quantum states were realized by the programming
VGS of –28.6, –29, and –29.5 V, corresponding
to Nth (0), Nth (–1), and Nth (–2), respectively.
(B) ΔVth versus retention time of different
quantum states in the 2D single- electron memory
device. The device was programmed by VGS of
–28.6, –29, –29.5, and –30 V, respectively, with a
30- ns pulse duration. The colored dashed lines
indicate the linear extrapolation of the data to
10 years. (C) Comparison of ΔVth quantum
values in different reported room- temperature
single- electron memory devices. There are three
areas: industrial products of Micron (29) and
Samsung (30) (blue area); single- electron
memory devices using nanomaterials as the SL,
like the quantum dot (13) and silicon nanocrystal
(15, 31) (green area); and 2D single- electron
memory devices of this work (red area).
)2]
)2]
(2)
Cch = kchμ (32); the charge of graphene channel (Qch) was given by Qch = 1
2kchμ2, determined by its DOS, where μ is the chemical potential (potential difference between the Fermi level and the Dirac point),
kch = 2e3S
2, S is the graphene channel area, ħ is Planck’s constant h
π(ℏvF)
divided by 2π, and vF is the Fermi velocity (33). Our experimental results verified the linear capacitance characteristic of graphene. Owing to the greater DOS, few- layer graphene exhibited a larger kch of 0.33 F/(V·m2), compared with that of monolayer graphene, which had a kch of 0.23 F/ (V·m2) (fig. S17). This linear capacitance provided the basis for construct- ing our amended single- electron memory theory and for predicting distinctive quantum memory behavior. On the basis of the above infor- mation, we began to establish our theoretical model to describe single- electron memory behaviors in graphene- channel devices. Of par- ticular importance was how the applied VGS,prog modulated the Vch and Vtunnel. A higher proportion of the gate voltage dropping across the channel enhanced the impact of the graphene layer on single- electron memory dynamics. The Vtunnel was the decisive factor determining whether the FN tunneling occurred.
The single- electron removal is described here as an example. According to the charge conservation principle of the gate- channel parallel- plate capacitor, any increment or decrement in charge on the positive plate must be mirrored by an equal change on the negative plate. In consideration of our experimental data, the pro- gramming voltage required to remove the first electron was –28.8 V, at which point the graphene channel was strongly p- type. Therefore, we could get the relationships between Vch, Vtunnel, and Vox. The com- prehensive analytical derivation can be found in the SM. Meanwhile, the voltage distribution across the dielectric layers is governed by the series capacitance model. Combining the above relationship, we could obtain
VGS,prog = Vch −Vch,fb −
(Ctunnel +Cox
)kch 2CtunnelCox
[(μini −Vch
[(μini −Vch
)2 +(μini −Vch,fb
)2 +(μini −Vch,fb
Vtunnel = Vtunnel,fb − kch 2Ctunnel
where Vtunnel,fb and Vch,fb are the built- in potential of the tunneling layer and graphene channel, respectively, arising from work- function differences at VGS,prog = 0 V. According to Eqs. 1 and 2, a quantitative result could be obtained to describe how the applied VGS,prog modu- lated the Vch and Vtunnel. Considering that the transition of graphene from n- type to p- type required the Fermi level to cross the Dirac point, the graphene capacitance became small when the Fermi level was close to the Dirac point. It reached a finite minimum value, leading to a capacitance saturation region ( | μ | ≤ | μsaturation | ), where μsaturation was the chemical potential at which the graphene capacitance reached its minimum value. Our experimental results showed μsaturation = ±0.09 V for monolayer graphene and ±0.07 V for few- layer graphene (fig. S17D), which was consistent with previous work (34). After considering the graphene capacitance saturation effect, we got the final quantitative relationship between VGS,prog, Vch, and Vtunnel (figs. S18 to S20). Our computational results demonstrated that when the graphene channel was strongly p- type and far from the capacitance saturation region, its capacitance greatly exceeded both Cox and Ctunnel. Under this condi- tion, the increment of the programming voltage ( | VGS,prog | − | VGS0 | ) was linearly distributed across Cox and Ctunnel according to the GCR. Consequently, approximately –0.47 V of programming voltage was consumed by the graphene channel before the first electron removal. Further decreasing the programming voltage rendered the influence of graphene channel capacitance negligible, resulting in experimental results that were consistent with existing single- electron theory.
DOS- scissors theory development and anomalous quantum memory observation In the aforementioned experiment, we used graphene as the chan- nel, yet no distinctive quantum memory behavior was observed because the large negative programming voltage strongly p- doped the graphene channel, shifting its Fermi level far from the Dirac
e
Fig. 4. Vanishing of quantum state enabled by a dual- Dirac structure design. (A) (Top) Device schematics and (bottom) energy band diagrams of the dual- Dirac structure under various programming VGS amplitudes. From left to right, the programming VGS is –VGSn (before the electron removal), –VGSn (after the electron removal), –(VGSn + V), and –(VGSn + 2V), respectively. In the energy band diagrams, the red area within the graphene indicates the electron- occupied states, and the green area of the tunneling layer indicates where the electric field reaches the threshold for FN tunneling. The thickness of each layer is shown schematically to highlight the change in the energy band of SL- graphene. (B) ΔVth versus programming VGS amplitudes in the dual- Dirac structure. The blue and red spheres indicate electron removal and addition processes, respectively. The shaded blue and red regions indicate the anomalous quantum behavior: The interval of the minimum programming voltages between the two quantum states Nth (–6) and Nth (–8) is about ±2V* (±0.6 V), and the sign indicates whether a single electron is moved into (positive) or removed from (negative) the SL- graphene. The dashed line indicates the average ΔVth values of each quantum state. The device was measured at 10 K and programmed with a 30- ns pulse duration.
(
Eg
)
(3)
point. However, when graphene was used in the SL, the SL- graphene experiences weaker gate controllability. Therefore, the Fermi level of the SL- graphene can be modulated close to the Dirac point, at which the DOS approaches zero. In addition, considering the quan- tum confinement effect, a finite bandgap (Eg) opens in the ul- trasmall graphene (35), effectively broadening the zero- DOS region. This zero- DOS region could potentially trigger distinct quantum memory phenomena.
On the basis of the above insights, we developed a DOS- scissors theory to further manipulate quantum states and explore a distinc- tive quantum memory effect. Using the dual- Dirac structure as a representative model, we maintained the same blocking layer, tun- neling layer, encapsulation layer, and channel as depicted in Fig. 2A but incorporated graphene as the SL. Unlike the graphene- channel– alone model, the SL- graphene introduced additional voltage division effects. To accurately describe the device physics, we aimed to obtain the relationship between Vtunnel and VGS,prog. Taking single- electron removal as an example, the comprehensive analytical derivation can be found in the SM. Before the first electron was removed from the SL- graphene, we could get the quantitative relationships between VGS,prog, Vch, and Vtunnel (fig. S22). As the programming VGS continued to decrease, the sequential removal of electrons drove the Fermi level of the SL- graphene steadily downward. Once the Fermi level entered the zero- DOS region, the SL- graphene could no longer pro- vide available electrons for FN tunneling. To cross this zero- DOS region and trigger the next electron removal, the required program- ming voltage increment, based on the capacitance division relation- ship, could be estimated as:
ΔVGS,prog = −
where CSL denotes the saturation capacitance of the SL- graphene within the zero- DOS region. This phenomenon represented the anomalous quantum memory effect, which originated from the DOS- scissors.
To provide a clearer physical intuition of the anomalous region, we illustrated the corresponding energy band diagram (Fig. 4A). When a programming voltage of –VGSn was applied, the (n + 1)- th electron was removed by means of FN tunneling. At this point, the channel became p- type as discussed before, and the SL- graphene was weakly n- type owing to the voltage distributed among different layers. After the removal of the (n + 1)- th electron, the VSL increased, leading to a decreased electric field within the tunneling layer, which inhibited the removal of the next electron, known as the Coulomb blockade. As the programming voltage decreased to –(VGSn + V), a SL material with a high DOS (such as metal) would typically allow the removal of the next electron because the VSL returned to the critical voltage for FN tunneling. However, for graphene as the SL, the Fermi level lay within the zero- DOS region. Because of the lack of available electron states, the SL- graphene could not provide elec- trons for tunneling, preventing the removal of the (n + 2)- th elec- tron. Therefore, an additional programming voltage (such as –2V) was required to shift the Fermi level beyond this zero- DOS region, triggering subsequent tunneling. When the programming voltage reached –(VGSn + 2V), the voltage increment of –2V partitioned into two effects: shifting the Fermi level of SL- graphene out of the zero- DOS region and enhancing the tunneling electric field, which
1+ CSL Ctunnel
Cox
led to the removal of the (n + 2)- th electron. Consequently, the zero- DOS region clipped a quantum state that would emerge at a specific voltage of –(VGSn + V). The minimum programming voltage interval between the two quantum states Nth [–(n + 1)] and Nth [–(n + 2)] became –2V. This broadened interval was strategically designed to reveal the precise manipulation of a single quantum state. The de- tailed calculation process is provided in the SM.
Guided by our DOS- scissors theory, we experimentally verified the anomalous quantum memory behavior. The dual- Dirac structure was realized through a self- aligned etching process that simultaneously defined the channel and SL region along the width dimension. To demonstrate that this theory enabled high- precision control of a single quantum state, according to Eq. 3, we designed an SL- graphene with a width of around 20 nm. The induced bandgap ensured that ΔVGS,prog aligned closely with –2V, allowing for the precise clipping of the quantum state at a programming voltage of –(VGSn + V). The specific device fabrication processes and characterizations are de- tailed in figs. S23 and S24. The relationship between ΔVth and pro- gramming VGS amplitudes of the dual- Dirac device at 10 K, which was designed with V = 0.3 V, is shown in Fig. 4B. As the programming VGS decreased from –27.6 V to –29.1 V (corresponding to the sequen- tial removal of the first to sixth electrons), both the minimum pro- gramming voltage interval and the ΔVth value between adjacent quantum states were around –V (fig. S25), which is consistent with conventional single- electron memory behavior. However, an anoma- lous behavior emerged as the Fermi level of the SL- graphene entered the zero- DOS region. Experimentally, as the programming VGS de- creased to –29.4 V, the zero- DOS region of the SL- graphene prevented the supply of available electrons for tunneling, inhibiting electron removal. As a result, the quantum state with Nth (–7), which typi- cally emerged at the programming VGS of –29.4 V, vanished. The next electron removal only occurred when the programming VGS reached –29.7 V. At this point, the Fermi level of the SL- graphene crossed the zero- DOS region, restoring the supply of tunnelable electrons. This transition resulted in an enlarged programming voltage step of –2V (–0.6 V) between the quantum states with Nth (–6) and Nth (–8), in- dicating that an additional voltage of –0.6 V was sufficient to drive the Fermi level across the zero- DOS region and facilitate further tun- neling. According to our theoretical model (3), the corresponding bandgap of SL- graphene was around 0.03 eV, which aligned closely with previously reported experimental values for 20- nm- wide graphene (35, 36). The bandgap of the SL- graphene was further verified through temperature- dependent transport measurements (fig. S26). This close alignment between experimental observation and our theoretical prediction highlighted the reliability of the DOS- scissors theory. Beyond this anomalous region, the minimum programming voltage interval and ΔVth value between adjacent quantum states returned to –V. Conversely, the process of moving single electrons into the SL- graphene exhibited similar anomalous quantum memory behav- ior, in which the quantum state with Nth (–7) also vanished (Fig. 4B, right). We conducted a series of control experiments to further con- firm the robustness of the mechanism (figs. S27 and S28).
Conclusions By combining the ultimate thickness confinement of 2D materials with a coplanar DCS structure to suppress fringe capacitance, a nonvolatile and distinguishable single- electron memory was realized at room tem- perature, along with the observation of two intriguing quantum behav- iors. Further, we established a DOS- scissors theory to predict a distinctive quantum memory effect. This prediction was verified through experi- ments, which demonstrated that our theoretical and technological framework can support the precise manipulation of even a single quan- tum state. Our findings pave the way for discovering emerging quantum phenomena, suggesting that the integration of diverse semiconductors
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manipulation. Figshare (2026); https://doi.org/10.6084/m9.figshare.32483589.
ACKNOWLEDGMENTS Funding: This work was supported by the National Key Research and Development Program of China (2024YFA1208400), the National Natural Science Foundation of China (62322405, 62525401, U25D8010, and 62374042), Shanghai Pilot Program for Basic Research- FuDan University 21TQ1400100 (21TQ011), New Cornerstone Science Foundation through the XPLORER PRIZE, Scientific Research Innovation Capability Support Project for Young Faculty, and the young scientist project of MOE innovation platform. Part of the sample fabrication was performed at Fudan Nano- fabrication Laboratory. Author contributions: C.L. and P.Z. conceived the idea; C.L. constructed the theory, and Y.X. provided valuable input; C.L. and Y.X. designed and conducted the experiments; C.W. provided valuable input in the simulation; C.L. and Y.X. cowrote the manuscript; and all authors contributed to the discussion and revision of the manuscript. Competing interests: The authors declare no competing interests. Data, code, and materials availability: All data needed to evaluate the conclusions in the paper are present in the paper or the SM. All data underlying the figures can be found at Figshare (37). License information: Copyright © 2026 the authors, some rights reserved; exclusive licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original US government works. https://www.science.org/about/science- licenses- journal- article- reuse
SUPPLEMENTARY MATERIALS
science.org/doi/10.1126/science.aeg6638
Materials and Methods; Supplementary Text; Figs. S1 to S28; Tables S1 to S3;
References (38–47)
Submitted 23 February 2026; accepted 29 May 2026
Drying of the Aral Sea reshapes the anthropogenic carbon inventory of Central Asia
Rafael Marcé1*, Daniel Diaz- de- Quijano2,3†‡§,
Sofía Rodríguez- Gómez4†, Enrique Moreno- Ostos4,
Makhambet Mukhtar5, Björn Wissel6, Zoraida Quiñones- Rivera6,
Carolina Olid7, Santiago Giralt8, Joan Pere Casas- Ruiz9,
Georgiy Kirillin10, Daniel Mercado- Bettín1, Valentí Rodellas11,
Jordi Ibáñez- Insa8, Núria Catalán1
lakes store large quantities of carbon in their sediments,
contributing to climate regulation. yet the fate of this carbon
after lake desiccation remains unclear. using a space- for- time
substitution approach, combining sediment cores, carbon
dioxide flux measurements, and remote sensing, we quantified
organic carbon losses from the world’s largest desiccated lake,
the Aral Sea. Since 1960, exposed lake bed sediments have
released 204 ± 53 teragrams of carbon (Tg C), with vegetation
growth offsetting less than 1%. Incorporating these emissions
alters the regional carbon budget, transforming the Aral Sea
basin from a presumed land- use- change carbon sink into a
net source. Reflooding the sea could prevent an additional
165 ± 13 Tg C release, reframing restoration not only as an
ecological and humanitarian imperative but also as a climate
mitigation opportunity.
The redistribution of carbon stocks across Earth’s compartments is a central focus in contemporary carbon biogeochemistry owing to its implications for atmospheric carbon levels and climate change. Lakes and inland seas regulate carbon transfer from land to oceans (1, 2), emit carbon dioxide (CO2) and methane (CH4) (3, 4), and bury organic and inorganic carbon (OC and IC, respectively) in sediments where it can persist for millennia (5–8), making them an important global carbon sink (9). However, lake area is changing because of water diversion, damming, and climate change (10). Newly formed lakes and reservoirs have globally expanded by ~48,000 km2 since 2001 (11), enhancing OC burial in their sediments (9, 12). In parallel, extensive lake shrinkage has occurred across arid and semiarid endorheic basins (10, 13). Since 2001, ~96,000 km2 of lake surface have desiccated (11), exposing vast areas of sediment to the atmosphere. As many lakes experience dra- matic drying, recent work shows that OC stored in lake sediments becomes mineralized to CO2 when sediments desiccate (14–17), imply- ing that drying can liberate previously buried carbon back to the at- mosphere. Yet despite this potential reversal of long- term OC burial, the overall consequences of lake drying for sedimentary carbon stocks and their atmospheric release remain poorly understood (18).
The Aral Sea (Kazakhstan/Uzbekistan), once the world’s fourth larg- est inland water body, began shrinking in the early 1960s, mainly as a consequence of the diversion of its two main tributaries for irrigation (19, 20). This triggered one of the most severe global environmental and social crises of the 20th century (21). The expansion of irrigation
1Centre for Advanced Studies, Spanish National Research Council (CEAB- CSIC), Blanes, Spain. 2Catalan Institute for Water Research (ICRA), Girona, Spain. 3Siberian Federal University (SFU), Krasnoyarsk, Russia. 4Universidad de Málaga; Departamento de Ecología, Grupo de Ecología Marina y Limnología, Málaga, Spain. 5NGO Aral Tenizi, Aralsk, Kazakhstan. 6Université Claude Bernard - Lyon 1, UMR 5023 LEHNA,Villeurbanne, France. 7UB- Geomodels Research Institute, Departament de Dinàmica de la Terra i l’Oceà, Facultat de Ciències de la Terra, Universitat de Barcelona (UB), Barcelona, Spain. 8Geosciences Barcelona (GEO3BCN), CSIC, Barcelona, Spain. 9Mediterranean Institute for Advanced Studies (IMEDEA- UIB- CSIC), Esporles, Spain. 10Leibniz Institute of Freshwater Ecology and Inland Fisheries (IGB), Berlin, Germany. 11Physics Department, Universitat Autònoma de Barcelona (UAB), Bellaterra, Spain. *Corresponding author. Email: rmarce@ ceab. csic. es †These authors contributed equally to this work. ‡Present address: Departament de Biologia Evolutiva, Ecologia i Ciències Ambientals, Universitat de Barcelona (UB), Barcelona, Spain. §Aquatic Ecology Research Group, Department of Biosciences, Universitat de Vic - Universitat Central de Catalunya, Vic, Spain.
resulted in vast anthropogenic land use/land cover change (LULCC) in the Aral Sea basin, with ~40,000 km2 of drylands converted to ir- rigated agriculture since the 1960s (22). Concurrently, the retreat of the shoreline of the Aral Sea exposed ~60,000 km2 of former lake bed to the atmosphere (23), accounting for ~50% of the global area of desic- cated lake sediments (11). Owing to its unprecedented scale, the Aral Sea offers an unprecedented opportunity to assess how large- scale lake drying impacts sedimentary carbon stocks and reshapes regional car- bon fluxes from LULCC.
In this study, we quantified carbon- stock changes resulting from exposure of Aral Sea lake bed sediments between 1960 and 2022 using data collected during a 2022 field expedition. Using a space- for- time substitution sampling design, we quantified four processes influencing the sedimentary carbon stock during the lake transition from aquatic to terrestrial land: (i) on- site degradation of OC in exposed sediments, (ii) wind deflation and off- site OC degradation, (iii) cessation of sedi- mentary carbon burial, and (iv) OC accrual from vegetation coloniz- ing the dry lake bed (24). We then assessed how incorporating these carbon fluxes reshapes net carbon exchange estimates for LULCC in the Aral Sea basin and examined the potential for reflooding to miti- gate emissions.
Environmental gradients along the drying chronosequence We surveyed 14 sites along three ~120 km transects selected to capture representative, flat terrain (mean slope 0.21%) and avoid major river inputs (Fig. 1A and fig. S1). Each transect included 4 to 5 sites placed along a drying chronosequence, that is, a sequence of areas exposed at different times, which we leverage to reconstruct carbon dynamics over ~50 years of desiccation, from areas dry since the 1970s to the central basin that remained submerged until 2020 (Fig. 1B). The un- derlying logic of the space- for- time sampling design is described in the materials and methods (24). Over the past five decades, lake retreat has created strong environmental gradients (Fig. 1, C to E). Surface sediment conductivity and water content peak near the former lake center and decrease toward longest- exposed areas (Fig. 1F). Recent drying in the lake center has produced hypersaline conditions (25) with halide and sulfate mineral precipitation (Fig. 1G). Sediment cores reveal three primary lithofacies: (i) well- sorted, light brown sands with local levels of bioclasts, indicative of shallow water deposition; (ii) bluish to greenish clays and silty clays representing offshore clastic accumulation; and (iii) thin, whitish halite and other sulfates crusts formed during late- stage drying. These facies alternate vertically, re- flecting past lake- level fluctuations (figs. S2 and S3), and the crust facies occur only in areas dried after the 1990s. Exposed sediments have developed into poorly drained saline soils, such as solonchaks and takyrs (26).
We found clear evidence of wind deflation in fine, unconsolidated siliciclastic sediments not cemented by saline crusts (Fig. 1D and fig. S4). This is supported by excess 210Pb inventories (24), which yielded defla- tion rates higher at midchronosequence sites and lower in recently exposed zones (Fig. 1B), consistent with remote sensing analyses (27). Rates ranged from 0 to 8.0 mm yr−1, with a mean of 2.6 ± 2.2 mm yr−1 (mean ± SD, N = 14 sites), matching previous long- term estimates derived from sand traps and aerosol modeling (28, 29).
Shrub vegetation variably established along the chronosequences, particularly in areas exposed between the 1960s and 1980s, some of which have been subject to afforestation (30). Aboveground biomass estimates from the Global Ecosystem Dynamics Investigation (GEDI)
Fig. 1. Sampling design and environmental gradients along the Aral Sea drying chronosequence. (A) Map of the Aral Sea showing shoreline retreat over time (blue gradient) and the contemporaneous accumulation of above ground plant biomass on the dry bed (green gradient). The box indicates the location of the transects and sampling sites. The asterisk and diamond mark inundated locations (33, 34), and small squares mark dry bed locations (32) compiled from the literature. (B) Sampling points (circles) along the three transects (thin straight lines). The retreat of the shore over time is indicated by blue lines (except for 1960, gray line). The shade of red of the circles is proportional to the estimated wind deflation rate (millimeters per year). White areas represent land above water level in 1960. The thin cross represents a sampling site that could not be reached (site S11). The background is a corrected- reflectance MODIS/Terra image from 4 September 2022. (C to E) Landscape transformation along the drying chronosequence. Note the transition from plants in long- exposed dry beds (E) to sandy sediments on intermediate sections of the transects (D) and hypersaline salt crusts in recently exposed sediments (C). (F) Conductivity of sediment slurries (millisiemens per centimeter) and water content (percentage) of surface sediments (top 10 cm) along the drying chronosequence. (G) Average percentage composition of minerals in sediment cores along the drying chronosequence, measured by x- ray diffraction. Only the seven most abundant minerals are shown. In (F) and (G), the x axis depicts both sampling locations and the corresponding year since desiccation. Lines and shadows express the mean and standard deviation of all samples available (core depths and/or sampling sites) for each point along the chronosequence.
remote sensing product (31) show agreement with our drone- based photogrammetry estimates (power regression slope = 1.1, coefficient of determination R2 = 0.62, P = 0.037, N = 7 sites; fig. S5) and show that 55% of the Aral Sea dry bed lacks detectable vegetation (Fig. 1A). Where present, above ground biomass is low, averaging 0.029 ± 0.087 kg C m−2 (N = 24,725 pixels at 1 km2 resolution).
Organic carbon stocks are lost upon drying We estimated OC and IC stocks from one 23- to 55- cm core per site (see the supplementary text for an analysis of the representativeness of results at the sampling site scale) and calculated cumulative carbon mass down to layers dated 205 to 255 years before 2022 (24). OC stocks
declined sharply (Fig. 2A), from over 3.0 kg C m−2 at recently desiccated sites to ~0.50 kg C m−2 at sites that have been dry for over 30 years. We interpret this reduction as a loss of OC along the chronosequences, which aligns with similar patterns observed in drying Arctic shallow lakes (14). OC decline followed an exponential decay (Fig. 2A), match- ing values from other dry bed areas in the Aral Sea (32) (Figs. 1A and 2A). The expected OC stock before the onset of drying (intercept of the exponential fit, 4.0 ± 0.44 kg C m−2, Fig. 2A) is consistent with OC stocks calculated for cores recovered from inundated regions (33, 34) (Figs. 1A and 2A). By contrast, IC stocks showed no significant variation across transects (P = 0.051; fig. S6). We also recorded moder- ate but widespread CO2 emissions from the dry lake bed (0.131 ± 0.136 kg
Fig. 2. Decline in sedimentary OC stocks along the Aral Sea drying chronosequence. (A) Sedimentary OC stocks as a function of years since drying and sampling locations (circles), together with an exponential fit (dashed line) and bootstrapped 95% CIs (shaded area). Reference OC values for inundated conditions from the literature (33, 34) are indicated with an asterisk and a diamond, whereas OC stocks from the dry lake bed derived from the literature (32) are indicated with squares (Fig. 1A). Literature- derived values were not included in the model fit. (B) Comparison of carbon isotopic composition (δ13C, per mille) of sedimentary OC (dark box plot) and dry- bed CO2 emissions estimated from Keeling plots (light box plot). Data correspond to the first chronosequence (sites S1 to S5). Because sample sizes differ between groups, we used a Wilcoxon signed-rank test to assess differences in central tendency.
Fig. 3. Organic carbon loss in the dry bed of the Aral Sea. (A) OC loss from 1960 to 2022 as estimated with the aggregated exponential model (Fig. 2A) compared with a waterfall chart of the accumulation of actual (on- site degradation, wind deflation) and counterfactual (forgone burial) loss processes. For the contribution of on- site degradation, we used estimates using either OC stocks or CO2 emissions from the dry bed. The striped areas denote the bootstrapped uncertainty (±1 SD), and the values on top of bars are averages. (B) Relative annual contribution to total OC loss of on- site degradation (calculated using OC stocks), wind deflation, and forgone burial during the period 1960 to 2022. (C) The same as in (B) but for the period with legacy effects from on- site degradation and wind deflation (2023 to 2085) (i.e., no new dry areas considered after 2022). The line and gray area in (B) and (C) represent the median and 95% CIs, respectively, of the sum of the annual contributions from the three processes (total OC loss, teragrams C per year).
CO2- C m−2 year−1, N = 109 flux measurements), measured using soil chambers and port able gas analyzers (24). Simultaneously, we char- acterized δ13C of the dry bed CO2 emissions at sites S1 to S5 using Keeling plot experiments (−22.5 ± 1.8‰, N = 8 Keeling plots), which matched the stable isotope composition of sedimentary OC (−22.4 ± 1.7‰, N = 150 sediment samples) (Fig. 2B). These values are statistically indistinguishable (Wilcoxon’s W = 576, P = 0.85), suggesting that CO2 emis- sions originate from the on- site mineralization of sedimentary OC. CH4 emissions were not detected in any of the sampling locations (24).
Organic carbon losses in the dry bed of the Aral Sea OC stock reductions reflect three processes: (i) on- site OC degradation, (ii) wind deflation and subsequent off- site degradation, and (iii) for- gone sedimentary OC burial following desiccation. The latter repre- sents a counterfactual burial flux: OC that would have been buried had desiccation not interrupted sediment accumulation. We estimated the aggregated OC loss across the whole Aral Sea’s dry bed from 1960 to 2022 by integrating the exponential decay of OC stocks under dry conditions (Fig. 2A) over space and time (see the supplementary text for an analysis of the transferability of the results in Fig. 2A to the whole dry bed). We used historical lake retreat data to map desiccation timelines and applied the decay function accordingly, with uncertainty quantified through bootstrap resampling and Monte Carlo propaga- tion (24). Predicted remaining OC stocks in 2022 were compared with the model intercept, representing the OC baseline had desiccation not occurred, yielding an aggregated loss of 204 ± 53 Tg C (Fig. 3A).
To establish the contribution of actual and counterfactual loss pro- cesses on the observed aggregated OC loss, we independently esti- mated (24): (i) on- site OC degradation by fitting an exponential decay to OC stocks calculated for deep sections of the cores unaffected by burial or wind deflation since 1960 (fig. S7); (ii) wind deflation by
Fig. 4. Impact of OC loss from the Aral Sea dry bed on the LULCC- driven carbon balance in the Aral Sea basin and potential carbon credits associated with the recovery of the Aral Sea. (A) Waterfall chart showing how net carbon emissions from LULCC related to irrigated agricultural expansion in the Aral Sea basin (1975 to 2019) (22) are altered when including actual OC losses (on- site degradation and wind deflation) from the exposed Aral Sea dry bed. Agricultural expansion impacts include legacy effects projected to 2067. OC losses from the dry bed are shown separately for 1975 to 2019 and legacy effects projected to 2082. Arrows indicate the direction of change. Bar labels show mean values; bootstrapped uncertainty (±1 SD) is represented by striped areas. (B) Estimated effect of increased freshwater inflow on water- covered area of the Aral Sea versus resulting tradable carbon stocks (top inset) and the relationship between investment costs in the basin for increasing inflow and resulting tradable carbon stocks (bottom inset). Some error bars are hidden by symbols, except for investment cost, for which no uncertainty is provided. Symbol colors in the insets correspond to colors in the map.
combining 210Pb- derived erosion rates with a time- dependent sediment OC content decline model; and (iii) forgone OC burial using a literature- based average OC burial rate (20 ± 16 g C m−2 yr−1, N = 61 estimates), assumed constant through space and time. These yielded 101 ± 41 Tg C (on- site degradation), 28 ± 9 Tg C (wind deflation), and 41 ± 4 Tg C (forgone burial), totaling 167 ± 33 Tg C, statistically indis- tinguishable from the aggregated estimate [204 ± 53 Tg C; 95% con- fidence interval (CI) of difference: −71 to 200 Tg C] (Fig. 3A).
An independent estimate of on- site OC degradation was derived from in situ CO2 fluxes modeled as a function of seasonal sediment temperature and integrated over space and time (24). This gave a loss of 119 ± 17 Tg C, consistent with the stock- based estimate of 101 ± 41 Tg C (95% CI of difference: −71 to 89 Tg C). This agreement and the convergence between aggregated and process- specific estimates lend robustness to our approach and support the interpretation that post- desiccation OC loss is dominated by on- site degradation.
The nonlinear trajectory of OC decay has reduced the fraction of actual losses from ~80% in the 1960s to ~70% in the 2020s (Fig. 3B) as degradable OC is depleted. With little further dry bed expansion expected, only counterfactual losses (forgone burial) are projected after 2085 (Fig. 3C).
Carbon accrual by vegetation growth is negligible compared with losses We converted GEDI- derived above ground biomass (Fig. 1A) into above- ground carbon (24), totaling 0.72 ± 0.13 Tg C across the dry bed. This reflects the net vegetation accumulation since 1960 and represents only 0.56% of actual OC losses from on- site degradation and wind deflation (128 ± 40 Tg C). Including belowground biomass (24) raises total biomass accumulation to 1.36 ± 0.91 Tg C, still only 1.1% of total actual OC losses. Thus, vegetation has a negligible effect on the carbon
budget. Although recent greening initiatives (30) may help mitigate sandstorm- related health and economic impacts in Central Asia (35), they offer minimal potential for carbon offset. Vegetation can reduce wind erosion locally (36) and thus indirectly impact OC loss; how- ever, vegetated areas remain dust hot spots (37), questioning their effectiveness at larger scales. Furthermore, high salinity in areas dried after the 1990s limits further plant colonization in the central dry bed (38, 39).
Implications for the anthropogenic carbon inventory of Central Asia Studies assessing carbon emissions from LULCC in Central Asia have focused on shifts between drylands and irrigated cropland. A book- keeping model estimated a cumulative carbon sink of −89 ± 35 Tg C in the Aral Sea basin since 1975, driven mainly by dryland to irrigation conversion (22). This estimate accounts for LULCC impacts up to 2019 as well as legacy effects projected to persist until 2067. We revisited this assessment by considering OC losses associated with the desicca- tion of the Aral Sea (24), incorporating processes that contribute to an actual vertical carbon exchange with the atmosphere (i.e., on- site degradation and wind deflation), consistent with LULCC assessment conventions. Accounting for the effects of on- site OC degradation and wind deflation between 1975 and 2019 (94 ± 32 Tg C) shifted the LULCC balance to near zero (4.7 ± 47.4 Tg C) (Fig. 4A). Including legacy effects related to actual OC loss processes that will last until 2082 (134 ± 34 Tg C) turned the net LULCC balance into a carbon source of 45 ± 49 Tg C (Fig. 4A).
We compared Aral Sea OC losses with other carbon fluxes associated with LULCC across the broader Central Asian region (40). The actual OC loss from the exposed Aral Sea bed between 1960 and 2022 is 167 ± 42 Tg C (with legacy effects projected through 2085). Meanwhile, a recent study reported a gain of 130 Tg C in soil OC stocks across Central Asia between 1979 and 2011 during long- term drought conditions, with a concurrent reduction of 570 Tg C in vegetation biomass also attributed to drought (41). Notably, these changes occurred over an area nearly 100 times larger than the dry bed of the Aral Sea. Thus, the Aral Sea desiccation not only reverses the LULCC budget of the Aral Sea basin, shifting it from a net carbon sink to a source, but also carries broader implications for the carbon dynamics of Central Asia as a whole.
Including carbon fluxes from drying lakes in National Inventory Reports Lake desiccation driven by human activities can substantially affect regional anthropogenic carbon inventories, particularly in arid and semiarid regions with retreating lakes, such as the Great Salt Lake and the Salton Sea (USA), Lake Urmia (Iran), Lake Chad (Chad), Lake Poopó (Bolivia), Lake Mar Chiquita (Argentina), and Lake Rukwa (Tanzania) (13). Of special concern is the Caspian Sea, the largest in- land water body on Earth, which is projected to shrink by approxi- mately 23% (~90,000 km2) by the end of this century (42), a process already observable along its northeastern Kazakh shores (43).
Lake desiccation is often tied to basin- level LULCC, such as shifts from unmanaged land to irrigation, for which carbon accounting guid- ance exists. However, no guidelines address carbon emissions from water bodies converting to drylands. Including desiccated lakes in National Inventory Reports is essential for comprehensive and equi- table assessment of anthropogenic greenhouse gas (GHG) emissions. Integrating drying lakes into the Land Use, Land- Use Change, and Forestry sector of national inventories faces three challenges: First, saline lakes and soils (common in desiccated regions) are excluded from current IPCC Guidelines owing to insufficient data (44). Second, it is unclear how drying lakes fit within the “managed land proxy,” the IPCC’s operational assumption that all GHG fluxes occurring on land defined as managed are anthropogenic and therefore must be included in national inventories. This raises questions such as whether GHG
fluxes from partially inundated zones during drying should be attrib- uted to human management. Third, lake surfaces often fluctuate sea- sonally and interannually (11), complicating the identification of permanent land- use change. We expand on these issues in the supple- mentary text and provide recommendations for incorporating drying lakes into national inventories. Notably, future methodologies could leverage existing guidance for drained peatlands (45), which face simi- lar challenges.
Leveraging the vulnerability of sedimentary carbon stocks to support the recovery of the Aral Sea Efforts to address the Aral Sea disaster have long drawn international attention (21), with most interventions focusing on socioeconomic adaptation, such as afforestation of the dry lake bed to reduce sand- storms (30) and promotion of alternative livelihoods (46). Although important, these strategies do not address the drastic decline in lake water levels. However, reversing the desiccation would require major, politically sensitive changes in water management across the trans- boundary basin (47). Yet, encouragingly, successful models of trans- boundary water governance are emerging globally (48).
Our findings show the importance of the hydrological restoration of the Aral Sea, not only as an ecological and humanitarian imperative but also as a climate mitigation opportunity. We estimate that 38.6 ± 4.7 Tg of OC remains vulnerable to on- site degradation and wind defla- tion between 2023 and 2085 (Fig. 3C). Under the 100- year carbon accounting horizon, we also estimate a counterfactual loss of 125 ± 13 Tg C due to forgone burial. Reflooding would halt further OC deg- radation and restore sedimentary carbon burial, thus potentially pre- venting the additional emission of 165 ± 13 Tg C, which corresponds to 604 ± 48 Mt CO2 assuming aerobic degradation of OC stocks. Fol- lowing the IPCC Wetlands Supplement (44), we assumed negligible CH4 emissions from reflooded saline wetlands owing to the inhibitory effect of sulfate on methanogenesis (supplementary text).
This mitigation potential could generate substantial carbon credits in the voluntary carbon market (VCM), potentially doubling the cur- rent global volume of nonretired credits (~700 Mt CO2) (49). Irrigation efficiency projects that increase Aral Sea inflows could credibly claim both avoided emissions and restored sinks as tradable credits. Al- though the market value of such a large pool of credits is uncertain, given their measurable, verifiable impact and significant social cobe- nefits, these offsets would likely qualify as high quality (50, 51). Using 2024 VCM price ranges for forestry and land use projects ($6.03 to $29.72 per ton of CO2 equivalent) (52), the market value of Aral Sea carbon credits is estimated at $3.6 ± 0.29 billion to $18 ± 1.4 billion USD. Investing $9.7 billion (2024 USD) to improve water manage- ment, conveyance, and on- farm irrigation efficiency in Central Asian agriculture could boost freshwater inflow by 28 km3 yr−1 (53, 54). Be- cause these gains stem from reducing current water losses rather than reallocating irrigation withdrawals, this level of inflow could restore ~50% of the lake’s 1960 area without adversely affecting regional ag- ricultural production (55), generating 323 ± 25 Mt CO2 in credits (Fig. 4B). However, as restoration progresses, the costs for further improving water management, conveyance, and irrigation efficiency increase exponentially (fig. S8), leading to declining marginal returns in terms of carbon credits (Fig. 4B) and making full recovery through carbon offsetting alone unlikely. Nevertheless, carbon credits could play a catalytic role in restoration, especially when complemented by mechanisms such as transboundary water rights trading (56).
We acknowledge the considerable uncertainties inherent in our es- timates along with the substantial technical, social, economic, and political challenges that any restoration effort would entail (supple- mentary text). Yet, the valuation of tradable carbon stocks in the Aral Sea dry bed could provide a powerful incentive, transforming restora- tion from a regional burden into a globally supported climate mitiga- tion opportunity.
Rehabilitation of a Great Lake (Springer, 2014). 22. Y. Wang et al., J. Environ. Manage. 314, 115078 (2022). 23. H. Liu, Y. Chen, Z. Ye, Y. Li, Q. Zhang, Sci. Rep. 9, 16277 (2019). 24. Materials and methods are available as supplementary materials. 25. Z. Duan, X. Wang, L. Sun, Water 14, 1438 (2022). 26. E. Argaman, A. Singer, H. Tsoar, Earth Surf. Process. Landf. 31, 47–63 (2006). 27. L. Spivak, A. Terechov, I. Vitkovskaya, M. Batyrbayeva, L. Orlovsky, in Aralkum - a
Man- Made Desert. The Desiccated Floor of the Aral Sea, S.- W. Breckle, W. Wucherer,
L. A. Dimeyeva, N. P. Ogar, Eds. (Springer, 2012), pp. 97–106.
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Xinjiang Province of China. It includes the Aral Sea basin, and it is four times larger. 41. C. Li et al., Glob. Change Biol. 21, 1951–1967 (2015). 42. R. Samant, M. Prange, Commun. Earth Environ. 4, 357 (2023). 43. R. Court et al., Commun. Earth Environ. 6, 261 (2025). 44. T. Hiraishi et al., Eds., 2013 Supplement to the 2006 IPCC Guidelines for National
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Asia, Zenodo (2025); https://doi.org/10.5281/zenodo.16809289.
ACKNOWLEDGMENTS
We thank Z. Tairova, A. Makhambetzhanov, O. Ospanov, M. Sayanov, K. Pazylbekov, I. Tairov,
T. Abdikerov, M. Konysov, Y. Aldamzharov, and L. Carrau for assistance in the field.
A. Baimahanova from the NGO Aral Tenizi decisively contributed to the logistics and success
of the expedition. We thank J. M. Bruach, S. Sammartino, A. Freixa, C. Gutiérrez, S. Martínez,
F. Ikane, E. Bisbal, L. Cojoc, P. Giménez, C. Estop- Aragonés, and K.- H. Knorr for assistance in
the laboratory or with calculations and the Applied Physics II Department of the University of
Málaga for hardware and software support. Discussions with B. Obrador and D. von Schiller
greatly contributed to the development of the hypotheses and methods guiding this research.
In memory of our esteemed colleague and friend Jordi Garcia Orellana, who passed away just
weeks before the expedition. He approached this work with great enthusiasm and will be
missed by colleagues around the world. Funding: This work was supported by the Spanish Agencia
Estatal de Investigación (grants PID2024- 161534NB- C31/AEI/10.13039/501100011033 to
R.M., D.M.- B., and G.K., PID2024- 161534NB- C32/AEI/10.13039/501100011033 to E.M.- O.
and S.R.-G, and PID2023-148093NB-I00/MCIU/AEI/10.13059/501100011033/FEDER,UE
to C.O.). S.R.- G. benefited from a grant by the Spanish Ministerio de Ciencia, Innovación y
Universidades (FPU22/01818). J.P.C.- R. benefited from a grant by the Vicenç Mut fellowship
funded by the government of the Balearic Islands (ref. PD- 057- 2023). Author contributions:
Conceptualization: R.M., E.M.-O., D.M.- B., N.C; Methodology: R.M., D.D.- d.- Q., S.R.- G., E.M.- O.,
M.M., B.W., Z.Q.- R., C.O., S.G., D.M.- B., V.R., N.C.; Investigation: R.M., D.D.- d.-Q., S.R.- G., E.M.-O.,
M.M., B.W., Z.Q.- R., C.O., S.G., J.P.C.- R., G.K., N.C.; Formal analyses: R.M., D.D.- d.-Q., S.R.- G.,
B.W., Z.Q.- R., C.O., S.G., J.P.C.- R., D.M.- B., V.R., J.I.- I., N.C.; Visualization: R.M., Z.Q.- R., J.P.C.- R.,
N.C.; Resources: R.M., E.M.-O., M.M., B.W., Z.Q.- R., S.G., G.K., V.R.; Funding acquisition: R.M.,
E.M.-O., D.M.- B., N.C., G.K.; Project administration: R.M., E.M.-O., D.M.-B.; Supervision:
R.M., E.M.-O., N.C.; Writing – original draft: R.M., Z.Q.R., N.C.; Writing – review & editing: R.M.,
D.D.- d.- Q., S.R.- G., E.M.-O., M.M., B.W., Z.Q.- R., C.O., S.G., J.P.C.- R., G.K., D.M.- B., V.R., J.I.- I., N.C.
Competing interests: The authors declare that they have no competing interests. Data,
code, and materials availability: All data needed to evaluate the conclusions in the paper
are present in the paper and/or the supplementary materials. Raw data and processing codes
are available at Zenodo (57). No new materials were generated for this study. License
information: Copyright © 2026 the authors, some rights reserved; exclusive licensee
American Association for the Advancement of Science. No claim to original US government
works. https://www.science.org/about/science- licenses- journal- article- reuse
SUPPLEMENTARY MATERIALS science.org/doi/10.1126/science.aeb2344 Materials and Methods; Supplementary Text; Figs. S1 to S17; References (58–108)
10.1126/science.aeb2344
Submitted 13 August 2025; accepted 27 May 2026
Parallel independent voltage computing along dendrites of CA3 pyramidal neurons
Asako Noguchi1,2†, Satoshi Terada1,2†, George N. Zakka2,
Cliodhna O’Toole2, Luke Reynolds2, Michelle Ann Land3,
Balázs J. Rózsa4,5,6, François St- Pierre3,7,8, Attila Losonczy1,2,9*
Dendritic computation contributes to information processing in cortical circuits. Hippocampal CA3 plays a central role in navigation, but how the dendrites of CA3 pyramidal neurons process information in vivo remains largely unknown. using voltage imaging across dendrites and somata of CA3 pyramidal neurons during virtual reality–guided navigation in mice, we found that the dendritic arbor comprises multiple independent computational units that can dynamically couple to or dissociate from somatic activity, depending on behavioral conditions. Dendritic activity shapes subcellular representations of space, reward, and context through conditional coupling to the somatic output. Furthermore, spatially cotuned dendrites retain their coordination during sharp- wave ripples. These findings demonstrate that past, present, and future representations coexist within the dendritic arbor of CA3 pyramidal neurons, collectively shaping behaviorally relevant neuronal coding.
A growing body of experimental and theoretical work suggests that dendrites of pyramidal neurons can process information either inde- pendently or jointly through flexible coupling with axosomatic com- partments (1–7). In the CA3 area of the hippocampus, pyramidal neurons (CA3PNs) play a critical role in spatial navigation and memory through spatial- , reward- , and context- related activity (8–10), as well as through sharp- wave ripple (SWR)–associated reactivation of online activity patterns (11, 12). However, measurement of dendritic integra- tion properties of CA3PNs in vivo using voltage imaging has been inac- cessible in behaving animals during online exploration and offline memory consolidation. Most studies on dendritic integration have been conducted in slice preparations, where anatomical and physio- logical conditions differ from those in vivo (13–17). In vivo studies have mainly relied on calcium indicators (18–20), which lack both the tem- poral resolution for submillisecond dendritic signals and the sensitiv- ity to resolve subthreshold dynamics. Furthermore, dendritic voltage imaging at a single depth (21, 22) limits access to the membrane po- tential (Vm) at multiple sites along the somatodendritic membrane, and thereby to the signal initiation and propagation. To address these major gaps, we performed two- photon voltage imaging at multiple sites along the somatodendritic membrane surface of CA3PNs using ultrafast, motion- stabilized, three- dimensional (3D) acousto- optical microscopy and an optimized genetically encoded voltage indicator.
In vivo voltage imaging of CA3 pyramidal neuron dendrites To achieve motion- stable scanning of regions of interest (ROIs) across the dendritic tree, we leveraged real- time motion correction (RTMC)
1Peter O’Donnell Jr. Brain Institute, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, USA. 2Mortimer B. Zuckerman Mind Brain Behavior Institute, Department of Neuroscience,
Columbia University, New York, NY, USA. 3Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA. 4BrainVisionCenter, Budapest, Hungary. 5Laboratory of 3D Functional
Network and Dendritic Imaging, Institute of Experimental Medicine, Budapest, Hungary. 6 Faculty of Information Technology and Bionics, Pázmány Péter University, Budapest, Hungary.
7Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, Baylor College of Medicine; Houston, TX, USA. 8Department of Electrical and Computer Engineering, Rice University, Houston, TX,
USA. 9Department of Neuroscience, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX, USA. *Corresponding author. Email: asako. noguchi@ utsouthwestern. edu (A.N.);
st3166@ columbia. edu (S.T.); attila. losonczy@ utsouthwestern. edu (A.L.) †These authors contributed equally to this work.
(23). CA3PNs were sparsely labeled with a virally expressed green volt- age indicator, JEDI3sub (24), and with tdTomato, a static reference for RTMC (Fig. 1A and fig. S1). One somatic and multiple dendritic ROIs were imaged at more than 1 kHz (Fig. 1B and fig. S2). Recordings revealed distinct patterns of Vm signals, operationally categorized as fast spikes and slow subthreshold dynamics (17, 23, 25–27) (Fig. 1C and figs. S3 and S4) (see materials and methods). Fast spikes putatively correspond to somatic action potentials and dendritic sodium spikes (17, 28). Back propagating action potentials (bAPs) were defined as fast dendritic events occurring within 1 ms of a somatic spike and exhibited the expected attenuation in amplitude and increase in latency with path distance from the soma (22, 23) (fig. S5). To investigate somatodendritic voltage dynamics during spatial navigation, we used a virtual reality system (29, 30) (Fig. 1D). We recorded Vm dynamics from 20 CA3 place cells, simultaneously monitoring Vm at the soma and in up to 14 dendritic ROIs per cell (5 to 14 ROIs per cell) (Fig. 1E). Physiological benchmarks indicated the stability and reliability of voltage imaging (fig. S6).
Somatodendritic coupling in CA3 place cells We first analyzed spatial tuning and coordination across the dendritic tree. Dendrites generally showed similar spatial tuning with the soma, indicating highly coupled somatodendritic dynamics (Fig. 1, F and G) (20). This coupling, however, exhibited a prominent spatial gradient. Tuning curve (TC) similarity between each dendritic ROI and its parent soma decreased with path distance along the dendritic arbor (fig. S7A). This gradient was still present after excluding bAP- associated dendritic events, indicating that it is not solely attributable to bAPs. Moreover, removing dendritic fast spikes preceding somatic action potentials (APs) reduced the correlation (fig. S7, B to D), suggesting that pre- AP dendritic spikes contribute to path distance–dependent somatoden- dritic coordination. On behavioral timescales, dendritic spike rates increase before the animal enters the somatic place field (PF) (fig. S8, A and B), whereas no comparable increase was observed after the PF (fig. S8C). These results reveal that somatodendritic coupling in place cells is spatially organized and associated with temporally asymmetric dendritic activity preceding somatic PF firing.
We next asked whether this spatial organization extends below su- prathreshold activity (Fig. 1G and materials and methods). Using a random forest regressor, we modeled lap- by- lap somatic PFs as a func- tion of preceding dendritic TCs within defined spatial intervals and their path distance (Fig. 1H and fig. S9). Both subthreshold and supra- threshold dendritic features robustly predicted subsequent somatic PF dynamics (Fig. 1, H and I, and fig. S10). SHapley Additive exPlana- tions [SHAP (31)] analysis was used to quantify the marginal contribu- tion of each feature, revealing that predictive influence decayed nonlinearly with path distance (Fig. 1I). Dendritic subthreshold fea- tures exhibited a U- shaped relationship with SHAP values (fig. S10B), suggesting distinct functional subtypes of dendrites that either poten- tiate or suppress somatic PF magnitude. Clustering with Ward’s method and uniform manifold approximation and projection (UMAP) identified dendritic populations whose contributions were strongly positive only within specific spatial intervals but weak or negative elsewhere (Fig. 1J and fig. S11). Defining “IN” intervals as those with peak predictive influence and “OUT” intervals as minimal (Fig. 1K), den- dritic features were positively correlated with SHAP values within “IN” regions and negatively correlated outside (Fig. 1L). These results indi- cate that temporally disconnected dendritic activity can predict subse- quent somatic firing through selective tuning within defined receptive fields and suppression elsewhere.
I
L
D
J
1 0
virtual reality
G
Subthreshold
F
Fast spike Subthreshold
K
-30%
∆F/F (Z)
ER (Z) 4 0 ∆F/F (Z) 3 0 soma
soma
soma
Lap #
Lap #
Lap#
Lap#
Lap#
Lap#
2 0
2 0
2 0
2 0
basal
basal
basal
apical
apical
apical
apical
tuft
tuft
0.2
-0.2
0.2
0.1
0.2
0.2
0.1
0.2
0.2
-0.1
300 0 200 100
300 0 200 100
Position (cm)
Position (cm)
0.4
1 2
Predicted Somatic PF
-0.4
Importance
somatic PF
OUT+
0.4
0.4
Fig. 1. Dendritic voltage imaging from hippocampal CA3 place cells. (A) Example image of a field of view showing reference (red, tdTomato) and functional (green, JEDI3sub)
indicators in CA3 pyramidal neurons. White lines indicate example ROIs. (B) Schematics of 3D line scanning and real- time motion correction. (C) (Left) Representative traces
from the soma and each dendritic domain, along with detected fast spikes. (Right) Example trace of a somatic burst event and the corresponding time- frequency spectrum.
Black ticks show detected spikes, and the dashed line indicates subthreshold dynamics. (D) Schematics of a spatial navigation task with a fixed water reward (top) and the
integrated two- photon microscope and virtual reality system. (E) Representative traces from the soma and an apical dendritic ROI of a place cell (top) and the animal’s position
on the track (bottom). (F) (Left) Spike timing of an apical dendritic ROI for each lap (top) and the corresponding event rate (bottom) relative to the place field (PF) peak.
(Right) Heatmap of the subthreshold dynamics of the apical dendritic ROI for each lap (top), and the corresponding traces in blue, and the average trace in black (bottom).
(G) Heatmaps of subthreshold dynamics (left) and spike rates (right) of soma, basal, apical, and tuft dendritic ROIs simultaneously recorded from a place cell as a function of
the animal’s position. White arrows indicate dendritic spatial tuning that is isolated from the somatic PF. (H) (Left) Random forest (RF)–based prediction of somatic PF intensity
from preceding dendritic tuning curve (TC). (Top right) Prediction accuracy quantified by coefficient of determination (R2) score (R2 = 0.873, n = 2816 events from 20 cells in
12 mice). (Bottom right) Relative importance of dendritic features used in the RF regressor. (I) SHapley Additive exPlanations (SHAP) plots illustrate the relationship between
feature values and their impact on the predicted somatic PF intensity. The panels show how distance from the soma predicts somatic PF, derived from either subthreshold
dynamics (left) or fast- spiking activity (right). The solid lines represent high- order polynomial fits that capture the nonlinear trend. (J) Representative examples of dendritic
functional subtypes. The marker colors correspond to each subtype. AUC, area under the curve. (K) Schematics demonstrating the impact of a dendritic subtype [from (J), top]
on model prediction. (L) SHAP dependence plots across dendritic functional subtypes [OUT: Pearson correlation coefficient (R) = −0.4, P < 0.0001; IN: R = 0.71, P < 0.0001).
10s
∆F/F (Z) at position: 0.92
55µm
70µm
156µm
0 -100 -200
Position (cm) from peak of somatic PF (sub)
~-60cm
~-85cm
~-100cm
~-130cm
~-155cm
~-155cm ~-130cm ~-100cm ~-85cm ~-60cm
SHAP value
SHAP value
SHAP value
SHAP value
R=-0.27
Dendritic TC subtypes
-0.5 0.5 0
5 0
5 0
5 0
R=0.53
time (1s)
1s
soma basal apical tuft Dendrites
Subthreshold Fast spike at position: 0.92
2 ∆F/F (Z)
apical apical
Event Rate (Hz)
-6 -4 0 2 -2 4
-6 -4 0 2 -2 4
Time (s) from peak of somatic PF Time (s) from peak of somatic PF
Predicted by Dendritic TC
(AUC / PF width)
0 3
0.3
AUC (dendrite)
Distance from Soma
* *
*
* *
*
* *
*
*
R=0.015
R=-0.23
R=0.58
R=0.73
2.5 0
R=0.59
R=0.51
R=0.12
R=0.19
Z-scored AUC of dendritic TC
Frequency (Hz)
0.6 R= -0.77 R= 0.66
Distance from Soma (µm) Distance from Soma (µm) 100 0 300 200 400 100 0 300 200 400
dend-TC IN
IN OUT
IN OUT
R= -0.4 R= 0.71
0 2 4 -2 10 5 0 Z-scored AUC of dendritic TC
<40Hz
Wavelet Amp
H
I
C
Event- level analysis of subthreshold dynamics at the millisecond timescale revealed structured temporal relationships between den- dritic and somatic activity. The likelihood of local dendritic events increased with path distance from the soma (Fig. 2, A and B). By con- trast, analysis of coactive dendritic events revealed structured temporal relationships in dendrite- soma latency, with dendrite- preceding events (negative latency) decreasing and dendrite- following events (positive latency) increasing with path distance (Fig. 2, C to E). These patterns were accompanied by distinct waveform features, defining functional
-2
Co-active
F
dend
Dend
Dend
D
G
A B
* 1.0
Local d-event 1.0
1.0
-10
soma dendrite
100ms
0.0
0.0
1 ∆F/F (Z)
1 ∆F/F (Z)
1 ∆F/F (Z)
* *
*
*
*
*
*
*
R=0.30
Lag | (ms)
Lag (ms)
0.2
0.2
400 300 200 100 0
0.02
0.2
0.1
0.2
400 300 200 100 0
400 300 200 100 0
0.1
0.2
0.2
0.1
-0.2
400 300 200 100 0
-200
Distance from soma(µm)
Distance from soma(µm)
Distance from soma(µm)
Distance from soma(µm)
R=-0.27 E
Temporal Precedence
0.4
0.4
0.4
Index
R=0.37
Decoded
Fraction
basal
apical
tuft
Squared Error
MSE
0.5
Follower
Follower
Driver
Driver
J
Sync
Driver
Follower
R=0.31
Sync
Somatic event
R=-0.20
Driver
Follower
Fig. 2. Somatodendritic subthreshold coordination associated with somatic place field. (A) Perievent time histograms (PETHs) triggered on the onset of local dendritic
subthreshold events (d- events). (B) (Left) Fraction of the local dendritic voltage events per domain (n = 20 cells, χ2 test, P < 0.05). (Right) Fraction of the local dendritic events
as a function of the distance between their source dendrites and soma (R = 0.37, P < 0.05). The gray- shaded area indicates 95% confidence intervals. The marker shapes and
colors correspond to the dendritic domains (basal: green square; apical: sky- blue cross; tuft: purple inverted triangle). (C) PETHs triggered on the onset of coactive dendritic
voltage events. (D) Absolute (left) and signed latencies between dendritic and somatic events as a function of the distance from the parent soma (absolute latency: R = 0.30,
P < 0.05; positive latency: R = 0.31, P < 0.05; negative latency: R = −0.20, P < 0.05). The solid line represents a locally weighted scatterplot smoothing fit (left) and three- order
polynomial fit (right). (E) Temporal precedence index, defined as (Npreceding − Nfollowing) / (Npreceding + Nfollowing) as a function of the distance from the parent soma (R = −0.27,
P < 0.05). (F) Average waveforms of the functional subtypes of coactive dendritic voltage events. Dashed lines represent the onset of the somatic events. (G) All PETHs of the
driver and follower dendritic events, and the co- occurring somatic events. (H) An example of the correlations between the amplitude of somatic events and the one predicted by
either driver (left, R = 0.58, P < 0.05) or follower (right, R = 0.22, P < 0.05) dendritic events within the same cell. (I) (Left) Comparison of squared errors between the amplitude
of somatic events and the decoded one (blue: driver; pink: follower; t test, P < 0.05). The comparison of mean squared errors (MSEs) per dendrite (t test, P < 0.05). (J) Temporal
profile of the occurrences of the coactive dendritic events relative to time from the onset of the somatic PF (top: synchronous; middle: driver; bottom: follower). The solid lines
indicate kernel density estimation for the histograms, corresponding to the above heatmap.
0.8
0.8
Local Co-active
0.6
0.6
Driver D-event
subtypes lag-based
50ms
30 20 10
event # event # event #
-20 -30 -40
11900
Preceding Following
classes of dendritic events. In particular, a subset of dendritic events exhibited ramping depolarization preceding somatic activation (“driver” events), whereas others followed somatic activity with slower dynam- ics (“follower” events) (Fig. 2, F and G). Driver events more strongly accounted for event- by- event somatic activity than follower events (Fig. 2, H and I), suggesting that dendritic depolarization preceding somatic activation provides a major contribution to somatic firing. On behavioral timescales, driver events increased before entry into the somatic PF, whereas follower events showed a sharp increase after PF
Fraction of local d-event
Follower D-event
Follower D-event
-0.5 2 ∆F/F (Z) Driver D-event
-100 0 200 100 Time (ms) from onset of somatic events
Driver Soma Follower Soma
2 R=0.58 R=0.22
2.5 -2.5 0 -2
2.5 -2.5 0
Somatic amplitude (original)
1.5 1e-5
1e-5
(zero-lag)
Probability Density
6 4 0 -4 -2 2 Time (s) from onset of somatic PF
0.06
0.04
onset (Fig. 2J). Together, subthreshold dynamics exhibit temporally asymmetric spatial organization that underlies the emergence and trial- by- trial representation of somatic PFs.
A
C
G
H
I
Somatodendritic reorganization during reward translocation We next investigated subcellular voltage dynamics during reward translocation within the same environment and during a global con- text switch. Upon reward translocation (Fig. 3A), somatic fields reor- ganized rapidly, whereas a subset of dendrites retained their original spatial tuning even after the parent soma had remapped (Fig. 3B). We quantified this reorganization by comparing the fraction of “familiar” (pretranslocation) and “novel” (posttranslocation) TCs of dendrites
Reward translocation
Familiar
Global context switch
dendrite
RZ1 RZ2
relocation
0 3 m
E F
soma dendrite
somadend
*
*
*
*
*
Familiar-TC ratio
1.0
1.0
-1.0 *
-10
-10
0.5
-0.5
0.5
-5
-5
0 soma tuft 1
0 3 Position (m)
0 3 Position (m)
0 3 Position (m)
0.2
apical 1
Novel TC
0.4
0.2
= 0.53
∆Lap# of remapping
-0.4
-0.8
= 0.39
∆Lap# of remapping
∆Lap# of remapping
Fig. 3. Somatodendritic decoupling during place field remapping. (A) (Top) In reward translocation, the
reward zone is moved to another fixed location in the familiar context. (Bottom) Mean velocity profile before
and after the reward translocation. (B) Fast spike rate heatmaps of the soma and an apical dendritic ROI
(apical 1) from a place cell before and after the reward translocation, indicated by the dashed line. (C) (Left)
Somatic tuning curves (TCs) before (familiar) and after (novel) reward translocation for the cell shown in (B).
(Right) Fraction of laps showing high similarity to the familiar or novel TCs in each domain separately for before
and after the reward translocation [Fisher’s exact test, soma: odds ratio (OD) = 0.073, P = 1.2 × 10−3; apical1: OD =
0.463, P = 0.45; apical2: OD = 0.063, P = 2.0 × 10−4; apical3: OD = 0.26, P = 0.094; tuft1: OD = 0.13, P = 0.017].
(D) Ratio of laps with familiar TCs normalized by the summation of the lap numbers with novel and familiar
TCs (Familiar- TC ratio). t = 21.1, 24.6, P = 6.9 × 10−18, 2.5 × 10−48, n = 14, 60 ROIs for soma and dendrite,
respectively, Student’s t test (see also fig. S12F). (E) Changes in the Familiar- TC ratio before and after reward
translocation [ΔFamiliar- TC ratio (after- before)]. P = 0.021, t = −2.4, Student’s t test. (F) ΔFamiliar- TC ratio
(after- before) is plotted as a function of the path distance from the soma. t test of the correlation coefficients (two-
sided), R = 0.39, P = 6.7 × 10−4, n = 74 ROIs from 14 cells in 10 mice. (G) The lap number at which dendritic
ROIs started remapping is calculated relative to that of the cognate soma (ΔLap# of remapping initiation) and
plotted as a function of the path distance. t test of the correlation coefficients (two- sided), R = 0.53, P = 1.3 ×
10−6, n = 74 ROIs from 14 cells in 10 mice. (H) Firing rate heatmaps of the soma and a tuft dendritic ROI (tuft 1)
after the global context switch. The white arrows indicate the lap at which each ROI started forming PFs.
(I) The lap number at which dendritic ROIs start forming PFs, calculated relative to that of the cognate soma
(ΔLap# of remapping initiation). t = −6.7, P = 2.7 × 10−8, n = 45 ROIs from 10 cells in 8 mice, one- sample t test
compared to zero. (J) ΔLap# of remapping initiation is plotted as a function of the path distance. R = −0.42,
P = 1.5 × 10−3, n = 55 ROIs from 10 cells in 8 mice, t test of the correlation coefficients (two- sided). In (F), (G),
and (J), orange, green, blue, and purple denote soma, basal, apical, and tuft dendrites, respectively.
B soma Lap
Familiar TC 0.4
Event rate (Hz)
Event rate (Hz)
0 1 2 3
∆Familiar-TC ratio (aft-bef)
∆Familiar-TC ratio (aft-bef)
0 100 200 300 Path distance (um)
0 100 200 300 Path distance (um)
initiation (rel. soma)
initiation (rel. soma)
initiation (rel. soma)
between laps before and after reward translocation (Fig. 3C, left). Somata showed a decreased fraction of the laps with the familiar TC and an increased fraction with the novel TC, confirming somatic re- mapping. By contrast, dendrites exhibited more heterogeneous dy- namics; whereas some remapped in parallel with the soma, others maintained the familiar TC (Fig. 3C, right). Across ROIs, the fraction of laps with familiar TCs decreased in both the soma and dendrites (Fig. 3D). However, this reduction was greater at the soma (Fig. 3E), indicating that dendrites reorganize their spatial representation less or more gradually than the soma. We further found that distal den- drites retained their original tuning more strongly than proximal den- drites, with familiar TCs decreasing with path distance from the parent
n.s. n.s.
= -0.42 J
0 100 200 Path distance (um)
soma (Fig. 3F). The temporal progression of re-
mapping followed a centrifugal gradient, occur-
ring earlier at the soma and in proximal dendrites
than in distal dendrites (Fig. 3G and fig. S12). This
relationship persisted after removing dendritic
events associated with bAPs, indicating that the
distance dependence is not solely driven by bAP-
related effects (fig. S13, A and D). Excluding pre-
and/or post- AP dendritic spikes further increased
the retention of familiar tuning (fig. S13E), sup-
porting partial dendritic autonomy. Moreover, this
distance- dependent pattern was also observed in
dendrites whose tuning differed from the soma
before reward translocation (fig. S13F), indicating
that the spatially graded reorganization is not re-
stricted to dendrites that are functionally coupled to
the soma. These results suggest that reward trans-
location induces transient decoupling between the
soma and its dendrites, which is characterized by
rapid reorganization of somatic PFs, whereas den-
dritic representations remain more stable, fol-
lowed by their gradual, centrifugal realignment
to the soma.
Familiar Novel
Coordinated somatodendritic spatial tuning evolution in a novel environment In contrast to reward translocation, PFs formed within a similar time course in both the soma and its dendrites during the large- scale remapping that occurred when mice were exposed to a novel context (29, 30) (Fig. 3H). To determine when and where novel spatial tuning first emerged, we iden- tified the initial lap as the first occurrence of a dendritic TC that was highly similar to the stabi- lized somatic novel PF. Most imaged dendrites ex- pressed novel TCs earlier than the soma (Fig. 3I), and this temporal lead was spatially organized along the dendritic arbor, with distal dendrites exhibiting the novel TC earlier than proximal com- partments (Fig. 3J). These results suggest that PF remapping first emerges in distal dendrites and progresses centripetally toward the proximal den- drites and the soma. These results demonstrate that distinct subcellular remapping patterns with distinct temporal and spatial coordination are elicited by reward translocation and novel con- text exposure.
Subthreshold coordination in dendrites associated with remapping We next investigated somatodendritic coordina- tion during remapping at the subthreshold level. Using non-negative matrix factorization (NMF), we
decomposed the spatially tuned subthreshold dynamics of individual laps into combinations of basis tuning patterns (fig. S14 and materials and methods). We first utilized this latent embedding to classify the somatic PF remapping process into four functional epochs, “Familiar,” “Before,” “During,” and “Remapped,” each defined by the distinct load- ing properties of somatic tuning patterns (Fig. 4A and fig. S14, A to C). To assess the spatial distribution of remapping dynamics along the dendritic arbor, we then tracked the magnitude of familiar and novel tuning curves throughout these epochs, mapped as a function of path distance from the soma. Upon reward translocation, new spatial tun- ing preferentially emerged in proximal dendrites during the “Before” epoch, preceding the onset of somatic remapping. This spatial bias was already present during the “Familiar” epoch, before the reward switch, indicating that features of future somatic tuning preexist within dendritic subthreshold dynamics. By contrast, after context switch, novel tuning emerged in distal dendrites during the “Before” epoch (Fig. 4, B and C, and fig. S15). These initial spatial asymmetries were followed by the recruitment of additional dendritic compartments, resulting in a more spatially uniform tuning as learning progressed. The spatial gradients observed across dendrites were consistent with the evolution of suprathreshold tuning under the corresponding behavioral conditions and further revealed predictive features that precede and predict the reorganization of somatic representations.
We next asked whether individual dendrites undergo similar transi- tions or instead exhibit distinct, compartment- specific temporal dy- namics. We found that in parallel with the somatic remapping represented by concurrent up- regulation of novel PFs and down- regulation of familiar PFs, dendrites exhibited distinct temporal evolu- tion of their familiar and novel TCs (Fig. 4D). Using hierarchical clustering on this joint progression, we identified three primary pat- terns (Fig. 4E). Notably, dendrites with independent tuning preferen- tially showed early up- regulation of new spatial representations, suggesting that these compartments may initiate remapping.
Lastly, we investigated how dendrites can rapidly generate new spatial tuning. A k- nearest neighbor decoder trained on the NMF- derived latent embedding (Fig. 4, F and G, and fig. S16) recapitulated the leading role of proximal dendrites during reward translocation and further revealed that dendritic activity occasionally predicted fu- ture somatic tuning states before behavioral change (Fig. 4, H and I). Specifically, when the decoder failed to match the current somatic state, dendritic activity exhibited increased representation of the fu- ture PF, further indicating that features of upcoming somatic tuning are already present within dendritic subpopulations. These findings reveal a latent organization in dendritic subthreshold activity, in which future somatic representations are already embedded in ongoing sig- nals and align with somatic activity in a context- dependent manner.
Compartmentalized dendritic dynamics during sharp- wave ripples Previous studies suggest distinct activity dynamics of place cells and nonplace cells during SWRs (32–34). To determine whether this dis- tinction extends to dendritic dynamics in CA3, we combined somato- dendritic voltage imaging with local field potential recordings in contralateral CA1 (fig. S17A) (35, 36). During SWRs, place cells exhib- ited higher somatic firing rates and dendritic fast spike rates than nonplace cells (fig. S17B) (33, 34), particularly in basal and apical com- partments. In addition, place cells showed a greater fraction of den- dritic branches active during SWRs (fig. S17C) (18), indicating more widespread dendritic recruitment (37). We next examined the tempo- ral structure of spikes across dendritic domains relative to SWR peaks. Basal and apical dendrites showed earlier spike times than the other domains and relative to SWR peaks (fig. S18A), and the proximal ROIs showed spikes earlier than distal ROIs (fig. S18B), which is consistent with recurrent inputs targeting proximal dendrites and contribut- ing to SWR generation (38–40). To characterize subthreshold voltage
dynamics during SWRs, principal components analysis and hierarchi- cal clustering identified three classes of events: depolarizing, hyper- polarizing, and nonmodulated events (fig. S17, D and E). Proximal dendritic waveforms were more like somatic waveforms than distal dendritic waveforms (fig. S19A), which is consistent with stronger somato- dendritic coupling in proximal compartments. Depolarizing events occurred more frequently in basal and apical dendrites of place cells, whereas hyperpolarizing events were less frequent across dendritic domains in place cells as compared with nonplace cells (fig. S17F), indicating enhanced dendritic depolarization and reduced inhibition during SWRs. To further evaluate the contribution of synaptic inputs, we analyzed SWRs lacking concurrent somatic depolarization. Under these conditions, dendrites of place cells still exhibited larger depo- larizations and more depolarizing events than those of nonplace cells (fig. S19, B to D), suggesting contributions of both elevated den- dritic excitability and different excitation- inhibition balance of inputs. Lastly, we asked whether dendritic dynamics during spatial navigation predict coordination during SWRs. Dendritic ROI pairs with highly correlated spatial tuning during navigation exhibited more similar spike- count dynamics and subthreshold activity during SWRs than weakly correlated pairs (fig. S17, G to I), indicating that spatially co- tuned dendrites retain coordinated dynamics during subsequent SWRs.
Discussion We conducted an in- depth analysis of dendritic function in mammalian cortical pyramidal neurons, assessed with two- photon voltage imaging across subcellular compartments in behaving animals. The results provide new insights into the in vivo dynamics of subcellular repre- sentations in single CA3PNs (fig. S20). We present in vivo evidence that distinct dendritic computations support goal- directed navigation and context representation. Soma- independent dendritic activity enables the formation and maintenance of subcellular representations of space, reward, and context with conditional coupling to the somatic output. This mechanism may enable dendrites to represent not only online (present) environmental features and task variables but also retain (past) memories of recent reward locations or precede (future) remapping of somatic output in the global environmental context.
At the suprathreshold level, somatodendritic coupling is flexibly reconfigured in response to behavioral demands, giving rise to distinct reorganization motifs within individual CA3PNs. In the reward trans- location paradigm, reorganization followed a centrifugal pattern, which may provide an efficient strategy for rapidly updating salient, local information while preserving the broader spatial context. By contrast, during global context switch, reorganization exhibited a dendrite- driven centripetal pattern, in which distal dendrites ex- pressed new representations before somatic remapping. Together, these observations indicate that both the degree of somatodendritic coupling and the directionality of reorganization are dynamically regu- lated by behavioral context, revealing a flexible single- neuron scheme that supports both rapid updating and de novo formation of spatial representations. Consistent with this flexible organization, dendritic activity patterns observed during spatial navigation were maintained during subsequent SWRs. These active and cooperative dendritic dy- namics may support memory reactivation and consolidation of place cell activity patterns.
Beyond suprathreshold voltage dynamics, our analysis of subthresh- old Vm reveals an additional layer of dendritic computation that links local activity to somatic output. Dendritic subthreshold dynamics pre- ceding the somatic PF predict trial- by- trial variability in somatic spa- tial tuning, indicating that dendritic activity encodes latent structure that shapes subsequent somatic output. Moreover, we uncover a distinct mode of somatodendritic coordination in which dendritic depolarization precedes somatic activation on the millisecond times- cale and, collectively, could drive somatic PF activity on a behav- ioral timescale.
3.0
B C
G
Soma
soma
soma
Soma
Soma
Soma
Soma
Soma
Lap # 20 soma basal
2.0
2.0
Lap #
Lap #
Familiar During Remapped
Remapped
Remapped
Familiar
Familiar
During
During
Remapped
Remapped
Familiar
Familiar
During
During
Remapped
Remapped
Familiar
During
Familiar
During
Familiar
Remapped
Familiar
Remapped
Familiar
Remapped
Lap # 20 Lap # 20 Lap # 20 tuft apical
Before
Before
Before
Before
Before
Before
Before
Before
Position (m)
0 3 Position (m)
0.3
-0.3
F
Familiar TC
Familiar TC Upregulation of
Familiar TC
Novel TC
Novel TC
Novel
Magnitude of TC (z-scored W)
Magnitude of TC (z-scored W)
dend
dend
-1
-1
1.0
1.0
-1
-1
-1.0
-1.0
1.0
*
*
*
E Pattern 1 Pattern 2 Pattern 3 *
Change from Familiar
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
-0.2
0.2
0.1
-0.1
Before -During
Before -During
Before -During
0.8
0.8
0.6
0.6
0.6
0.4
0.4
0.4
Global context Switch
0.8
0.8
0.8
0.6
0.6
0.6
0.4
0.4
0.4
Reward translocation
Reward translocation
Correct
Failed
Correct
Failed
Reward translocation
I
* 0.6
0.4
Reward translocation
0.25
0.8
0.4
Fraction
0.6
0.4
After
Reward translocation
0.25
0.0
w / iso-TC
wo / iso-TC
Before After
Before After
Fig. 4. Compartment- specific subthreshold coordination in dendrites associated with somatic remapping across distinct behavior paradigms. (A) Subthreshold
activity heatmaps of dendrites and their parent soma during the somatic place field (PF) remapping process, initiated by reward translocation (left). Representative somatic
tuning curves (TCs) extracted from the heatmap (right). Remapping epochs are categorized as: “Familiar” (baseline laps); “Before” (after reward translocation or context
switching, before somatic PF formation); “During” (after PF formation, but before stabilization); and “Remapped” (after stabilization of new PFs) (see materials and methods
and fig. S13). (B) Magnitude (W) of dendritic TCs, same as newly stabilized in soma, during each remapping epoch as a function of distance from soma (top: reward
translocation; bottom: global context switch). Solid lines represent linear regression fitting with 95% confidence intervals (Reward translocation: Familiar, R = −0.25, P = 0.03;
Before, R = −0.23, P = 0.044; During, R = −0.12, P = 0.314; Remapped, R = −0.07, P = 0.562. Global context switch: Familiar, R = 0.02, P = 0.907; Before, R = 0.37, P = 0.002;
During, R = −0.12, P = 0.344; Remapped, R = −0.05, P = 0.682). Dashed lines indicate mean values of magnitude during Familiar epoch. The marker shapes correspond to
the dendritic domains (basal: square; apical: cross; tuft: inverted triangle). (C) (Left) Box plots for (B) categorized by each domain (red: soma; green: basal; sky blue: apical;
purple: tuft dendrites). (Right) Those for the magnitude of TCs identified as PFs during familiar environments. Their scatterplots as a function of distance from soma are shown
in fig. S14. (D) Box plots for the magnitudes of novel TCs and familiar TCs, categorized by each dendritic transition during the remapping process. (E) (Left) Identified dendritic
remapping patterns in reward translocation (see materials and methods). Yellow and purple indicate novel and familiar TCs, respectively. (Right) Fraction of remapping patterns
between the dendrites with (w / iso- TC, 42 dendritic ROIs) and without (wo / iso- TC, 29 dendritic ROIs) local TCs during the familiar virtual reality environment (χ2 test; χ2(1, 71) =
13.64, P < 0.0001). (F) NMF- based latent embedding of somatic and dendritic TCs used for k- nearest neighbor (kNN) decoding, with UMAP applied for 3D visualization. The
color scale indicates lap progression, ranging from blue (early laps) to red (late laps). (G) Performance of the kNN decoder for each domain plotted as a function of laps.
(H) Comparison of the magnitudes of novel or familiar TCs, including dendritic TCs [correct versus failed prediction (pred.) during familiar environments] and somatic TCs
(before versus after remapping). Statistical analysis was performed using analysis of variance (familiar TC: F(3,2175) = 94.97, P = 9.28 × 10−58, novel TC: F(3, 2175) = 148.23,
P = 1.66 × 10−87). (I) Averaged waveforms of all TCs are categorized in (H).
Familiar Before During Remapped
Magnitude of Novel TC (W)
Magnitude of Novel TC (W)
r = -0.25 r = -0.23 r = -0.12 r = -0.07
2 ∆F/F (Z)
200 0 400
r = 0.02 r = 0.37 r =0.12 r = -0.05
1 0 2 3
200 0 400 200 0 400 200 0 400
Distance from soma (µm) 200 0 400 200 0 400 200 0 400 200 0 400
Downregulation of
1 Lap #
early late
Latent 1
Latent 2
Magnitude of TC (W)
Magnitude of TC (W)
45% 36% 19%
5% 45% 50%
10 20 30 40 0
Apical6
10 20 30 40 0 10 20 30 40 0
Familiar TC Novel TC
Familiar TC Novel TC
Dend (Failed) Dend (Correct)
Dend (Failed) Dend (Correct)
Magnitude of TC (W) Magnitude of TC (W)
Basal2
10 20 30 40 0 Reward translocation
Apical8
0.75
0.75
0.50
0.50
norm. amplitude
Position (cm) from peak of PF -50 0 50 -50 0 50
soma basal apica tuft
Dend (Failed pred.)
Dend (Correct pred.)
Soma Dend
At the population level, the hippocampal spatial map emerges from the coordinated activity of structured, sequential ensembles of place cells. Accordingly, somatodendritic activity dynamics of individual place cells should be best interpreted within the framework of this network- level organization. We speculate that the location- specific and temporally disconnected predictive power of dendritic activity that we observed (Fig. 1, G to L) may reflect the integration of network- level sequences within dendrites. Indeed, at the cellular level, individual den- drites have been shown to receive organized and sequential synaptic inputs (41). Such integration could provide an instructive signal about an animal’s current location, which then evolves into the subsequent somatic PFs. This perspective could link population- level cell ensembles with localized dendritic processing (synaptic ensembles), suggesting that individual PFs are not isolated units but are coordinated compo- nents of a larger sequential representation of the environment.
Upon reorganization in response to environmental change, den- dritic subthreshold patterns predict subsequent somatic remapping. Under reward translocation, features of future spatial tuning are pres- ent in dendritic subthreshold dynamics even before the environmental change. Because environmental structure is partially preserved during reward translocation, preexisting dendritic representations can inter- act with incoming inputs to shape reorganization, biasing the balance of input pathways toward somatic and proximal dendritic inputs over distal, entorhinal- driven inputs. Collectively, these findings indicate that dendritic subthreshold activity constitutes a multitimescale sub- strate that integrates past, ongoing, and prospective representations, dynamically organizing these signals to shape somatic output while preserving flexibility. Although the mechanism underlying dynamic segregation and coupling of dendritic electrical signals from the so- matic output remains to be determined, it is likely that both biophysi- cal mechanisms (42) and subcellular domain- specific γ- aminobutyric acid (GABAergic)–releasing inhibition play roles in regulating somato- dendritic spike coupling and remapping (43–47).
These observations provide compelling evidence for the long- held hypothesis that dendrites operate as conditionally independent process- ing units (2, 48, 49). The diverse somatodendritic dynamics revealed in the present study enhance the computational power of CA3PNs by enabling parallel input processing and signal integration. Although the specific biophysical nature of the dendritic events remains to be determined by future studies, this study provides empirical support for dendritic autonomy and highlights its role in the flexible feature selectivity of single neurons. Our results further position subthreshold dynamics as a substrate for dynamic neuronal representations under- lying memory formation, revealing a high- dimensional layer of orga- nization that shapes neuronal computation. This principle may extend beyond the hippocampus and pyramidal neurons, offering a broader framework for understanding neuronal computation in general.
ReFeReNces aND NOtes
S. Kim, S. J. Guzman, H. Hu, P. Jonas, Nat. Neurosci. 15, 600–606 (2012).
S. V. Rolotti, H. Blockus, F. T. Sparks, J. B. Priestley, A. Losonczy, Neuron 110, 977–991.e4 (2022).
org/10.1101/2023.05.25.542363. 23. K. C. Gonzalez et al., Neuron 114, 1877 (2026). 24. M. A. Land et al., Nat. Methods 23, 986–997 (2026). 25. J. Carolan et al., Nat. Commun. 16, 8834 (2025). 26. B. H. Lee et al., bioRxiv 10.64898/2026.01.03.696606 [Preprint] (2026). https://doi.
org/10.64898/2026.01.03.696606. 27. X. Wu et al., bioRxiv 10.64898/2026.01.18.700189 [Preprint] (2026). https://doi.
org/10.64898/2026.01.18.700189. 28. A. Losonczy, J. C. Magee, Neuron 50, 291–307 (2006). 29. J. C. Bowler et al., eLife 13, RP97433 (2025). 30. J. B. Priestley, J. C. Bowler, S. V. Rolotti, S. Fusi, A. Losonczy, Neuron 110, 1978–1992.e6 (2022). 31. S. M. Lundberg, G. G. Erion, S.- I. Lee, arXiv:1802.03888 [cs.LG] (2018). 32. A. K. Lee, M. A. Wilson, Neuron 36, 1183–1194 (2002). 33. K. C. Bittner et al., Nat. Neurosci. 18, 1133–1142 (2015). 34. S. Yagi, H. Igata, Y. Ikegaya, T. Sasaki, Cell Rep. 42, 112871 (2023). 35. A. C. Singer, L. M. Frank, Neuron 64, 910–921 (2009). 36. E. Hwaun, L. L. Colgin, Hippocampus 29, 921–938 (2019). 37. J. H. L. P. Sadowski, M. W. Jones, J. R. Mellor, Cell Rep. 14, 1916–1929 (2016). 38. G. Buzsáki, Hippocampus 25, 1073–1188 (2015). 39. X. G. Li, P. Somogyi, A. Ylinen, G. Buzsáki, J. Comp. Neurol. 339, 181–208 (1994). 40. C. Le Duigou, J. Simonnet, M. T. Teleñczuk, D. Fricker, R. Miles, Front. Cell. Neurosci. 7, 262
(2014). 41. T. Ishikawa, Y. Ikegaya, Sci. Adv. 6, eaay1492 (2020). 42. B. F. Behabadi, B. W. Mel, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 498–503 (2014). 43. M. Jadi, A. Polsky, J. Schiller, B. W. Mel, PLOS Comput. Biol. 8, e1002550 (2012). 44. J. Bono, C. Clopath, Nat. Commun. 8, 706 (2017). 45. J. R. Boivin, E. Nedivi, Curr. Opin. Neurobiol. 51, 16–22 (2018). 46. N. Jeong et al., Nature 642, 1007–1015 (2025). 47. V. Robert et al., Science 390, eadn0623 (2025). 48. P. Poirazi, T. Brannon, B. W. Mel, Neuron 37, 989–999 (2003). 49. C. Koch, I. Segev, Nat. Neurosci. 3 (suppl.), 1171–1177 (2000). 50. A. Noguchi et al., Parallel Independent Voltage Computing along Dendrites of CA3
Pyramidal Neurons, Dryad (2026); https://doi.org/10.5061/dryad.hmgqnkb07.
acKNOWleDGMeNts We thank F. Polleux, B. Y. Rao, T. Mihaila, and A. Shah for comments on an early version of the manuscript. Confocal imaging was performed with support from the Zuckerman Institute’s Cellular Imaging platform. Funding: This work is supported by the Human Frontier Science Program (HFSP) Fellowship LT0003/2024- L (DOI: 10.52044/HFSP.LT00032024- L.pc. gr.194283) and Overseas Research Fellowships (Japan Society for the Promotion of Science) to A.N.; by the Brain and Behavior Research Foundation to S.T.; by National Institute of Mental Health R01MH124047 and R01MH124867, National Institute on Aging RF1AG080818, National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) Brain Initiative U01NS115530, NINDS R01NS121106, NINDS R01NS131728, and NINDS Brain Initiative R01NS133381 to A.L.; by the Klingenstein- Simons Fellowship Award in Neuroscience, the McNair Medical Foundation, Welch Foundation grant Q- 2016- 20190330, NIH R01EB027145, U01NS113294, U01NS118288, U01NS133971, and R01NS136027 to F.S.- P.; and by 2025- 3.1.1- ED- 2025- 027, 2025- 1.3.3- NEURO- 2025- 01, NKKP Excellence 153978, 2025- 3.1.1- ED- 2026, 2020- 2.1.1- ED- 2021- 00190, 2020- 1.1.3- IPARJOG- 2023- 00477, 2020- 2.1.1- ED- 2022- 00208, 2021- 1.1.4- GYORSÍTÓSÁV- 2022- 064, 2022- 2.1.1- NL- 2022- 00012, 2022- 1.1.1- KK- 2022- 05 Demján Sándor, 2024/1+1/2598, 2020- 1.1.5- GYORSÍTÓSÁV- 2021- 04, and GINOP_PLUSZ- 2.1.1- 21- 2022- 0143 to B.J.R. Author contributions: Conceptualization: A.N., S.T., A.L.; Data curation: A.N., S.T.; Formal analysis: A.N., S.T.; Funding acquisition: A.N., S.T., F.S.- P., B.J.R., A.L.; Investigation: A.N., S.T., A.L.; Methodology: A.N., G.N.Z., S.T., C.O’T., L.R., M.A.L., B.J.R., F.S.- P., A.L.; Project administration: B.J.R., F.S.- P., A.L.; Resources: F.S.- P., M.A.L., A.L.; Software: A.N., S.T.; Supervision: B.J.R., F.S.- P., A.L.; Validation: A.N., S.T.; Visualization: A.N., S.T.; Writing – original draft: A.N., S.T., A.L.; Writing – review & editing: All authors. Competing interests: F.S.- P. holds a US patent for a voltage sensor design that covers JEDI3sub, the voltage indicator used in this study (patent no. US9606100 B2, “Fluorescent protein voltage sensors for measuring membrane potential and imaging high- frequency neuronal electrical activity”). F.S.- P. received consulting fees from Flagship Pioneering for work on general aspects of voltage sensor development and application; these activities are unrelated to the specific study reported here. B.J.R. is a founder of Femtonics and a member of its scientific advisory board. Data, code, and materials availability: Datasets included in this study are available upon publication at Dryad (50). License information: Copyright © 2026 the authors, some rights reserved; exclusive licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original US government works. https://www.science. org/about/science- licenses- journal- article- reuse
sUPPleMeNtaRY MateRials science.org/doi/10.1126/science.aeh9302 Materials and Methods; Figs. S1 to S20; MDAR Reproducibility Checklist
Structure and evolution- guided design of minimal RNA- guided nucleases
Petr Skopintsev1,2†, Isabel Esain- Garcia1,2†, Evan C. DeTurk1,2†‡,
Peter H. Yoon1,3, Zehan Zhou1,3, Trevor Weiss4, Maris Kamalu4,
Ajit Chamraj1,3, Kenneth J. Loi1,2, Conner J. Langeberg1,2,
Ron S. Boger1,2,5, Hunter Nisonoff6, Hannah M. Karp1,7,
Lin-Xing Chen8§, Honglue Shi1,2, Kamakshi Vohra1,2¶,
Jillian F. Banfield1,8,9, Jamie H. D. Cate1,2,3,5,10, Steven E. Jacobsen4,11,
Jennifer A. Doudna1,2,3,5,10,12,13,14,15*
The design of RNA- guided nucleases with properties not limited by evolution can expand programmable genome- editing capabilities. However, generating diverse multidomain proteins with robust enzymatic properties remains challenging. Here, we use a protein design strategy that couples a structure- guided inverse- folding model with evolution- informed residue constraints to generate active, divergent variants of TnpB, a minimal CRISPR- Cas12–like nuclease, termed SynTnpBs. High- throughput screening of artificial intelligence–generated variants yielded editors that retained or exceeded wild- type activity in bacterial, plant, and human cells. Cryo–electron microscopy–based structure determination of the most divergent variant revealed stabilizing contacts in the RNA–DNA interfaces across conformations, demonstrating the design potential of this approach. Together, these results establish a strategy for creating non- natural RNA- guided nucleases and conformationally active nucleic acid binders, enlarging the designable protein space.
CRISPR- Cas systems have revolutionized genome editing by en- abling programmable, sequence- specific DNA and RNA targeting, forming a foundation for precise genetic and epigenetic perturbations (1–7). Protein design has the potential to extend these capabilities by creating RNA- guided nucleases with functions and properties, includ- ing sequence and structures, that are not observed in nature.
However, design of this type is particularly challenging because these nucleases are multidomain nucleic acid binders whose activity depends on coordinated RNA and DNA recognition, activation, and cleavage by distinct conformational states (8–11). Sequence- based biological lan- guage models (LMs) trained on evolutionary data can generate RNA- guided nucleases by inferring sequence–function relationships, but the active nucleases they produce often remain highly similar to the refer- ence sequences they are trained on, even after extensive post hoc filtering (12, 13). Structure- guided rational design approaches offer a robust strat- egy to sample highly divergent protein sequences, and also structures not found in nature, extending into de novo design (14–19). Although this approach has been successful for the generation of dynamic switches and DNA binders (20–22), the design of complex enzymes, such as
1Innovative Genomics Institute, University of California, Berkeley, Berkeley, CA, USA. 2California Institute for Quantitative Biosciences (QB3), University of California, Berkeley, Berkeley, CA,
USA. 3Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley, Berkeley, CA, USA. 4Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California at
Los Angeles, Los Angeles, CA, USA. 5Biophysics Graduate Group, University of California, Berkeley, Berkeley, CA, CA, USA. 6Center for Computational Biology, University of California Berkeley,
Berkeley, CA, USA. 7Department of Chemistry, University of California, Berkeley, Berkeley, CA, USA. 8Department of Earth and Planetary Science, University of California, Berkeley, CA, USA.
9Department of Microbiology, Biomedicine Discovery Institute, Monash University, Clayton, Victoria, Australia. 10Molecular Biophysics and Integrated Bioimaging Division, Lawrence Berkeley
National Laboratory, Berkeley, CA, USA. 11Howard Hughes Medical Institute (HHMI), University of California at Los Angeles, Los Angeles, CA, USA. 12Howard Hughes Medical Institute, University
of California, Berkeley, Berkeley, CA, USA. 13Li Ka Shing Center for Genomic Engineering, University of California, Berkeley, Berkeley, CA, USA. 14Gladstone Institute of Data Science and
Biotechnology, San Francisco, CA, USA. 15Gladstone- UCSF Institute of Genomic Immunology, San Francisco, CA, USA. *Corresponding author. Email: doudna@ berkeley. edu †These authors
contributed equally to this work. ‡Present address: Department of History and Philosophy of Science, University of Cambridge, Cambridge, UK. §Present address: State Key Laboratory of
Advanced Environmental Technology, School of Environment, University of Science and Technology of China, Hefei, China. ¶Present address: The Biochemistry, Quantitative Biology, Biophysics
and Structural Biology Track, Yale University, New Haven, CT, USA.
We reasoned that inverse protein- folding models (17–19), a structure- conditioned approach, coupled with evolutionary information could generate highly diverse proteins while retaining function. To test the potential of such a design strategy, we selected TnpB, a diverse family of small transposon- encoded ancestors of CRISPR- Cas12 nucleases that mediate RNA- guided DNA cleavage, transcriptional regulation, and genome targeting across all kingdoms of life (23–29). These fea- tures render TnpBs as a promising scaffold for exploring RNA- guided nucleases not produced by natural evolution.
Evolution- and structure- conditioned inverse folding of TnpB using ESM- IF1 We began our study by evaluating in silico whether the ESM Inverse Folding (ESM- IF1) model (18) could redesign the minimal RNA- guided nuclease ISDra2 TnpB to create functional enzymes with non- natural sequences. ESM- IF1–generated sequences accurately recapitulated the input fold predicted by AlphaFold2 (30) (Fig. 1A and fig. S1A), pre- served the DED catalytic triad in the RuvC domain (Fig. 1B and fig. S1B), and captured amino acid variation found among natural homologs (fig. S1, C and D) (18). By contrast, LigandMPNN (19, 31) reproduced the TnpB fold but failed to maintain the catalytic triad across all model generation temperatures.
Phylogenetic analysis placed ESM- IF1 sequences in a distinct clade from that of natural TnpBs (Fig. 1C), sharing only 50 to 60% identity with ISDra2 TnpB, basal to this clade (fig. S1, E and F). The model produced chemically conservative substitutions across the DNA–RNA interface (Fig. 1B). However, it also introduced nonsynonymous muta- tions at residues K76, F77, and T123, known to mediate nucleobase- specific recognition of the transposon- associated motif (TAM) sequence (32), a short DNA motif priming TnpB activation similar to the protospacer adjacent motif (PAM) of CRISPR- Cas9 (1). Similarly, residue substitutions diverging from the wild- type (WT) ISDra2 TnpB occurred at the interface between the protein and its guide RNA (or reRNA for TnpB). This suggests that ESM- IF1 captures TnpB’s fold and catalytic DED motif and partially recovers nucleic acid–binding resi- dues, but misassigns some contact positions in the absence of a cog- nate RNA–DNA context.
We therefore explored targeted conditioning to enforce functional protein- RNA and protein- DNA contacts. Typically, inverse- folding models fix residues within a defined radius of experimentally resolved bound li- gands (33). For TnpB, however, the 49- kDa RNA–DNA heteroduplex binds the 46- kDa protein over a large interface, requiring many residues to be fixed and leaving little space to redesign. Furthermore, for dynamic pro- teins such as RNA- guided nucleases, available cryo–electron microscopy (cryo-EM) structures (32, 34) may miss transient protein- DNA/RNA con- tacts, which may result in not fixing all residues necessary for function.
To address this issue, we developed a masking strategy for inverse folding that introduced functionally critical residues from evolutionary data. Pairwise evolutionary couplings derived from Potts models in phys- ics have been foundational for inferring residue contacts, guiding pro- tein structure prediction, predicting protein- protein contacts, and estimating mutational effects (35–38). Previous bioinformatic studies showed that DNA and RNA binding residues can be identified from
i
i
i
ESM-IF1
ESM-IF
DNA
C D
ISDra2
Fig. 1. RNA- guided nuclease TnpB design strategy with an ESM Inverse Folding (ESM- IF1) model. (A) ESM- IF1 generates sequences that consistently fold into ISDra2 TnpB structure
via AlphaFold2 (30) (B) RuvC catalytic residues returned by ESM- IF are similar to the WT, whereas those that bind to the nucleic acids vary between WT and ESM- IF sequences.
(C) Phylogenetic analysis shows that sequences generated by ESM‐ IF1 cluster into a distinct clade, reflecting substantial divergence from natural TnpBs. Nodes with ≥90% bootstrap
support are marked with gray dots. (D) To preserve ISDra2 TnpB- specific nucleic acid–binding residues in the generated sequences, the ESM- IF model is conditioned on WT residues
conserved above a chosen threshold for positional conservation Ci or coevolutionary coupling strength σi to the ligand nucleic acids. By increasing the (Ci, σi) thresholds, the divergence from
the WT ISDra2 TnpB is gradually increased, ultimately yielding fully unconstrained sequences. Consensus sequences at selected parameters are then calculated and tested for activity.
Consensus
Natural TnpBs
Structure
Evolution
ESM Inverse Folding
Generated sequences
Consensus
Positional conservation Ci
WT
Test
Ci
Coupling strength
phylogenetic conservation or evolutionary couplings (39, 40). We thus derived positional conservation Ci values for TnpB residues i from multiple- sequence alignments of natural TnpBs, and coupling signals σi from a Potts model (GREMLIN) (37) trained on either paired TnpB– RNA or TnpB–DNA sequences mined from genomic databases (materi- als and methods and fig. S2). Residues exceeding given Ci, σi thresholds C0, σ0 were fixed to their WT identities in ISDra2 TnpB, producing se- quence masks for conditional ESM- IF1 generation. Varying thresholds C0, σ0 effectively tuned the balance between structural and evolutionary input to the model (Fig. 1D). We further found that the consensus aver- aging of generated sequences had lower model perplexity than indi- vidual sequences, indicating improved fold- compatibility and possibly higher chances of activity (fig. S3).
Input
High- throughput bacterial screens identify active variants Our design objective was to experimentally determine which (C0, σ0 ) combinations produced active nucleases while minimizing fixed resi- dues, thereby maximizing the sampled sequence space and exploring synthetic TnpB diversity. To maximize the generation rate of active proteins, we tested consensus sequences derived from 10,000 ESM- IF1
WT residues AI-generated residues DNA RNA
AF2 model
WT TnpB
generations per C0 or dual (C0, σ0) conditions. To screen the gener- ated TnpB variants for activity, we used a bacterial assay in which cell recovery is proportional to TnpB- mediated cleavage of a plasmid car- rying the ccdB toxin gene (41) (Fig. 2, A to C).
Using spot plating to test full- length proteins generated for a range of conservation (Ci) thresholds (C0) and model temperatures (T), we observed that three variants at C0 = 0.25 and 0.35 exhibited activity, with survival levels of 103 to 104 colony- forming units (CFU)/μg, albeit lower than the 106 CFU/μg for the WT (C0 = 0.0; Fig. 2D). We hypoth- esized that as TnpBs are multidomain proteins, the different lobes may not tolerate comparable mutational depth or achieve similar genera- tion success. Therefore, we implemented a split- domain strategy in which the generated DNA and RNA binding domains, referred to as REC and NUC respectively, were experimentally tested separately.
Inspired by the domain- swapping strategy previously applied to CRISPR-Cas9 engineering (42), we fused the artificial intelligence (AI)–generated lobes to their WT counterparts to assess them individu- ally (Fig. 2, E and F). Supporting our hypothesis, the lobes exhibited different tolerances to sequence divergence. Only one AI- generated REC-lobe variant at C0 = 0.25 was functional when fused to the WT
Output Model
Conditioned on the mask
WT residues mask (Ci,
thresholds)
Protein residue i RNA
Steering ( ) thresholds
Sampling sequence space
B
DNA REC lobe
E F
G
Fig. 2. Screening AI- generated SynTnpB variants conditioned on positional conservation (Ci) and coupling strength (σi) thresholds. (A) Split- lobe design of TnpB (depicted
with 8EXA model) allowed combinatorial testing of REC and NUC lobes. Plasmids expressing TnpB variants were electroporated into E. coli cells carrying an arabinose- inducible
toxin (pBAD- ccdB). Active variants cleave the toxin plasmid, enabling survival on selective agar. (B) Activity was assessed by spot plating (top) or by pooled bacterial selection
coupled to high- throughput sequencing (bottom). The equation terms denote the abundance of each generated variant expression plasmid in the initial transformed library (P0),
selection plate (S), and nonselective plate (R). A denotes transformation and growth bias, and F selection fitness associated with toxin- plasmid cleavage. (C) Log10 enrichment of
generated variants across two experimental replicates. Data were normalized such that reference WT ISDra2 TnpB enrichment = 1. Enrichment versus identity to WT is depicted in
fig. S4. (D) Activities of full- length variants generated across Ci thresholds at two ESM- IF1 sampling temperatures. Bars show mean ± SD from three replicates. (E and F) Cleavage activi-
ties of REC (E) and NUC (F) lobes tested individually with their WT counterparts. (G) Recovery of top variants [1980 tested in (C)] assembled from REC and NUC lobes conditioned on
both (Ci, σi) thresholds. (H and I) Heat maps showing enrichment of AI- generated REC (H) and NUC (I) lobes over (Ci, σi) thresholds, averaged over all fused combinations.
I
WT
often higher than that of the WT, for C0 thresholds with values as high as 0.65. These results suggest that the NUC lobe accepts higher levels of divergence from the WT, whereas the REC lobe is more sensitive to substitutions under single- parameter (Ci) conditioning.
diversity of active variants, we tested a dual- conditioning strategy by fix ing residues according to both positional conservation (Ci) and pro- tein–nucleobase coupling strength (σi). REC and NUC lobes were in- dependently generated under (C0, σ0) thresholds (materials and methods; figs. S2, S4, and S5) and assayed in all pairwise REC–NUC combinations (44 × 45 lobes; 1980 fusions) using a high- throughput pooled library selection assay (Fig. 2B). Activity was quantified as the enrichment of lobe- pair plasmids under selective (+arabinose) versus nonselective (–arabinose) conditions.
0 0
produced a markedly broader distribution of active variants, revealing
TnpB activity measurement
reRNA NUC lobe
101 102 103 104 105 106 107 108
10-1
10-2
10-3
High-throughput readout with sequencing
Replicate 2 Enrichment F
10-3 10-2 10-1 100 101
Replicate 1 Enrichment F
v9
the 466 lobe combinations that had detectable enrichment in bacterial assays (24% of 1980 designs), ~8% exceeded the activity of the WT (Fig. 2C and fig. S6). The most diverse and active variants identified in the pooled assay (SynTnpBs- v1 to v9) were validated by spot plating (Fig. 2G) and were shortlisted for testing in human and plant genome editing assays.
v4
v2
v8
v6
human and plant cells We next evaluated the genome- editing activity of representative SynTnpB variants (v1 to v9), spanning high activity and sequence di- versity ranging from 77 to 91%, and WT ISDra2 in an endogenous blue fluorescent protein (BFP) gene knockout assay in human embryonic kidney 293T (HEK293T) cells using biological triplicates (Fig. 3A and fig. S7). The WT enzyme exhibited an average of 28% editing. Variants v2 to v4 and v6 to v8 showed values comparable to those of the WT in
v3
v7
v5
Fig. 3. AI- generated TnpB genome editing in HEK293T cells. (A) Plasmids encoding variant proteins and corresponding guide reRNAs were cotransfected into HEK293T cells. Editing efficiency was assessed by either (B) BFP gene knockout measured by flow cytometry or (C) NGS quantification of indels at endogenous loci (RUNX1, NIBAN1, EMX1, AGBL1). Statistical significance was determined using a two- tailed Welch’s t test. Data are presented as mean ± SD (n = 3). ns, not significant; P value: ns > 0.05, P ≤ 0.05, P ≤ 0.01, P ≤ 0.001, **P ≤ 0.0001. UTC: untransfected control; NTG; nontargeting guide.
the range of 23 to 32%. Notably, v1 and v5 showed the highest increases in editing efficiencies over WT, with values of 46% (P < 0.001) and 50% (P < 0.001), respectively (Fig. 3B). These results confirmed the success- ful generation of active and diverse variants.
Next, to assess programmability and editing potential, we targeted en dogenous human and plant genomic loci. Four endogenous genes in- terrogated previously, RUNX1, NIBAN1, EMX1, and AGBL1, were targeted by the AI- generated TnpBs in HEK293T cells (23, 43), and the percentage of insertions and deletions (indels) was calculated by next- generation sequencing (NGS). Although most variants exhibited similar activity to that of the WT, v1 and v5 again were the most active variants across the tested loci. Variant v1 showed editing of 26, 26, 28 and 21% for EMX1, AGBL1, NIBAN1, and RUNX1, respectively, while v5 showed 21, 20, 24, and 35%, compared to 7, 18, 25 and 30% for the WT (Fig. 3C). Notably, v1 and v5 showed respective 3.8- and 3.1- fold increases over WT at the EMX1 locus (v1 P < 0.0001, v5 P < 0.01). No significant differences in edit- ing windows were observed between the AI- designed variants and WT ISDra2 TnpB (fig. S8).
We next assessed the specificity of the AI- designed variants using genome- wide Tn5 tagmentation profiling (materials and methods). Variant v1 showed comparable specificity to that of the WT, whereas v5 and v7 had more detectable off- target sites. All variants retained the ca- nonical TTGAT TAM preference (figs. S9 and S10). Western blot analysis in HEK293T and Escherichia coli showed that expression differences across variants do not correlate with editing activity (fig. S11A). Bio- chemical characterization using in vitro cleavage assays revealed that v7 retains robust target strand cleavage activity, albeit with moderately re- duced kinetics relative to WT (fig. S11B). Circular dichroism–based thermal denaturation analysis showed that v7 exhibits comparable thermal stabil- ity to that of the WT, with a melting temperature of 51.2°C (fig. S12) (32).
Because of their minimal size, TnpBs are well suited for plant genome editing by viral vector delivery (44). Thus, we tested the nine selected variants in Arabidopsis protoplast cells by targeting the AtPDS3 gene at four distinct sites. Consistent with the HEK293T results, v1 outper- formed ISDra2 at nearly all tested targets (fig. S13 and table S1).
Conformational dynamics provide mechanistic insights into SynTnpB activity The highly divergent variant v7 showed the highest absolute editing efficiency in our cellular experiments (44% at RUNX1; Fig. 3C). This variant shared 77% sequence identity with the WT (excluding the un- structured C terminus dispensable for activity, which was kept fixed; 83% for the REC lobe, 72% for the NUC lobe). In line with our design objective, approximately one in four residues in v7 was generated by the evolution- conditioned ESM- IF1 model, totaling 85 positions. Many of these residues lined the nucleic acid interface alongside masked WT residues and included both conservative and nonconservative substitu- tions (fig. S14). These results prompted us to examine the structural basis of how AI- introduced substitutions facilitate the SynTnpB cleav- age mechanism. To study how these residues facilitate function in the AI- generated protein v7, we determined its ternary complex structure with cryo- EM, capturing TAM- bound and R- loop–formed states set at 2.8- Å resolution (Fig. 4 and fig. S15).
For both states, in the NUC lobe, the RNA–protein interface exhib- ited a build- up of positive electrostatic potential facilitated by AI- introduced residues K224R, Q227R, T228R, and K245R (Fig. 4, A and B). The RNA was further stabilized by the masked WT residues R232, R238, and K241, which interact with coevolving RNA nucleobases. Additional previously unreported contacts at K256Q and R270K lined the RNA pseudoknot region. Notably, our cryo- EM analysis resolved a TAM- bound conformational intermediate state not previously re- ported for TnpBs. In this state, the protein and RNA conformations closely resembled the binary complex of ISDra2 TnpB [8BF8 in (34)], but the complex was also bound to DNA, containing a single nucleotide pair formed in the guide reRNA–target DNA heteroduplex seed region. Although most of the WT protein- DNA contacts were kept owing to strong coevolution with the TAM motif, the generated N4R substitu- tion stabilized the heteroduplex seed pair together with the conserved “phosphate lock” residue K84 (45) (Fig. 4C). Unlike in the ISDra2 struc ture where the reRNA Stem2 is disordered (34), in v7 Stem 2 is structured and bound to the REC lobe.
D
DNA:RNA heteroduplex seed formed
Fig. 4. Cryo- EM structures of the AI- generated variant v7 reveal RNA–DNA interface residues and conserved conformational motions. (A) Cryo- EM reconstructions of the TAM- bound (heteroduplex seed formed) and (D) R- loop (full heteroduplex) states at 2.8- Å resolution. (B) In the NUC lobe, introduced residues (coral) form contacts with the guide reRNA. (C) The phosphate lock residue K84 stabilizes the first DNA base pairing with the RNA spacer; putative contacts H4R and T88R appear near the heteroduplex seed. (E) Both REC and NUC lobes exhibit additional AI- generated contacts with the RNA:DNA heteroduplex. (F) Conserved conformational motions include lid- domain stabilization and bridge- helix kinking mediated by AI- generated residues (L289R- L293R, and Y214F–L219E). Color scheme: AI- generated residues, red; fixed WT residues, gray; RNA, orange; DNA, cyan.
Our R- loop–formed state closely resembled the previously reported ISDra2 TnpB ternary complex [8EXA in (34)], with the heteroduplex fully formed along the RNA spacer nucleotides 1 to 12 (Fig. 4D). The REC lobe positions the AI- generated T88R, K102E, R108K, R113K, and R160K residues in contact with the heteroduplex. Further, the lid do- main, which caps the substrate- binding cleft, was structured on the heteroduplex through non- natural D283K, R286M, R289H, and L293R contacts (Fig. 4, E and F). Notably, a helical segment largely composed of ESM- IF1–generated residues Y214F, Y215L, R216K, S217K, and L219E preserved the previously observed kink motion that facilitates hetero- duplex formation (Fig. 4F) (34). Structure- guided reversal mutagenesis supports a functional contribution of a substantial fraction of these AI- introduced residues (fig. S16). Finally, the NUC lobe was fully struc- tured and bound the single- stranded DNA substrate in the RuvC cata- lytic pocket, which remained lined by residues found in the WT enzyme.
Together, these structures and reversal mutagenesis suggest that the AI- generated residues introduced electrostatic and hydrogen- bonding networks that likely stabilize the RNA–DNA interface in different pro- tein conformational states. The largely AI- generated segment of the protein preserved the native helix kink, consistent with the protein conformational transitions. Finally, our design approach enabled us to capture a previously unobserved TAM- bound state that may not be fa- vored in the WT but is populated in the AI- generated variant.
Discussion TnpB- family enzymes, which are compact RNA- guided nucleases ances- tral to CRISPR- Cas12, are an attractive target for protein design because they couple programmable DNA targeting and a variety of natural func- tions to a minimal architecture. However, designing such systems has remained limited because sequence- based biological LMs produce pro- teins that remain close to natural sequences, whereas rational design requires explicit programming of the conformational mechanism.
Unlike LMs that generated proteins that retained WT DNA binding domains with >99% identity to natural homologs (fig. S17) (12, 13), our structure- and evolution- guided design approach created DNA- and RNA- interacting lobes with AI- generated contacts that had 83% and 72% identity to their closest counterparts in nature, respectively. The split- design approach further revealed asymmetric tolerance to se- quence change: The DNA- recognition REC lobe was markedly more substitution sensitive than the RNA binding catalytic NUC lobe. We attribute this sensitivity to finely tuned biophysical requirements and stricter evolutionary constraints on TAM search and recognition (46), consistent with the need for separate optimization of the REC and NUC lobes. This modular design principle could generalize to other multidomain proteins. Our masking strategy is agnostic to prior ex- perimental structures and is based on evolutionary information. It preserves critical contacts yet permits emergence of contact networks
that create conformation- specific RNA–DNA interactions across enzy- matic states, as supported by our first insight into the cryo- EM struc- tures of the AI- generated RNA- guided nucleases.
Supporting the outcome of our design strategy, recent deep muta- tional scanning and directed- evolution studies identified that our AI- generated N4R, Q227R, and other substitutions increase ISDra2 TnpB activity (fig. S16) (47, 48). Further, whereas recent AI- guided engi- neering studies have used inverse- folding models to enhance natural proteins with single- point mutations (49, 50), our distinct strategy integrates phylogenetic conservation with protein–RNA/DNA coevolu- tion, enabling the design of highly divergent non- natural proteins.
The appearance of distinct combinations of DNA–RNA contact resi- dues and their alignment with TnpB’s conformational motions raise the possibility that ESM- IF1 may infer fold- and phylogeny- specific protein sequence constraints that give rise to conformational states and residue arrangements compatible with nucleic acid binding, even in the absence of explicit nucleic acid information during training. Refined by evolu- tionary constraints in our approach, this capability establishes a basis for structure- guided design of other multistate proteins or nucleic acid binders, provided that they are diversely and evenly represented in ge- nomic databases together with their cognate DNA and RNA sequences (51–53). Furthermore, it has been proposed that proteins function and evolve as ensembles of conformations rather than as single static struc- tures (54). In that context, the previously unresolved TAM- bound state that we observe likely represents a distinct kinetic intermediate relative to the WT TnpB and provides a precedent for isolating and studying transient conformations that RNA- guided nucleases may sample in na- ture and beyond. Establishing the foundation for design of RNA- guided systems and flexible nucleic acid binders with an evolution- and structure- guided model, we envision extending their functions beyond natural sequence constraints through generative biology (55) and to- ward de novo design, expanding the designable protein space.
ReFeReNces aND NOtes
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acKNOWleDGMeNts
We thank members of the Doudna laboratory and the Innovative Genomics Institute for helpful
discussions and UCSF for giving us access to the high- performance computing cluster Wynton
to meet our computational needs. D. Bulkley and G. Gilbert at the UCSF CryoEM Core are
acknowledged for the support in ternary complex screening; D. Toso, K. Sharma, J. Remis,
P. Tobias, at the Cal- Cryo at QB3- Berkeley for data collection support; UC Berkeley DNA
Sequencing Facility for Sanger and Oxford Nanopore sequencing; QB3 Genomics and IGI
sequencing core for NGS sequencing; C. Citek from the Lawrence Berkeley National Laboratory
and E. Gerbe form the Marqusee’s lab at UC Berkeley for supporting circular dichroism
experiments; Y. Koga from the Cate laboratory for support on Western blotting experiments;
C. Hsu and D. Savage for feedback on the initial manuscript; S. Chitrananda for discussions on
the Potts model; L. E. Valentin- Alvarado for discussions on phylogenetics; B. W. Thornton for
discussions on the library vector design; K. Chen and K. Wasko for providing the BFP HEK293T
cell line; K. Zhou and J. Ye for invaluable technical and organizational support of the Doudna
laboratory; and K. Lucas for leadership and coordination in managing the laboratory’s
operations and research activities. Schematic illustrations in Figs. 2A and 3A were created with
BioRender.com. Funding: This work was supported by an NSF Plant Genome Research Program
grant (2334027) to S.E.J., J.A.D., and J.F.B. J.A.D. and S.E.J. are Investigators of the Howard
Hughes Medical Institute. P.S. was supported by the Swiss National Science Foundation Mobility
fellowship (P500PB_214418). H.S. was supported by a K99 award from the National Institutes of
Health (K99GM160778). A.C. was supported as a summer research student by HHMI. Author
contributions: Conceptualization and methodology: P.S., J.A.D. Computational design: P.S.,
H.N. Bioinformatics: P.S., I.E.- G., C.J.L., L.- X.C., P.H.Y. Cloning and bacterial assays: E.C.D., P.S.,
I.E.- G., A.C., P.H.Y., K.J.L., H.S., K.V. HEK293T experiments: I.E.- G., P.S., P.H.Y., E.C.D., H.M.K. Data
analysis: P.S., I.E.- G., E.C.D., R.S.B. Plant editing and analysis: T.W., M.K., S.E.J. Protein purification:
Z.Z., P.S. Cryo- electron microscopy: P.S., I.E.- G. Writing – original draft: P.S., I.E.- G., E.C.D., J.A.D.
with contributions from all authors. Competing interests: P.S., S.E.J., J.A.D., I.E.- G, and E.C.D.
have filed a patent covering aspects of this work. The Regents of the University of California have
patents pending on technologies on which the authors are inventors. S.E.J. is a cofounder and
consultant for Inari Agriculture and a consultant for Terrana Biosciences, Invaio Sciences, Sail
Biomedicines and Zymo Research. J.F.B. is a cofounder of Metagenomi. J.A.D. is a cofounder of
Aurora Therapeutics, Azalea Therapeutics, Caribou Biosciences, Editas Medicine, Evercrisp, Scribe
Therapeutics, Intellia Therapeutics, and Mammoth Biosciences. J.A.D. is a scientific advisory board
member at BEVC Management, Caribou Biosciences, Evercrisp, Intellia Therapeutics, Isomorphic
Labs, Scribe Therapeutics, Mammoth Biosciences, The Column Group, and Inari. J.A.D. is an
adviser for Aditum Bio and Aurora Therapeutics. J.A.D. is Chief Science Adviser to Sixth Street and
is a Director at Johnson & Johnson, Altos, and Tempus. Data, code, and materials availability:
TAM- bound and R- loop–formed cryoEM states models are deposited in the Protein Data Bank
under accession numbers pdb_00009YYG, pdb_00009YYH. The CryoEM maps are available in
the Electron Microscopy Data Bank under accession numbers EMD- 73644 and EMD- 73645.
Sequences of synthetic oligonucleotides generated in this study are provided in data S2, and
constructs are available upon reasonable request. Sequencing data for the ccdB assay, HEK293T
amplicon sequencing, genome- wide Tn5 off- target profiling, and protoplast amplicon sequencing
have been deposited in the Sequence Read Archive under BioProject PRJNA1454204. Code and
data related to this study are available at https://github.com/pyskop/SynTnpBs and are archived
at Zenodo (56). License information: Copyright © 2026 the authors, some rights reserved;
exclusive licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original US
government works. https://www.science.org/about/science- licenses- journal- article- reuse. This
article is subject to HHMI’s Open Access to Publications policy. HHMI lab heads have previously
granted a nonexclusive CC BY 4.0 license to the public and a sublicensable license to HHMI in their
research articles. Pursuant to those licenses, the Author Accepted Manuscript (AAM) of this article
can be made freely available under a CC BY 4.0 license immediately upon publication.
sUPPleMeNtaRY MateRials
science.org/doi/10.1126/science.aed6123
Materials and Methods; Figs. S1 to S18; Tables S1 to S3; References (57–70);
MDAR Reproducibility Checklist
Production and spectroscopy of cold radioactive molecules
Chandler J. Conn1†, Phelan Yu1†, Madison I. Howard1, Yuxi Yang1,
Chaoqun Zhang2‡, Arian Jadbabaie1§, Aikaterini Gorou1¶,
Alyssa N. Gaiser3,4, Timothy C. Steimle1,
Lan Cheng2, Nicholas R. Hutzler1*
Molecules with heavy, radioactive nuclei promise extreme sensitivity to fundamental nuclear and particle physics. However, these nuclei are available in limited quantities, which challenges their use in precision measurements. Here we demonstrate the gas- phase synthesis, cryogenic cooling, and high- resolution laser spectroscopy of radium monohydroxide, monodeuteroxide, and monofluoride molecules (226RaOH, 226RaOD, and 226RaF) in a tabletop apparatus by combining trace radioactive target production protocols, optically driven chemistry in a cryogenic buffer gas, and low- background spectroscopic detection methods. The molecules are cooled in the lab frame, creating conditions that are the same starting points as those for many current molecular precision measurement and quantum information experiments. This approach can be readily applied to a wide range of species and establishes key capabilities for molecular quantum sensing of exotic nuclei.
Radioactive atoms and molecules are sought for use in studying a wide range of physics including nuclear structure, fundamental symmetries, and stellar processes (1). However, radioactive molecules in particular remain a relatively unexplored area owing to limited availability and associated safety hazards. Recently, there has been great interest in molecules containing heavy, octupole- deformed (“pear- shaped”) nuclei, which amplify sensitivity to nuclear symmetry violations stemming from “new physics” by more than three orders of magnitude compared to spherical nuclei (1–3). Combined with the roughly thousand- fold en- hancement in sensitivity of molecules over atoms (4), these species are extremely sensitive probes of fundamental nuclear properties and phys- ics beyond the Standard Model (BSM).
Among the possible octupole- deformed candidates, radium- containing molecules are compelling owing to the large and relatively well- characterized octupole- shape deformation of radium (5, 6), their large molecular sensitivity to fundamental symmetry violations via a nuclear Schiff moment (2, 7–9), and their distinctive ability to create optically controllable, laser- coolable molecules (9–12). By combining modern quan- tum tools with the large sensitivity enhancements to BSM physics af- forded by molecules containing heavy, deformed nuclei, one can probe far above teraelectron volt energy scales, complementing and extending the reach of state- of- the- art colliders and precision measurements (1, 13).
For precision atomic and molecular experiments, achieving a high degree of motional and internal quantum state control is an essential prerequisite as it enables long interrogation times as well as coherent,
1Division of Physics, Mathematics, and Astronomy, California Institute of Technology, Pasadena, CA, USA. 2Department of Chemistry, Johns Hopkins University, Baltimore, MD, USA. 3Department of Chemistry, Michigan State University, East Lansing, MI, USA. 4Facility for Rare Isotope Beams, Michigan State University, East Lansing, MI, USA. *Corresponding author. Email: cconn@ caltech. edu (C.J.C.); phelanyu@ caltech. edu (P.Y.); hutzler@ caltech. edu (N.R.H.) †These authors contributed equally to this work. ‡Present address: Department of Chemistry, Yale University, New Haven, CT, USA. §Present address: Department of Physics, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA. ¶Present address: Department of Chemistry, University of California, Berkeley, CA, USA.
quantum state–resolved preparation, manipulation, and readout. Recent approaches have made progress in this direction with radium- containing molecules, including RaF spectroscopy using accelerated radioisotope beams (3, 14–16) and the trapping of radium- containing polyatomic molecular ions (17), both with an aim toward precision measurement of fundamental symmetries (10, 18).
Here we report the production, cooling, and high- resolution laser spectroscopy of radium- 226 monohydroxide, monodeuteroxide, and monofluoride molecules (226RaOH, 226RaOD, and 226RaF) at tempera- tures of ∼4 K in a tabletop apparatus. Using pulsed laser ablation of fabricated radium targets, cryogenic buffer gas cooling (19), resonant optical driving of state- selective chemical reactions (20), and high- sensitivity low- background detection methods, we create and study cold and low- velocity (<30 m/s) samples. These species have structures ame- nable to laser cooling and optical trapping for long coherence times and high- fidelity quantum state control and readout (9–12, 21, 22). The poly- atomic species furthermore feature near- degenerate states of opposite parity that enable advanced protocols for precision measurement (23–26) and quantum information (27). This work illustrates a pathway for ap- plying precision molecular science tools—particularly in the areas of BSM searches (4, 28, 29) and quantum information (30, 31)—to short- lived, radioactive systems. More generally, the availability of radioactive mol- ecules for tabletop experiments in a university (or larger) setting enables wide- ranging applications in fundamental physics (1).
In addition to the usual difficulties of working with molecules for precision measurements (4), the primary challenge limiting access to radioactive molecules is low material quantity, often less than a few micrograms. A compounding challenge is the large theoretical uncer- tainties for these very heavy molecules; the electronic energy levels can be predicted (32) with ∼10- THz uncertainty, which is many orders of magnitude larger than the ∼100- MHz linewidth of individual quan- tum states at cryogenic temperatures. In combination, these challenges mean that molecule production and measurement strategies must be efficient. By using an array of broadly tunable continuous- wave (CW) and pulsed dye lasers with a hierarchy of linewidths, we demonstrate material- efficient spectral searches ranging over >10 THz for a priori unknown optical transitions from previously unobserved radioactive molecules. Subsequent laser excitation with progressively decreasing laser linewidth down to single longitudinal mode (Δ𝜈 ≤ 500 kHz) enables us to directly resolve individual, low- lying (N ≤ 9) rotational transitions on molecular vibronic bands with ∼100- MHz Doppler- limited linewidth and few- megahertz resolution. These advances in the radiochemical target preparation, cryogenic source design, chemi- cal production, spectroscopic methods, and detection approaches are readily extendable to a broad range of short- lived radioisotopes and complex molecular structures.
Production and detection of radioactive molecules Cold gas- phase radioactive atoms and molecules are produced inside a copper cryogenic buffer gas cell ~48 cm3 in volume, which is held at a base temperature between 4 and 7 K by a commercial closed- cycle cryocooler. The geometry and optical paths of the cryogenic cell are depicted in Fig. 1. First, atomic and molecular precursors are vaporized by laser ablation of solid targets. Next, molecules are formed by opti- cally driven chemical reactions between radium atoms and reagents. Finally, laser- induced fluorescence from tunable lasers is collected onto a photodetector to measure molecular spectra. These steps are described in detail below.
Within the cell, atomic and molecular precursors are ablated by focused, nanosecond 532 nm Nd:YAG (yttrium- aluminum- garnet) la- sers delivering 5 to 20 mJ of energy per pulse, depending on the target. Molecule production occurs via ablation of separate targets for the radioisotope and the ligand species, allowing for species- selective pro- duction by switching between targets in situ. Radioisotope targets containing 10 to 50 μCi (0.37 to 1.85 MBq, 44 to 221 nmol) of radium
A
C
B
Fig. 1. The experimental apparatus. (A) A cutaway render of the cryostat without gas or electrical feedthroughs. The
entire system is less than a meter tall, and the experiment fits on an optical table. (B) Detail of the copper cell where
molecules are produced and studied spectroscopically. Pulsed ablation lasers vaporize reagents off a target plate, which fill
the cell interior and thermalize with cold helium buffer gas. Probe lasers are sent through an orthogonal axis. A light-
collection lens, parallel to the ablation axis but offset by 4 cm, collimates laser- induced fluorescence to be detected by a
photomultiplier tube external to the cryostat. The cell is vacuum- sealed to mitigate the spread of radioisotope contamina-
tion to the larger cryostat. The example target plate shows the drop- cast radium target on gold foil surrounded by various
reagents and Yb metal for testing. (C) Resonant laser- induced fluorescence of RaOH molecules recorded after ablation
while addressing the C̃2Σ+−X̃2Σ+ band system. Time- dependent traces depict concurrently recorded fluorescence from
fixed- frequency “normalization” laser excitation (blue, top), and scanning “spectroscopy” laser excitation (orange, middle),
as well as nonresonant scatter from ablation and plasma backgrounds (black, bottom). The inset is zoomed- in and
depicts two cycles of amplitude- modulated fluorescence data, with the short, pulsed normalization probe (blue) interspersed
with the longer, CW spectroscopy probe (orange). See fig. S5 for further discussion.
Fig. 2. Molecular production via resonant, optically driven chemistry in the cryogenic gas. (A) Energy levels of Ra reacting with water. The ground 1S0 state cannot react to form RaOH, but the excited 3P1 state can, so we excite the atoms with a strong 714- nm laser. (B) The dependence of RaOH production enhancement on the 3P1 laser detuning from resonance. (C) Single- shot fluorescence traces demonstrating resonant production of RaOD. When the Ra 3P1 laser is off- resonant (“off”), we see some production of RaOD, which is enhanced in the presence of an on- resonant (“on”) laser. We open a shutter ~3 ms after the ablation pulse to distinguish between molecules created in the ablation plume versus by the resonant chemistry. After an initial ablation shot on a new drop- cast target spot, we estimate that up to ~1010 total molecules are produced [see (37) for details on the number estimation].
chloride (RaCl2) or nitrate [Ra(NO3)2] salts are fabricated in- house via manual pipet- ting (“drop casting”) of weakly acidic aque- ous salt solution onto a heated gold surface. A small amount of xylitol is dis- solved into the solution to improve abla- tion target consistency and adhesion after evaporation. Reagent “cotargets” are solid pellets formed by hydraulic pressing of fluoride- , hydroxide- , or deuteroxide- containing powders. Production of differ- ent molecules is achieved by steering the ablation laser to specific cotargets, of which there can be many (10 or more) in a single cell (Fig. 1B), with considerable chemical diversity, limited only by the available space on the target plate.
After ablation, the gas- phase atomic and molecular products rapidly cool to cryo- genic temperatures via collisions with pre- loaded helium buffer gas. This means that many possible chemical reactions that would form the desired molecules become energetically forbidden, stifling molecule production (Fig. 2A). To overcome this, radium atoms are excited from the 1S0 ground state into the 3P1 metastable state [λ = 714 nm, τ ≈ 422 ns (33)] using 1.5 W of CW laser light operating close to population saturation. The 3P1–1S0 transition is spin- forbidden but acquires transition strength due to extremely strong spin- orbit mixing. In the 3P1 state, the Ra atoms have enough internal energy to overcome additional re- action barriers, such as the one shown in Fig. 2A, resulting in a factor of ∼10 to 30 increase in molecule number (Figs. 2, B and C). The resonant behavior of this reaction gives a strong systematic check that the molecules are radium- containing even in the presence of substantial chemical con- tamination or spectral congestion (34). This method works to enhance production of RaOH, RaOD, and RaF, as well as BaOH and BaF, which are used as test and cali- bration species in this apparatus.
Atomic Ra densities inside the cell are measured via resonant optical absorption on the strong 1P1 – 1S0 line at 483 nm [τ ∼ 6 ns (35)]. Approximately 1010 to 1012 cold Ra atoms are generated per ablation pulse. Each radium target yields ∼0.5 × 104 to 2 × 104 shots before being depleted, depending on the amount deposited and the deposition procedure (fig. S1).
Molecular products are detected via laser- induced fluorescence from both pulsed and CW lasers. An integrated lens in the cryo- genic cell assembly collects light from a focal plane in the middle of the cell bore for real- time readout via a low- noise photomulti- plier tube (PMT) module. This detection presents several challenges: The con- strained geometry results in considerable light scatter from the various lasers off
D
E
surfaces; nonresonant scattering occurs off gas- phase clusters and macromolecules created from ablation; and metastable excited states of various atoms and molecules created from the ablation emit broadband fluorescence. We treat the cell with low- reflectance surface coatings and detect fluorescence at a different wavelength from that of any excitation laser so that scattered laser light can be blocked with optical filters. Resonant and nonresonant scattering are distinguished by scanning the laser frequencies to directly observe resonant behavior. Broadband background fluorescence is differen- tiated from laser- induced fluorescence signals by using amplitude- modulated lasers, typically in the 50- to 100- kHz range, combined with lock- in detection.
B A
C
The lock- in detection approach also gives a useful tool to normalize against shot- to- shot fluctuations in atomic and molecular yield in a material- efficient way. By temporally interleaving two lasers (Fig. 1C) within each molecule pulse, one with a varying frequency for measuring a spectrum and the other having a fixed frequency at a known molecular resonance for signal normalization, we can monitor molecule production to reduce noise without needing to average many ablation shots. This method also verifies that any lack of spectral signal was not simply a result of poor molecule production owing to ablation of a depleted target spot.
Laser spectroscopy of RaOH, RaOD, and RaF Laser spectroscopy of RaOH and RaOD focused on the C̃2Σ+−X̃2Σ+ electronic transitions, which approximately correspond to the single pσ ←sσ excitation of a valence, metal- localized electron (23, 36). A probe laser excites C̃2Σ+(000) ← X̃2Σ+, and fluorescence from the decay
2Σ+−̃X
2Σ+ origin band and RaF C2Σ+(𝒗′ = 0) − X2Σ+ (𝒗′′ = 1) systems. Each point represents a single ablation pulse. (A and B) Pulsed- dye laser fluorescence spectrum of RaF (purple) and RaOH (blue), without normalization, at ∼2.5 GHz resolution set by the laser linewidth. (C) Zoom- in on a spin- rotation doublet from the high- resolution data from (D) showing the line shape with Voigt fit. (D) CW dye laser fluorescence spectrum of RaOH with ∼100- MHz linewidth set by the Doppler temperature and radiative broadening. (E) CW dye laser fluorescence spectrum of RaOD. Table S1 contains the list of measured line centers for RaF, and table S2 contains the full line list and comparison to prediction for both RaOH and RaOD.
Fig. 3. Laser- induced fluorescence spectra of the RaOH and RaOD ̃C
C̃2Σ+(000) → X̃2Σ+(ν1ν2ν3) is detected. Here (ν1ν2ν3) labels the number of quanta in the (Ra–O stretch, Ra–O–H bend, O–H stretch) vibrational modes (24), and the relative decay rates to each state are governed by the magnitudes of Franck- Condon factors (22). Because these mole- cules are predicted to be laser coolable, the electronic and vibrational degrees of freedom are largely decoupled, and the dominant decay is back down to (000) (32); however, because that decay wavelength is the same as the intense probe laser, it is optically filtered so that only decays to excited vibrational states ν1 = 1 and ν2 = 2 are detected.
To efficiently find and explore the spectra given the large theoretical uncertainty and limited material, spectra were collected in phases with increasing resolution. The initial broadband CW survey spectroscopy for the RaOH C̃ state was guided by prior relativistic coupled- cluster electronic structure calculations (32), which pointed to a search win- dow on the order of 100 cm−1 near 15,750 cm−1. An efficient search strategy was devised to scan over the full theory uncertainty range with a single 10- μCi radioisotope target. We used a spectrally broad (Δ𝜈 ∼ 30 GHz, ∼1 cm−1) tunable CW laser to scan for laser- induced fluorescence, which enabled coverage of this large area in only a few hours and a few hundred ablation shots. By using a CW laser, we utilized the full few- millisecond duration of the molecular pulse. From this initial survey data, a region of excess fluorescence at 15,740 cm−1 was located (fig. S6), which we tentatively assign as the C̃2Σ+ ← X̃2Σ+ origin system.
Subsequent scans with increasing resolution were performed over increasingly narrow regions. Medium- resolution (Δ𝜈 ∼ 2.5 GHz) pulsed dye laser excitation revealed a tightly bunched band head with isolated,
rotationally resolved progressions in the wings, as depicted in Fig. 3B. The pulsed dye laser was operated with 50- kHz repetition rate, providing ∼1000 fluorescence pulses over the length of the molecular pulse. The clustered band head appearance, atypical for a highly diagonal Σ+ − Σ+ band, is attributable to the large, negative excited state spin rotation of the C̃2Σ+ state, which pushes rotational R1 and P2 branch progressions toward the band origins. This is likely a con- sequence of large spin- orbit coupling (ASO ~ 1500 cm−1) to the | Ω | = 1/2 component of the Ã2Π electronic manifold that is predicted to lie ~2000 cm−1 below the C̃2Σ+ manifold (32) [see (37) for details]. Finally, individual lines were resolved at high resolution with a single- longitudinal- mode (Δ𝜈 ∼ 0.5 MHz) tunable CW dye laser, giving line- widths of ∼100 MHz full width at half maximum caused by Doppler and natural broadening and enabling the determination of line centers to approximately megahertz, as depicted in Fig. 3D and fig. S7.
2Σ+(000) ̃C
̃X
2Σ+(000) ̃C
2Σ+(000)
2Σ+(000)
A similar spectroscopic search was performed for the deuterated isotopolog RaOD, locating a band ∼9 cm−1 to the red of the main origin feature for RaOH, in reasonable agreement with electronic structure predictions for vibrational isotope shifts. The features at both bands show clear dependence on ablation of the (un)deuterated cotarget as well as resonant pumping into the Ra 3P1 state, indicative of optically driven chemical production (see Fig. 2C and fig. S7d). Substituting H→D (or even H→T) should lower the bending vibration energy, thereby increasing the spontaneous lifetime of the symmetry- lowered “science state” (24, 38).
Twenty- seven and 32 low- N lines on the RaOH and deuterated RaOD C̃2Σ+−X̃2Σ+ systems, respectively, were recorded via narrowband CW laser excitation. Here N is the angular momentum of the molecule not including electron or nuclear spin. A list of line centers determined via Voigt profile fit can be found in table S2. Splittings caused by the spin- rotation interaction are resolved for all lines down to the lowest N = 1 rotational states. Hyperfine coupling from the proton and deu- teron spin is expected on the order of ∼1 MHz, which is below the present linewidth and therefore unresolved. In contrast to the severe perturbations observed in the first excited 2Σ+ state of BaOH (39, 40), the low- N progressions into the C̃2Σ+ manifold in RaOH/D appear largely unperturbed. However, as discussed in (37), the intensities of some features and the excited- state spin- rotation constants are indica- tive of spin orbit–induced mixing of the C̃2Σ+ state with adjacent states.
The complete RaOH/D high- resolution line lists were fit to a five- parameter molecular fine- structure Hamiltonian model with rotation (B0) and spin rotation (γ), whose operator form can be written as
where the double and single primes as well as g, e subscripts reference the ground and excited states, respectively, and T0 is the excited- state origin. The angular momentum matrix elements of the Hamiltonians are written in (37).
Rotational constants and deuterated isotope shifts for both the X̃2Σ+ and C̃2Σ+ states are in excellent agreement with bond lengths and moments of inertia calculated in (32). A full set of extracted molecular parameters with ab initio theory comparisons are listed in Table 1. Good agreement is reached between observation and calculation of the ground spin- rotation constants, whereas a discrepancy exists in the magnitude of the excited- state value. This suggests the influence of additional perturbations on the excited manifold from adjacent electronic states, which have been observed in similar systems (39, 40) but whose effects are not captured in the present electronic structure calculations.
g + γ ̂Ng ⋅̂Sg
̂Hg = B’’
0 ̂N
0 ̂N
e + γ ̂Ne ⋅̂Se
̂He = T0 + B’
Table 1. Fitted parameters for RaOH, RaOD, and RaF (Fig. 3, D and E). Theory values for band origins (T0) of RaOH and RaOD are taken from (32). All theory values for rotational constants (B0) and spin- rotation constants (𝛾) were obtained from relativistic exact two- component equation- of- motion coupled- cluster (X2C- EOM- CC) (46, 47) calculations [see (37) regarding the methods and comparison to experiment]. For RaF medium- resolution fits, T0 is referenced to the C2Σ1/2
+(𝑣′′ = 1) vibronic transition (Fig. 3A). Values in parentheses are standard errors (1σ) from fitting, whereas those in brackets correspond to wavemeter uncertainties.
(High res.) ̃X
RaOH Measured Theory Measured Theory
T 0 (cm−1) 0 0 15,739.4220(2) [20] 15,749
B 0 (MHz) 5814.3(7) 5818 5780.3(6) 5783
γ (MHz) 151(3) 165 –7641(4) –13,574
RaOD Measured Theory Measured Theory
T 0 (cm−1) 0 0 15,728.2246(2) [20] 15,730
B 0 (MHz) 5256.3(6) 5258 5208.9(6) 5226
γ (MHz) 143(2) 149 –6739(3) –12,342
(Med. res.) C2Σ+(𝒗’=0)
RaF Measured Theory
T 0 cm−1) 16,171.920(8) 16,199
B 0 (MHz) 5663(6) 5647
γ (MHz) –12,388(90) –13,443
dye excitation of the 𝑣′′ = 1 → 𝑣′ = 0 band system (Fig. 3A and fig. S8). Detection was performed on the strong 𝑣′ = 0 → 𝑣′′ = 0 decay via opti- cal filtering. Similar to the RaOH data, isolated low- N features in the Q21 + R2 and P1 + Q12 progressions were resolved at the pulsed dye linewidth. As the ground state X2Σ+ parameters for RaF have already been determined (15), these features can be used to extract molecular parameters for the C2Σ+ state, which are listed in Table 1.
Discussion and outlook We have demonstrated cryogenic production and high- resolution laser spectroscopy of cold radioactive molecules, as well as achieving the detection and characterization of neutral radium- containing polyatomic molecules, putting them in position to benefit from a wide range of modern quantum science tools. The techniques devel- oped in this work are broadly applicable, establishing a pathway for precision study of a wide range of radioactive species (1) in a table- top setting.
With the generation of cold samples, advanced spectroscopic tech- niques currently used on stable species to improve bandwidth and resolution of spectra are now applicable for the study of radioactive atoms and molecules. Broadband light sources in combination with high–optical dispersion detectors can enable fast, multi- terahertz broadband spectral acquisition while preserving rotational and fine structure resolution (41).
Formation of molecular beams (19) will enable laser cooling, which is expected to be feasible in these species (10–12, 15) and therefore open up a wide range of precision measurement applications. These molecules have the electronic structure for which many advanced optical trapping (42, 43) and precision measurement schemes (18, 24–26, 44) have been both proposed and demonstrated. Our approach can be used for many radioactive systems, including molecular isoto- pologs (14, 45) containing the spinful, octupole- deformed 225Ra (𝐼 = 1/2) and 223Ra (𝐼 = 3/2) isotopes, which we anticipate being able to
study using this approach given the demonstrated signal- to- noise ra- tio, and which would enable highly sensitive searches for charge- parity (CP)–violating hadronic physics at the frontiers of current experimen- tal limits.
REFERENCES AND NOTES
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244309 (2021). 35. V. Dzuba, V. Flambaum, J. Phys. At. Mol. Opt. Phys. 40, 227–236 (2006). 36. M. V. Ivanov, F. H. Bangerter, A. I. Krylov, Phys. Chem. Chem. Phys. 21, 19447–19457
(2019). 37. See supplementary materials. 38. N. B. Vilas et al., Phys. Rev. A 107, 062802 (2023). 39. S. Kinsey- Nielsen, C. Brazier, P. Bernath, J. Chem. Phys. 84, 698–708 (1986). 40. T. Gustavsson et al., J. Mol. Spectrosc. 145, 210–221 (1991).
(2025). 42. L. Anderegg et al., Science 365, 1156–1158 (2019). 43. N. B. Vilas et al., Nature 628, 282–286 (2024). 44. J. J. Hudson et al., Nature 473, 493–496 (2011). 45. S. G. Wilkins et al., Science 390, 386–389 (2025). 46. C. Zhang, L. Cheng, J. Phys. Chem. A 126, 4537–4553 (2022). 47. A. Asthana, J. Liu, L. Cheng, J. Chem. Phys. 150, 074102 (2019). 48. N. R. Hutzler, C. Conn, P. Yu, Production and spectroscopy of cold radioactive molecules
[Data set], CaltechDATA (2026); https://doi.org/10.22002/qc4at- 7mn31.
ACKNOWLEDGMENTS The authors thank H. Issaian and A. Jefferson for extensive radiation safety support and advice throughout the planning and operation of the project, as well as S. Hwang and the Caltech Solid State NMR Facility for verification of synthesized reagents. C.J.C. and P.Y. thank A. Duarte for assistance in obtaining laser hardware, Y. Zeng for contributions to the control system and prototyping lasers, and M. Gababa and Z. Ye for assistance with developing the cryogenic apparatus, as well as C. Zhang for advice on low- noise RF design. The authors also thank J. M. Doyle, R. F. Garcia Ruiz, and the RaX Collaboration for helpful discussions and comments on the manuscript. We acknowledge Oak Ridge National Laboratory and Eckert & Ziegler for supplying the isotopes used in this work. Some of the isotopes used in this research were supplied by the US Department of Energy Isotope Program, managed by the Office of Science for Isotope R&D and Production. Computational modeling of chemical reactions was conducted in the Resnick High Performance Computing Center, a facility supported by Resnick Sustainability Institute at Caltech, using QChem (version 5.3). Relativistic electronic structure calculations reported in this work used the CFOUR (version 2.1) program package. Funding: Experimental work at Caltech was supported by the National Science Foundation (PHY- 2309361), a De Logi Science and Technology Grant, the Heising- Simons Foundation (2022- 3361), and an Alfred P. Sloan Research Fellowship. Computational and theoretical work at Johns Hopkins University (C.Z. and L.C.) was supported by the National Science Foundation under grant no. PHY- 2309253. P.Y. acknowledges support from a Caltech Eddleman Graduate Fellowship. M.I.H. acknowledges support from an NSF Graduate Research Fellowship and the Caltech Dominic Orr Graduate Fellowship. A.G. acknowledges support from the Thomas Lauritsen Caltech SURF Fellowship Author contributions: Conceptualization: C.J.C., P.Y., N.R.H. Experimental design and construction: C.J.C., P.Y. Data collection: C.J.C., P.Y., M.I.H., Y.Y. Data analysis: C.J.C., P.Y. Development and implementation of electronic structure calculations: C.Z., L.C. Spectral modeling, data fitting, and laser assistance: T.C.S. Development of wet radiochemical procedures: A.N.G. Assistance with development of measurement protocol: A.J. Computational modeling of chemical reaction pathways: A.G. Supervision: N.R.H. Competing interests: A patent application covering inventions described in this report (serial no. 19/551,368) has been filed in the US with the following listed inventors: N.R.H., C.J.C., P.Y., M.I.H., and Y.Y. Data, code, and materials availability: Underlying data and analysis code produced in this work is available on the Caltech Research Data Repository (48). Details of the preparation and characterization of all materials are provided in the methods section (37). License information: Copyright © 2026 the authors, some rights reserved; exclusive licensee American Association for the Advancement of Science. No claim to original US government works. https://www.science. org/about/science- licenses- journal- article- reuse
SUPPLEMENTARY MATERIALS
science.org/doi/10.1126/science.aea9413
Materials and Methods; Supplementary Text; Figs. S1 to S10; Tables S1 to S8;
References (49–82)
10.1126/science.aea9413
Submitted 9 August 2025; accepted 18 May 2026
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RESPONSIBILITIES: As a successful candidate, you will apply your chemistry and structure biology skills to play a pivotal role in study design, data collection, analysis pipeline development, data analysis, algorithm development, results interpretation, manuscript writing and proposal development for protein structure prediction projects. Your responsibilities will extend to collaborative research with esteemed faculty at UTHealth and other institutions, fostering a dynamic and interdisciplinary approach to AI and data science. DSICCR is renowned for its productive track record in data science, informatics, and AI (https://sbmi.uth.edu/dsiccr/outcomes). Past postdoctoral fellows have made significant contributions to high-impact publications and played key roles in winning teams in national and international competitions, such as BioCreative and LitCoin NLP Challenge. Notable publications include works in JAMA (Zhu and Zheng, 320(11):1103-1104, 2018), Nature Communications (Yuan, et al., 12, 2031, doi:10.1038/s41467-021-22200-5, 2021), and Nucleic Acid Research (Yang, et al., 53(D1):D331-D339, 2025, PMID: 39530217) As a member of our research community, you will benefit from comprehensive training in AI research and gain hands-on experience with DSICCR’s advanced computing infrastructure (https://sbmi.uth.edu/dsiccr/ resources). This includes access to a Hadoop cluster, a large memory server, several state-of-the-art Nvidia GPU servers (including the world’s first Nvidia DGX H100 server), and High-Performance Computing (HPC) clusters at the Texas Advanced Computing Center.
Equal Opportunity Employer/Disability/Veteran
Located in the heart of the Texas Medical Center in Houston, the fourth largest city in the United States, UTHealth offers a cosmopolitan setting for your academic and professional growth. Join us in our commitment to advancing the frontier of AI and data science applied to basic research and clinical practice. We look forward to welcoming an enthusiastic and dedicated postdoctoral fellow to contribute to our collaborative and innovative research environment. APPOINTMENTS/BENEFITS: This is a full-time, 12-month appointment, renewable annually with comprehensive benefits. Anticipated postdoctoral training duration is 2-3 years with multiple fellowship support opportunities.
QUALIFICATIONS: The energetic and proactive individual should have a strong background and formal training in chemistry, structural biology, and small-molecule drug screening and development. Essential qualifications include solid experience in protein structure and related data analysis, with a proven record of published research. Hands-on experience wit
g p th experimental structural methods such as cryo-EM, X-ray p y y crystallography, or NMR along with the detailed understanding of protein y g p y g secondary and tertiary structure
behavior that comes from working in such an environment is strongly preferred. Programming skills is required and additional expertise in bioinformatics and quantitative and analytical science is a plus.. Excellent teamwork, communication skills, and the ability to develop and maintain high-quality collaborations are required.
HOW TO APPLY: Note that all application materials must be submitted to https://careers.uth.tmc.edu/us/en/job/260001GW. The candidate should provide a current curriculum vitae and a cover letter describing qualifications and career goals as part of the application process.
SALARY: Comply with NIH postdoc salary standards based on the qualifications and experience.
job focus: data science
A
s my colleague stood there crying in my office, telling me the details of how he had just been forced to retire, I was mortified. I was an assistant professor a year into my tenure, and he was “a name”—someone well known in the field. I felt bad for him. But as a noncrier, I was unsure where to look as he sobbed, or what to say to “fix” it. Like most men of my generation, I was socialized early on to stay composed and just deal with a problem; crying was not acceptable, because it would be perceived as weak and vulnerable. I was shocked that my colleague was allowing his tears to fall in front of me, and the panic and confusion I felt stayed with me long after.
The experience with the retiring faculty member was 2 de- cades ago. But I found myself in similar situations years later, in the context of mentoring conversations where I was the more senior person. In one, an early-career colleague asked about a possible career pivot. I offered what I thought was practical advice: She wasn’t ready yet. The conversation moved on. But 40 minutes later she became visibly upset and began to cry. As I sat there trying to resume the conversation, I felt the same flicker of discomfort and uncertainty about how to respond that I had experienced years earlier.
Around the same time, a colleague injured his hand in a door after a meeting in my office. He was in pain and visibly upset. This time, the tears did not unsettle me at all; they made sense as part of a problem I knew how to address. I checked he was OK and moved directly to the institutional safety procedures I had been trained to follow. Afterward, though, I faced an unsettling question: Why was my response so different when the tears reflected physical pain, not emo- tional distress?
Thinking about the two situations, I realized I needed to allow more space for emotional crying, and to be open to what it signaled. The cues that my early-career colleague was upset had been there—hesitation, small shifts in tone, mo- ments of uncertainty. The crying simply made visible what had already been building. I began to wonder whether I had delivered my message too directly and what I might have done differently to lessen the emotional impact it had on her. And instead of seeing her crying as a problem, I could have taken it as an opportunity to better understand her as a person.
In academia we are rarely trained for moments when a col- league becomes upset in front of us. But this is no less important than knowing how to deal with cries of physical pain. Now, when someone I work with starts to cry, I know not to brush it aside or immediately move toward making the problem go away. I try to slow the conversation and allow space for the reaction. I pay closer attention to what led up to that moment, including what I said and how I said it. Only afterward do I return to the issue that prompted it.
I still feel traces of my earlier discomfort. But I no longer see it as something to eliminate, because the stakes are high during these moments. They can lead to a more open and honest ex- change and signal an important shift in the conversation—from routine discussion to something more consequential. Tears can mark the points in work life where decisions matter most: whether to stay or leave, whether progress is enough, whether a path still feels viable.
I sometimes think back to that early encounter in my office. Today, I would tell my junior self that I don’t need to fix the person who is crying, or to run away from the emotional reaction. The tears should remind me that my job as a faculty member and col- league is not just about leading for better performance, but also about embracing the whole person behind the moment.
Sometimes, the most useful thing to do is not to stop the tears, but to notice what they might be telling us about a person—and about the work lives we share.
Gavin Schwarz is a professor at the UNSW Business School. Do you have an interesting career story to share? See our author guidelines at https://scim.ag/WorkingLife.
ILLUSTRATION: ROBERT NEUBECKER
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主要原因： 1. Page 210 出现不可读的乱码块。 2. Page 5 出现严重的文本拆分与逻辑断裂，无法构成连贯文章。 3. Page 106 擅自对原文结构进行“学术化”重组（添加了原件不存在的标签）。 4. Page 4 部分目录内容缺失。